行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
中醫藥對肝再生能力之影響(2/3)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC92-2320-B-039-014- 執行期間： 92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日 執行單位： 中國醫藥大學學士後中醫系 計畫主持人： 蔡金川 計畫參與人員： 林俊清,陳悅生,黃志揚,梁秀蓮,吳嘉平,蘇啟成 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 93 年 5 月 31 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫期中成果報告
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中草藥對肝再生能力之影響
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計畫類別：
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個別型計畫 □整合型計畫
計畫編號：NSC 92-2320-039-014
執行期間：92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日
計畫主持人：蔡金川 副教授
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：中國醫藥大學 學士後中醫學系
中 華 民 國 93 年 5 月 31 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
Preparation of NSC Project Reports
計畫編號：NSC92-2320-039-014
執行期限：92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日
主持人：蔡金川 副教授
計畫參與人員：林俊清,陳悅生,黃志揚,吳嘉平,梁秀蓮,蘇啟
成
一、中文摘要: 肝病是國人常見的疾病，其相關病 變：慢性肝炎、肝硬化、肝癌久為台灣地 區十大死亡原因之一。在其病變當中，包 括化學性及生物性之傷害，肝細胞的再生 扮演著重要功能修復角色且在肝硬化、肝 癌病變或其他腫瘤移轉，需進行手術切 除、或則肝臟移植後，此時肝細胞之再生 絕對重要且必要。為研究中草藥在肝細胞 再生階段中所扮演之角色，並探討中醫學 理之實質，進而開發中草藥之醫療願景， 而進行本實驗。本研究以:益氣中藥-「黨 參」、活血中藥-「丹參」、清熱民間藥-「丁豎朽」、本土產和解藥-「高氏柴胡」， 進行對肝再生能力之評估，以及作用機制 之探討。現代醫學試圖對此有所突破，因 此具有多方面的嘗試及探討被提出，包 括：Glutamine、Vit D3、酒精對肝切除後 再生的影響，甚至碳水化合物、脂肪、胺基 酸的營養調控也被研究。我們的探討將包 括：存活率、肝重的改變率(再生肝重量/ 原本起始肝重量)。並同時探討(1)肝細胞增 生 之 相 關 分 子 訊 息 途 徑 ， 含 HGF-c-MET-Cell cycle factors 及 TGFα -EGFR-MEK-ERK 途徑，並同時分析細胞 生存增生途徑，IGFs-IGFIR-Akt-Bcl 2 等分 子 訊 息 途 徑 。(2) 及 結 痂 (scar) 途 徑 ， FGF-2-UPA-MMPs。(3)促結痂及纖維化途 徑，TGFβs-TGFR-Smads。(4)並將偵測增 生/纖維化 markers,α-SMG 及 procollagen 之變化。期望藉肝切除3 天及 7 天 models， 比較出(1)快速促肝生長之中草藥及較晚期 作用之中草藥。(2)探討具療效之不同中草 藥，其所透過之不同及共同分子訊息途 徑。將採用(1)dot-blotting 及 RTPCR 分析 mRNA level 之變化(2)Western blotting 分 析protein 含量及活性之改變。 二、前言: 肝病是國人常見的疾病，其相關病 變：慢性肝炎、肝硬化、肝癌久為台灣地 區十大死亡原因之一。在其病變當中，包 括化學性及生物性之傷害，肝細胞的再生 變演著重要修復工作。尤其是在肝硬化、 肝癌變或其他腫瘤移轉，手術切除、或則 肝臟移植是必要的，在此階段肝細胞之再 生更凸顯重要。 為研究中醫藥是否再肝細胞再生之階段 中所扮演之角色，並探討中醫學李之實 質，進而開發中草藥之醫療願景，而進行 本實驗。此研究以:益氣中藥-「黨參」、 活血中藥-「丹參」、清熱民間藥-「丁豎 朽」、本土產和解藥-「高氏柴胡」，進行 對肝再生能力之作用，以及作用機制之探 討。現代醫學試圖對此有所突破，因此具 有多方面的嘗試及探討被提出，包括： Glutamine、Vit D3、酒精對肝切除後再生 的影響，甚至碳水化合物、脂肪、胺基酸 的營養調控也被研究。其探討包括：存活 率、肝重的改變率(再生肝重量/原本起始肝重量)、肝臟再生之特殊基因表現(包 含:HGF，c-met，TGF-α，cyclin D1，cyclin A，procollage，TGF-β1 等)，以觀察細胞 週期進入S phase 表現情形。 肝細胞增生因子 HGF(Hepatocyte growth factor)為一個雙硫鍵結的 heterodimer
，是由69 kDa 的α-chain 及 34kDa 的β -chain 所組成，而α-chain 則為具有一個 hairpin domain 的 N 端；β-chain 則為具有 四個Kringle domains 的 Serine protease。 同時HGF 大多位於 Kidney，mammary gland，lung and tooth 等基質組織(stromal tissue)中並且具有增生及再生的作用。 HGF 是一種具有生物活性的 growth factor，以誘導細胞進行 survival， migration，proliferation 及 tubulogenesis。 HGF 和其 receptor( c-met) 結合在各種組 織中以autocrine 及 paracrine 的作用，促使 細胞的mitogenic，motogenic，及 morphogenic。HGF 促使肝細胞增生是透過 c-met 之相關分子訊息途徑，進入 Cell cycle 中活化 Rb 及 E2F 並促進細胞的增 生。而增生的另一途徑IGF-1 主要在肝臟 中製造分泌可行Endocrine 及在部分組織 中，可自行分泌行Paracrine 和 Autocrine， 對細胞造成影響。Insulin-like growth factors I 於 1960 年代被發現，且已被證實 IGFs 能調節 Growth、Development、Cell survival 和 Tissue differentiation 的發生 (72,73)。IGF-I 是一 70 Amino acid 的 Single-chain basic protein (74)；而IGF-I 主要 是透過IGF-IR 造成 Cellular actions，而 IGF-I receptor (IGF-IR)為一 Tyrosine kinase receptor，是一個 Heteroterotrameric
glycoprotein，由兩個 706 胺基酸的α -subunits 和兩個 627 胺基酸的β-subunit 行成一個四聚體(78)，而α-subunits 為 Ligand 結全的區域，而 Ligand 主要結全在 α-subunits extracellular domain 的
Cystein-rich 的區域，並活化 Cytoplasmic β-domain 上的 Tyrosine kinase (78)。而β -subunit 為 Transmembrane 的 protein。α -subunits 和β-subunit 之間以 Disulfide 相 連接(78)。IGF-IR 的基因在人類
Chromosome 15q25-q26(79)。當 IGF-I 結合 在IGF-IR 後會活化 Insulin receptor
substrate 1(IRS)，其下游路徑包括：IRS、 Akt、Bcl 2 等分子訊息途徑。 未開發有潛力中藥及本土性中草藥，本 實驗將現代外科與中醫結合，探討中醫藥 之療效與作用機轉，以期對中醫藥作深入 之探討。將來更可提供一個良好的模式來 篩選及開發有效之中藥。 三、研究方法: 1、組織研磨液的製備： 肝 臟 先 以 ddH2O 清洗之後，再以每 100mg 組織 1ml 的 PBS ( 0.14M NaCl,3mM KCl, 1.4mM KH2PO4, 14mM K2HPO4 ) 研 磨。以均質機 ( KNEMATICA,PT2100, 瑞 士 )研磨約 5 分鐘。研磨液在冰上靜置 10 分鐘之後，以12,000rpm 離心 30 分鐘，取 上清液並且放置在 -20℃冰箱中備用。 2、肝臟組織中蛋白定量分析：
以 蛋 白 標 準 品 bovin serum albumin (BSA)在紫外線光譜儀波長 595 nm 所測得 的標準曲線來計算肝臟組織中蛋白質的濃 度(如下表)。將肝臟蛋白樣品稀釋 10 倍後 加入1ml 1：5 稀釋的 Bradford protein assay reagent 充分混合均勻，以紫外線光譜儀在 波長 595 nm 測定其吸光值，利用此標準 曲線來計算肝臟組織中蛋白質的濃度。 blank 1 2 3 4 5 6 7 8 BSA(ul) 0 4 8 12 16 20 24 28 32 濃度 0 1.6 3.2 4.8 6.4 8 9.6 12.8
0.4mg/ul) 11.2 DdH2O 200 196 192 188 184 180 176 172 168 DdH2O 500 PBS 100 Dye 200 3 、 西 方 墨 點 分 析 ( Western Blotting Analyses ) 取40ug 的肝臟蛋白萃取液，加入適量的 PBS ( 0.14M NaCl, 3mM KCl, 1.4mM KH2PO4、6H2O, 14mM K2HPO4 )及 4ul 的 dye，在 95℃下作用 10 分鐘使蛋白質變性。 然後將蛋白樣品以1.2﹪polyacrylamide gel ( 附圖 二 )以 110 伏特，進行蛋白電泳 90 分 鐘 。 電 泳 完 成 後 ， 將 凝 膠 平 舖 在 以 transfer
buffer ( 24.7mM Tis-base,192mM glycine 及 20﹪methanol，最後補 ddH2O 到 1L,PH 8.3 ~ 8.4 )潤濕的濾紙，蓋上 PVDF membrane 之 後，再蓋上一層濾紙，放入 transfer tank 之 中，以 150mA 電流，transfer 2 個小時。 然 後將PVDF membrane 取出，依照各種不同 分子量抗體位置，剪成一小長條狀，在放 入含有0.1﹪Tween 20 的 5﹪脫脂牛奶中， blocking 一個小時之後，將 membrane 取出 放入密封袋中，加入2ml 含有 0.1﹪Tween 20 的 5﹪脫脂牛奶，及一次抗體，包含： IGF-І ( Santa Cruz Biotechnology,1:500 )， IGF-IR( Upstate biotechnology,1:500 ) ，
bcl-2
( Transduction Laboratories,1:500 )， α-tubulin ( Neo Markers,1:500 )。 HGFα ( Santa Cruz Biotechnology,1:500 )，UPA ( Santa Cruz Biotechnology,1:500 )，PAI-I ( Santa Cruz Biotechnology,1:500 )，FAK ( Santa Cruz Biotechnology,1:500 )，Rb
( Santa Cruz Biotechnology,1:500 )。 在 4 ℃ 冰 箱 中 ， 反 應 24 小 時 。 取 出 membrane 以 TBS+Tween 20 wash 三次， 每次 5 分鐘。之後，再將 membrane 取出 放入新的密封袋中，加入含有0.1﹪Tween 20 的 5﹪脫脂牛奶 2ml 及二次抗體，包 含：anti-rabbit IgG
(Antibodies Incorporated,1:1000) ，
anti-mouse IgG( Antibodies Incorporated,1:1000 )，anti-
goat IgG ( Antibodies Incorporated, 1:1000 ) ，在室溫中，反應 2 個小時。重覆 wash 步驟，最後加入 7.5ml 的 substrate buffer ( 76.8mM Tris-HCl ,1M NaCl , 5mM MgCl2、
6H2O )，2.5ul H2O2及500ul DAB
(3,3`-diaminobenzidine)染色，約 5 分鐘。 觀 察 結 果 並 做 相 對 密 度 測 量(relative density measurement)。 4、18srRNA，IGF-І，IGF-R，COXvb 探針 (prob)之製備： a. 大 腸 桿 菌 的 培 養 ： 將 LB(Luria-Bertani)medium 加入 15g 的 agar 之後，再加 ddH2O 到 1L。並在 121℃下 autoclave 50 分鐘，待稍微冷卻之後，再加 入 1ml 的 ampicilim 稍微混勻之後再將 agarose medium 緩緩地倒入培養皿中，靜 置使其慢慢冷卻，製作成plate。凝固後的 plate 再將 clone 有 pGEMI-IGFІ DNA 及 COX vb DNA 的 E coli，劃到 plate 上，並 在37℃的 oven 中培養 24 小時。再將培養 出來的E coli 菌株，從其中挑出一小菌株 在10ml 的 LB medium 中，培養另 24 小時。
b.取 DNA plasmid：取 1~5 ml E coli LB(Luria-Bertani) medium，在 3,000rpm 下 離心5 分鐘，倒掉上清液。再將剩餘沉澱 下來的E coli，以 QIAprep Spin Miniprep kit
萃取，首先加入250ul 的 buffer P1，使其 溶解之後再將其置換到1.5ml 的 eppendorf 中。加入250ul 的 buffer P2，上、下 invert 4 到 6 次之後，再加入 350ul 的 buffer N3， 並且再上、下 invert 4 到 6 次之後，以 12,000rpm 離心 10 分鐘。將其上清液倒入 QIA prep column 之中，離心 30 秒，再加 入0.5ml 的 buffer PB，離心 30 秒，再加入 0.75ml 的 buffer PE wash 並離心 1 分鐘。 再加入 50ul 的 ddH2O 使其 DNA 溶解出
來。儲藏於-70℃。
c.環形 DNA 切割成線形 DNA：將抽出
的DNA 取 2ul，加 98ul 的 ddH2O 稀釋 50
倍 ， 測 吸 光 度(OD260) 值 。 IGF-І (OD260
值)，COX(OD260值)再利用公式 OD260 ×50
×稀釋倍數 50，計算出 IGF-І DNA 濃度 (ng/ul)，COX DNA 濃度(ng/ul)，IGF-R 濃 度(ng/ul)，18sRNA 濃度(ng/ul)。取 DNA 16ul( 約 2~3ug) ， 10 × React 3 10ul，(10 ug/ul )Bam H1 3ul，ddH2O 70ul，在 37℃
下，培養5 個小時。
d.DNA 純化：取 200ul 的 phenol 及 chloroform 以 1:1 等比例混合，再取 100ul 的線形DNA 在 37℃下，培養 5 分鐘之後 再與混合後的phenol-chloroform 以等量混 合之後，再離心1 分鐘。取上清液，重覆 上一步驟3 次。將上清液 100ul 的 DNA 補 ddH2O 到 200ul。加入 20ul 的 Na acetate
( 3M,PH5.2)，500ul 的 100﹪EtOH，培養 在-20℃下，24 小時。取出後，在 4℃下， 以12,00rpm 離心 15 分鐘，倒掉上清液。 加入70﹪酒精 spin 幾次之後，在 8,000rpm 下離心5 分鐘，重覆上步驟。倒掉上清液， 讓白色沉澱物自然乾燥。再加入 20ul 的 ddH2O 將 DNA 溶解出來。 e. 轉 錄 (Transcription):DNA template (COXvb，IGF-І，IGF-R，18srRNA )，10× DIG RNA labeling buffer，10×transcription buffer，Rnase Inhibitor，T7 RNA polymerase 及DEPC H2O。在 37℃下，培養 5 小時。
之後，加入2ul 的 EDTA ( 0.2M,PH8.0 ) 以停止反應的繼續進行，再加入 2ul 的 DNAase І Rnase free，然後在 37℃下，培 養 15 分鐘。再加入 20ul 的 Na acetate ( 3M,PH5.2)，500ul 的 100﹪乙醇，在-70 ℃ 下 反 應 24 小時。取出後在 37℃下 incubate 5 分鐘，再以 12,000 rpm 離心 15 分鐘，倒掉上清液，以70﹪的酒精 wash 2 次，自然乾燥後，再加入 50ul 的 DEPC H2O，將 RNA 溶出，儲藏在-70℃中。 5、RNA 的萃取: 0.1g 的左心室組織蛋白，加入 1ml 的 Ultraspec RNA reagent ( BIOTECX,USA )
， 在 4 ℃ 下 以 均 質 ( KINEMATICA,SWITZERLAND )均質 5 分鐘再置換 eppendrof 之中，加入 0.2ml 的chloroform 上、下搖晃 15 秒鐘。使上層 的組織萃取液與下層的chloroform 均勻混 合。並放置在 4℃冰上 5 分鐘。於 12,000 rpm，離心 15 分鐘，取上層澄清透明液。 再加入等量的isopropanol 並靜置在 4℃冰 上，十分鐘。再於12,000rpm 4℃下，離心 十分鐘。倒掉上清液，便可以看到底部殘 留 的 白 色 沉 澱 物 。 加 入 75﹪的酒精， washing 沉澱物再以 12,000rpm 離心 4 分 鐘，倒掉上清液。重覆以上wash 的步驟。 將上清液倒掉之後，再將 eppendrof 倒放 等它晾乾。但不要過度乾燥。之後，再溶 解於50ul 的 DEPC H2O 中，於 60℃下， 靜置十分鐘，再測其 RNA 濃度。濃度的 測量乃取5ul 的 RNA 到 eppendrof 中，再
加入995ul 的 ddH2O 稀釋成 200 倍後，測
OD260吸光值。並以公式 OD260×40(ug/ml)
×稀釋倍數( 200 )，計算出 RNA 濃度。
6、RNA hybridization and detection：
將萃取出來的RNA sample 加入適量的 denature buffer (formamide,37﹪
formaldehyde
,10×MOPS) 稀釋到濃度為 80 ng/ul，並在 65 ℃下培養15 分鐘。取 3ul (240ng )稀釋過的 RNA sample 點到 nylon membrane (
boechringer mannheim,USA )上，以 pump sucking 5 分鐘之後再將 membrane 放入 80 ℃的 oven 之中培養 10 分鐘，將 nylon membran 反置，使 sample 面向光源再以 UV transilluminator ( VILBER,Lourmat ) cross linking 5 分鐘，讓 sample RNA 能夠完全固 定在membrane 上。將 membrane 放入塑膠 膜袋之中，加入 3 到 5ml prehybridization buffer [50﹪formamide ( sigma,USA )，5× SSC (3M NaCl, 0.3M sodium citrate,PH 7.0,sigma,USA ) ， 2 ﹪ blocking reagent ( sigma,USA) ， 0.1 ﹪ N-lavroyl sarcosine ( sigma,USA )，0.02﹪SDS ( sigma,USA )]到 塑膠膜袋之中，密封之後放入68℃的 oven 之中培養 70 分鐘之後。取出 membrane 放 入另一個塑膠膜袋之中，加入 hybridization buffer [ prehybridization+RNA probe ( IGF-І ( 800 ng/ml)/COX vb ( 800 ng/ml )/18sRNA ( 150 ng/ml )/IGF-1R ( 800 ng/ml ))密封之 後，在 68℃之中，反應 24 小時。取出 membrane 之後，以 2×Washing solution [ 2× SSC( 3M NaCl ,0.3M sodium citrate),0.1﹪ SDS] wash 7.5 分鐘，再以 0.5×Washing solution [ 0.5×SSC( 3M NaCl,0.3M sodium citrate),0.1﹪SDS ] 20 分鐘。之後，再以 0.1 ﹪ ×Washing solution [ 0.1 ﹪ × SSC ( 3M NaCl,0.3M sodium citrate),0.1﹪SDS] wash 20 分鐘，最後再以 rinse buffer [ buffer І( 0.1M Maelic acide,0.15M NaCl,PH
7.5)+0.3﹪Tween 20 ] wash 2 分鐘。wash 之 後再加入buffer Ц ( buffer І + blocking stock solution ) blocking 60 分鐘，使 membraner 上附上一層薄薄的blocking reagen，再加入 2ul Ab (anti-DIG Ab conjugated AP,Roch,USA ) ， 20ml buffer Ц ( buffer І+blocking stock solution)為 buffer，在室溫 中反應60 分鐘，以 rinse buffer ( buffer І+0.3 ﹪Tween 20) wash 20 分鐘，2 次，再加入 buffer Ш ( 0.1M Tris-HCl,0.1M NaCl,50mM MgCl2 ,PH 9.5 )反應 25 分鐘，以平衡 PH
值。將 membrane 取出後將 membrane 放入 密封袋之中
，加入 5ml 的 buffer Ш，50ul 的 CDP-star ( BOEHRINGER MANNHEIM )，密封
。反應5 分鐘。取出 membrane 進行晾乾之後， 以底片( BOEHRINGER MANNHEIM,USA )壓 片及以densitometer ( KODA.USA )相對密度測 量( relative density measurement)。
7、primer（引子）設計：
首 先 進 入 NCBI （ http ： //www.ncbi.nlm.nih.gov/）網站，並在網頁上 的 search 處選擇 Nucleotide；接著再 for 後 鍵入所要搜尋的 mRNA 之字串及屬性（例 如：BNIP3 mRNA and rat），接著按“go”， 然後盡量選擇句尾含“complete cds.”例 如 Rat Bcl2 E1B 19 kDa/ Bcl2 interacting protein-3 mRNA 的 mRNA 序列；將 mRNA 序列的起始至終止密碼複製。下一步進入 NTHU Bioinformatics Center 選 擇 “ link ” ， 接 著 進 入 “ The Biology WorkBench ” ， 點 選 “ Enter the Biology WorkBench 3.2”，輸入各人密碼；再點選 “ Nucleic Tools ” ， 接 著 選 擇 Add New Nucleic Sequence，貼在 NCBI 所複製的 mRNA 序列並輸入名稱及儲存，接著點選
primer 3 進行設計，輸入所需條件：產物長 度範圍（400-600 bp），primer（20-30 個鹼 基），黏合溫度（50-60℃），GC 含量（50-60 ﹪）；最後，將所設計的 5’及 3’primer 到 NCBI 中的 BLAST 進行比對確認，即可 將 primer 序列送出訂購。
8.Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reactio（RT-PCR）
Reverse Transcriptase Reaction： RT (reverse transcriptase)：取 4 ug 的 RNA 加入 DEPC-H2O 17.75 l，以 70℃處
理 5 分鐘。加入 0.25 ul RNase inhibitor （Promega；40 U/ul），10 ul 5X RT buffer (Promega；50 mM Tris-HC，75 mM KCl，3 mM MgCl2 和 10 mM DTT) 以 及 4 ul dNTP (Promega；2.5 mM)，和 5 ul Oligo dT 後，於 溫度循環機處理 42℃，5 分鐘後加入 RT 酵 素 (Promega) 1 μl，.繼續在 42℃反應，1 小時之後再以 99℃作用 5 分鐘後以 4℃保 存。 9. 聚 合 酵 素 連 鎖 反 應 （ Polymerase Chain Reaction）： 取 10 ul cDNA 加 入 39 ul DEPC-H2O，加入 5 ul forward primer 和 5 ul
reverse primer，再加入 5 ul dNTP (10 mM) 以及 5ul 10X PCR buffer (DyNa；10 mM Tris-HCl，1.5 mM MgCl2，50 mM KCl 和 0.1% Triton X-100)，和加入 1 l DNA polymerase (DyNa，2U/ul )於溫度循環機前 處理 94℃，5 分鐘後再進入第 1 個循環處 理 94℃ 1 分鐘，annealing 溫度 1 分鐘，並 於 72℃反應 2 分鐘，此循環次數 30 cycle， 最後再處理 72℃反應 20 分鐘，4℃保存. 加入 DNA marker 和取 10 µl 的 PCR 產物加入 2 µl 的 6 倍 loading dye，加到電 泳膠片。電壓 100 V，跑電泳膠片 30 分鐘， 於 UV 光下對照 DNA marker 位置，檢查所 要的位置是否有所表現。 四、研究結果: (1) 肝細胞增生相關分子訊息途徑: 在早期的三天肝再生中，觀察肝臟生 長因子HGF 與其下游之 HGFR、 FAK、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E、 E2F、Rb 的 mRNA 表現量(圖一)。由 結果中得知，在餵食中草藥丹參、丁 豎杇、高氏柴胡、黨參及保肝藥 (Silymarin)的肝臟再生中，其丹參、 高氏柴胡、黨參之 mRNA 的表現量 尚未有顯著的增加，而丁豎杇及保肝 藥(Silymarin)的 mRNA 的表現量卻已 有顯著的增加情形。而在部分肝切除 之後的七天再生肝中，肝臟生長因子 HGF 與 其 下 游 之 HGFR 、 FAK 、 Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E 的 mRNA 表現量(圖二)。由實驗結 果中得知，餵食中草藥丹參、丁豎 杇 、 高 氏 柴 胡 、 黨 參 及 保 肝 藥 (Silymarin) 的 mRNA 的表現量均在 部分肝切除之後的七天再生肝中，已 有顯著的增加趨勢。唯讀其丁豎杇及 保肝藥(Silymarin) 的 mRNA 表現量 具有較顯著的增加。經由 RNA 的表 現量中得知肝細胞增生的分子訊息 途徑，為了更準確的知道其 mRNA 確實有表現，並且能夠轉譯出具有功 能 的 蛋 白 ， 因 此 更 進 一 步 的 以 Weatern Blot 做偵測，偵測出其相關 的分子訊息途徑之蛋白質表現量。因 此以偵測肝臟生長因子 HGF 及其相 關之分子訊息途徑蛋白FAK 及 Rb 蛋 白質的表現量(圖三)，在早期的三天 肝再生中，丁
豎杇及保肝藥(Silymarin)的蛋白質表 現量與其他的中草藥丹參、高氏柴 胡、黨參的蛋白質表現量有較顯著的 增加情形。
圖(一)、增生因子 HGF 及其增生途徑 HGFR， FAK，yclin A，Cyclin B，Cyclin E， E2F，Rb 之 mRNA 的表現量。在早 期的三天肝臟再生中，餵食中草藥 丹參、丁豎杇、高氏柴胡、黨參、 Normal Saline 及 保 肝 藥 品 (Silymarin)。而以餵食中草藥丁豎杇 及保肝藥品(Silymarin)之 mRNA 的 表現量具有顯著的增加。 圖(二)、增生因子 HGF 及其增生途徑 HGFR，FAK，Cyclin A，Cyclin B ， Cyclin D ， Cyclin E 之 mRNA 的表現量。觀察在七天 的 肝 臟 再 生 中 ，Control 、 Sham、保肝藥品(Silymarin)及 餵食中草藥丹參、丁豎杇、高 氏柴胡、黨參等之 RNA 的變 化。而以餵食中草藥之丹參、 丁豎杇、高氏柴胡、黨參及保 肝藥品(Silymarin)之 mRNA 的 表現量均具有顯著的增加。 圖(三)、增生因子 HGF 及其增生途徑 FAK、Rb 之蛋白質的表現量。在早期的三天肝 臟再生中，餵食Saline 及中草藥丹參、 高氏柴胡、黨參、丁豎杇及Silymarin。 而以丁豎杇及保肝藥品(Silymarin)之 蛋白質表現量具有明顯的增加。 (2) 肝細胞存活增生途徑: 在早期的三天肝再生中，觀察細胞存 活增生途徑 IGF-I 及 Bcl 2 之 mRNA 的表現量(圖四)。由結果中得知，餵 食中草藥丹參、丁豎杇、高氏柴胡、 黨參、Saline 及保肝藥(Silymarin)的 mRNA 之表現量中。以丁豎杇及保 肝藥(Salymarin)的 mRNA 之表現量 具有明顯增加的趨勢。而再切除肝 臟之後的七天肝再生中，RNA 的表 現量在餵於中草藥高氏柴胡、黨參 HGF HGFR FAK Cyclin A Cyclin B Cyclin E Rb E2F GAPDH HGF HGFR FAK Cyclin A Cyclin B Cyclin D Cyclin E GAPDH HGF FAK Rb
α-tubulin
及保肝藥(Salymarin) )的 mRNA 之 表現量具有明顯增加的趨勢(圖 五)。為了更進一步的確定，此途徑 是否真的具有表現，因此以蛋白值 得表現量做更進一步的榷認。由(圖 六)結果中得知，IGF-IR 及其 Receptor IGF-IR 的蛋白質表現量， 在早期的三天肝再生中，以餵食中 草藥丁豎杇及保肝藥(Salymarin)的 蛋白質之表現量具有明顯增加。相 同的，在七天的肝再生之後，給於 中草藥丁豎杇及保肝藥(Salymarin) 的蛋白質之表現量具有顯著增加的 趨勢(圖七)。 圖(四)、細胞存活及增生途徑 IGF-I 及 Bcl 2 之 mRNA 的表現量。在早期的三天肝臟再 生中，餵食中草藥丹參、丁豎杇、高氏 柴胡、黨參、Normal Saline 及保肝藥品 (Silymarin)。而以餵食中草藥丁豎杇及 保肝藥品(Silymarin)之 mRNA的表現量 具有顯著的增加。 圖(五)、細胞存活及增生途徑 IGF-I 及 Bcl 2 之 mRNA 的表現量。觀察在七天的肝臟再 生中，Control、丹參、高氏柴胡、 黨參及保肝藥品(Silymarin)等之 RNA 的變化。而以餵食中草藥之高氏柴胡、 黨參及保肝藥品(Silymarin)之 mRNA 的 表現量均具有顯著的增加。 圖(六)、細胞存活及增生途徑 IGF-I 及 IGF-IR 之 蛋白質的表現量。在早期的三天肝臟 再生中，餵食Saline 及中草藥丹參、高 氏柴胡、黨參、丁豎杇及Silymarin。 而以丁豎杇及保肝藥品(Silymarin)之 蛋白質表現量具有明顯的增加。 圖(七)、細胞存活及增生途徑 IGF-IR 及 Bcl 之蛋白質的表現量。 在七天肝臟再生中，Control、 Sham 及餵食中草藥丹參、 高氏柴胡、黨參、丁豎杇及保 肝藥品(Silymarin)。而以丁 豎杇及保肝藥品(Silymarin)之 蛋 白 質 表 現 量 具 有 明 顯 的 增 加。 (3) 經由抗結痂因子(UPA)，觀察肝臟再 生: 由(圖八)的結果中觀察在早期的三天 肝再生中抗結痂因子(UPA)的 mRNA 表現量。由結果中得知，給予中草藥 丹參、丁豎杇、高氏柴胡、黨參及保 肝藥(Salymarin)之 mRNA 的表現量 中，以丁豎杇及保肝藥(Salymarin)的 mRNA 之表現量具有明顯增加的趨 IGF-I Bcl-2 GAPDH
IGF-1
Bcl 2
GAPDH IGF-I IGF-IR
α-tubulin IGF-IR Bcl 2
α-tubulin
勢。而將肝臟切除後的七天再生肝中， 由餵食中草藥丹參、高氏柴胡、黨參、 丁豎杇及保肝藥(Salymarin)中，其 中草藥高氏柴胡、黨參、丁豎杇及保 肝藥(Salymarin) 之 mRNA 的表現量 具有顯著增加的趨勢(圖九)。而由結 痂因子(PAI-I)的蛋白質表現量中，可 以 觀 察 得 知 ， 丁 豎 杇 及 保 肝 藥 (Salymarin) 之 PAI-1 的蛋白質表現 量，在早期三天肝再生中有顯著降低 的現象(圖十)。然而更進一步的觀察 七天肝再生中抗結痂因子 UPA 的蛋 白質表現量(圖十一)，在中草藥丹 參 、 高 氏 柴 胡 、 丁 豎 杇 及 保 肝 藥 (Salymarin)之蛋白質表現量，以丁豎 杇及保肝藥(Salymarin) 之蛋白質的 表現量具有顯著增加的趨勢。 圖(八)、抗結痂因子 UPA 之 mRNA 的表現 量。在早期的三天肝臟再生中，餵 食中草藥丹參、丁豎杇、高氏柴胡、 黨參、Normal Saline 及保肝藥品 (Silymarin)。而以餵食中草藥丁豎杇 及保肝藥品(Silymarin)之 mRNA 的 表現量具有顯著的增加。 圖(九)、抗結痂因子 FGF 2 之 mRNA 的表現 量 。 觀 察 在 七 天 的 肝 臟 再 生 中 ， Control、Sham 及餵食中草藥丹參、 高氏柴胡、黨參、丁豎杇及保肝藥 (Silymarin)等之 RNA 的變化。而以餵 食中草藥之高氏柴胡、黨參、丁豎杇 及保肝藥(Silymarin)之 mRNA 的表現 量均具有顯著的增加。 圖(十)、結痂因子 PAI-1 之蛋白質的表現量。 在早期的三天肝臟再生中，餵食 Saline 及中草藥丹參、高氏柴胡、黨 參、丁豎杇及Silymarin。而以丁豎 杇及保肝藥品(Silymarin)之結痂因 子PAI-1 的蛋白質的表現量具有明 顯降低的情形。 圖(十一)、抗結痂因子 UPA 之蛋白質的表現 量 。 在 七 天 肝 臟 再 生 中 ， Control、Sham 及餵食中草藥丹 參、高氏柴胡、黨參、丁豎杇及保肝藥 (Silymarin)。而以丁豎杇及保肝藥品 (Silymarin)之蛋白質表現量具有明顯的增 加。 (4)透過早期 Proliferative 指標: 在早期的增值 proliferative 過程中，藉由早期 的 proliferative 指標，觀察早期三天再生肝 中α-SMA 的蛋白質表現量(圖十二)。而在給 予中草藥丹參、丁豎杇、高氏柴胡、黨參、 Normal Saline 及保肝藥(Salymarin)中，以丁 豎杇及保肝藥(Salymarin)之 mRNA 表現量具 有明顯增加的趨勢。而在七天肝再生中， Control、Sham 及給予中草藥丹參、高氏柴 胡、黨參、丁豎杇及保肝藥(Salymarin) 之 mRNA 表現量具有明顯增加(圖十三)。 UPA GAPDH FGF 2
GAPDH PAI-1 α-tubulin UPA
α-tubulin
α-SMA GAPDH
圖(十二)、早期 Proliferative 指標α-SMA 之 mRNA 的表現量。在早期的三天肝 臟再生中，餵食中草藥丹參、丁豎 杇、高氏柴胡、黨參、Normal Saline 及保肝藥品(Silymarin)。而以餵食中 草藥丁豎杇及保肝藥品(Silymarin) 之 mRNA 的表現量具有顯著的增 加。 圖(十三)、早期Proliferative 指標α-SMA 之 mRNA 的表現量。觀察在七 天的肝臟再生中，Control、Sham 及餵食中草藥丹參、高氏柴胡、 黨 參 、 丁 豎 杇 及 保 肝 藥 品 (Silymarin)等之 RNA 的變化。 而以餵食中草藥丹參、高氏柴胡 、黨參、丁豎杇及保肝藥品 (Silymarin)之 mRNA 的表現量均 具有顯著的增加。 (5) 促 結 痂 因 子 TGF β 及 纖 維 指 標 procollagen: 將部份肝切除七天後，觀察其是否因長期的肝 臟再生中，以有結痂或纖維化的現象。因此， 在七天的肝臟再生中，Control、Sham、保肝 藥(Salymarin)及中草藥丹參、丁豎杇、高氏柴 胡及黨參。其中以丁豎杇及保肝藥(Salymarin) 之mRNA 表現量具有明顯降低(圖十四)。 圖(十四)、促結痂因子 TGFβ1 及纖維化 指標procollagen 之 mRNA 的表現量。在七天的肝臟再生 中，Control、Sham、保肝藥品 (Silymarin) 及 餵 食 中 草 藥 丹 參、丁豎杇、高氏柴胡、黨參。 而餵食中草藥之丁豎杇及保 肝藥(Silymarin)之 mRNA 的表 現量具有顯著的降低。 五、討論; 1. 在肝臟再生的初期三天，從肝細胞增 生的相關途徑及細胞生存增生途徑中，可 發現大多的中草藥丹參、高氏柴胡、黨參， 尚未有顯著的促進肝臟再生的功能。唯獨 丁豎杇已有明顯的促進肝臟再生的功能。 然而在肝臟長期的七天再生作用中，其他 中草藥丹參、高氏柴胡、黨參均已有明顯 增加的趨勢。而丁豎杇在肝細胞增生的相 關途徑及細胞生存增生途徑中，仍有顯著 的增加。由此，可知丁豎杇確實可促進肝 臟的再生。 2. 再增生過程中有可能因中草藥的藥性 不同，而造成肝臟結痂及纖維化的現象。 因此再觀察肝臟再生過程中其抗結痂途徑 及結痂指標因子的作用情形。從 FGF-2R 及UPA 的 RNA 及蛋白質表現量中可明顯 指出，丁豎杇在三天及七天的肝再生中具 有抗結痂及proliferation 的作用。然而，再 長期七天的肝再生作用中，是否造成肝的 纖 維 化 ？ 須 從 纖 維 化 指 標 TGF β 及 procollagen 之 RNA 及蛋白質表現量中得知， 由結 果中得知，在七天的中草藥作用中，丁豎 杇尚不會造成肝臟的纖維化。因此，足以 證明丁豎杇能夠促進肝臟的再生功能。 六、參考文獻:
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