探討三環藥物Teroxirone及吲哚基喹嚀藥物抑制人類非小細胞肺癌類幹細胞增生的機制

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 探討三環藥物 Teroxirone 及吲哚基喹嚀藥物抑制人類非小細胞肺癌類幹細胞增生的機制 Mechanisms of Teroxirone and Indolylquinoline Compound That Impair Growth in Cancer Stem-Like Cells of Human Non-Small-Cell-Lung-Cancer. 研究生：倪玉玲 Yu-Lin Ni. 指導教授：方剛博士 Kang Fang. 中華民國 105 年 8 月.

(2) 目錄. 壹、中文摘要 ........................................................................................ 2. 貳、英文摘要 ........................................................................................ 4. 參、文獻回顧 ........................................................................................ 6. 肆、研究目標 ...................................................................................... 16. 伍、材料與方法 .................................................................................. 18. 陸、結果............................................................................................... 31. 柒、討論............................................................................................... 40. 捌、參考文獻 ...................................................................................... 48. 玖、圖................................................................................................... 58. 壹拾、附表................................................................................................97. 1.

(3) 壹、中文摘要先前研究結果顯示三環衍生物 teroxirone (1, 3, 5-triazine-2, 4, 6 (1H, 3H, 5H)-tri-one-1, 3, 5-tri-(oxiranylmethyl))及吲哚基喹嚀藥物 EMMQ (3-((7-ethyl-1H-indol-3-yl)-methyl)-2-methylquinoline)具有抑制人類非小細胞肺癌生長的效果，雖然它的反應機制是透過細胞凋亡，然而卻因為殘存的癌幹細胞阻礙了藥物的完整活性。所以本論文的主要目的是想透過肺癌類幹細胞的培養模式探討 teroxirone 及 EMMQ 是否能夠根除潛在的肺癌幹細胞。首先須建立無血清以及低貼附性的特殊環境培養出肺癌類幹細胞球再進行後續的實驗。利用 BrdU 螢光染色和 soft agar assay 發現 teroxirone 與 EMMQ 可以抑制球狀細胞的生長、數量以及形成群落的能力。而以內差法計算 soft agar assay 的結果顯示，肺癌類幹細胞球所需的 IC50 遠高於貼附性細胞先前於 MTT assay 結果中所需的 IC50，證明肺癌類幹細胞球確實具有較高的抗藥性。次以反轉錄聚合酶連鎖反應、西方墨點法及免疫螢光染色法證實 teroxirone 和 EMMQ 抑制肺癌類幹細胞的自我更新能力相關的幹細胞標誌基因，例如 Nanog 和 ALDH1A1 等。此外，TUNEL assay 和西方墨點法的結果也顯示，teroxirone 及 EMMQ 會誘發球狀細胞產生凋亡，最後以裸鼠皮下注射之腫瘤異種移植模式探討 EMMQ 之治療效果。根據論文的結論，teroxirone 與 EMMQ 2.

(4) 除了可以抑制貼附性肺癌細胞生長，若能適當地提高濃度也可以藉由細胞凋亡清除肺癌幹細胞。. 關鍵字：肺癌、癌類幹細胞、 teroxirone、EMMQ、細胞凋亡. 3.

(5) 貳、英文摘要 We showed before that teroxirone and EMMQ inhibited the growth of human non-small-cell-lung-cancer cells (NSCLC) and the effects doseand time-dependent. The apoptotic cell death accounted for cell death. However, the residual drug resistance hampers complete drug activity because of residual stem cells. Cancer stem cells (CSCs) are resistant to chemotherapy treatments, and accentuate disease progression despite therapeutic intervention. The work is aimed to override the drug resistance of teroxirone and EMMQ by targeting their corresponding CSC cells as enriched from the parental cells. To know if the chemical drugs can potentially eradicate lung CSC cells, we have established the spheroids of human NSCLC cells under serum-free condition. Experiments with fluorescence microscopy and soft-agar assay showed that the colony sizes and numbers of spheroids were suppressed after treatment with higher teroxirone and EMMQ concentrations. The formation of spheres, the expression of self-renewal related genes, such as, Nanog and ALDH1A1 stemness markers, were repressed as confirmed by RT-PCR, western blot analysis and immunofluorescence staining. The results proved that the chemical drugs affected the self-renewal ability of the spheroid cells. Furthermore, we demonstrated that higher concentrations of teroxirone and EMMQ caused apoptotic cell death of spheres as confirmed by western blot and TUNEL assay. At last, EMMQ suppressed the growth of H460 spheroid cells in xenograft tumors by exhibiting apoptosis characteristics. As a potential therapeutic agent by restraining cell growth through apoptotic death in spheroids, teroxirone 4.

(6) and EMMQ promised an addition to the current list in complete eradication of human lung cancer.. Keywords: lung cancer, cancer stem-like cells, teroxirone, EMMQ, apoptosis. 5.

(7) 參、文獻回顧一、肺癌 (Lung cancer) 從 1989 至 2014 年的統計結果可知，因癌症而死亡的人數一直位居台灣國人死亡原因之首，而其中又以肺癌為首。肺癌常見的症狀有咳嗽、氣喘、咳血、胸悶等，而引起的主要危險因素是吸煙 [1]。但是也有發現部分的肺癌是發生於非吸煙患者，其引起的相關原因多如繁星，包括長期暴露於二手煙、廚房油煙、空氣汙染等環境之中、接觸致癌物質、飲食習慣與呼吸系統疾病等[2,3]。肺癌分為兩種類型，一為小細胞肺癌 (small cell lung cancer, SCLC)，另一為非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC)，其中以非小細胞肺癌占所有肺癌約 85% [4]。非小細胞肺癌又可細分成鱗狀上皮細胞癌 (squamous cells carcinoma)、腺癌 (adenocarcinoma)以及大細胞 (未分化)癌 (large cells carcinoma)三種亞型[5]。依照肺腫瘤之大小和侵犯的程度可以將肺癌分為一至四期。若在第一期時能及早被發現，外科手術便能達到有效的治療，但也因為早期的肺癌沒有明顯的症狀，故容易耽誤到治療的時機。當病情進入第二期或第三期時則會結合高劑量化學藥物和放射線治療，但是這些治療經常伴隨著副作用的發生，甚至是產生抗藥性、腫瘤的轉移及復發。由於癌幹細胞被認為是造成以上預後不佳的一項主要原因[6]，因此本論文希 6.

(8) 望藉由篩選出具有抑制非小細胞肺癌之癌症幹細胞的藥物來加以達到肺癌的根治。. 二、癌症幹細胞 (cancer stem cells) 癌症幹細胞的特性主要包含了自我更新 (self-renewal)以及具有分化 (differentiation)之能力，且能夠表現一些特殊的標記分子 (cancer stem cell markers) [6]。雖然在腫瘤裡癌症幹細胞僅佔據了一小部分，但只要沒有辦法清除所有的癌症幹細胞，就有可能因為其穿膜運轉蛋白的作用而產生抗藥性或者是因為癌幹細胞持續分裂而復發。人體中具有少量的幹細胞，而這些幹細胞的生長和分化透過相關基因的調控，若是因為外來的刺激，例如紫外線的照射和化學物質的接觸，DNA 遭受到無法修復的損傷而使調控失衡，便有可能使幹細胞轉變成癌症幹細胞[7,8]。目前傳統治療癌症的方法，手術治療、化學藥物和放射線治療等對於癌症幹細胞的效果不佳[9]，因此本實驗欲以無血清以及低貼附性的特殊環境培養出具有高癌症幹細胞特性的球狀細胞當作篩選基礎[10]，以此篩選出具有抑制非小細胞肺癌之癌幹細胞的藥物。 1. 自我更新 (self-renewal) 自我更新為一種不對稱的細胞分裂，幹細胞經由分裂後的其中 7.

(9) 一個子細胞會與原先的母細胞具有相同的分化能力，而另一個則會分化為具有功能的體細胞[11]。自我更新的訊息傳遞路徑 (selfrenewal pathways, SRPs)，包括了 Hedgehog, Wnt 和 Notch 等，若是這些訊息傳遞產生缺陷，則會不恰當的過度活化自我更新的程序而影響癌幹細胞的分化，進而導致腫瘤的產生[12]。 2. 抗藥性 (drug resistance) 根據文獻指出癌幹細胞對於抗癌藥物具有抗藥性，而它的發生主要和穿膜運轉蛋白有關，例如 ATP binding cassette (ABC)，化學藥物容易透過此蛋白而被排出細胞外，因此無法達到好的療效[13]。另外也有研究指出在癌症幹細胞中，ABCB1, ABCG2 等比起一般癌細胞會過度表現，其中特別的是 ABCG2 除了會使藥物被排出細胞外，也會排出 DNA 標記分子 Hoechst 33342，能夠作為抗藥性的重要指標[14]。 3. 侵入與轉移 (invasion and metastasis) 惡性腫瘤所導致的死亡絕大部分都是因為腫瘤出現侵入與轉移所造成的嚴重惡化。根據文獻報導，癌症幹細胞能夠透過相關蛋白 VEGF 的上調來促進癌細胞的侵入與轉移，進而影響患者的存活率 [15]。. 8.

(10) 4. 癌症幹細胞標記分子 (cancer stem cell markers) 研究指出在癌症患者經由化療後所殘存的腫瘤內，某些特定的標記分子，例如 ALDH1A1、CD44、Nanog、EpCAM 等表現量很高，而且這些標記分子的表現會參與各種不同的調控，造成患者更容易產生腫瘤的復發、轉移及造成患者有較差的臨床表現，例如身體各處疼痛、呼吸困難和發炎的情形加重等[16,17]。 4-1. ALDH1A1 (aldehyde dehydrogenase 1 family member A1) ALDH1A1 屬於乙醛脫氫酶家族的成員之一，於酒精代謝的途徑中，接在乙醇脫氫酶 (alcohol dehydrogenase)作用後的下一個酵素。在癌幹細胞中主要參與調控自我更新、分化和自我保護 (selfprotection) [18,19]。 4-2. Nanog Nanog 在未分化的胚胎幹細胞中扮演影響自我更新能力的重要轉錄因子，其表現則能夠影響癌細胞增生的能力、化療的敏感性和 epithelial-mesenchymal transition (EMT)的逆轉等[20]。 4-3. CD44 CD44 為細胞表面跨膜醣蛋白，參與了細胞和細胞間的相互作用、細胞黏附和細胞遷移。主要和腫瘤起始能力，抗藥性以及腫瘤的轉移與侵入等有關[21,22]。. 9.

(11) 三、. 針對癌症幹細胞療法之研究. 由於一般的傳統療法，例如化學療法、放射療法和手術切除等主要是針對癌細胞，所以仍然有殘存的癌症幹細胞發展成腫瘤的可能性，也因此有越來越多的研究開始探討針對癌症幹細胞的療法。其中又能將治療的方向分成誘導癌幹細胞發生細胞凋亡、促進癌幹細胞的分化與標靶癌幹細胞訊息傳遞路徑、抗藥性、轉移甚至癌幹細胞標記分子等相關機轉來治療癌幹細胞[23]。舉例來說， Cryptotanshinone (CT)化合物能夠透過下調攝護腺腫瘤起始細胞(也就是所謂的癌幹細胞)中癌幹細胞標記分子 (Nanog, OCT4, SOX2 等)的表現來達到抑制癌細胞生長與轉移良好的效果[24]。. 四、. 肺癌類幹細胞球之培養. 根據文獻結果顯示，將癌細胞以不含血清但含有特定生長因子，例如鹼性成纖維細胞生長因子 (bFGF)、表皮生長因子 (EGF)與 B-27 等所混合而成的 DMEM/F12 培養液培養在低貼附的培養盤中，會形成懸浮狀的球體 (sphere formation)，而經由檢測後發現這些球體細胞中含有豐富的癌幹細胞，目前推測這種特殊的培養方式能夠使癌幹細胞維持在未分化的狀態下不斷的進行自我更新而形成球體，並將其稱呼為癌類幹細胞球 (cancer stem-like cells) [25,26,53]。目前也有許多肺癌相關研究開始嘗試肺癌類幹細胞球的 10.

(12) 培養，並且希望透過此實驗方法進一步的探討出能夠針對肺癌幹細胞之療法，例如 Hedgehog 訊息傳遞路徑為癌症幹細胞中重要的自我更新能力的訊息傳遞路徑，而 Gli1 為 Hedgehog 訊息傳遞路徑中一個關鍵的轉錄因子。作者透過肺癌類幹細胞球之培養及後續的實驗，證明 arsenic trioxide (As2O3)作為 Gli1 的抑制劑，能夠達到抑制肺癌類幹細胞之效果[27]。. 11.

(13) 五、 Teroxirone (α-1,3,5-triglycidyl-s-triazinetrione)相關文獻 Teroxirone 是一種分子量為 297 的三環氧化物抗癌藥劑，結構如下圖所示[28]。其作用機制是能夠作為烷化劑 (alkylating reagent)，以烷基去取代 DNA 上的氫原子，導致 DNA 無法正常複製[29,30]。研究曾指出 teroxirone 能夠有效抑制不同類型的癌症，例如血癌以及淋巴癌[31]，且對於以抗癌藥物 cyclophosphamide 治療具有抗性的 p388 和 L1210 血癌細胞株同樣能達到抑制的效果[32]。在過去的研究中發現 teroxirone 能夠透過 p53 腫瘤抑制基因 (tumor suppressor gene)調控 DNA damage 所造成的細胞凋亡 (apoptosis)而達到抑制非小細胞肺癌的生長[28]，本實驗將進一步探討 teroxirone 對於非小細胞肺癌類幹細胞的影響與相關反應機制。. 12.

(14) 六、 EMMQ (3-((7-ethyl-1H-indol-3-yl)-methyl)-2-methylquinoline) 相關文獻 EMMQ 為分子量僅 298 的吲哚基喹嚀 (indolylquinoline)衍生物，其結構同時包含了 indole 及 quinoline 兩種官能基，如下圖所示 [33]。目前此類衍生物多用於利什曼原蟲症 (Leishmaniasis)的治療，其機制尚未明瞭[34]。根據文獻報導，indole 的化合物 indole-3carbinol 能夠抑制乳癌細胞上皮細胞生長因子受體 (epidermal growth factor receptor, EGFR)的表現，並且誘導細胞走向粒腺體相關的內源性凋亡途徑 (intrinsic apoptosis pathway) [35]。抗癌藥物長春花鹼 (vinblastine)的結構中也包含了 indole 官能基[36]。而 quinoline 的衍生物喜樹鹼 (camptothecin)是一種細胞毒性喹啉類生物鹼，能夠透過抑制 DNA topoisomerase I 造成細胞凋亡，目前其類似物 topotecan, irinotecan 已被核准使用在癌症治療上[36-38]。因此含有這兩種官能基的 indolylquinoline 衍生物就可能具有抗癌的效果，在過去的研究中也已經證實 EMMQ 同樣能夠透過 p53 腫瘤抑制基因所調控的 DNA damage 造成細胞凋亡進而抑制非小細胞肺癌的生長[33]，本實驗也將進一步探討 EMMQ 對於非小細胞肺癌類幹細胞的影響與相關反應機制。. 13.

(15) 七、 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑 (PI3K/Akt signalling pathway) PI3K/Akt 訊息傳遞路徑在人類的癌症中扮演重要的角色，透過調控 Akt 的活性能夠促進癌細胞的存活以及增生，並且影響細胞大小、組織侵襲和血管新生等[39]。同時也有研究指出 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑的活化在腫瘤抗藥性的表現中扮演了重要的角色[40]。舉例來說，Akt 的活性能夠影響抗癌藥物 Temozolomide (TMZ)對於 glioma stem-like cells 的敏感度，當 Akt 越是被活化，glioma stemlike cells 對於 TMZ 的抗藥性就越是高。而相對的，亦有許多研究結果顯示，當 glioma stem-like cells 受到 Akt 的抑制劑影響而下調 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑的活性時，便可以增進 TMZ 的細胞毒性 [41]。因此在本研究中欲探討藥物抑制非小細胞肺癌類幹細胞 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑的效果。. 八、 p53 依賴型的細胞凋亡路徑 (p53-dependent apoptosis pathways) 當細胞 DNA 受到損傷時，TP53 基因所表達的 p53 蛋白能活化 DNA 修復蛋白 (DNA repair proteins)，進行 DNA 的修補。同時會促進下游的 p21 與 CDK2 形成複合體，然後使細胞週期停滯，當損傷的 DNA 修復後細胞週期才得以持續進行。但當細胞週期中受損的 DNA 無法被修補的情況下，p53 則會誘發細胞程序性死亡 14.

(16) (programmed cell death, PCD)，是為了避免擁有不正常遺傳資訊的細胞繼續分裂生長後造成更大的危害[42,43]。而在先前的研究結果中顯示 teroxirone 與 EMMQ 是透過對於 DNA 造成損傷，再引發 p53 依賴型的細胞凋亡路徑達到抑制非小細胞肺癌的生長效果[28,33]。因此本研究欲透過此路徑下游的 caspase-3 以及 Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)進一步探討藥物對於非小細胞肺癌類幹細胞是否能達到同樣的效果。當細胞被誘發細胞凋亡時，pro-caspase-3 (32 kda)會被切成 cleaved caspase-3 (17 kda)，而下游 PARP 被作用後，會由原本的 116 Kda (precursor form)被切成 89 Kda (cleaved PARP)的片段，失去其 DNA 修補的能力，使得細胞凋亡反應得以持續進行 [44]。. 15.

(17) 肆、研究目標一、. 利用癌症幹細胞標記分子鑑定肺癌類幹細胞之幹細胞特性. 本實驗欲以無血清以及低貼附性的特殊環境培養出具有癌症幹細胞特性的懸浮球狀細胞，因此須先透過癌症幹細胞標記分子 ALDH1A1、CD44 等確定其是否為具癌症幹細胞特性之癌類幹細胞後才得以進行後續實驗。. 二、. 探討 teroxirone 抑制非小細胞肺癌之癌類幹細胞生長效果. 先前研究初步指出 teroxirone 可抑制非小細胞肺癌類幹細胞之生長[54,55]，但結果尚未周全，而本實驗將透過觀察細胞群落數量的變化，BrdU 細胞增生試驗、西方墨點法和 RT-PCR 等實驗來驗證先前之結果並且進一步探討藥物對於肺癌類幹細胞之抑制能力。. 三、. 鑑定 EMMQ 抑制非小細胞肺癌之癌類幹細胞生長效果. 在過去的研究中已證實 EMMQ 能夠抑制非小細胞肺癌的生長，但未曾探討 EMMQ 對於非小細胞肺癌類幹細胞之影響，因此本實驗想透過先前所建立的癌類幹細胞對藥物的特殊篩選平台[55]及動物實驗探討其影響與相關反應機制。. 16.

(18) 四、. 利用 p53 shRNA knock down 試驗鑑定 EMMQ 藥物機轉. 過去文獻中藉由轉殖突變及野生型 p53 至該基因缺失非小細肺癌細胞株 H1299 證實 EMMQ 是透過 p53 腫瘤抑制基因所調控的 DNA damage 造成細胞凋亡，進而抑制非小細胞肺癌的生長[33]。故本研究欲利用做過 p53 shRNA knock down 處理以及未處理的非小細胞肺癌，經特殊培養養成肺癌類幹細胞球後，接著再以細胞群落試驗 (soft agar colony formation assay)比較兩者對於 EMMQ 的藥物敏感程度，藉此鑑定 EMMQ 於肺癌類幹細胞中的藥物機轉。. 17.

(19) 伍、材料與方法一、細胞株人類非小細胞肺癌 1. H1299: 大細胞(未分化)癌 (large cells carcinoma); p53 null 2. A549: 腺癌 (adenocarcinoma); wild-type p53 3. H460: 大細胞(未分化)癌 (large cells carcinoma); wild-type p53 人類正常肺組織細胞 4. MRC-5: 纖維母細胞 (fibroblast); wild-type p53 以上細胞源自 ATCC (American Type Culture Collection). 二、細胞培養 (cell culture) 以 10% (v/v)胎牛血清的 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (Caisson, Utah, USA)將肺癌細胞培養於恆定條件 5% CO2 與 37℃的培養箱中。當細胞擴張至培養皿約八分滿時進行繼代，先將舊培養液移除並以 PBS (UniRegion Bio-Tech, Taiwan)清洗，洗淨後加入 trypsin-EDTA (Gibco, CA, USA)於 37℃作用約 5 分鐘，再以含有血清之培養液終止 trypsin-EDTA 的作用並同時將細胞沖洗下來，接著取適量的細胞液放置於新的培養皿，同樣加入含有血清之培養液繼續培養。(另外 MRC-5 細胞所需的培養液為 10% FBS EMEM 18.

(20) (Eagle's Minimum Essential Medium) (ATCC, Manassas, VA)). 三、細胞計數利用 PBS 清洗細胞後以 trypsin-EDTA 作用，接著將用培養液所沖洗下來的細胞液收集至 15 mL 離心管中，進行 800 rpm 離心 5 分鐘後移除上清液，再以 1 mL 培養液將沉澱的細胞沖散混勻，取出 10 µL 以 trypan blue (BioWest, Miami, Fla, USA)進行 1:1 的稀釋和染色，最後以血球計數盤計數。. 四、癌類幹細胞球形成試驗 (tumor sphere formation assays) 將 0.5% poly (2-hydroxyethylmethcrylate) (Sigma, St. Louis, MO) 塗抹於細胞培養皿底部使癌細胞不易進行貼附，接著置入所需的細胞數，再加入特殊的癌類幹細胞培養液，其中包含 DMEM/F12 (Caisson, Utah, USA)、20 ng/mL EGF (Life, USA)、10 ng/mL FGF (Life, USA)與 1% B-27 (Gibco, CA, USA)，放置於 5% CO2 和 37℃的培養箱中培養 7 至 12 天後再以培養好的癌類幹細胞球進行後續實驗[45]。. 19.

(21) 五、藥物配製將 teroxirone 和 EMMQ 粉末分別溶解於 DMSO 中，配製的濃度為 10 mM。分裝液保存於-20℃冰箱中，待實驗時使用。. 六、細胞全蛋白質萃取 (protein extract) 首先培養 H460、A549 和 H1299 肺癌類幹細胞球約七天後，進行加藥處理，透過自然沉澱或是低速離心(800 g 離心 5 分鐘)的方式使細胞沉澱並移除含有藥物的上清液，用 PBS 清洗兩次並且完整移除液體，加入適量的 RIPA buffer 【20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA (Sigma, St. Louis, MO), 1% sodium deoxycholate (Sigma, St. Louis, MO), 2.5 mM sodium pyrophosphate (Sigma, St. Louis, MO), 1 mM Na3VO4 (Sigma, St. Louis, MO), 1 μg/mL leupeptin (Sigma, St. Louis, MO)】完全覆蓋並打散混勻後放入 4℃冰箱中搖晃作用，待作用完全後將含有細胞與蛋白的 RIPA buffer 取入微量離心管中，4℃ 且 3,000 rpm 離心 30 分鐘，將上清液取至另一個新的微量離心管，保存於-20℃冰箱，待後續的蛋白質定量。. 七、蛋白質定量 (Bradford protein assay) 利用 Bradford 蛋白質定量法之原理，於 96-well plate 各格中加入 295 μL Coomassie Blue (Bio-Rad protein assay, Coomassie® Brilliant 20.

(22) Blue G-250 dye 1:4 ddH2O 稀釋)。接著將已知濃度的標準定量品-蛋白質牛血清蛋白 BSA (bovine serum albumin; 2,000 μg/mL) (Albumin Standard, Thermo #23209)，以 PBS 稀釋配製為 1000、500、250、 125 與 62.5 μg/mL 之濃度。將不同濃度之 BSA 取 4 μL 加入 96-well plate，而實驗蛋白質樣品取 1 μL 加入，混合均勻後以連續性波長酵素免疫分析儀測量 OD595 nm 的吸光值，以標準定量品的吸光值製作出標準曲線，再將蛋白質樣品所測之吸光值帶入並換算出濃度進行後續實驗。. 八、西方墨點法 (western blot) 1. 鑄膠: 以膠體製備裝置配製 12％的分離膠 (separating gel)並使用異丙醇 (Sigma, St. Louis, MO)壓制分離膠的表層使其平整並隔絕空氣氧化，待分離膠凝固後，將上層的異丙醇以 ddH2O 沖洗乾淨，接著配製 5％的聚集膠 (stacking gel)，並插入齒梳，膠體完全凝固後，將移除齒梳的膠體與玻璃一同裝於中型直立式電泳槽並且加入 running buffer。 2. 跑膠: 取 20 μg 蛋白樣品與 3× sample buffer 【350 mM TrisHCl (pH 6.8), 12% SDS, 0.02% bromophenol blue, 35% glycerol, 30% 2mercaptoethanol (MDBio, Inc., Taiwan)】一同放入微量離心管中混和均勻，以乾浴槽 95℃加熱 5 分鐘，之後將蛋白質分子量標記蛋白 21.

(23) (prestained molecular weight markers, Infinigen EZColor II TM, IN1125) 與加熱完之樣品逐一置入分離膠中的 well 裡，以電流方向為負到正進行電泳，聚集膠層以 60V 的電壓進行，分離膠層以 120V 的電壓進行。 3. 轉印: 準備四張濾紙，以及與膠體大小相似的聚硝化纖維膜 (nitrocellulose membrane, Pall Corporation, USA)，取出 SDS-PAGE 以聚硝化纖維膜覆蓋，外邊兩側再依序以濾紙、海綿覆蓋，放於轉印板夾內夾緊(黑為負極、白為正極，轉印方向為黑向白，故膠體的蛋白質面面向白面)，裝入轉印槽並裝填 blotting buffer 以 80V 的固定電壓轉印 80 分鐘。 4. 抗體反應: 轉印完後，使用 PBS-T(含 0.05% Tween-20 的 PBS)搖晃清洗已轉印之聚硝化纖維膜 5 分鐘(若有磷酸化則使用 TBS-T)，以 5%的 blocking buffer (5% skim milk (BD, Mansfield, MA) 的 PBS-T)浸泡於 4℃輕搖至隔天，接著利用 PBS-T 搖晃清洗 3 次，每次 10 分鐘，加入適當稀釋倍率的一級抗體，放入 4℃冰箱反應 2 天，以 PBS-T 搖晃清洗 3 次，每次 10 分鐘，接著加入以 1: 1,000 比例稀釋之二級抗體 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)，放入 4℃冰箱反應 1 天，再以 PBS-T 搖晃清洗 3 次，每次 10 分鐘，最後加入 ImmobilonTM western chemiluminescent HRP substrate 22.

(24) (GeneTex, Inc., Taiwan) (luminal reagent : peroxide solution = 1 : 1)，均勻覆蓋在膜上，於冷光儀 (LAS3000/LAS4000, Fuji Film, Taiwan)中呈像。 5. 定量: 量化結果所使用的軟體為 Multi Gauge (FUJIFILM, Inc., Taiwan)以 loading control GAPDH 之 DMSO 組別為 1.0 算出加藥組別之 loading control 的相對值，接著將欲求之蛋白表現個別除以 loading control 的值後以 DMSO 組別為 1 再與其他加藥組別做相對比較。. 九、細胞 RNA 萃取 (RNA extract) 首先培養 H460、A549 和 H1299 肺癌類幹細胞球約七天後，進行加藥處理，接著移除含有藥物之培養液，以 PBS 清洗 2 次，加入 1 mL TriPure Isolation Reagent (Roche, inc., Taiwan)將細胞沖洗並收集於微量離心管中，加入 200 μL 的氯仿(Sigma, St. Louis, MO)混合均勻，以 4℃、12,000 g 離心 15 分鐘，取上清液 500 μL 至新的微量離心管，並且加入 500 μL 的異丙醇混和均勻，在 4℃中以 12,000 g 離心 10 分鐘後，移除上清液，加入以 DEPC-ddH2O (Amresca, USA)所製備的 70%酒精 (Sigma, St. Louis, MO)，4℃中 12,000 g 離心 5 分鐘，移除上清液，放置無菌操作台內透過層流加速乾燥後，加入 10 23.

(25) 至 40 μL 的 DEPC-ddH2O 回溶，最後 65℃乾浴 15 分鐘，放至-80℃ 冰箱保存。. 十、反轉錄-聚合酶連鎖反應 (reverse transcription-PCR, RT-PCR) 取 1 μg 的 RNA，利用 RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo, USA)反轉錄為 cDNA，於 4℃冰箱保存。接著取 1 μL 的 cDNA 進行 PCR，加入 1 μL 5 μM forward primer (Genomics, Inc., Taiwan)、1 μL 5 μM reverse primer、2 μL 2.5 mM dNTP (Biomi, Inc., Taiwan)、2 μL 10× PCR buffer (Biomi, Inc., Taiwan) 和 0.5 μL Tag (Biomi, Inc., Taiwan)，最後以 ddH2O 補體積至 20 μL 後混勻，放入 PCR 儀器 (Applied Biosystems, USA)依序以 94℃作用 5 分鐘，94℃作用 30 秒、55℃作用 30 秒、72℃作用 1.5 分鐘進行 30 個循環，最後以 72℃作用 7 分鐘，保存於 4℃。取 10 μL PCR 後的產物進行 DNA 電泳 (1.5% agarose, Biomi, Taiwan)，利用 ethidium bromide (EtBr) (Biomi, Inc., Taiwan)染色使 DNA 發出螢光，並於 UV 照膠系統中呈像，以軟體 Multi Gauge 做量化。. 十一、細胞群落試驗 (soft agar colony formation assay) 1. 下層膠: 配製 2% agar (Amresco, USA)後滅菌處理，以 10% FBS 的 DMEM 與 2% agar 以 3:1 之比例混合(agar 最終濃度為 24.

(26) 0.5%)，取 0.75 mL 放入每格 12-well plate 中，待其凝固。 2. 上層膠: 將培養約 7 天後的 H460、A549 和 H1299 肺癌類幹細胞球進行加藥處理，將細胞液收集至 1.5 mL 微量離心管中待細胞自然沉澱(或是 4℃中 800 g 離心 5 分鐘)，移除上清液，加入 10% FBS 的 DMEM 與滅菌處理後的 1.4% agarose 以 3:1 之比例混勻 (agarose 最終濃度為 0.35%)，取 0.7 mL 放入每格 12-well plate，待其凝固，接著加入 10% FBS 的 DMEM 給予細胞養分與保持膠的濕潤以免乾裂。培養於 5% CO2 與 37℃之環境約 30 天，最後以 0.002%的 crystal violet (Sigma, St. Louis, MO)於 4℃染色 overnight，觀察以及紀錄細胞群落數目和大小。. 十二、 BrdU 細胞增生試驗 (bromodeoxyuridine, BrdU cell proliferation assay) 當細胞增生合成 DNA 時，需要 thymidine (dT)的參與，而 BrdU 做為 dT 的類似物，能夠像 dT 一樣滲入新合成的 DNA 當中，再以免疫螢光染色原理使 BrdU 接上帶有螢光的抗體，偵測其螢光表現，作為觀察細胞增生的實驗方法。將培養好的 H460、A549 和 H1299 肺癌類幹細胞球進行加藥處理後，以新的培養液將含有藥物的培養液置換，加入 10 mg/mL 的 BrdU (Sigma, St. Louis, MO) (最終濃度為 10 μg/mL)作用 1 天，接著把培養液移除並收集細胞，用 PBS 25.

(27) 清洗 2 次，以 4%甲醛 (Sigma, St. Louis, MO)固定細胞 2 小時，用 PBS 洗淨後加入以 99%甲醇 (Gene Star, Taiwan)所配製的 5% H2O2 (Sigma, St. Louis, MO)進行 blocking 30 分鐘，PBS 清洗 2 次，接一級抗體 Anti-BrdU (GeneTex, Inc., Taiwan) (1:1,000) 2 天，PBS 清洗 2 次，再接二級抗體 FITC-conjugated goat anti-rabbit (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA , USA) (1:1,000) 1 天，用 PBS 洗淨後以 5 μM DAPI (Sigma, St. Louis, MO) (1:2,000)染色約 15 分鐘，再次以 PBS 清洗，最後用活細胞顯微鏡 (live image, Leica, German)觀察並紀錄細胞型態及螢光表現。分別將 DAPI 與 BrdU 螢光強度以 Multi Gauge 軟體做量化後，各組別的 BrdU 除以 DAPI，算出所佔的比例，再以 DMSO 組別為百分之百做相對之比較。. 十三、 TUNEL 細胞凋亡試驗 (terminal transferase dUTP nick end labeling, TUNEL assay) 當細胞凋亡進入末期時 DNA 會被核酸內切酶 (endonuclease)切成片段，產生去氧核糖核酸斷裂 (DNA fragmentation)的現象，而所切的缺口 (nick)或是 3’-OH 末端的切口，能夠在末端脫氧核苷酸轉移酶 (Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)的作用下將 BrdUTP 連接上去，再使用帶有螢光標記的 TRITC-Anti-BrdU 抗體對其進行細胞凋亡之檢測。培養約七天已生長成熟的 H460、A549 和 H1299 26.

(28) 肺癌類幹細胞球，進行加藥處理，接著等待球狀細胞自然沉澱並移除培養液，用 PBS 清洗 2 次，以 4%甲醛固定細胞 2 小時，再用 PBS 洗淨後加入以 99%甲醇所配製的 5% H2O2 進行 blocking 30 分鐘，最後使用 TUNEL 試劑組 (In Situ Cell Death Detection Kit, POD, Roche, inc., Taiwan)進行螢光染色之步驟，最後以 5 μM DAPI 染色 15 分鐘後利用 PBS 洗淨，便可透過活細胞顯微鏡觀察並紀錄細胞型態及螢光表現。分別將 DAPI 與 TUNEL 螢光強度以 Multi Gauge 軟體做量化後，各組別的 TUNEL 除以 DAPI，再以 DMSO 組別為 1.0 做相對之比較。. 十四、細胞免疫螢光染色法 (immunofluorescence staining) 透過免疫螢光染色鑑定癌症幹細胞標記分子，首先將三株非小細胞肺癌分別種 3×105 細胞數於 6-cm dish 中，以癌類幹細胞培養液培養約 7-10 天。生長成熟的肺癌類幹細胞球再以 DMSO 及濃度 10、20 與 30 μM 的 EMMQ 處理 48 小時，接著把細胞液移置 15 mL 離心管中，待細胞沉澱後將上清液移除，用 PBS 清洗 2 次，以 4%甲醛固定細胞，隔天再用 PBS 洗淨後加入以 99%甲醇所配製的 5% H2O2 進行 blocking 30 分鐘，PBS 清洗 2 次，接一級抗體 AntiALDH1A1 (GeneTex, Inc., Taiwan) (1:5,000)或是 Anti-Nanog 27.

(29) (GeneTex, Inc., Taiwan) (1:1,000)於 4℃中 48 小時，PBS 清洗 2 次，再接二級抗體 FITC-conjugated goat anti-rabbit (1:1,000)於 4℃中，避光處理 24 小時，用 PBS 洗淨後以 5 μM DAPI (1:2,000)避光染色約 15 分鐘，再次以 PBS 清洗兩次，最後用活細胞顯微鏡觀察照相並且以 Adobe Photoshop 進行影像分析處理。. 十五、裸鼠皮下注射之腫瘤異種移植模式本篇選用三週大之 BALB/c 品系雌性裸鼠，來源自國家實驗研究院國家實驗動物中心，一切實驗流程按照實驗動物中心之實驗動物管理與使用指南進行。選用肺癌細胞株 H460 所培養出的肺癌類幹細胞，經由細胞分離溶液 accutase 將細胞打散後，取 2×105 個細胞溶液與 Matrigel® Basement Membrane Matrix (corning, product #354234)以 4:1 的比例混和，透過皮下注射將細胞打入裸鼠後肢，因裸鼠具有自發性免疫缺陷，故可以接受異種移植之癌細胞而不易產生排斥，等到兩週腫瘤生成後，開始注射藥物。將濃度 10 mg/kg 或 50 mg/kg 的 EMMQ 以皮下注射的方式打入腫瘤組織附近，一週給藥兩次，總共給藥六次。每次加藥前先測量裸鼠體重與腫瘤直徑，利用公式. (短邊直徑)2 ×(長邊直徑) 2. 計算出腫瘤體積。最後一次藥物處理結. 束後會再觀察 4 天，亦會測量裸鼠體重與腫瘤大小。最後以乙醚將裸鼠犧牲並取出腫瘤。腫瘤組織取出後，以相機紀錄影像並測量其 28.

(30) 重量。將腫瘤組織保存於-80℃冰箱，待之後欲以組織切片或萃取蛋白質進一步分析時，再取出退冰進行實驗。. 十六、蘇木素-伊紅染色 (hematoxylin and eosin stain, H&E stain) 蘇木素 (hematoxylin)為鹼性染劑，可染嗜鹼性之細胞核，呈色為藍色，而伊紅 (eosin)為酸性染劑，染嗜酸性之細胞質，呈色為紅色。將存於-80℃冰箱的腫瘤組織取出，放置冰上回溫，接著切取適量大小的腫瘤組織，浸泡在 4%甲醛後，置於 4℃冰箱固定。後續石蠟包埋、切片與染色委託保吉生化學股份有限公司 (BIO-CHECK LABORATORIES LTD.)處理。完成後的 H&E 染色玻片於共軛焦顯微鏡 (Leica TCS Sp2 confocal spectral microscope)下觀察並紀錄影像。. 十七、冷凍組織免疫螢光染色法將存於-80℃冰箱的腫瘤組織取出，放置冰上回溫，接著切取適量大小的腫瘤組織，浸泡在 4%甲醛後，置於 4℃冰箱固定 (overnight)。固定好的組織接著逐次以 10%、20%與 30%蔗糖緩衝液浸泡並置於 4℃冰箱中(每一濃度放置一晚)，避免組織在低溫時產生冰晶，最後取出腫瘤組織存於-20℃冰箱 (overnight)。將準備好的腫瘤組織於冷凍切片機 (Cryostat for Frozen Section, LEICA)中以冷 29.

(31) 凍劑 (O.C.T.)包覆，待冷凍劑凝固後，將組織切成厚度為 10 m 之切片，浸泡於 PBS 中。接著將切片浸於含有 5 % FBS 的 PBS 中進行 blocking (overnight)，以 PBS 清洗兩次，加入 ALDH1A1 (GeneTex, Inc., Taiwan) (1:5,000)或是增生细胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) (GeneTex, Inc., Taiwan) (1:1000)之一級抗體於 4℃作用 48 小時。用 PBS 清洗 2 次，加入二級抗體 FITCconjugated goat anti-rabbit (1:1,000)於 4℃冰箱避光作用 24 小時。以 PBS 沖洗 2 次，最後避光處理 DAPI 約 20 分鐘後。用 PBS 洗淨，以尖頭毛筆挑起組織切片，擺放於載玻片上，待組織切片自然風乾，滴上適量的鏡油，並以指甲油封片之。玻片於共軛焦顯微鏡 (ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope)下觀察並紀錄影像，並以 ZEISS Microscope Software ZEN 進行影像分析處理，而 PCNA 的部分再以 Multi Gauge 軟體做量化，以控制組之螢光強度為百分之分算出加藥後之相對值。. 30.

(32) 陸、結果一、. 確認肺癌類幹細胞球之幹細胞特性. 以 H460 細胞為代表利用西方墨點法比較其癌類幹細胞球與貼附性細胞所萃取的蛋白質中癌症幹細胞標記分子的表現。結果顯示癌類幹細胞球的 CD44 和 ALDH1A1 表現量高於貼附性細胞 (Fig 1)。因此我們能以此培養模式為基準進行後續相關的實驗。. 二、. 高濃度的 teroxirone 可抑制肺癌類幹細胞球生長. 先前發表的文獻結果顯示，以低濃度 5 μM 的 teroxirone 作用 H460、A549 和 H1299 肺癌細胞 24 小時後，H460 的細胞存活率介於 30%至 40%，A549 介於 50%至 60%，生長會受到顯著抑制。 H1299 介於 70%到 80%，雖然有受到抑制但未達到顯著差異[28]。而癌類幹細胞球形成試驗的結果顯示在 10 μM 以下的 teroxirone 處理後，無法看到三株肺癌類幹細胞球有明顯的變化。20 μM 以上的劑量才能夠明顯觀察到三株肺癌類幹細胞球的型態皆變得較小，甚至有破碎的情形 (Fig 2)，代表肺癌類幹細胞球對於 teroxirone 的敏感度比貼附性細胞來得低，可能具有較高的抗藥性表現，需要以較高藥物濃度處理，因此以此作為加藥濃度的初步篩選。接著由細胞群落試驗結果 (Fig 3)結果顯示三株肺癌類幹細胞球形成群落的能力 31.

(33) 都受到 teroxirone 的影響而被抑制，並且達到顯著差異，再以內差法依序計算 H460、A549 和 H1299 IC50 的結果分別為 24.8、24.8 和 18 μM。最後以 BrdU 細胞增生試驗進一步分析 teroxirone 作用三株肺癌類幹細胞球後，其增生能力的影響 (Fig 4)。結果可發現 BrdU 的螢光強度(綠色)整體而言隨著藥物濃度的上升而有下降。同時從西方墨點法的結果顯示，H460、A549 與 H1299 肺癌類幹細胞球之 Akt1/2/3 及 p-Akt1/2/3Ser473/474/472 蛋白質表現量在加藥之後也有下降 (Fig 5)，由此可證實三株肺癌類幹細胞球的增生能力確實能夠被 teroxirone 所抑制。. 三、. 高濃度的 teroxirone 可引起 wild-type p53 肺癌類幹細胞球細. 胞凋亡且抑制其癌症幹細胞標記分子的表現由 TUNEL 細胞凋亡試驗結果顯示，wild-type p53 的 H460 (Fig 6A)以及 A549 (Fig 6B)肺癌類幹細胞球經由藥物 teroxirone 處理後的螢光強度(綠色)隨著藥物濃度的上升而有上升，而 H1299 (Fig 6C)肺癌類幹細胞球則無明顯變化。將 Fig 6A-C 定量統計後的結果顯示 (Fig 6D)，H460 與 A549 肺癌類幹細胞球處理 5 μM 的 teroxirone 後，帶有 TUNEL 螢光的細胞百分比增加至 5.9%和 7.5%，30 μM 時顯著上升至 28.4%和 46.4% (P<0.05)。而 H1299 在 5 μM 及 30 μM 32.

(34) 的 teroxirone 處理下帶有 TUNEL 螢光的細胞百分比分別為 5.0%和 0.6%，未有顯著差異。表示高濃度 teroxirone 的藥物處理後能誘發 H460 以及 A549 肺癌類幹細胞球產生細胞凋亡。從反轉錄-聚合酶連鎖反應將 RNA 反轉錄成 cDNA，再將 cDNA 以 PCR 放大的結果 (Fig 7)，可觀察到 H460 和 A549 肺癌類幹細胞球在 teroxirone 處理後，各類癌幹細胞標記分子表現量的下降。但目前在 H1299 肺癌類幹細胞球則是觀察到 Nanog 未有明顯的變化。最後西方墨點法的結果 (Fig 5)顯示在 teroxirone 處理 H460 以及 A549 癌類幹細胞球後，細胞凋亡相關蛋白 pro-caspase-3 下降， cleaved PARP 與 cleaved caspase-3 表現量的上升，此結果與 TUNEL 細胞凋亡試驗的結果相呼應，再次證實 teroxirone 能夠誘發 wildtype p53 肺癌類幹細胞球的細胞凋亡。結果中也發現到癌幹細胞標記分子 CD44、ALDH1A1 與 Nanog 表現量的下降。但上述細胞凋亡相關蛋白的表現量於加藥之後的 H1299 肺癌類幹細胞球則沒有明顯的變化，癌幹細胞標記分子的表現也僅在 Nanog 有下降。因此目前的結果顯示為 teroxirone 可抑制 H1299 肺癌類幹細胞球的生長但不會引起細胞凋亡。. 33.

(35) 四、. 高濃度的 EMMQ 能夠抑制肺癌類幹細胞球之生長. 過去研究結果顯示 EMMQ 影響 H460 細胞存活率的 IC50 約為 9.5 μM、A549 細胞約是 9.7 μM 而 H1299 細胞則是需要濃度高於 10 μM 的 EMMQ [33]。由癌類幹細胞球形成試驗的結果顯示，低濃度 (10 μM 以下) EMMQ 處理後的三株肺癌類幹細胞球皆無法觀察到明顯的型態變化，但在高濃度(20 μM 以上)EMMQ 處理後的三株肺癌類幹細胞球有隨著時間與濃度的增加而變得較小甚至出現破碎的現象 (Fig 8)，顯示高濃度的 EMMQ 才能觀察到其對於三株肺癌類幹細胞球的明顯影響。接著由細胞群落試驗結果 (Fig 9)，可以發現三株癌類幹細胞球形成群落的能力都能受到 EMMQ 的影響而被抑制，並且達到顯著差異，再以內差法依序計算 H460、A549 和 H1299 IC50 的結果分別為 22.8、24.5 和 27.6 μM。最後以 BrdU 細胞增生試驗進一步分析三株癌類幹細胞球的增生能力在加藥 EMMQ 之後的影響 (Fig 10)，可以看到 BrdU 的螢光強度(綠色)隨著藥物處理濃度的上升而有下降。從西方墨點法的結果來看，H460 和 A549 肺癌類幹細胞球之 Akt1/2/3 及 p-Akt1/2/3Ser473/474/472 和 H1299 肺癌類幹細胞球之 p-Akt1/2/3Ser473/474/472 蛋白質表現量在加藥之後也有下降 (Fig 11)，證實三株癌類幹細胞球的增生能力確實能被 EMMQ 所抑制。. 34.

(36) 五、. 高濃度的 EMMQ 能引起 wild-type p53 肺癌類幹細胞球的細. 胞凋亡且抑制其癌症幹細胞標記分子的表現由 TUNEL 細胞凋亡試驗結果 (Fig 12)，可以觀察到表現 wildtype p53 的 H460 (Fig 12A)以及 A549 (Fig 12B)肺癌類幹細胞球經由藥物 EMMQ 處理後的螢光強度(綠色)隨著處理濃度的上升而有上升，而 H1299 (Fig 12C)肺癌類幹細胞球則無明顯變化。將 Fig 12AC 定量統計後的結果顯示 (Fig 12D)，H460 與 A549 肺癌類幹細胞球處理 10 μM 的 EMMQ 後，帶有 TUNEL 螢光的細胞百分比增加至 6.0%和 7.4%，30 μM 時顯著上升至 25.9%和 41.0% (P<0.05)。而 H1299 在 5 μM 及 30 μM 的 teroxirone 處理下帶有 TUNEL 螢光的細胞百分比分別為 3.5%和 1.1%，未有顯著差異。表示高濃度 EMMQ 的藥物處理後能誘發 H460 以及 A549 肺癌類幹細胞球產生細胞凋亡。從反轉錄-聚合酶連鎖反應將 RNA 反轉錄成 cDNA，再將 cDNA 以 PCR 放大的的結果中 (Fig 13)，可以觀察到 H460 和 A549 肺癌類幹細胞球在 EMMQ 處理之後癌幹細胞標記分子 ALDH1A1 表現量有下降。而免疫螢光染色的結果也顯示，EMMQ 能夠抑制 H460 和 A549 肺癌類幹細胞球 ALDH1A1 之螢光強度 (Fig 14A 與 14B)，於 H1299 則無明顯變化 (Fig 14C)。而癌幹細胞標記分子 35.

(37) Nanog 之螢光強度於三株非小細胞肺癌類幹細胞球處理 EMMQ 之後的螢光強度皆下降 (Fig 15)。最後由西方墨點法的結果 (Fig 11)顯示 H460 以及 A549 肺癌類幹細胞球在 EMMQ 處理之後，細胞凋亡相關蛋白 pro-caspase-3 的下降，cleaved PARP 與 cleaved caspase-3 表現量的上升，再次證實 EMMQ 能夠誘發 wild-type p53 肺癌類幹細胞球的細胞凋亡，並且能夠降低癌幹細胞標記分子 CD44、 ALDH1A1 和 Nanog 的表現量。但在 H1299 肺癌類幹細胞球加藥之後的細胞凋亡相關蛋白的表現皆未有明顯變化，而癌幹細胞標記分子的表現在 CD44 和 ALDH1A1 沒有變化，在 Nanog 有明顯的下降，故 EMMQ 雖然能夠抑制 H1299 肺癌類幹細胞球的生長但不會引發細胞凋亡。. 六、. p53 knock down 後的 A549 肺癌類幹細胞球對於 EMMQ 的. 敏感度下降由細胞群落試驗結果顯示 (Fig 9B 與 9D)， A549 癌類幹細胞球形成群落的能力受到 EMMQ 的影響而被顯著抑制，而本實驗利用做過 p53 shRNA knock down 處理再培養而成的 A549 肺癌類幹細胞球所做的細胞群落試驗結果中 (Fig 16)，形成群落的數目則無明顯下降。兩者相比較的結果顯示，p53 knock down 後的 A549 肺癌類幹細 36.

(38) 胞球對於 EMMQ 的敏感度低於未 p53 knock down 的 A549 肺癌類幹細胞球。. 七、. Teroxirone 與 EMMQ 不會引起正常肺組織細胞 MRC-5 細. 胞凋亡本研究選用了正常肺組織細胞 MRC-5，分別處理 5 μM teroxirone 與 10 μM EMMQ(在過去文獻中主要用以處理一般貼附性肺癌細胞的最高濃度) [28,33]，透過西方墨點法檢測細胞凋亡相關蛋白質之表現 (Fig 17)，目的是為了探討 teroxirone 與 EMMQ 對於一般肺組織細胞是否會造成毒性傷害。實驗結果顯示，MRC-5 於藥物處理前後的凋亡相關蛋白 pro-caspase-3、cleaved PARP 與 cleaved caspase-3 在兩者都不會有變化。而 teroxirone 對於 MRC-5 之 Akt1/2/3 也不會有影響。. 八、. EMMQ 抑制 H460 肺癌類幹細胞球之異種移植腫瘤生長. 由裸鼠犧牲後取下的腫瘤組織可以觀察到在濃度 10 mg/kg 與 50 mg/kg EMMQ 的處理下，腫瘤的大小隨著濃度上升而有明顯的變小 (Fig 18B)。期間所量測的腫瘤體積，在沒有給予藥物的控制組 (vehicle, 圖示為中空圓形)隨著時間有明顯大幅上升的趨勢，藥物處理 10 mg/kg EMMQ 之組別(圖示為灰色方框)次之，50 mg/kg EMMQ 37.

(39) 之組別(圖示為綠色三角)腫瘤大小的變化幅度則最輕微 (Fig 18C)，腫瘤重量於加藥 EMMQ 之組別亦有明顯減輕 (Fig 18D)，結果顯示 EMMQ 能有效抑制 H460 肺癌類幹細胞球之異種移植腫瘤生長。另外，實驗期間觀察裸鼠體重之結果 (Fig 18E)，顯示裸鼠體重在給予 EMMQ 藥物處理後皆無明顯變化。細胞凋亡的過程中，會發生細胞核裂解，細胞膜皺縮且向內凹陷，將細胞分割成數個有細胞膜包覆的泡狀小體，內含胞質、DNA 物質及胞器等，稱為凋亡小體 (apoptotic body) [46]。透過 H&E 染色結果顯示 (Fig 19)，藥物處理 10 mg/kg EMMQ 之組別中能夠觀察到有凋亡小體的出現(黑色箭頭指示處)，細胞間隙較沒有給予藥物的控制組鬆散，而 50 mg/kg EMMQ 之組別中凋亡小體的數目明顯增加，細胞間隙最為鬆散。透過西方墨點法檢測相關蛋白質之表現 (Fig 20)，結果顯示 p53 在處理 50 mg/kg EMMQ 組別中有上升，cleaved caspase-3 隨著 EMMQ 藥物處理濃度升高而上升，PARP 的 precursor form 隨著 EMMQ 藥物處理濃度升高而下降，證明 EMMQ 能誘發異種移植腫瘤組織細胞之 p53 依賴型的細胞凋亡。由冷凍組織免疫螢光染色 (Fig 21A)可以觀察到位於細胞核(藍色 DAPI)周圍，細胞質中的 ALDH1A1(綠色)螢光強度隨著 EMMQ 38.

(40) 藥物處理濃度升高而下降，表示腫瘤組織中癌症幹細胞標記分子 ALDH1A1 的表現能夠被 EMMQ 抑制。另外和注射一般 H460 肺癌細胞所生長的異種移植腫瘤做比較 (Fig 21B)，可以觀察到兩者間的細胞型態有明顯差異，H460 肺癌類幹細胞球之異種移植瘤的組織細胞核的大小較 H460 肺癌細胞之異種移植瘤的組織細胞核大許多，而兩者控制組的相比之下，H460 肺癌類幹細胞球之異種移植瘤的 ALDH1A1 螢光強度有較高且專一之表現，H460 肺癌細胞之異種移植瘤中的 ALDH1A1 螢光強度因為較弱而顯整體背景值較深。此外以 PCNA 為一抗進行染色之結果顯示 (Fig 22A)，於未處理藥物之控制組，位於細胞核內的 PCNA 綠色螢光強度最強，亮點最多，表示多數細胞處於細胞增生的狀態，而加藥 EMMQ 之組別， PCNA 的綠色螢光與控制組相比，明顯有隨加藥濃度上升而下降的趨勢。將控制組與加藥組隨機選三個不同視野定量統計後的結果顯示 (Fig 22B)，處理 50 mg/kg EMMQ 之組別，其 PCNA 螢光強度和控制組相比之結果達顯著下降(P<0.01)，證明 EMMQ 具有抑制癌細胞生長的效果。. 39.

(41) 柒、討論一、. 確立癌類幹細胞對藥物的特殊篩選平台. 根據文獻指出，能夠做為肺癌癌症幹細胞標記分子的蛋白有許多種，包括 CD133、Oct4 和 ABCG2，以及本篇研究所用到的 ALDH1A1、CD44、EpCAM 和 Nanog 等[17,18]。先前已有研究證明肺癌類幹細胞球中的 ALDH1A1 表現量較貼附性細胞高出許多 [55]，而本篇研究目前主要透過了西方墨點法再次比較兩者所萃取的蛋白質中 ALDH1A1 和 CD44 的表現差異來確立此肺癌類幹細胞平台。此外也透過免疫螢光染色的方式來觀察其癌症幹細胞標記分子螢光的表現[47,56]，證明經過特殊培養的肺癌類幹細胞球確實具有幹細胞之特性。. 二、. Teroxirone 抑制肺癌類幹細胞球生長以及引起凋亡相關機制. 跟據先前的文獻指出，在一般貼附性培養以及低濃度 teroxirone 處理的情況下，就能明顯抑制 H460 與 A549 細胞的生長，而 H1299 細胞雖有受到抑制卻未能達到顯著差異，其關鍵性的因素應該是因為在這樣的情況下，主要是透過 p53 依賴型的細胞凋亡路徑來達到生長的抑制，因此 p53 null 表現的 H1299 細胞就顯得對 teroxirone 沒那麼敏感[28]。 40.

(42) 而從本篇研究的結果來看，高濃度的 teroxirone 對於 H460 與 A549 肺癌類幹細胞球，同樣能引起細胞凋亡 (Fig 5 與 7)以及抑制其細胞的生長 (Fig2-4)。但值得注意的地方是，高濃度的 teroxirone 對於 H1299 肺癌類幹細胞球雖然還是無法引起 p53 依賴型的細胞凋亡 (Fig 5 與 7)，不過卻對於其生長有了明顯的抑制 (Fig2-4)，而造成它的其中一個機轉可能是因為其 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑能夠被 teroxirone 所抑制，因為我們可以從結果中看到 H460、A549 與 H1299 三株肺癌類幹細胞球之 Akt1/2/3 及 p-Akt1/2/3Ser473/474/472 蛋白質表現量在加藥之後皆有下降 (Fig 7)，證明 teroxirone 同時也會透過抑制 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑來達到抑制三株肺癌類幹細胞球的生長，這是先前所沒有探討到的部分，但詳細的調控機轉也還需更進一步的深入探討。. 三、. Teroxirone 對於肺癌類幹細胞標記分子以及幹細胞特性之影. 響本篇於 RNA 層級的研究結果顯示，teroxirone 抑制 H460 肺癌類幹細胞球中 ALDH1A1 和 Nanog 的表現以及抑制 A549 肺癌類幹細胞球中 ALDH1A1、EpCAM 和 SOX2 的表現，另外在 H1299 肺癌類幹細胞球中觀察到 Nanog 未有明顯變化。在蛋白質層級的研究結 41.

(43) 果中，H460 和 A549 肺癌類幹細胞球中 CD44、ALDH1A1 和 Nanog 表現量明顯下降。H1299 於 CD44 和 ALDH1A1 的表現量沒有變化，但能在 Nanog 觀察到明顯的下降，推測這也可能和其生長能夠被 teroxirone 抑制有相關性，但還需要更進一步的深入研究。整體而言，可以證實 teroxirone 能夠藉由抑制大多數的肺癌類幹細胞標記分子來達到抑制幹細胞的特性，並且增進治療的效果。. 四、. EMMQ 抑制肺癌類幹細胞球生長以及引起凋亡相關機轉. 和 teroxirone 的結果相似，先前的文獻中指出 EMMQ 主要也是透過 p53 依賴型的細胞凋亡路徑來達到生長的抑制，因此一般貼附性培養以及低濃度 EMMQ 處理的情況下， p53 null 表現的 H1299 細胞和 wild-type p53 表現的 H460 與 A549 細胞相比，就顯得對 EMMQ 較不敏感[33]。本篇的研究結果顯示，高濃度的 EMMQ 能引起 H460 與 A549 肺癌類幹細胞球的細胞凋亡反應 (Fig 12 與 14)以及抑制其細胞的生長(Fig 9-11)。且當 A549 肺癌類幹細胞球的 p53 被 knock down 後會降低其對於 EMMQ 的敏感度 (Fig 16)。另一方面，即使高濃度 EMMQ 無法引起 H1299 肺癌類幹細胞球 p53 依賴型的細胞凋亡. 42.

(44) (Fig 12 與 14)，但還是對於生長的部分能夠看到明顯抑制 (Fig 911)。在先前已經發表的研究結果中顯示，低濃度 EMMQ (10 μM 以下)處理的情形下，A549 和 H460 細胞中 Akt 以及 p-AktSer473 蛋白表現量有下降，對於 H1299 細胞沒有影響。不過對於有轉染 p53 質體的 H1299 細胞就同樣能看到 Akt 以及 p-AktSer473 蛋白表現量的下降，這是因為 EMMQ 能夠間接地透過提高 p53 表現量的上升進而抑制 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑所影響[28,48]。但是從本篇西方墨點法的結果中可以看到 H460 和 A549 肺癌類幹細胞球之 Akt1/2/3 及 p-Akt1/2/3Ser473/474/472 和 H1299 肺癌類幹細胞球之 p-Akt1/2/3Ser473/474/472 蛋白質表現量在加藥之後有下降 (Fig 14)，目前推測在高濃度處理的情況下，EMMQ 是能夠直接抑制 PI3K/Akt 訊息傳遞路徑來達到抑制三株肺癌類幹細胞球的生長，待未來更深入的研究和探討。. 五、. EMMQ 對於肺癌類幹細胞標記分子以及幹細胞特性之影響. 本篇於 RNA 層級的研究結果顯示，EMMQ 抑制 H460 和 A549 肺癌類幹細胞球中 ALDH1A1 的表現。另外免疫螢光染色的結果同樣顯示 H460 和 A549 肺癌類幹細胞球中 ALDH1A1 與 Nanog 的螢光 43.

(45) 強度於 EMMQ 處理之後有明顯減弱，在 H1299 則是 Nanog 的螢光強度有所減弱。而在蛋白質層級中，H460 和 A549 肺癌類幹細胞球中 CD44、ALDH1A1 和 Nanog 表現量有下降。H1299 於 CD44 和 ALDH1A1 的表現量沒有變化，但能在 Nanog 觀察到明顯的下降，這也可能和 EMMQ 能夠抑制其生長有相關性，但還需要更進一步的深入研究。整體而言，可以證實 EMMQ 透過抑制大多數的肺癌類幹細胞標記分子來達到抑制幹細胞的特性。. 六、. 探討藥物對正常肺組織細胞之毒性. 由於對於癌細胞具有毒性的藥物同時也可能對於正常組織細胞具有毒性，若是缺乏選擇性機制，效果不專一，往往就容易伴隨著許多副作用，造成額外的傷害。所以研究藥物對於正常組織細胞之影響也是相當重要的課題之一。在先前的研究中，將無胸腺裸鼠皮下注射 teroxirone 後，犧牲並取出肺、肝和脾臟等做檢測，沒有觀察到給藥之後所造成的創傷或是病變[28]。過去文獻中的動物實驗結果也顯示，在每間隔 3 至 4 天皮下注射一次濃度 0.2 mg 或 1 mg EMMQ (per mouse)至無胸腺裸鼠體內長達四週後，皆未對裸鼠的體重造成顯著的影響[33]。. 44.

(46) 在目前未公開發表的 MTT 試驗結果中顯示 teroxirone 和 EMMQ 對於正常肺組織細胞 MRC-5 的細胞存活率不會造成影響。本篇研究中，透過西方墨點法觀察到 teroxirone 和 EMMQ 不會引起正常的肺組織細胞 MRC-5 細胞凋亡相關蛋白表現之變化。而 MRC-5 同樣為 wild-type p53 表現的細胞，卻不會被誘發細胞凋亡的原因，推測是和 DNA 損傷後的修復系統有關。一般情況下的正常細胞具有許多修復系統，例如鹼基切除式修復，核苷酸切除式修復及誤配修補等，所以處理化學藥物後，對於 MRC-5 正常肺組織細胞所造成的 DNA 損傷，能夠得到較完善的修復，不易導致細胞凋亡；但在癌細胞中的這些修復系統，有些會因為缺陷而被部分甚至是完全關閉，使得癌細胞本身的 DNA 不穩定，加上本實驗給予化學藥物後造成的 DNA 損傷，容易使癌細胞 DNA 過度損傷，最後導致細胞凋亡[49]。. 七、. 透過動物實驗驗證 EMMQ 對於肺癌根治之潛力. 首先實驗僅取 2×105 個經由打散後的的癌類幹細胞球之細胞進行皮下注射，原因在於想要證明本研究所培養之肺癌類幹細胞球具有幹細胞特性，例如腫瘤起始能力，相較於實驗室先前注射 H460 肺癌細胞所需要的 3×106 個細胞，需要的數目僅約 6.7%就能讓腫瘤 45.

(47) 生成。給藥 EMMQ 之後，由腫瘤體積與重量的下降證明了 EMMQ 能有效抑制腫瘤組織生長，實驗動物的體重無明顯的變化，則間接證明 EMMQ 不會對一般組織細胞造成毒性。透過 H&E 染色中凋亡小體的出現與西方墨點法中凋亡相關蛋白表現的上升，證實 EMMQ 會使腫瘤組織細胞產生細胞凋亡。腫瘤組織中癌症幹細胞標記分子 ALDH1A1 的表現亦能夠被 EMMQ 抑制。此外 H460 肺癌類幹細胞球與 H460 肺癌細胞之異種移植瘤組織切片中細胞核大小差異的原因，推測有可能是因為幹細胞需要持續進行細胞分裂，細胞分裂的主要作用是傳遞遺傳訊息，而核內具有 DNA 遺傳物質、RNA 與蛋白質等細胞分裂時的重要原料，幹細胞需要的原料比一般细胞多，也因此細胞核之型態較大，但尚不能斷定。最後，EMMQ 能夠抑制 PCNA 之螢光強度，而 PCNA 在細胞核內合成，存在於細胞核內參與 DNA 的合成，也被證實參與在核酸切除修復 (nucleotide excision repair)之 DNA 修復機制中，因此若是 PCNA 被抑制，表示細胞增生被抑制外，也可能因為癌細胞中不完善的修復機制又受到抑制，而更能夠使癌細胞走向細胞凋亡[50-52]。. 八、. 結論. 本篇研究結果顯示，適當地提高 teroxirone 與 EMMQ 的濃度可以透過抑制生長、抑制幹細胞標記分子與引發 p53 依賴型細胞凋亡 46.

(48) 的方式清除肺癌類幹細胞。比較兩者藥物所需濃度，在一般貼附性肺癌細胞中 EMMQ 達到 IC50 所需要的濃度較 teroxirone 高一些，但對於肺癌類細胞球，兩者所需濃度差異不大。有文獻指出進入第一期臨床試驗的 teroxirone 的最大耐受劑量 (maximum tolerance dose, MTD)為 340 mg/m2/day，會引起靜脈炎及骨髓抑制之副作用[30]，而 EMMQ 目前未有相關報導。本篇尚未進行提高藥物濃度後對於正常組織細胞影響之研究，期許未來能夠找到一個最適當的濃度，讓實驗有更進一步的研究意義。另外已知 teroxirone 抗癌的作用機制是作為烷化劑，干擾癌細胞 DNA 正常複製，但 EMMQ 的作用機制尚未清楚。兩者皆為化學合成且分子量低於 300 kDa 的小分子藥物，優點在於具備較佳的腫瘤組織穿透能力，透過實驗結果顯示兩者為具有根治肺癌之潛力藥物。. 47.

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(59) 玖、圖. Fig 1.透過西方墨點法比較一般肺癌細胞與肺癌類幹細胞球之蛋白表現一般貼附性培養的 H460、A549 和 H1299 細胞(左半邊, monolayer cells)以 DMSO 與濃度 1、2 及 5 μM 的 teroxirone 處理 24 小時；而培養約 7 天生長成熟後之 H460、A549 和 H1299 肺癌類幹細胞球以 DMSO 及濃度 5、10 與 30 μM 的 teroxirone 分別處理 48、 24 及 24 小時(右半邊, spheroid cells)，藉由西方墨點法比較兩者癌症幹細胞標記分子 ALDH1A1 和 CD44 之表現，可以發現於肺癌類幹細胞球中確實有較高表現，證明特殊培養的情況下能夠具有較高的癌症幹細胞特性。加藥 teroxirone 後的結果顯示，ALDH1A1 及 CD44 表現量下降。另外 cleaved PARP 與 cleaved caspase-3 表現量上 58.

(60) 升，證明誘發細胞凋亡。(下方數字為定量值，D 為 DMSO。 GAPDH 為 loading control，以 Multi Gaug 軟體進行蛋白質定量，將每組蛋白量除以對應的 GAPDH，再以 DMSO 為絕對值換算之。). 59.

(61) (A). (B). (C). 60.

(62) Fig 2.肺癌類幹細胞球經 teroxirone 處理後的型態變化 (A) H460 (B) A549 (C) H1299 肺癌類幹細胞球生成後，以 DMSO 及 2、5、10、30 與 50 μM 之 teroxirone 處理，於 12、24 和 48 小時在顯微鏡下觀察並紀錄之結果，結果顯示三株肺癌類幹細胞球的型態受到 teroxirone 的影響，隨著加藥時間和濃度的上升會逐漸變得較小，甚至破碎而呈現非完整的球狀。. 61.

(63) (A). (B). (C). 62.

(64) Fig 3. Teroxirone 抑制 H460、A549 和 H1299 肺癌類幹細胞的群落生長能力 (A)細胞群落試驗流程圖。將培養約 7 天後的 H460、A549 及 H1299 肺癌類幹細胞以 DMSO 及濃度 10、30 與 50 μM 的 teroxirone 處理 48 小時，接著透過細胞群落試驗觀察 30 天之後細胞群落生長變化。(B)最終以結晶紫染色後的照相結果。可以觀察到三株非小細胞肺癌類幹細胞於加藥之後形成的細胞群落數量皆下降，證明群落生長能力受到 teroxirone 抑制。(C)為圖(B)群落數量之量化統計圖，取三次獨立實驗結果的平均值(±標準差)，以 Pair t-test 計算 P 值 (P<0.05, P<0.01)。. 63.

(65) (A). (B). (C). 64.

(66) (D). Fig 4. Teroxirone 抑制 H460、A549 和 H1299 肺癌類幹細胞球的增生以濃度 5、10 及 30 μM 的 teroxirone 分別處理(A) H460、(B) A549 及(C) H1299 肺癌類幹細胞球 48、24 及 24 小時後，透過 BrdU 細胞增生試驗觀察 teroxirone 處理後之影響。綠色表示 BrdU 螢光強度而藍色是作為細胞核 counterstain 的 DAPI。結果顯示 BrdU 的螢光強度在加藥之後有下降的趨勢，證明 H460、A549 和 H1299 肺癌類幹細胞球的增生能夠被 teroxirone 所抑制。(D)為量化統計圖，分別取三次獨立實驗結果的平均值(±標準差)，以 Pair t-test 計算 P 值 (P<0.05, P<0.01)。. 65.

(67) Fig 5. 透過西方墨點法觀察 teroxirone 對於肺癌類幹細胞球蛋白質表現量之影響萃取 H460、A549 和 H1299 肺癌類幹細胞球經 teroxirone 分別處理 48、24 及 24 小時後之蛋白質，以西方墨點法觀察各蛋白表現變化。(下方數字為定量值，D 為 DMSO。GAPDH 為 loading control，以 Multi Gaug 軟體進行蛋白質定量，將每組蛋白量除以對應的 GAPDH，再以 DMSO 為絕對值換算之。). 66.

(68) (A). (B). (C). 67.

(69) (D). Fig 6. Teroxirone 誘發 H460、A549 肺癌類幹細胞球之細胞凋亡以濃度 5 及 30 μM 的 teroxirone 分別處理(A) H460、(B) A549 及 (C) H1299 肺癌類幹細胞球 48、24 及 24 小時後，透過 TUNEL 細胞凋亡試驗偵測螢光(綠色)，再以 DAPI 作細胞核 counterstain (藍色)後以螢光顯微鏡照相。結果顯示， H460 和 A549 肺癌類幹細胞球中的綠色螢光強度隨著加藥濃度上升而上升，表示被誘發細胞凋亡。 (D)為量化統計圖，取三次獨立實驗結果之平均值(±標準差)，以 Pair t-test 計算 P 值(P<0.05, P<0.01)。. 68.

(70) Fig 7. Teroxirone 抑制 H460 和 A549 肺癌類幹細胞之癌幹細胞標記分子 RNA 表現萃取 H460、A549 和 H1299 肺癌類幹細胞球經 teroxirone 分別處理 48、24 及 24 小時後之 RNA，以 PCR 觀察各癌幹細胞標記分子 RNA 表現量的變化。結果顯示 H460 和 A549 肺癌類幹細胞在加藥之後癌幹細胞標記分子 RNA 表現量下降，但於加藥之後的 H1299 肺癌類幹細胞則沒有明顯的變化。(下方數字為定量值，D 為 DMSO。GAPDH 為 loading control，以 Multi Gaug 軟體進行蛋白質定量，將每組蛋白量除以對應的 GAPDH，再以 DMSO 為絕對值換算之。). 69.

(71) (A). (B). (C). 70.

(72) Fig 8.肺癌類幹細胞球經 EMMQ 處理後的型態變化以 DMSO 及 5、8、10、20 與 30 μM 之 EMMQ 分別處理 (A) H460 (B) A549 (C) H1299 肺癌類幹細胞球後，於 24、48 和 72 小時在顯微鏡下觀察並紀錄之結果。結果顯示三株癌類幹細胞球的型態隨著 EMMQ 加藥時間和濃度的上升會逐漸變得較小，甚至破碎而不完整。. 71.

(73) (A). (B). (C). 72.

(74) Fig 9. EMMQ 抑制 H460、A549 和 H1299 肺癌類幹細胞的群落生長能力 (A)細胞群落試驗流程圖。以 DMSO 及濃度 10、20 與 30 μM 的 EMMQ 處理 H460、A549 及 H1299 肺癌類幹細胞球 48 小時後，透過細胞群落試驗觀察 30 天之後細胞群落生長變化。(B)最終以結晶紫染色後的照相結果。結果顯示三株非小細胞肺癌類幹細胞於加藥之後形成的細胞群落數量皆下降，證明群落生長能力受到 EMMQ 抑制。(C)為圖(B)群落數量之量化統計圖，取三次獨立實驗結果的平均值(±標準差)，以 Pair t-test 計算 P 值(P<0.05, P<0.01)。. 73.

(75) (A). (B). (C). 74.

(76) (D). Fig 10. EMMQ 抑制 H460、A549 和 H1299 肺癌類幹細胞球的增生以濃度 10、20 及 30 μM 的 EMMQ 處理(A) H460、(B) A549 及 (C) H1299 肺癌類幹細胞球 48 小時後，透過 BrdU 細胞增生試驗觀察 EMMQ 處理後之影響。綠色表示 BrdU 螢光強度而藍色表示 DAPI 作為細胞核 counterstain。結果顯示 H460、A549 和 H1299 肺癌類幹細胞球 BrdU 的螢光強度在加藥之後有下降的趨勢，證明其增生能夠被 EMMQ 所抑制。(D)為量化統計圖，分別取三次獨立實驗結果的平均值(±標準差)以 Pair t-test 計算 P 值 (P<0.05, . P<0.01)。. 75.

(77) Fig 11. 透過西方墨點法觀察 EMMQ 對於肺癌類幹細胞球之影響萃取 H460、A549 和 H1299 肺癌類幹細胞經 EMMQ 處理 48 小時後之蛋白質，以西方墨點法觀察各蛋白表現變化。(下方數字為定量值，D 為 DMSO。GAPDH 為 loading control，以 Multi Gaug 軟體進行蛋白質定量，將每組蛋白量除以對應的 GAPDH，再以 DMSO 為絕對值換算之。). 76.

(78) (A). (B). (C). 77.

(79) (D). Fig 12. EMMQ 誘發 H460、A549 肺癌類幹細胞球進行細胞凋亡以濃度為 10 及 30 μM 的 EMMQ 處理(A) H460、(B) A549 及(C) H1299 肺癌類幹細胞球 48 小時後，透過 TUNEL 細胞凋亡試驗偵測螢光(綠色)，再以 DAPI 作為細胞核 counterstain (藍色)後以螢光顯微鏡照相。加藥後 H460、A549 肺癌類幹細胞球中的綠色螢光強度上升，表示被誘導發生細胞凋亡。(D)為量化統計圖，取三次獨立實驗結果的平均值(±標準差)以 Pair t-test 計算 P 值(P<0.05)。. 78.