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行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
高分子薄膜於外加電場下應用於血漿蛋白質分離之研究
計畫編號：89-2314-B-002-259-執行期限：88 年 8 月 1 日至 89 年 7 月 31 日
主持人：林東燦 國立台灣大學醫學院檢驗醫學科
共同主持人：楊台鴻 國立台灣大學醫學院醫學工程研究所
一、中文摘要 過去實驗已證實自製之高分子薄膜於 分離免疫球蛋白及白蛋白之可行性，惟其 間發現分離之效果未臻理想之最大原因為 蛋白質在薄膜表面形成一層濾餅（cake）， 為改進此缺失，本實驗乃以掃流過濾及外 加電場，以期藉流動性溶液及電場使免疫 球蛋白不致沉積在薄膜表面，阻塞過濾效 果，以便白蛋白通過薄膜，如此將可達到 預期的效果。故本實驗分為三部分：（1） 薄膜結構之鑑定包括薄膜之表面，截面， 孔隙度大小之測定（2）蛋白質溶液在外加 電場掃流之過濾實驗及（3）血液檢體於同 樣狀況下之測試。希望此外加電場掃流之 簡易裝置能徹底改善過去因阻塞造成阻力 增加，導致過濾效果降低之缺失，使此高 分子薄膜能作為臨床上治療性血漿分離時 二次過濾之用。 關鍵詞：蛋白質分離、高分子薄膜、電場 Abstr actPrevious experiments have proved that membranes have the possibility to separate of globulins and albumin. From these experiments, we found the pitfall causing the lower filtration efficiency is due to the “cake” formation on the membranes. In order to improve this pitfall, we try to add an electric field and cross-flow to the experiments. As we know, the anode will attract the negative-changed globulins with the cross-flow that will prevent the obstruction of the micropores. By the way, the cross-flow will simulate the condition of cascade filtration by its continuous flow. So, three parts will compose the studies: 1) Identification of membrane structures including surface and cross-section, measuring size of the micropores, contact angles and degree of crystallization. 2) Experiments of protein
solutions filtered through membranes within a cross-flow device under electric field. 3) Experiments of plasma of different composition filtered through membranes under the same conditions of above. We hope this simple cross-flow and electric field design will improve the filtration efficacy and let the membrane can be used clinically in cascade or double filtration technique in therapeutic plasmapheresis.
Keywor ds: protein separation, membrane,
electric field 二、計畫緣由與目的 由 於 血 漿 交 換 實 際 存 在 著 許 多 之 缺 點 ， 故 有 其 他 替 代 方 法 的 想 法 ， 其 基 本 概 念 是 利 用 薄 膜 過 濾 的 方 法 ， 將 血 液 中 過 多 或 發 生 病 變 之 蛋 白 質 與 其 他 蛋 白 質 分 離 ， 留 下 有 用 之 蛋 白 質 ， 即 可 免 除 血 漿 交 換 之 缺 點。。1980年 ， Agishi et al. 提 出 分 段 過 濾 (cascade filtration or double filtration) 之 構 想 [1] ： 先 將 血 液 經 初 次 過 濾 (primary filtration)， 分 離 出 血 漿 及 血 球 ； 再 取 血 漿 進 行 二 次 過 濾 (secondary filtration)， 將 免 疫 球 蛋 白 或 免 疫 複 合 體 等 較 大 之 溶 質 與 白 蛋 白 等 其 它 較 小 之 溶 質 分 離 ， 而 達 到 以 上 之 目 的 ， 由 於 免 疫 球 蛋 白 與 白 蛋 白 具 有 指 標 作 用 ， 故 在 分 離 過 程 中 ， 分 離 免 疫 球 蛋 白 與 白 蛋 白 為 最 關 鍵 之 步 驟 [2-4]。 若 就 薄 膜 本 身 性 質 而 言 ， 影 響 過 濾 特 性 最 鉅 者 就 是 其 孔 隙 度 ， 包 含 薄 膜 的 孔 隙 大 小 與 分 佈 等 為 影 響 薄 膜 過 濾 特 性 的 重 要 因 素 。 本 計 畫 的 研 究 方 向 是 朝 利 用 薄 膜
2 進 行 分 離 血 漿 蛋 白 質 的 方 向 進 行 ， 在 分 離 過 程 中 將 免 疫 球 蛋 白 盡 可 能 去 除 ， 而 盡 可 能 將 其 他 有 用 之 蛋 白 質 留 下 。 所 用 的 高 分 子 薄 膜 材 料 為 乙 烯 -乙 烯 醇 共 聚 合 物 (poly (ethylene-co-vinylalcohol) ， 由 於 其 血 液 適 合 性 佳 [5-7]， 目 前 已 廣 泛 應 用 於 血 液 透 析 ， 且 效 果 良 好 [8]； 此 材 料 具 有 結 晶 性 ， 皆 可 利 用 其 結 晶 性 製 備 微 孔 型 (microporous)薄 膜，故 過 濾 時 流 通 率 較 大 。 依 過 去 實 驗 ， 在 薄 膜 進 行 分 離 血 漿 蛋 白 質 的 主 要 缺 點 是 蛋 白 質 會 在 薄 膜 表 面 形 成 一 層 濾 餅 (cake)，使 薄 膜 在 操 作 過 程 中 過 濾 功 能 會 逐 漸 衰 退 ， 此 種 現 象 又 特 別 會 發 生 在 分 離 高 濃 度 的 溶 液 時 ， 一 般 在 以 薄 膜 濃 縮 蛋 白 質 時 亦 有 類 似 的 問 題 ， 文 獻 上 解 決 此 問 題 的 方 法 則 常 在 過 濾 時 外加電場[9-12]，亦 即 利 用 蛋 白 質 的 帶 電 特 性 ， 在 特 定 電 場 下 ， 使 蛋 白 質 懸 浮 於 溶 液 中 ， 而 不 會 在 薄 膜 表 面 形 成 一 層 濾 餅 ， 因 此 濾 液 的 流 通 量 可 加 大 。 三、實驗結果與討論 薄膜結構：本研究所製備之薄膜分為 兩大類：非對稱性薄膜與顆粒型薄膜。圖 1(a)為顆粒型薄膜(E1 膜)SEM 照片，可發 現薄膜是由大小相同顆粒所堆積而成的結 構，顆粒半徑約為 0.4 μm，其為使用濕製 程且利用正辛醇為凝聚劑，外觀呈略微透 明，且強度較差。圖 1(b)為非對稱型性薄 膜(E2 膜)，包含緻密的皮層與孔洞結構， 孔洞的形態為手指形結構，其外觀則呈現 不透明之乳白色，且強度較好。 薄膜之孔隙度主要可由水銀測孔儀量測， 經理論計算可計算出薄膜之整體孔隙度， 如表 1 所示。 純 蛋 白 質 溶 液 外加電場掃 流 過 濾 實 驗 ： 首 先 要 設 計 一 個 可 外 加 電 場 的 掃 流 過 濾 裝 置 (見 圖 2)，將 純 蛋 白 質 溶 液 以 幫 浦 送 到 過 濾 裝 置 的 入 口 ， 薄 膜 上 下 方 各 有 金 屬 外 接 直 流 電 源 形 成 陰 陽 兩 極 ， 濾 液 穿 過 薄 膜 從 下 方 流 回 蛋 白 質 溶 液 槽 ， 重 複 循 環 過 濾 ， 未 穿 過 薄 膜 的 溶 液 則 自 裝 置 出 口 流 出 排 掉 ， 經 過 多 組 實 驗 發 現 將 電 壓 固 定 於 3 volt，即 電 場 強 度 為 273(V/m)可 有 效 的 增 加 濾 液 的 流 通 量 ， 如 圖 3 所 示 ， 但 若 電 場 超 過 此 值 則 蛋 白 質 則 有 變 質 之 虞 ； 至 於 蛋 白 質 溶 液 濃 度 選 用 的 條 件 和 人 體 內 血 液 中 蛋 白 質 濃 度 相 同 （ 4.0 g/dl）；而 過 濾 壓 力 依 不 同 薄 膜 強 度 做 調 整，以 達 到 最 佳 流 通 量。另外由濾過 液之蛋白質濃度，發現顆粒型薄膜(E1)均可 使白蛋白通過，而非對稱型性薄膜(E2 膜) 則因為其表層有一皮層，故阻擋了白蛋白 的通過。 血 液 檢 體 測 試 ： 表 2 表示，使用免 疫球蛋白過高之血漿進行超過濾實驗之結 果，操作壓力為 0.5 kgf/cm2。由表中可知， 在血漿超過濾實驗結果中，E2 薄膜完全阻 隔免疫球蛋白的通過，但同時也阻隔了白 蛋白的穿透，用於血漿分離時，是不理想 的薄膜。在顆粒型 E1 薄膜，白蛋白可穿 透，免疫球蛋白也有部份穿透。而在實際 的應用上，對於薄膜之要求為白蛋白穿透 愈多、免疫球蛋白愈少愈好，因此定義一 個白蛋白和免疫球蛋白兩者間的比值， A/G，此值愈大代表薄膜愈能符合要求，另 外，由圖 4 中，於流速達穩定狀態(Steady State)再外加電場 273 V/m，確實可以使流 速增加，但對過濾的組成沒有幫助，其原 因可能其只是破壞濾 餅 (cake)，而 沒 有 改 變 薄 膜 的 孔 隙 度 。 因此，非對稱性薄膜中同時阻隔了免 疫球蛋白與白蛋白的通過，所以無法應用 於血漿分離上，而顆粒型薄膜為本研究中
3 應用於血漿分離較佳之選擇。 四、計畫成果自評 本計畫的目的是要探討高分子薄膜於 外加電場下應用於血漿蛋白質分離的可行 性，將薄膜分離技術應用免 疫 球 蛋 白 與 白 蛋 白 的 分 離 ，以高分子薄膜為研究對 象 ， 完 成 之 工 作 項 目 有 鑑 定 薄 膜 的 結 構 ， 量 測 薄 膜 之 孔 隙 度 及 表 面 性 質 。 設 計 外 加 電 場 的 掃 流 過 濾 裝 置 ， 建 立 實 驗 量 測 蛋白質穿 透 薄 膜 的 情 形。研 究 蛋 白 質 與 膜 材 間 的 作 用 力 ， 並 改 善 蛋 白 質 阻 塞 膜 材 的 情 形 。 取 人 體 血 液 檢 體 進 行 實 際 操 作，測 試 薄 膜 進 行 於外加 電 場 下 應 用 於 血 漿 蛋 白 質 分 離 的 可 行 性 。 五、參考文獻
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12. H. Yukawa, K. Shimura, A. Suda, A.
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4 圖 1：薄膜之 SEM 表面及淬斷面結構照片 (a) (b) 圖 2：過濾裝置簡圖 圖 3：不同電場下，蛋白質濾過液流速對時 間作圖 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 F low R at e (ml /s ec ) Time (sec) E1 membrane P=0.5 kgf/cm2 with electric field 273 (V/m) with electric field 91 (V/m) without electric field
圖4：血漿過濾過程中當流速達穩定狀態 (Steady State)外加一電場273 V/m之表現 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 0.11
Add Electric Field 273 (V/m)
E1 membrane P=0.3 kgf/cm2 F low Rate (m l/ sec) Time (sec) 表 2 血漿電場超過濾之濾過液濃度組成 (免疫球蛋白濃度過高之血漿) 溫度 25℃，操作壓力 0.5 kgf/cm2 原液組成: Alb=2.5 g/dl IgG=7.1 g/dl E1 membrane Alb. (g/dl) IgG (g/dl) A/G Origin 2.5 7.1 0.35 10 ml 0.5 1.3 0.38 20 ml 0.8 1.2 0.67 30 ml 0.9 0.7 1.29 40 ml 0.8 0.7 1.14 50 ml 0.8 0.7 1.16 60 ml 0.7 0.6 1.18 70 ml 0.8 0.6 1.33 80 ml 0.7 0.6 1.19
Alb = Albumin；IgG = Immunoglobulin G. 正常人體血漿中，Alb = 4.0 g/dl，IgG = 800 ~ 1600 mg/dl D.C. Power Supply V Membrane Anode Cathode Inlet Outlet Filtrate (pump)
