I-Shou University Institutional Repository:Item 987654321/11137
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(2) 三種威靈仙屬植物之抑菌與抗氧化活性 分析 Antibacterial and antioxidant properties of three Chinese herbs of Clematis species 研究生：蔡宜恩 指導教授：莊麗月. Student：E-En Tsai Advisor：Li-Yeh Chuang 義守大學. 生物技術與化學工程研究所 碩士論文 A Thesis Submitted to Department of Biotechnology and Chemical Engineering I-Shou University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Master degree in Biotechnology and Chemical Engineering July, 2010 Kaohsiung, Taiwan, Republic of China. 中華民國九十九年七月.
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(4) 摘要 自從 1928 年英國科學家弗萊明發現抗生素以來，人們享受了近 40 餘年免 於擔心在醫療過程受細菌感染產生併發症而死亡的困擾。然而，這樣美好日子 卻因人們對抗生素的過度依賴及濫用而提早結束了。因為過度使用抗生素，使 得細菌產生了抗藥性，這情況讓醫院不得不加強抗生素的用藥量或改用其他抗 生素，然而，這樣的使用方式更導致多重抗藥性細菌的出現。鑒於目前越來越 多的多重抗藥性細菌使既有的抗生素漸漸不敷使用，我們希望能從中藥尋得可 能成為抗生素替代品的有效成份。 本研究選用了三種常用的毛茛科威靈仙屬中草藥－威靈仙、川木通及鐵線 透骨草來做為研究目標，由於這三種中草藥目前除威靈仙有部份文獻指出具有 抑菌效果外，包括川木通及鐵線透骨草均未有文獻證實具有抑菌作用。本研究 利用乙醇分別對三種中草藥進行萃取，以取得中草藥中的有效物質，經過 disc diffusion 的測試後發現三種中草藥對所測試的三種臨床病原菌－金黃色葡萄球 菌、鮑氏不動桿菌及綠膿桿菌均有抑制效果。 再將各中草藥的乙醇粗萃物以不同極性的有機溶劑進行分配萃取後，發現 三種中草藥的有效成份均在乙酸乙酯層的萃出物。經過最小抑菌濃度（MIC） 與最小殺菌濃度（MBC）測試後發現，鐵線透骨草之最小抑菌濃度約在 1.8～ 5.3 mg/mL，最小殺菌濃度約在 2.3～5.5 mg/mL；威靈仙之最小抑菌濃度約在 6.0 ～14.0 mg/mL，最小殺菌濃度約在 8.0～16.0 mg/mL；川木通之最小抑菌濃度則 大於 10.0 mg/mL。此外，在殺菌曲線的測試中發現，川木通是唯一不具有殺菌 效果的中草藥，而鐵線透骨草和威靈仙均可在下藥後半小時內殺死測試菌株並 維持 24 小時不再增長。 根據成份鑑別的結果，鐵線透骨草在經過管柱色層層析後所得的有效區分 物經 GC-MS 的資料庫及相關文獻的比對後並未發現相關的結構資料，因此， 我們推測應是未知物。而在經過薄層色層層析及相關的顯色觀察後，我們推測. I.
(5) 鐵線透骨草的有效抑菌物質可能為酚類化合物。 因應近年來人們對抗老化及抗癌物質的追求，在本研究中亦對三種中草藥 進行了抗氧化能力的測試。根據本研究所進行的抗氧化能力的測試結果，我們 發現三種中草藥中以鐵線透骨草的抗氧化能力最佳，其 DPPH 自由基清除率 之 IC50 為 134.00 μg/mL；總抗氧化力的 TEAC 值：247.66 mg Trolox / g；還原力 的斜率為 0.40；總多酚類含量為 133.45 mg Gallic acid / g dw；總類黃酮含量為 76.762 mg Quercetin / g dw。 根據本研究所得結果顯示，鐵線透骨草是三種中草藥中抑菌效果最好，也 是廣效性最佳，同時也是抗氧化能力最好的中草藥。可謂是三種中草藥中最具 有成為抗生素替代品的來源。. 關鍵字：中草藥、鐵線透骨草、威靈仙、川木通、抗菌活性、抗氧化能力. II.
(6) Abstract Since the British scientist Fleming discovered Penicillin back in 1928, people enjoyed over 40 years of their lives without the fear of complications caused by bacteria infections during therapy processes that may lead to death. However, these good old times has come to an end due to excessive dependence and abuse of antibiotics. The excessive use of antibiotics resulted in drug-resistant bacteria, so hospitals had to increase the dosage of antibiotics or change to other antibiotics. In the light of increasing in multiple drug-resistant bacteria, which causes many current antibiotics to become invalid, we aim to look for possible valid ingredients in the Chinese herbs that may replace current antibiotics. In this study, we have chosen three herbs of Ranunculaceous Clematis plants: Clematidis Radix, Caulis Clematidis armandii and herba Clematidis intricatae as the media of research. There had been only few published reports that pointed out Clematidis Radix as having antibacterial effects, but none for Caulis Clematidis armandii and herba Clematidis intricatae. In order to characterize the active components of these Chinese herbs, the three kinds of herbs were extracted by ethanol extraction. Through the disc diffusion test, the herbs revealed good antibacterial activity against the following clinical antibiotic resistant pathogens： Staphyloccocus aureus, Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa. The ethanol extracts then were partitionated into different organic solvents based on their polarity for distribution extraction. Following the bioassay, the active fraction were found in ethyl acetate fraction. We have also found that all of the clinical pathogens in our test were sensitive for the extracts. The results obtained from minimum inhibitory concentration ( MIC ) and minimum bactericidal concentration ( MBC ) tests, showed that three kinds of herbs' MIC and MBC were:. III.
(7) herba Clematidis intricatae's MIC was about 1.8～5.5 mg / mL and the MBC was about 3.0～5.5 mg / mL; Clematidis Radix's MIC was about 6.0～14.0 mg / mL and MBC was about 2.0～16.0 mg / mL; Caulis Clematidis armandii's MIC was greater than 10.0 mg / mL. Moreover, the time killing curve test, indicated that Caulis Clematidis armandii did not have bactericidal affects, although the other two herbs could kill bacteria within half an hour and maintained no bacterial growth within 24-hours. According to the results of GC-MS identification, the active components of herba Clematidis intricatae fraction collected from column chromatography had no structural information match in the GC-MS database and related documents; therefore it is suggested to be unknown substances. Through the thin layer chromatography test, the results showed that the active substances might be phenolic compounds. In addition, the antioxidant activities were determined for the three herbs in response to people’s pursuit of anti-aging material and cancer cures in recent years. According to the results of the antioxidation analysis, herba Clematidis intricatae presented a higher antioxidant activity with the IC50 of DPPH at 134.00 μg/mL；the value of TEAC is 247.66 mg Trolox/g; and the slope of reducing power is 0.40; the total phenolic content is 133.45 mg Gallic acid/g dw and the total flavonoid content is 76.762 mg Quercetin/g dw. According to the results of this study, the antimicrobial activity of herba Clematidis intricatae is the best among the three herbs, and it has a broad-spectrum of antibacterial activity. Moreover, herba Clematidis intricatae also showed the best antioxidant activity. Overall, herba Clematidis intricatae, of the three herbs in this study, has the most potential in becoming an alternative antibiotic.. IV.
(8) Keywords：Chinese herbs、Clematidis Radix、Caulis Clematidis armandii、herba Clematidis intricatae、antibacteria、antioxidant. V.
(9) 謝誌 在碩士研究的這四年間，我有太多需要感謝的人了，首先要感謝我的父母， 感謝他們不計代價的讓我將這個研究完成。接著要感謝我的指導教授莊麗月博 士，在我碩士的這四年中不斷的給予我指導及鼓勵，並在研究遇到疑難處給予 建議使我得以順利完成論文的研究及撰寫。另外要感謝我的學長姐哲偉及百 薇，在我初入實驗室時給予我許多的指導及關心，讓我能很快的進入實驗室的 生活。 還要感謝實驗室裡的翔翔、于甯、合陽、榮憲、阿佩、美蓉、黑黑等眾學 弟妹們，謝謝你們在這段日子裡陪我渡過難熬實驗時間，並幫我許多忙，讓我 的研究生生活不至潰乏。 最後，要感謝我的弟弟宜呈及我的女友芷毓，感謝你們在這四年給我的支 持及包容，讓我在各方面能無後顧之憂。. VI.
(10) 目錄 摘要............................................................................................................................ I. Abstract ..................................................................................................................... III. 謝誌........................................................................................................................... VI. 目錄........................................................................................................................... VII 圖目錄........................................................................................................................ X. 表目錄....................................................................................................................... XII 第一章 前言............................................................................................................. 1. 第二章 文獻回顧..................................................................................................... 3. 1. 研究藥材的選擇 .......................................................................................... 3. 2. 威靈仙簡介 .................................................................................................. 3. 3. 川木通簡介 .................................................................................................. 5. 4. 鐵線透骨草簡介 .......................................................................................... 6. 5. 臨床抗藥性病菌簡介 .................................................................................. 7. 6. 中草藥有效成份的萃取方法 ...................................................................... 8. 7. 天然抑菌成份的介紹 .................................................................................... 9. 8. 抗氧化簡介 .................................................................................................... 9. 第三章 研究目的..................................................................................................... 12. 第四章 實驗材料與方法 ........................................................................................ 14. 1.實驗材料 ........................................................................................................ 14. 2. 實驗方法 ...................................................................................................... 17. (1) 抗生素感受性測試 ....................................................................................... 17. (2) 粗萃物之製備 ............................................................................................... 19. (3) 分配萃取 ....................................................................................................... 19. (4) 管柱色層層析（Column Chromatography） .............................................. 19. VII.
(11) (5) 抗菌活性分析 ............................................................................................... 21. ( i ) 最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）測定.................. 21. ( ii ) 殺菌曲線（Time-Killing curve） ...................................................... 21. (6) 萃出物穩定性測試 ....................................................................................... 21. ( i ) 耐熱性測試 .......................................................................................... 21. ( ii ) 耐酸鹼測試 ......................................................................................... 22. (7) 抗氧化活性分析 ........................................................................................... 22. ( i ) 總酚量測定 .......................................................................................... 22. ( ii ) 類黃酮含量測定 ................................................................................. 22. ( iii ) DPPH 自由基清除能力測定.............................................................. 23. ( iv ) 還原力的測定 .................................................................................... 23. ( v ) 總抗氧化力測試（total equivalent antioxidant capacity，TEAC）. 24. (8) 有效成份鑑定 ............................................................................................... 25. ( i ) 薄層色層分析（Thin Layer Chromatography，TLC）..................... 25. ( ii ) 氣相層析質譜（Gas Chromatography-Mass Spectrophotometer， GC-MS） ............................................................................................ 25. 第五章 實驗結果..................................................................................................... 26. 1. 臨床金黃色葡萄球菌之抗生素敏感性測試 .............................................. 26. 2. 粗萃物及各區分層活性測試 ...................................................................... 28. 3. 最小抑菌濃度與最小殺菌濃度測試 .......................................................... 30. 4. 殺菌曲線測試 .............................................................................................. 32. 5. 耐熱性與耐酸鹼測試 .................................................................................. 38. 6. DPPH 自由基清除能力測定........................................................................ 40. 7. TEAC 總抗氧化力測試................................................................................ 41. 8. 還原力測試 .................................................................................................. 43. 9. 總多酚含量測試 .......................................................................................... 44. VIII.
(12) 10. 總類黃酮含量測試 .................................................................................... 45. 11.薄層色層分析 .............................................................................................. 46. 12. GC-MS 分析 .............................................................................................. 49. 第六章 討論............................................................................................................. 53. 第七章 結論............................................................................................................. 56. References................................................................................................................. 58. IX.
(13) 圖目錄 圖 一、威靈仙乾燥品 .............................................................................................. 4. 圖 二、川木通........................................................................................................... 6. 圖 三、關木通........................................................................................................... 6. 圖 四、實驗架構...................................................................................................... 13 圖 五、分配萃取流程示意圖 ................................................................................. 20 圖 六、鐵線透骨草乙酸乙酯層區分物對鮑氏不動桿菌 ( Ab 20 ) 之殺菌曲 線測試.......................................................................................................... 32 圖 七、威靈仙乙酸乙酯層區分物對鮑氏不動桿菌 ( Ab 20 ) 之殺菌曲線測 試.................................................................................................................. 33 圖 八、川木通乙酸乙酯層區分物對鮑氏不動桿菌 ( Ab 20 ) 之殺菌曲線測 試.................................................................................................................. 33 圖 九、鐵線透骨草乙酸乙酯層區分物對綠膿桿菌 ( Pa 3651 ) 之殺菌曲線測 試.................................................................................................................. 34 圖 十、威靈仙乙酸乙酯層區分物對綠膿桿菌 ( Pa 3651 ) 之殺菌曲線測試.... 35 圖 十一、川木通乙酸乙酯層區分物對綠膿桿菌 ( Pa 3651 ) 之殺菌曲線測試 ................................................................................................................... 35 圖 十二、鐵線透骨草乙酸乙酯層區分物對金黃色葡萄球菌 ( Sa 0752 ) 之殺 菌曲線測試............................................................................................... 36 圖 十三、威靈仙乙酸乙酯層區分物對金黃色葡萄球菌 ( Sa 0752 ) 之殺菌曲 線測試 ....................................................................................................... 37 圖 十四、川木通乙酸乙酯層區分物對金黃色葡萄球菌 ( Sa 0752 ) 之殺菌曲 線測試 ....................................................................................................... 37 圖 十五、DPPH 自由基清除能力測定 .................................................................. 40 圖 十六、Trolox 標準曲線..................................................................................... 41. X.
(14) 圖 十七、三種中草藥之 ABTS 自由基清除率 .................................................... 42 圖 十八、三種中草藥之還原力測試 ..................................................................... 43 圖 十九、Gallic acid 標準曲線 .............................................................................. 44 圖 二十、Quercetin 標準曲線................................................................................ 45 圖 二十一、鐵線透骨草活性區分物之薄層色層分析 ......................................... 46 圖 二十二、川木通乙酸乙酯層區分物之薄層色層分析 ..................................... 47 圖 二十三、威靈仙乙酸乙酯層區分物之薄層色層分析 ..................................... 48 圖 二十四、川木通乙酸乙酯層區分物之 GC-MS 圖......................................... 49 圖 二十五、威靈仙乙酸乙酯層區分物之 GC-MS 圖......................................... 50 圖 二十六、鐵線透骨草乙酸乙酯層區分物之 GC-MS 圖................................. 50 圖 二十七、鐵線透骨草經管柱色層層析後之活性區分物之 GC-MS 圖......... 50. XI.
(15) 表目錄 表 一、抗生素濃度表 ............................................................................................. 18 表 二、臨床金黃色葡萄球菌菌株抗生素敏感性測試 ......................................... 27 表 三、粗萃物及各區分層抑菌活性測試 ............................................................. 29 表 四、最小抑菌濃度與最小殺菌濃度測試 ......................................................... 31 表 五、耐熱性測試.................................................................................................. 38 表 六、耐酸鹼測試.................................................................................................. 39 表 七、三種中草藥乙酸乙酯區分物之 GC-MS 分析.......................................... 51 表 八、三種中草藥之抗氧化能力測試總表 ......................................................... 55. XII.
(16) 第一章 前言 在 1940 年以前醫院裡充滿因細菌感染所引起之傳染性疾病的病人，其中許 多病患正值青壯年時期。這些病患常因為在治療過程中不慎與他人發生交互感 染而引起併發症，嚴重者因多重感染而死亡。然而，自 1980 年後至今的醫院 裡反而多是各種癌症、心臟病、高血壓、糖尿病等疾病病患。醫學界能夠在短 短四十年的時間有這麼重大的轉變，主要是因為抗生素（Antibiotics）的誕生。 抗生素始於 1928 年英國科學家弗萊明（Alexander Fleming）在遭黴菌污染 的葡萄球菌培養皿中發現的，由於他看到在黴菌的附近葡萄球菌都無法生長， 因而推測黴菌具有殺菌之能力，使得細菌無法生長。後來經由錢恩（Earnest Chain） 、佛洛裡（Howard Florey）以及希特利（Norman Heatly）等人研究及發 展，才將這第一個被發現的抗生素－盤尼西林 （penicillin）成功的使用在人體 身上，並引起一連串對抗生素的研究 1, 2。 隨著時代的改變、醫療品質的改善及醫療技術發展純熟之下，抗生素的種 類隨之增加。然而，隨著人們對於抗生素的過度依賴促使細菌對抗生素產生抵 抗能力，例如：盤林西尼自 1940 年代開始使用，抗盤林西尼的金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus，SA）於三至四年內就出現。而在醫院濫用抗生素的情 形下，更使得細菌同時對多種抗生素具抗藥性而形成所謂的多重抗藥性細菌。 這些抗藥性細菌的產生使得許多現行的抗生素不再具有效用，而在醫療院所中 發生的院內感染更成為醫療界的重大問題 2-4。 因此，我們必需不斷研發新的抗生素來取代現有的藥物。然而，新型藥物 的研發對製藥業來說是種藥物革命，研發過程必須不斷面對失敗與成本損耗。 動物及人體試驗更是新藥必須面對的一大挑戰，尤其是台灣在人體試驗這關不 如國外有著足夠的病患以及病患對於藥物信心程度，使得在推動新藥過程出現 瓶頸。再加上新藥有諸多風險，如藥物穩定性、是否會造成細菌的突變等，使 得新藥研發的成功率大為下降。面對如此高研發失敗率，有部份研究人員進而. 1.
(17) 尋求其他足以代替抗生素的抗菌藥物。 早在化學製藥盛行前，先民們為了尋求生存而建立了許多古老的醫療體 系。在自然界中取得的各種天然材料進行處理以使之成為藥材來醫治人們的病 痛；或是成為日常飲食中的食材，以達到保養功效。由於這些藥草多數具有一 定的療效，且具有較低的副作用、低毒性以及易被人體吸收的特性，因而吸引 許多研究人員轉向研究以傳統醫藥來代替抗生素。 中草藥為我國數千年中醫藥資產，歷經中醫藥臨床考證驗治的結晶，且中 藥品種繁多，資源豐富。將中草藥開發製成新藥，我國相較國外具有競爭優勢， 其因在於具有深厚的臨床實驗作基礎，透過中醫藥典籍中所記錄的中醫藥臨床 考證驗治知識，選擇適當標的藥物，並非靠盲目藥物篩選。如此在新藥開發中 具有高命中率，風險少，投入資金相對地少及開發期相對縮短的種種優勢。 近年來於許多研究發現人類的老化現象、癌症及心血管病變等問題與人體 內的活性氧（即為自由基）與脂質的過氧化作用有關，也有許多研究指出抗氧 化物質的抗氧化能力與其還原力及對金屬離子的螯合能力之間有著密切關係。 此外，隨著人們生活水準的提高，養生保健也開始漸漸倍受重視。藉由化學合 成的保健藥品因為單價較高或僅有少數保健效果，更容易產生為了達到效果而 攝取過量中毒的問題。 因此，人們轉而開始尋求較天然，低單價又具有多種效用，低毒性的保健 品。眾多的中草藥中有許多藥材具有多種保健功效，同時也是常用的食材之一 而受到重視。這些藥材因為長久以來被用為保養食材的特性而成為抗氧化物質 的研究題材。 本研究即以中草藥為研究題材，希望能在眾多常用中草藥中尋得具抑殺抗 藥性病菌活性的藥材並研究其含有的有效成分。同時探討這些中藥草之乙醇萃 取物所具有的抗氧化能力。. 2.
(18) 第二章 文獻回顧 1. 研究藥材的選擇 由於中草藥的藥材來源廣泛，因此我們設定了一些條件來做為我們尋找具 有抑菌能力之藥材的基礎。在本實驗室中已有學長依我們所設定的條件進行了 測試，並從中確定了包含威靈仙等數種具有抑菌效果的中草藥。在這些具抑菌 效果的中草藥中，我們選擇了威靈仙來做為研究題材. 22, 33. 。在經過相關文獻的. 檢閱後，我們發現川木通及鐵線透骨草等兩種常用中草藥的來源植物亦與威靈 仙一樣是毛茛科（Ranuculaceae）威靈仙屬（Clematis）植物，故我們將三種中 草藥一同列為研究題材來探討。. 2. 威靈仙簡介 威靈仙（Clematidis Radix ） ，是毛茛科（Ranuculaceae）威靈仙屬 （Clematis） 植物的根乾燥製成。早在南北朝時期的 [ 集驗方 ] 中就有提及威靈仙的相關 記錄，而後在唐朝周群巢所著的 [ 威靈仙傳 ]、宋朝的[ 開寶本草 ]、[ 証類 本草 ]、明朝的 [ 本草綱目 ] 及清朝的 [ 植物名圖實考 ] 都有對威靈仙的植 物形態及功能藥效做記載，其主要來源植物為威靈仙（C. chinensis Osbeck） 、棉 團鐵線蓮（C. hexapetala pall.）和東北鐵線蓮（C. manshurica Rupr.）5, 6。 威靈仙的產地北自大陸東北，南至台灣，分佈甚廣。依古籍敘述其莖呈四 方形，枝葉約六～七層，每層約六～七片葉子，開淺紫色或白色的花，根生長 稠密。採收時期以九月到十二月為佳，採集方式以採收其根部洗淨後陰乾即可 （圖一 7） 。. 3.
(19) 圖 一、威靈仙乾燥品. [ 本草綱目 ] 的釋名曰： 「威，言其性猛也。靈仙，言其功神也。」[ 圖考 ] 曰： 「其力勁，故謚日威。其效捷，故諡曰靈。威靈合德，仙之上藥也。」[ 開 寶 ] 曰：「一名能消。」從這些古籍中的敘述可以得知威靈仙是因具有快速又 有效的治療效果而得其名。而在方劑中常用來治療風濕、關節炎、腰痛、腳氣 浮腫等，其水煎劑對平滑肌痙攣有鬆弛作用，可治骨骾之症，外洗則可解毒止 癢。 在威靈仙的藥理試驗方面，其水浸劑在試管試驗中具有抑制皮膚癬菌的能 力，同屬植物 C. angustifolia 的煎劑對小白鼠的離體腸管有興奮作用，可使已 麻醉的狗的血壓下降、腎臟收縮。另外，國內針對川威靈仙及本威靈仙的抽出 物做了一些試驗包括毒性、利尿作用、消腫作用、抗扭曲作用及對中樞神經系 統影響等方面，其結果如下 8： (1)毒性試驗： 川威靈仙及本威靈仙的甲醇及水抽出物對雄性小白鼠以 5000 mg/kg 口服 72 小時無毒性顯示，腹腔注射部分川威靈仙的甲醇及水抽出物 2500 mg/kg，本 威靈仙的甲醇抽出物 5000 mg/kg 及水抽出物 500 mg/kg 經 72 小時無毒性反應。 在對中樞神經系統影響上，川威靈仙的甲醇抽出物在口服 5000 mg/kg 或腹腔注. 4.
(20) 射 2500 mg/kg 和本威靈仙的甲醇及水抽出物在口服 5000 mg/kg 或腹腔注射 500 mg/kg 的劑量下經 1 及 3 小時對雄性小白鼠均無毒性反應。 (2)利尿作用： 川威靈仙的乙醇、50 %乙醇及水抽出物無明顯利尿效果，而本威靈仙的乙 醇抽出物在 1000 mg/kg 劑量，水抽出物在 2500 mg/kg 劑量，及 50 %乙醇抽出 物在 5000 mg/kg 劑量下給雄性大鼠口服有顯著的利尿現象。 (3)消腫作用： 本威靈仙的 50 %乙醇抽出物給雄性大鼠口服 5000 mg/kg 劑量有顯著的消 腫作用。 (4)抗扭曲作用： 川威靈仙的乙醇及 50 %乙醇抽出物，本威靈仙的水抽出物在 250 mg/kg 劑 量下給雄性小白鼠進行皮下注射均有顯著的抗扭曲作用。 據文獻指出，威靈仙主要成份含有原白頭翁素（protoanemonin） 、白頭翁素 （Anemonin)、白頭翁醇（Anemonol） 、內酯類、固醇類、醣類、皂苷、內酶酚 類、胺基酸、生物鹼、有機酸及蒽醌物質( anthraquinone )等。原白頭翁素和白 頭翁素可能為威靈仙的抑菌成份，皂苷類則具有消炎作用 5, 9, 10。. 3. 川木通簡介 木通最早見於[ 神農本草經 ]中，在唐、五代之前稱為通草，到了[ 食性本 草 ]才開始有木通之名。木通屬常用生藥，具有消炎利尿之效，在歷代的藥藉 藥典多有記載。由於時代及地域之不同木通之基原植物也越來越多，而就其植 物形態大體言之可分成二大系列即其一為「繞樹藤生」之灌木，二為直立性灌 木。 雖然木通的基源植物有很多，但由於李時珍在[ 本草綱目 ]中對木通的敘 述太過強調“有細孔，兩頭皆通”，使得東北木通（俗稱關木通（圖三. 11. ），. Aristolochia manshuriensis（Aristolochiaceae））的木質莖充斥於各地市場。直到. 5.
(21) 1993 年比利時醫師 Vanherweghem 發表了兩則因中藥馬兜鈴酸引起的腎損害 的病例後，關木通才因此而被禁用，此時市售的木通改以川木通代之。. 圖 二、川木通. 圖 三、關木通. 川木通（圖二 11)又稱淮木通（出自 [中藥志]） 、油木通、白木通（出自 [四 川中藥志] ），為毛茛科小木通 C. armandii Franch、繡球藤 C. montana Buch.-Ham.、粗齒鐵線蓮 C. argentilucida（Levl. et Vant.）W. T. Wang、鈍齒鐵線 蓮 C. apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. 等植物的藤莖。主產於四川、湖 南、湖北、江西、貴州等地，從海拔 400～4000 m 的山坡、灌木叢、溝邊、林 邊中均有分佈。 川木通主要採收於秋季，以較老的莖截成長段後去皮陰乾而成。 川木通性寒，味淡苦，無毒，具有清熱利水，活血通乳之功效，可用以治 療腎臟病水腫，急性腎炎小便不利，濕熱癃閉，淋病，婦女經閉及乳閉等 12-16。. 4. 鐵線透骨草簡介. 6.
(22) 透骨草是中醫骨傷科常用中藥，臨床上主要用於治療跌打損傷。透骨草的 品種複雜，初步統計，在我國作透骨草入藥或有透骨草稱謂者，單原植物就有 14 科 27 種，在這諸多的品種中，其功效不盡相同，甚至完全不同，有的還有毒 性。 鐵線透骨草最早出現於 [ 醫學指南 ]，又稱狗腸草，其主要來源為毛茛科 黃花鐵線蓮 C. intricate Bge 的乾燥全草，部分地方則以細葉鐵線蓮 C. aethusaeta Bge 的乾燥全草做為來源。主要產於河北、北京等地，於夏、秋季間採割，去 淨雜草後全草曬乾而成。具有治療風濕性關節炎，癢疹，疥癩等功效 17-19。. 5. 臨床抗藥性病菌簡介 抗生素可說是對人類最偉大的發現，自英國科學家弗萊明發現盤尼西林 後，人類不再為了細菌感染造成的併發症而感到害怕。大量的抗生素研究及開 發，讓我們可以依不同的感染情況使用不同的抗生素。但是，基於物競天擇， 細菌也是一直在尋找各種可以生存的方式，因而形成具抗藥能力的抗藥性病菌。 致使抗藥性病菌的形成主要原因在於抗生素的濫用。自從發現抗生素以 後，人們對抗生素的能力越來越依賴，例如在醫療行為上，人們為了快速的治 療，常不論該病患是否為細菌感染，均給予使用抗生素做為治療，這行為讓細 菌受到大量的抗生素刺激，而在醫療行為結束後，存活下來的細菌就產生了對 抗生素的抗藥性。另一個讓細菌產生抗藥性的來源是養殖業對抗生素的濫用， 養殖業由於必需在有限的空間中畜養大量的動物，為了能得到較高的產能，他 們在動物的飼料中添加了大量的抗生素，有的是因為在動物身上有促進生長的 作用，有的則是為了預防感染。然而這些用於動物的抗生素卻因來不及代謝而 隨著人們的食用進到人體，因而誘使人體內的細菌產生抗藥性。 細菌產生抗藥性的主要變異點在其基因中，由於受到抗生素的刺激使細菌 為了生存而產生了基因變異，這些變異基因常存在於細菌的染色體 （chromosome）或質體（plasmid）中。特別的是，存在於質體中的抗藥基因常. 7.
(23) 會透過細菌間的接合（conjugation）而傳給其他細菌，這樣特別的情形使得具 抗藥能力的細菌越來越多。而在醫院中，因為這樣的基因傳遞造成了嚴重的院 內感染情形，同時更因為醫院過度濫用抗生素，造就了多重抗藥性病菌，甚至 出現了全抗藥性病菌，這使醫院又回到了沒抗生素可用的窘境 1-4。 根 據 行 政 院 衛 生 署 疾 病 管 制 局 的 統 計 ， 鮑 氏 不 動 桿 菌 （ Acinetobacter baumannii ）、 綠 膿 桿 菌 （ Pseudomonas aeruginosa ） 及 金 黃 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus）均佔台灣各區域醫院及醫學中心院內感染的前 10 名 22，因此，本實驗以這三種抗藥性病菌為研究的目標菌株，期望尋找具廣效性 的殺菌物質來做為輔助治療的藥物 20, 21。. 6. 中草藥有效成份的萃取方法 常見的中草藥有效成份萃取方法是以溶劑來進行萃取，其原理是利用溶劑 對中草藥中各成份之溶解度大小來選擇溶劑，再利用多次更換萃取溶劑來取得 所要的有效成份. 22. 。所選擇的溶劑必需具有對所需求的有效成份有較高的溶解. 度，對不需要的物質則溶解度低，且不會與中草藥有化學變化。中草藥的成份 在溶劑中的溶解度與溶劑的性質有直接的關係，一般溶劑可分為水、親水性有 機溶劑及親脂性有機溶劑，而被溶解的物質也有分親水性及親脂性。因此，我 們可以依照所要成份的性質來選擇最適當的溶劑，以提高有效成份的萃出率。 在萃取時將溶劑加到適量的中草藥中，這時溶劑會因為擴散作用及滲透作用漸 漸的滲入細胞裡，而細胞在溶劑滲入時會因為細胞內外的濃度差而將溶劑可溶 解的成份向細胞外擴散以達到細胞內外的濃度平衡。透過多次更換溶劑的方 式，一次次將細胞外的溶劑取出換新，細胞內的有效成份就會在一次次的濃度 平衡而漸漸被溶出，最後，中草藥中的有效成份就幾乎完全被溶解出。 在上述的萃取方式所得到的有效成份其實還是屬於混合物，我們稱之為粗 萃物，粗萃物中除了我們所想要得到的有效成份外還有其他因為性質與所選擇 的溶劑相似而溶出的雜質，為了能夠取得真正的有效成份，我們還需要做進一. 8.
(24) 步的純化，因而本實驗使用了分配萃取法。分配萃取法是利用粗萃物中的各成 份在兩個不相溶的溶劑裡的分配係數不同而達到分離的效果。因此，如果混合 物中各成份在用來進行分配萃取的兩個溶劑裡的分配係數相差越大，其分離效 果就越好，但是，如果兩個溶劑的性質較相近，則分離效果就會變差，進而影 響到對有效成份的進一步精製。. 7. 天然抑菌成份的介紹 目前已有許多文獻指出在許多天然物中具有抑菌成份，這些抑菌成份基本 分成以下幾類： (a)羥肉桂酸衍生物：主要存在於蔬果、穀類和堅果等的高等植物中，能抑 制革蘭氏陽性菌及陰性菌、酵母菌和黴菌等 23。 (b)咖啡因：主要存在於咖啡、可可豆及茶中，具有抑制黴菌生長的功效 24。 (c)茶鹼、可可鹼：與咖啡因類似，為黃嘌呤甲基化的衍生物，由茶葉中萃 取出來的可可鹼和茶鹼對部份食物病原菌有殺菌效果 25。 (d)類黃酮類：多以配糖苷的方式存於植物中，有研究認為其抗菌活性來自 配醣基部份 26。 (e)生物鹼：廣泛存在於植物中的二級代謝物，以植物的根、莖、果實及葉 中含量較多，但不同植物的生物鹼具有不同的生理功能。例如：有文獻指出馬 鈴薯所含的生物鹼 α-solanine 有抑菌效果 27。 (f)有機酸：有機酸存在於天然食品中，亦可透過發酵作用來產生。文獻指 出有機酸可以降低基質的 pH 值及減少細胞內因解離的酸分子化而產生的氫離 子 28。. 8. 抗氧化簡介 (1.)自由基與活性氧 自由基是含有一個或多個不成對電子並獨立存在的原子或分子，因此自由 基是以一種很不穩定的形態存在。為了能回到穩定狀態，自由基會與其他分子 9.
(25) 進行反應以取得電子，但是這樣的反應會使與其反應的另一個或多個分子也因 缺少電子而成為新的自由基，這個新的自由基也會再與其他分子重覆上述反應 而成為連鎖反應。 在人體中，自由基的來源除了粒線體中呼吸作用的副反應外，還有其他如 白血球活化、氧化還原酵素、血紅素自體氧化（auto-oxidation）等生化反應中 產生的，另外受到紫外線及輻射照射、或是藥物及環境毒物等亦都會在人體中 產生自由基。 由於自由基很活潑，很容易與其他分子反應，這使得生物體內的分子很容 易就被氧化或修飾。因此，在細胞中的蛋白質、脂質、酵素、RNA 和 DNA 等 都很容易被自由基攻擊而產生病變。更有研究指出自由基攻擊細胞所產生的代 謝物和老化速度有顯著的相關性 29, 30。 (2.)抗氧化與自由基清除 自由基因為具有活潑的化學特性，在過量的情況下就會對細胞造成傷害。 不過在人體裡也自有一套可以清除自由基的酵素系統，這個系統主要是一些利 用與金屬結合來催化反應以消除自由基的酵素，包括超氧岐化酶（superoxide dismutase，SOD） 、觸酶及麩胱甘肽過氧化酶 （glutathione peroxidase，GSHPx） 等。在正常的狀態下，只要有充足的營養就可以維持這個系統的運作。但是， 隨著年齡的增長，身體的抗氧化系統也慢慢的失去能力，使得體內的氧化還原 失去了平衡，這時就需要依靠額外補充抗氧化物質來作為輔助。 一般抗氧化物質可依其作用原理分為 31, 32： (i)自由基終止型：主要作用在提供電子或氫原子給自由基，以干擾或延滯 連 鎖 反 應 中 的 增 殖 步 驟 ， 大 多 數 為 酚 類 化 合 物 ， 如 丁 基 羥 基 甲 苯 （ butyl hydroxy-anisol，BHA）、二丁基羥基甲苯（dibutyl hydroxy toluene，BHT）等， 屬於一級抗氧化劑。 (ii)還原劑或氧清除劑：主要作用在於捕捉環境中的氧原子以避免氧化反應 的發生，或提供氫原子以讓過氧化物還原來減緩氧化反應的進行，如維生素 C 10.
(26) 及其鹽類。 (iii)金屬螫合劑：這類型的物質本身並不具有清除自由基的能力，但是可以 與 Cu2+、Fe2+等催化氧化反應的二價金屬離子結合的能力，藉由這樣的能力來 減緩氧化反應的進行，如檸檬酸（citric acid）、聚磷酸鹽 （polyphosphate）及 一些類黃酮（flavonoids）化合物。 (iv)單重態氧抑制劑：可以破壞單態氧（1O2）的氧化作用而抑制光氧化的 進行，例如 β-carotene 和 triethylamine 等. 11.
(27) 第三章 研究目的 威靈仙在中藥中具有治療風濕、去骨哽、活經絡等功效，而在文獻中更有 前人研究發現其亦具有抗菌、抗癌等能力。川木通則因關木通含馬兜鈴酸而受 重用，而鐵線透骨草是中醫骨傷中的常用藥之一。以上三種中草藥均是以毛茛 科威靈仙屬植物為其主要的藥物基源。有鑑於近年來因抗生素的濫用造成越來 越多抗藥性細菌的產生，使細菌感染越來越不易治癒，本研究希望能藉由中草 藥的萃取及各種純化分離的方法來研究此三種中草藥是否具有有效的抗菌成 份，同時研究其抗氧化能力。. 12.
(28) 實驗流程如圖四所示。. 中草藥 ( 威靈仙、川木通、鐵線透骨草 ). Extracts ( 95% Ethanol ). 抗菌性質分析. 13. TEAC. 圖 四、實驗架構. 抗氧化能力測試. DPPH. 測 定. GC-MS. 及. 抑 菌 活 性 測 試. TLC. 殺 菌 曲 線. MBC. 耐 熱 性 測 試. MIC. 耐 酸 鹼 測 試. 有效成分結構鑑定. 自 由 基 清 除 力 測 試. 總 抗 氧 化 力 測 試. 總 酚 含 量 測 定. 總 類 黃 銅 含 量 測 定. 還 原 力 測 定.
(29) 第四章 實驗材料與方法 1.實驗材料 中草藥： 威靈仙、川木通、鐵線透骨草，購自高雄地區中藥店。 菌株： 實驗之臨床菌株來自奇美醫院病患之血液、痰液所分離出來之金黃色葡萄 球菌（Staphylococcus aureus） ，及嘉義基督教醫院所分離的綠膿桿菌與鮑氏不動 桿菌。另購自新竹食品工業發展研究所菌株保存中心的對照菌株 Acinetobacter baumannii. ATCC. 19606,. Pseudomonas. aeruginosa. ATCC. 29260. 及. Staphylococcus aureus ATCC 6538P。 抗生素： Ampicillin （AM） 、Kanamycin （KM） 、Gentamycin （GM） 、Tetracycline （TC)、Streptomycin （SP） 、Cephalexin （CN） 、Erythromycin （EM） 、Clindamycin （CC） 、Amixillin （AMOX） 、Trimethoprim sulfamethoxazole （SXT） 、Amikacin （amk）、Imipenem （IMP）及 Piperacillin G （PIPG）均購自 Sigma。 溶劑： 乙醇（Ethanol，EtOH） 、甲醇（Methanol，MeOH） 、正己烷 （n-Hexane）、 乙酸乙酯（Ethyl acetate，EA）、氯仿（Chloroform）等均購自景明化工，純度 皆為試藥級或 LC 級。 培養基： LENNOXL BROTH，LB broth（Acumedia Manufacturers，USA） ：Enzymatic Digest of Casein 10 g/L；Yeast Extract 5 g/L；NaCl 5 g/L。 AGAR， Bacteriological（Acumedia Manufacturers，USA）。 Mueller Hinton Broth，MHB ( DIFCO )：Beef Extract Power 2 g/L；Acid Digest of Casein 17.5 g/L；Soluble Starch 1.5 g/L。 14.
(30) LA medium：LB Broth with 1.5 % agar。 LB – ampicillin agar：LA medium 滅菌後冷卻至 55 ℃，加過濾滅菌的 Ampicillin，使最終濃度為 50 μg/mL。 Mueller Hinton agar：Mueller Hinton Broth with 1.5 % agar。 MH Soft agar：Mueller Hinton Broth with 0.75 % agar。 LA Soft agar：LB Broth with 0.75 % agar。 儀器設備： 減壓濃縮機：Rotary evaporator N-1000（EYELA） 。 GC：Agilent，6890N（G1530N），USA MS：Agilent，5975 Inter Mass Selective Detector，USA Column：Agilent，DB-5（60 m × 250 μm × 0.25 μm） 其他化學藥品: α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl（DPPH，SIGMA） 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid（Trolox，SIGMA） 3,4,5-Trihydroxybenzoic acid（Gallic acid，SIGMA） 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic. acid). （ABTS，SIGMA） Folin & Ciocalteu’s phenol reagent（SIGMA） 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol（BHT，SIGMA） Quercetin dihydrate（SIGMA） Aluminium nitrate（Al(NO3)3，SIGMA） Potassium Acetate（CH3COOK，SIGMA） Sodium Phosphate Dibasic（Na2HPO4，SIGMA） Sodium phosphate（NaH2PO4，SIGMA） Potassium ferricyanide（K3Fe(CN)6，SIGMA） Ferric chloride（FeCl3，SIGMA） 15. diammonium. salt.
(31) Tricarboxylic acid（TCA，SIGMA）. 16.
(32) 2. 實驗方法 (1) 抗生素感受性測試 抗生素紙錠之製作 22, 33 將抗生素以無菌水依表一之濃度分別配製成儲存液後存放於-20 ℃備用。 取 10 μL 之抗生素加入直徑 8 mm 之空白紙錠中，製成抗生素紙錠。 抗生素感受性測試 挑取單一菌落接種於 5 mL LB broth 中，以 37 ℃振盪培養 16 小時後，再 以 LB broth 稀釋至 OD600 = 0.3，自稀釋菌液中取 50 μL 至 5 mL 未凝固之 Soft agar 中，混合均勻後倒入已含有 LA medium 的培養基形成 double layer，並靜 置 30 分鐘至 1 小時使其冷卻凝固。待培養基凝固後再將含有抗生素的紙錠貼 上，靜置 1～2 小時後，再將培養基倒置培養於 37 ℃、16 小時，觀察是否產生 抑制圈並記錄結果。. 17.
(33) 表 一、抗生素濃度表 名稱 Amikacin (AMK) Amoxicillin (AMOX) Ampicillin (AM) Cephalexin (CN) Streptomycin (SP) Trimethorim -sulfamethoxazole (SXT) Clindamycin (CC). 濃度 (mg/mL). 名稱 Erythromycin (EM) Gentamycin (GM) Imipenem (IMP) Kanamycin (KM) Tetracycline (TC). 30 30 50 30 15. Piperacillin G (PIPG). 40 15. 18. 濃度 (mg/mL) 25 15 50 15 15 30.
(34) (2) 粗萃物之製備 將中草藥以高速研磨機磨碎至適當大小，以 95 % 的乙醇為萃取溶劑，依 中草藥與乙醇為 1：5 的比例在 37 ℃、200 rpm 培養箱中隔夜振盪萃取，抽氣 過濾，收集濾液並重覆萃取兩次。將濾液於 40 ℃下進行減壓濃縮，並將乾燥後 的粗萃物保存於 4 ℃下備用 22, 33。. (3) 分配萃取 將乾燥的粗萃物加入適當體積的二次水充分震盪使其完全懸浮，再以兩倍 體積的 Hexane 進行分配萃取，待靜置分層後，收集有機相，並重覆進行萃取至 少兩次，接著再將水相分別以 Chloroform 及 Ethyl acetate 進行分配萃取。收集 各分層區分物，同時將萃取所得的萃取液進行減壓濃縮後，再以紙錠擴散法進 行活性測試 22, 33，如圖五所示。. (4) 管柱色層層析（Column Chromatography） 將 100 g 的 silica gel（70～230 mesh）填充於 2.5 × 60 cm 的玻璃管柱中， 以 Methanol：Ethyl Acetate：Hexane＝1：3：6（v/v）混和液為移動相，並取 1 g 的 sample 進行管柱色層層析，每 20 mL 收集至樣品瓶。收集之區分物 TLC 測試後，將相同結果的區分物合併進行濃縮，並利用紙錠測試法分析各區分物 之抑菌活性。 重覆上述方法並改以 Ethyl Acetate： Hexane＝4.：6（ v/v）混和液及 Acetone：Chloroform＝3：7（v/v）混和液進行管柱色層層析。. 19.
(35) 粗萃物水懸浮液 Hexane Hexane 層萃取液. 水層 Chloroform. Chloroform 層萃取液. 水層 Ethyl acetate. Ethyl acetate 層萃取液. 圖 五、分配萃取流程示意圖. 20. 水層.
(36) (5) 抗菌活性分析 ( i ) 最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）測定 將有效區分物以 1 g/mL 的濃度用甲醇回溶，再以不同的量加至 5 mL 的 LB broth 中，使成為含有不同濃度萃出物的培養液。 將已培養 16 小時之菌株以 LB broth 經序列稀釋至 106 CFU/mL，自稀釋菌 液中取 100 μL 接種於含有萃出物之 LB broth 中，再置於 37 ℃、220 rpm 培養箱 中隔夜振盪培 16 小時。 自上述菌液中分別取 100 μL 以無菌玻璃珠均勻塗佈培養基上，再將培養基 倒置培養於 37 ℃、16 小時後以肉眼觀察菌體生長狀況。以能抑制 90 %細菌生 長的濃度為最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentraction，MIC） ，能抑制 99 % 以 上 細 菌 生 長 的 濃 度 為 最 低 殺 菌 濃 度 （ Minimum Bactericidal Concentration，MBC） 。. ( ii ) 殺菌曲線（Time-Killing curve） 取試驗菌株之單一菌落接種於含 Ampicillin（50 μg/mL）的 5 mL LB Broth 中，於 37 ℃、220 rpm 培養箱中隔夜振盪培養 12 小時。將培養好的菌液以序列 稀釋調整到 106 CFU/mL 後，取 100 μL 加入含有 2 倍 MIC 藥量及 Ampicillin 的 5 mL LB Broth 中，並置於 37 ℃、220 rpm 培養箱培養，同時在培養了 0.5、1、 2、4、8、12 和 24 小時的時段分別取 100 μl 菌液搖盤後，培養於 37 ℃、16 小 時，計算其菌落數，繪成一曲線以了解其具有抑菌或殺菌效果。. (6) 萃出物穩定性測試 ( i ) 耐熱性測試 取適量待測物於微量離心管內，並分別置於 40 ℃、60 ℃、80 ℃恆溫槽和 滅菌釜 1 小時，再利用紙錠擴散法測試經熱處理後之待測物的抑菌活性。 21.
(37) ( ii ) 耐酸鹼測試 取適量待測物於微量離心管內，分別加入 pH 值為 2.0、5.5、8.9 和 12.0 的 甲醇中，再利用紙錠擴散法測試抑菌活性，藉此判斷溶劑的酸鹼對活性物質的 影響。. (7) 抗氧化活性分析 ( i ) 總酚量測定 藥品配製 Na2CO3：取 1 g Na2CO3 加入二次去離子水 50 mL 溶解後備用。 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent：取 2.5 mL Folin reagent 以二次去離子水定 量至 10 mL 後備用。 待測樣品：取 0.1 g 待測物加 1 mL 二次去離子水溶解後備用。 實驗步驟 取 0.1 mL 的待測物加入 2.8 mL 二次去離子水，2 mL 2 % Na2CO3 及 0.1 mL 25 % Folin reagent，充份混勻於室溫靜置 30 分鐘後，測定 750 nm 的吸光值。 重覆上述步驟測定不同濃度的 gallic acid 做為標準曲線 34。. ( ii ) 類黃酮含量測定 藥品配製 1000 ppm Quercetin dehydrate：取 0.01 g 的 Quercetin dehydrate 溶於 10 mL 甲醇中備用。 10% Al(NO3)3：取 0.5 g Al(NO3)3 溶於 5 mL 甲醇中備用。 1M CH3COOK：取 0.49 g CH3COOK 溶於 5 mL 甲醇中備用。 實驗步驟 取 1 mL 的待測物加入 3.8 mL 甲醇中，並加入 100 μl 的 10 % Al(NO3)3 反. 22.
(38) 應 40 分鐘，再測 OD415。重覆上述步驟測定不同濃度的 Quercetin dihydrate 做 為標準曲線 34。. ( iii ) DPPH 自由基清除能力測定 藥品配製 取 DPPH 0.1 g 在室溫避光的環境下溶於 50 ml 甲醇中。將 0.01 g 萃出物溶 於 1 mL 甲醇中，再取出 0.1 mL 萃出物溶液加 0.9 mL 甲醇至 1 mL，依此序列 稀釋。 實驗步驟 各取 1 mL 不同濃度的待測物甲醇溶液分別加入 0.25 mL DPPH 及 0.25 mL 甲醇為實驗組及對照組，於室溫下避光反應 30 分鐘後，測 517 nm 的吸光值。 另取 1 mL 甲醇加 0.25 mL DPPH 做為控制組。再以下列公式計算其 DPPH 清除 率 35。 . DPPH 清除率( % ) ＝ 1－. 實驗組吸光值 －對照組吸光值 100% 控制組吸光值 . ( iv ) 還原力的測定 藥品配製 磷酸鈉緩衝液：取 2.68 g Na2HPO4．12H2O 和 1.96 g NaH2PO4．H2O 以二 次去離子水溶解後，定量至 100 mL，於 4 ℃可貯存 2 星期。 K3Fe(CN)6：實驗當日配製。稱取 0.10 g K3Fe(CN)6 加入二次去離子水定量 至 10 mL，於褐色瓶中冰浴備用。 TCA：稱取 1 g TCA 加入二次去離子水定量至 10 mL，於室溫下貯存備用。 FeCl3：實驗當日配製。稱取 0.01 g FeCl3 加入二次去離子水定量至 10 mL， 於褐色瓶中冰浴備用。 實驗步驟. 23.
(39) 取 150 μL 不同濃度之萃取液，加入等體積磷酸鈉緩衝溶液及 1% K3Fe(CN)6 混合均勻後，於 50 ℃水浴 20 分鐘，冰浴冷卻，再加入 150 μL 10% TCA、600 μL 二次去離子水及 0.1% FeCl3 反應 14 分鐘後，以分光光度計檢測其 700 nm 之吸 光值。吸光值愈高表示樣品的還原力愈強。以樣品濃度對吸光度作圖，利用直 線斜率代表測試樣品之還原力，斜率愈高代表樣品還原能力愈強 36。. ( v ) 總抗氧化力測試（total equivalent antioxidant capacity，TEAC） 藥品配製 Sodium phophate buffer：取 1.091 g Na2HPO4、0.36 g NaH2PO4‧2 H2O 和 8.78 g NaCl 溶於 800 mL 去離子水，調至 pH 7.4 再加水至 1000 mL。避 光 4℃儲存，一星期內使用。 ABTS stock 溶液：取 10 mg ABTS 及 2.9 mg Potassium persulfate 溶於 10 mL 0.01 M sodium phosphate buffer（0.15 M NaCl，pH 7.4） ，混合於 25℃避 光反應 16 小時備用。 ABTS 分析溶液：取 2 mL ABTS stock 溶液加入 18 mL 0.01 M sodium phosphate buffer（0.15 M NaCl，pH 7.4）稀釋，並調整 ABTS 分析溶液使 其於 734 nm 吸光值在 0.85 左右，記錄吸光值做為控制組數值。此分析溶 液需當天新鮮配製。 Trolox：稱取 1.0 mg Trolox 溶於 20 mL 0.01 M sodium phosphate buffer（0.15 M NaCl，pH 7.4）當天新鮮配製，試劑包以鋁箔避光冰浴儲存。 待測樣品：實驗當天稱取 10 mg 待測物加 1 mL 0.01 M sodium phosphate buffer（0.15 M NaCl，pH 7.4）。 實驗步驟 取不同濃度之樣品溶液 20 μL，依序加入 1 mL 0.175 mM ABTS 溶液，震盪 後避光靜置 10 分鐘，以分光光度計檢測 734 nm 之吸光值。另以不同濃度的 Trolox 抗氧化劑進行測試作為標準曲線 36。以下列公式計算其清除效率： 24.
(40) 清除效率(％) =. 樣品吸光值 1 控制組吸光值 100% . 另以下列公式求其總抗氧化力值： TEAC =. Trolox的IC50 樣品的IC 50. . (8) 有效成份鑑定 ( i ) 薄層色層分析（Thin Layer Chromatography，TLC） 以毛細管吸取 1 μL 中草藥活性區分物（100 mg/mL） ，點於 10 × 10 cm 矽膠 薄層層析板上，以 Acetone：Chloform＝3：7（v/v）混和液為移動相在展開槽 中進行層析。取出後以波長 254 nm 及 365 nm 之紫外光照射進行觀察，另利用 FeCl3 及 Dragendorff 等試劑進行顯色觀察，以分析萃出物之活性成份。. ( ii ) 氣相層析質譜（Gas Chromatography-Mass Spectrophotometer，GC-MS） 將樣品以甲醇回溶至濃度 20 mg/ml 進行 GC-MS 分析，升溫條件為 80 ℃維持 5 分鐘，80～290 ℃，5 ℃/min 維持 5 分鐘，column 之移動相為氦氣， 流量為 1.0 μm/min。. 25.
(41) 第五章 實驗結果 1. 臨床金黃色葡萄球菌之抗生素敏感性測試 本實驗以 10 μL 的抗生素溶液進行紙錠擴散法試驗，將試驗菌株以不同的 抗生素進行感受性分類，如表一所示。其中有 8 株菌株對於除了 Erythromycin ( EM ) 外的抗生素皆會產生抑制圈，故將這些菌株分類為第 I 型。另有 7 株 菌株同時對 Erythromycin ( EM ) 及 Imipenem ( IMP ) 產生了抗藥性反應，我們 將 這 7 株 分 類 為 第 II 型 。 被 分 類 為 第 III 型 的 菌 株 則 是 兩 株 同 時 對 Erythromycin ( EM )、Trimethoprim-sulfamethoxazole ( SXT ) 及 KM 具抗藥性 反應的菌株，第 IV 型則是對 Erythromycin ( EM )、Imipenem ( IMP )、 Amoxicillin ( AMOX ) 及 Kanamycin ( KM ) 有抗藥性反應，共有兩株菌株。剩 餘的兩株菌株分別是對 Erythromycin ( EM ) 及 Amoxicillin ( AMOX ) 有抗藥性 的菌株，我們將他分類為第 V 型及被分類為第 VI 型的菌株對 Erythromycin ( EM )、Imipenem ( IMP )、Trimethoprim-sulfamethoxazole ( SXT ) 及 Kanamycin ( KM ) 有抗藥性反應。 另外，根據學長們的研究顯示，包含對照菌株 Acinetobacter baumannii ATCC 19606、 Pseudomonas aeruginosa ATCC 29260 及 Staphylococcus aureus ATCC 6538P 等 3 株標準菌及其他實驗室現有的臨床鮑氏不動桿菌、綠膿桿 菌、金黃色葡萄球菌均對 15 mg/mL 的 Tetracycline 有高度的敏感性，故以 Tetracycline 為抑菌試驗的正控制組試劑。並分別從各臨床病源菌種中各取兩株 較敏感之菌株與 3 株標準菌株共 9 株做為本研究的測試菌株。. 26.
(42) 表 二、臨床金黃色葡萄球菌菌株抗生素敏感性測試 分類. 抗生素感受性*. 臨床菌株數. I. EMr. 8. II. EMr, IMPr. 7. III. EMr, SXTr, KMr. 2. 2875 2840. 2. 1733 0622. 1. 331. 1. 1745. IV. EMr, AMOXr, IMPr, KMr EMr, AMOXr. V. VI. EMr, IMPr, SXTr, KM. r. 菌種編號 1827 2118 2803 26435 1826 335 2167 1037 924-1 924-2 0748 946 2801 71 0752. * r : resistant. 27.
(43) 2. 粗萃物及各區分層活性測試 本研究以三種毛茛科鐵線蓮屬中草藥為研究標的，利用 95% 乙醇做為萃 取溶劑來進行萃取以取得有效成份進行研究，並利用分配萃取進行初步純化， 萃出物之抑制圈測試結果如表三所示。由表中可知，三種中草藥乙醇粗萃物對 測試菌株 ( Ab9、Pa2167 及 Sa1733 ) 的抑菌圈大小分別為威靈仙 10～14 mm；鐵線透骨草 11～15 mm；川木通 0～15 mm，其中以鐵線透骨草對三種試 驗菌株具有較佳且較廣效的抑菌效果，且三種中草藥均對金黃色葡萄球菌有較 佳的抑制效果。 經過分配萃取後，發現各草藥的活性區分物均分佈於乙酸乙酯層，其抑菌 圈大小分別為威靈仙 20～23 mm；鐵線透骨草 16～20 mm；川木通 12.5～15.5 mm，經比較後以威靈仙及鐵線透骨草的抑菌效果及廣效性最佳且最明顯。. 28.
(44) 表 三、粗萃物及各區分層抑菌活性測試 DIZ ( mm ) 中草藥. 威靈仙. 鐵線透骨草. 川木通. 抗生素. 萃出物. Ab 9. Pa 2167. Sa 1733. 粗萃物. 12 ± 1.63. 10 ± 5.77. 14 ± 0.50. 乙酸乙酯層. 20 ± 1.52. 20 ± 2.56. 23 ± 3.61. 氯仿層. -. -. 10 ± 0.33. 正己烷層. -. -. 10 ± 0.33. 水層. -. -. -. 粗萃物. 14 ± 1.00. 11 ± 0.96. 15 ± 1.00. 乙酸乙酯層. 20 ± 1.41. 16 ± 1.86. 20 ± 2.31. 氯仿層. -. -. 10 ± 0.33. 正己烷層. -. -. 10 ± 0.33. 水層. -. -. -. 粗萃物. 11 ± 1.15. -. 15 ± 2.58. 乙酸乙酯層. 14 ± 2.12. 12.5 ± 0.71. 15.5 ± 0.71. 氯仿層. -. -. 13 ± 1.41. 正己烷層. -. -. 11 ± 1.41. 水層. -. -. -. TC. 36 ± 6.00. 24 ± 7.23. 23 ± 3.00. DIZ：disc inhibition zone -：no active. 29.
(45) 3. 最小抑菌濃度與最小殺菌濃度測試 由於經分配萃取後發現三種中草藥的主要抑菌成份均分佈於乙酸乙酯層， 故我們以各草藥的乙酸乙酯區分物做為測試藥物，分別對各測試菌株進行最小 抑菌濃度及殺菌濃度的測試，測試過程以可殺死測試菌株 90% 菌量為最小抑 菌濃度 ( MIC )，可殺死 99% 菌量為最小殺菌濃度 ( MBC )。 從表四可見，威靈仙對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度約在 6.0～8.0 mg/mL，最小殺菌濃度約在 8.0～10.0 mg/mL；對鮑氏不動桿菌的最小抑菌濃度 約在 8.0～14.0 mg/mL ，最小殺菌濃度約在 10.0～16.0 mg/mL；對綠膿桿菌的 最小抑菌濃度約在 11.0～14.0 mg/mL，最小殺菌濃度約在 12.0～16.0 mg/mL。 鐵線透骨草對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度約在 1.8～3.0 mg/mL，最小殺菌 濃度約在 3.0～4.0 mg/mL；對鮑氏不動桿菌的最小抑菌濃度約在 2.0～5.0 mg/mL，最小殺菌濃度約在 2.3～5.3 mg/mL；對綠膿桿菌的最小抑菌濃度約在 4.3～5.3 mg/mL，最小殺菌濃度約在 4.8～5.5 mg/mL。川木通對金黃色葡萄球 菌的最小抑菌濃度大於 10.0 mg/mL；對鮑氏不動桿菌及綠膿桿菌的最小抑菌濃 度均大於 16.0 mg/mL。 整體而言，在本研究中的三種草藥裡以鐵線透骨草對三種測試菌株的殺菌 藥量最小，平均約 4.24 mg/mL 即可達到清除 99% 目標菌量的目的。. 30.
(46) 表 四、最小抑菌濃度與最小殺菌濃度測試 威靈仙. 鐵線透骨草. 川木通. ( mg / mL ). ( mg / mL ). ( mg / mL ). 測試菌株 MIC. MBC. MIC. MBC. MIC. MBC. Sa 0752. 6.0. 8.0. 3.0. 4.0. >10.0. -. Sa 1733. 6.0. 8.0. 1.8. 3.0. >10.0. -. Sa 6538P. 8.0. 10.0. 3.0. 3.3. >10.0. -. MEAN ± SD. 6.67 ± 1.15. 8.67 ± 1.15. 2.60 ± 0.69. 3.43 ± 0.51. >10.0. -. Ab 9. 8.0. 10.0. 2.0. 2.3. >16.0. -. Ab 20. 14.0. 16.0. 4.5. 5.0. >16.0. -. Ab 19606. 11.0. 12.0. 5.0. 5.3. >16.0. -. 12.67 ± 3.06. 3.83 ±1.61. 4.20 ± 1.65. >16.0. -. MEAN ± SD 11.00 ± 3.00 Pa 2145. 14.0. 16.0. 4.8. 5.0. >16.0. -. Pa 3651. 12.0. 14.0. 4.3. 4.8. >16.0. -. Pa 29260. 11.0. 12.0. 5.3. 5.5. >16.0. -. 14.00 ± 2.00. 4.80 ± 0.50. 5.10 ± 0.36. >16.0. -. MEAN ± SD 12.33 ± 1.53. -：沒有測試. 31.
(47) 4. 殺菌曲線測試 經過最小抑菌濃度及最小殺菌濃度測試後，自 3 種測試菌株中各取一株菌 株來做殺菌曲線測試，並以 2 倍的 MIC 值 ( 2xMIC )、1 倍的 MIC 值 ( 1xMIC ) 及 1 倍的 MBC 值 ( 1xMBC )作為測試藥量。 圖六～圖八為各中草藥對鮑氏不動桿菌的殺菌曲線測試，由圖六顯示對測 試的鮑氏不動桿菌而言， 2xMIC 的鐵線透骨草可在 30 分鐘內殺死目標菌量， 而 1xMIC 及 1xMBC 的鐵線透骨草可在 1 小時內殺死目標菌量。而在圖七可 見，威靈仙的 2xMIC 可在 30 分鐘內殺死目標菌量，而 1xMIC 及 1xMBC 亦 可在 1 小時內殺死目標菌量。在川木通對鮑氏不動桿菌的殺菌曲線測試中( 圖 八 )，我們以 12 mg/mL 的川木通來進行測試，結果發現這樣的藥劑量並不足 以抑制目標菌的生長。. Log. 10. Blank 2xMIC 鐵 線 透骨 草 1xMIC 鐵 線 透骨 草 1xMBC 鐵 線 透骨 草. 1 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. Time ( hr ). 圖 六、鐵線透骨草乙酸乙酯層區分物對鮑氏不動桿菌 ( Ab 20 ) 之殺菌曲線測 試 ( n=3 ). 32.
(48) 10. Log. Blank. 2xMIC 威靈仙 1xMIC 威靈仙 1xMBC 威靈仙. 1 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. Time ( hr ). 圖 七、威靈仙乙酸乙酯層區分物對鮑氏不動桿菌 ( Ab 20 ) 之殺菌曲線測試 ( n=3 ). Log. 10. Blank 川木通. 1 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. Time ( hr ). 圖 八、川木通乙酸乙酯層區分物對鮑氏不動桿菌 ( Ab 20 ) 之殺菌曲線測試 ( n=3 ). 33.
(49) 圖九～圖十一為各中草藥對綠膿桿菌的殺菌曲線測試，由圖九可知 2xMIC 的鐵線透骨草可在 30 分鐘內殺死目標菌量，而 1xMBC 的鐵線透骨草可在 12 小時內殺死目標菌量，但是 1xMIC 則僅能在 4 小時內抑制菌株的生長，超 過 4 小時後即不具抑制作用。從圖十可見，威靈仙的 2xMIC 可在 30 分鐘內 殺死目標菌量，而 1xMIC 及 1xMBC 均可以在 2 小時內殺死目標菌量。在川 木通對鮑氏不動桿菌的殺菌曲線測試中 ( 圖十一 )，我們以 16 mg/mL 的川木 通來進行測試，發現這樣的藥劑量僅能在 4 小時內輕微的抑制菌株的生長，超 過 4 小時後即不具抑制作用。. Log. 10. Blank. 2xMIC 鐵線透骨草 1xMIC 鐵線透骨草 1xMBC 鐵線透骨草. 1 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. Time ( hr ). 圖 九、鐵線透骨草乙酸乙酯層區分物對綠膿桿菌 ( Pa 3651 ) 之殺菌曲線測試 ( n=3 ). 34.
(50) Log. 10. Blank. 2xMIC 威靈仙 1xMIC 威靈仙 1xMBC 威靈仙. 1 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. Time ( hr ). 圖 十、威靈仙乙酸乙酯層區分物對綠膿桿菌 ( Pa 3651 ) 之殺菌曲線測試 ( n=3 ). Log. 10. Blank 川木通. 1 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. Time ( hr ). 圖 十一、川木通乙酸乙酯層區分物對綠膿桿菌 ( Pa 3651 ) 之殺菌曲線測試 ( n=3 ). 35.
(51) 圖十二～圖十四為各中草藥對金黃色葡萄球菌的殺菌曲線測試，由圖十二 得知 2xMIC 的鐵線透骨草可在 30 分鐘內殺死目標菌量，而 1xMBC 的鐵線透 骨草可在 1 小時內殺死目標菌量，1xMIC 則可在 8 小時內殺死目標菌量。而 在圖十三可知威靈仙的 2xMIC 及 1xMBC 可在 1 小時內殺死目標菌量，而 1xMIC 則可在 8 小時內殺死目標菌量。在川木通對鮑氏不動桿菌的殺菌曲線 測試中( 圖十四 )，我們以 7 mg/mL 的川木通來進行測試，發現這樣的藥劑量 僅可以輕微抑制菌株生長。. 10. Log. Blank 2xMIC 鐵線透骨草 1xMIC 鐵線透骨草 1xMBC 鐵線透骨草. 1 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. Time ( hr ). 圖 十二、鐵線透骨草乙酸乙酯層區分物對金黃色葡萄球菌 ( Sa 0752 ) 之殺菌 曲線測試 ( n=3 ). 36.
(52) Log. 10. Blank. 2xMIC 威靈仙 1xMIC 威靈仙 1xMBC 威靈仙. 1 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. Time ( hr ). 圖 十三、威靈仙乙酸乙酯層區分物對金黃色葡萄球菌 ( Sa 0752 ) 之殺菌曲線 測試. ( n=3 ). Log. 10. Blank 川木通. 1 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. Time ( hr ). 圖 十四、川木通乙酸乙酯層區分物對金黃色葡萄球菌 ( Sa 0752 ) 之殺菌曲線 測試. ( n=3 ). 37.
(53) 5. 耐熱性與耐酸鹼測試 耐熱性與耐酸鹼測試主要目的在了解溫度及 pH 值的變化對於中草藥之抑 菌物質的影響，實驗結果如表五及表六所示。三種中草藥的乙酸乙酯層區分物 在經過靜置於各個選定溫度 1 小時後，其測試所得的抑制圈大小與未處理的抑 制圈大小相差不大，顯示三種中草藥所含之抑菌成份均不易受高溫影響。而在 耐酸鹼測試的實驗結果中，三種中草藥所含的抑菌物質均不易受 pH 值變化而 影響其活性，可見這些抑菌物質具有對熱及酸鹼之穩定性。. 表 五、耐熱性測試 DIZ ( mm ) 測試菌株. Sa 1733. Pa 3167. Ab 9. 萃出物. 40℃. 60℃. 80℃. Blank. TC. 鐵線透骨草. 24.5. 23.0. 23.0. 21.5. 24.0. 0.0. 22.0. 威靈仙. 20.0. 19.0. 18.0. 16.5. 22.0. 0.0. 24.0. 川木通. 15.0. 12.0. 10.5. 11.0. 15.5. 0.0. 22.0. 鐵線透骨草. 17.0. 17.5. 19.0. 17.0. 17.0. 0.0. 16.0. 威靈仙. 13.0. 12.0. 12.0. 12.0. 13.0. 0.0. 14.0. 川木通. 9.0. 9.0. 9.0. 9.0. 9.0. 0.0. 14.0. 鐵線透骨草. 22.0. 22.0. 22.0. 21.0. 22.0. 0.0. 36.0. 威靈仙. 17.0. 16.5. 15.5. 14.5. 18.0. 0.0. 24.0. 川木通. 10.0. 9.0. 9.0. 9.0. 14.0. 0.0. 22.0. DIZ：disc inhibition zone. 38. 120℃ untreated.
(54) 表 六、耐酸鹼測試 DIZ ( mm ) 測試菌株. SA 1733. PA 3167. AB 9. 萃出物. pH 2. pH 5.5. pH 8.9. 鐵線透骨草. 20.0. 20.0. 19.5. 20.0. 20.0. 0.0. 22.0. 威靈仙. 22.5. 22.0. 18.0. 18.0. 22.0. 0.0. 24.0. 川木通. 12.0. 12.0. 12.0. 11.0. 15.5. 0.0. 22.0. 鐵線透骨草. 15.0. 16.0. 16.0. 15.0. 15.5. 0.0. 16.0. 威靈仙. 13.5. 13.5. 13.5. 13.5. 13.0. 0.0. 14.0. 川木通. 9.0. 9.0. 9.0. 9.0. 9.0. 0.0. 14.0. 鐵線透骨草. 19.0. 18.0. 18.0. 17.5. 18.0. 0.0. 36.0. 威靈仙. 18.0. 18.0. 17.5. 17.5. 18.0. 0.0. 24.0. 川木通. 10.0. 10.0. 10.0. 10.0. 14.0. 0.0. 22.0. DIZ：disc inhibition zone. 39. pH 12 untreated Blank. TC.
(55) 6. DPPH 自由基清除能力測定 DPPH 測試主要是利用 DPPH 這個高穩定性的自由基來模擬人體內所產 生的自由基，再以中草藥中的抗氧化物質來進行還原自由基的實驗，由於 DPPH 在 517 nm 的波長下有很強的吸收，所以我們利用 DPPH 的這個特性來做為測 定中草藥中所含有清除自由基能力的指標。在 DPPH 測試中，我們以三種中草 藥的粗萃物來進行測試，並以甲醇做為負控制組，實驗結果如圖九。結果顯示， 各草藥可清除 50% DPPH 自由基的濃度分別為鐵線透骨草 134.00 μg/mL、 威 靈仙 276.09 μg/mL、 川木通 408.60 μg/mL。在這個測試中以中草藥可清除 50% DPPH 自由基所需濃度 ( IC50 ) 來做為衡量標準，故以濃度越低越好， 因此在這三個中草藥中以鐵線透骨草的 IC50 134.00 μg/mL 為最佳。. 100. Clearence rate ( % ). 80. 60. 鐵線透骨草 威靈仙 川木通. 40. 20. 0 0. 500. 1000. 1500. 2000. Concentration ( μ g/mL ). 圖 十五、DPPH 自由基清除能力測定 ( n=3 ). 40. 2500.
(56) 7. TEAC 總抗氧化力測試 在 TEAC 的測試中，我們以 Trolox 為實驗的標準品來換算各草藥萃出物 的總抗氧化能力，實驗結果如圖十及圖十一所示。根據實驗結果可得鐵線透骨 草的 50% ABTS 自由基清除率為 1128.22 μg/mL， 威靈仙的 50% ABTS 自 由基清除率為 1211.83 μg/mL，川木通的 50% ABTS 自由基清除率為 1421.29 μg/mL，而 Trolox 的 50% ABTS 自由基清除率為 279.41 μg/mL。經計算後可 得鐵線透骨草的總抗氧化力為 247.66 mg Trolox / g，威靈仙的總抗氧化力為 230.57 mg Trolox / g，川木通的總抗氧化力為 196.59 mg Trolox / g。由此可知， 在三種中草藥中，總抗氧化力最好的是鐵線透骨草，威靈仙次之，而川木通最 差。. Scavenging efficiency ( % ). 100. 80. 60. 40. 20. 0 0. 200. 400. Concentration ( μg/mL ). 圖 十六、Trolox 標準曲線 ( n=3 ). 41. 600.
(57) Scavenging efficiency ( % ). 100. 80. 60. 40 鐵線透骨草 威靈仙 川木通. 20. 0 0. 1000. 2000. 3000. 4000. Concentration ( μg/mL ). 圖 十七、三種中草藥之 ABTS 自由基清除率 ( n=3 ). 42. 5000.
(58) 8. 還原力測試 還 原 力 測 試 主 要 是 藉 由 中 草 藥 中 的 抗 氧 化 物 質 將 Fe(CN)3+ 還 原 成 Fe(CN)2+ 後，再利用 Fe(CN)2+ 與 Fe3+ 反應形成普魯士藍所得之吸光值來做 為指標，以顯示在中草藥中所含的抗氧化物質的還原能力，實驗結果如圖十二。 將實驗數據經計算可得鐵線透骨草的還原力斜率為 0.398 ，威靈仙的還原力斜 率為 0.057，川木通的還原力斜率則為 0.264。還原速率越高代表該中草藥的還 原能力越好，由以上計算結果可見還原速率由大到小為鐵線透骨草 ＞ 川木通 ＞ 威靈仙，可見得在還原力上以鐵線透骨草效果最好。. 0.5 鐵線透骨草 威靈仙 川木通. O.D. 700 nm. 0.4. 0.3. 0.2. 0.1. 0.0 0. 200. 400. 600. 800. concentration ( μg/mL ). 圖 十八、三種中草藥之還原力測試 ( n=3 ). 43. 1000.
(59) 9. 總多酚含量測試 本實驗在總酚量測試中是以 Gallic acid 為標準品來進行換算以取得在中 草藥粗萃物中所含有的多酚類物質的相對含量，其實驗結果如圖十三所示。經 換算實驗結果後可得鐵線透骨草粗萃物所含的總酚量為 133.45 mg Gallic acid / g dw，威靈仙粗萃物所含的總酚量為 171.09 mg Gallic acid / g dw，川木通粗萃 物所含的總酚量為 216.18 mg Gallic acid / g dw。由上述結果顯示，在三種中草 藥中，川木通所含的多酚類物質較威靈仙及鐵線透骨草所含的多。. 4.0 3.5. O.D. 750 nm. 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0. 50. 100. 150. 200. 250. Concentration ( μg/mL ). 圖 十九、Gallic acid 標準曲線 ( n=3 ). 44. 300. 350.
(60) 10. 總類黃酮含量測試 本實驗在總類黃酮含量測中是以 Quercetin 為標準品來進行換算以取得在 中草藥粗萃物中所含有的多酚類物質的相對含量，其實驗結果如圖十四所示。 經換算實驗結果後可得鐵線透骨草粗萃物所含的總類黃酮含量為 76.762 mg Quercetin / g dw，威靈仙粗萃物所含的總類黃酮含量為 1.238 mg Quercetin / g dw，川木通粗萃物所含的總類黃酮含量為 10.667 mg Quercetin / g dw。由此可 見，類黃酮類物質在威靈仙的乙醇萃取物中含量很低，而類黃酮類物質含量最 高的是鐵線透骨草。. 2.5. O.D. 415 nm. 2.0. 1.5. 1.0. 0.5. 0.0 0. 50. 100. 150. 200. 250. Concentration ( μg/mL ). 圖 二十、Quercetin 標準曲線 ( n=3 ). 45. 300. 350.
(61) 11.薄層色層分析 將鐵線透骨草之乙酸乙酯層區分物經管柱色層層析後所得的活性區分物利 用 TLC 薄層色層分析後所得的實驗結果如圖十五所示。由圖十五 a 觀察後發 現發現在 Rf = 0.31 的位置有螢光反應，代表在此區分物內之物質具有多共軛雙 鍵系統，如芳香族或多苯環類物質。由圖十五 b 觀察發現有呈色反應，且在經 顯色劑 FeCl3 溶液呈色後 ( 圖十五 c ) 亦有呈色反應，表示此活性區分物含有 苯環結構且可能為酚類的化合物。在經顯色劑 Dragendorff 試劑處理後 ( 圖十 五 d ) 並無呈色反應，代表此活性區分物並不含有屬於生物鹼類物質。. Rf = 0.31. 圖 二十一、鐵線透骨草活性區分物之薄層色層分析 a. b. c. d.. 未使用顯色劑在 UV 365 nm 下觀察 未使用顯色劑在 UV 254 nm 下觀察 使用顯色劑 FeCl3 溶液處理後在可見光下觀察 使用顯色劑 Dragendorff 試劑處理後在可見光下觀察. 將川木通的乙酸乙酯區分物利用 TLC 薄層色層分析後所得的實驗結果如 46.
(62) 圖十六所示。川木通乙酸乙酯區分物在 UV 365 nm 下觀察後發現在 Rf = 0.75 的位置有螢光反應 (圖十六 a )，代表在此區分物內之物質具有多共軛雙鍵系 統，如芳香族或多苯環類物質。由圖十六 b 觀察發現同位置有呈色反應，且在 經顯色劑 FeCl3 溶液呈色後 (圖十六 c ) 亦有呈色反應，表示此活性區分物含 有苯環結構且可能為酚類的化合物。在經顯色劑 Dragendorff 試劑處理後 (圖 十六 d ) 有橘紅色呈色反應，代表此活性區分物內含有屬於生物鹼類等芳香族 含氮化合物。. Rf = 0.75. 圖 二十二、川木通乙酸乙酯層區分物之薄層色層分析 a. b. c. d.. 未使用顯色劑在 UV 365 nm 下觀察 未使用顯色劑在 UV 254 nm 下觀察 使用顯色劑 FeCl3 溶液處理後在可見光下觀察 使用顯色劑 Dragendorff 試劑處理後在可見光下觀察. 將威靈仙的乙酸乙酯區分物利用 TLC 薄層色層分析後所得的實驗結果如 47.
(63) 圖十七所示。威靈仙的乙酸乙酯區分物在 UV 365 nm 下觀察後發現分別在 Rf = 0.75 及 0.25 的位置有螢光反應 (圖十七 a )，代表在此兩位置的物質具有多 共軛雙鍵系統，如芳香族或多苯環類物質。在圖十七 b 中，在 UV 254 nm 下 觀察發現在 Rf = 0.75 及 0.25 的位置有呈色反應，但經由顯色劑 FeCl3 溶液呈 色後 (圖十七 c ) 僅在 Rf = 0.75 的位置有呈色反應，表示在 Rf = 0.25 的活性 區分物為含有苯環結構的物質，但可能不是酚類的化合物。而在 Rf = 0.75 的活 性區分物含有苯環結構且可能為酚類的化合物。在經顯色劑 Dragendorff 試劑 處理後 (圖十七 d ) 發現，在 Rf = 0.75 的位置有橘紅色呈色反應，代表此位置 活性區分物含有屬於生物鹼類等芳香族含氮化合物。. Rf = 0.75. Rf = 0.25. 圖 二十三、威靈仙乙酸乙酯層區分物之薄層色層分析 a. b. c. d.. 未使用顯色劑在 UV 365 nm 下觀察 未使用顯色劑在 UV 254 nm 下觀察 使用顯色劑 FeCl3 溶液處理後在可見光下觀察 使用顯色劑 Dragendorff 試劑處理後在可見光下觀察. 48.
(64) 12. GC-MS 分析 將三種中草藥的乙酸乙酯區分物以甲醇配製成 0.02 mg/mL 溶液後取 1 μL 進行 GC-MS 分析，其結果如圖十八到圖二十所示。在利用 The NIST 08 Mass Spectral Library 進行主要成份比對後，將結果整理成表七。根據表七的結果， 比對文獻後並未發現具有抑菌效果成份，因此我們推測，這三種中草藥的可能 的抑菌成份均為未知物或因含量低無法為 GC-MS 所檢測。 另外，我們亦將鐵線透骨草經管柱層析所得之活性區分物進行 GC-MS 分 析，其結果如圖二十一。在利用 NIST 資料庫及相關文獻進行比對後並未發現 符合之化合物。同時，我們比對到乙酸乙酯區分物的圖譜後發現，有部份 peak 並未在乙酸乙酯區分物之圖譜上發現，這證實了在前面所推測的，在鐵線透骨 草的有效抑菌成份應為未知，且在乙酸乙酯區分物上因含量低而未被 GC-MS 所測得。. 圖 二十四、川木通乙酸乙酯層區分物之 GC-MS 圖. 49.
(65) 圖 二十五、威靈仙乙酸乙酯層區分物之 GC-MS 圖. 圖 二十六、鐵線透骨草乙酸乙酯層區分物之 GC-MS 圖. 圖 二十七、鐵線透骨草經管柱色層層析後之活性區分物之 GC-MS 圖. 50.
數據
![圖 一、威靈仙乾燥品 [ 本草綱目 ] 的釋名曰： 「威，言其性猛也。靈仙，言其功神也。」 [ 圖考 ] 曰： 「其力勁，故謚日威。其效捷，故諡曰靈。威靈合德，仙之上藥也。」[ 開 寶 ] 曰：「一名能消。」從這些古籍中的敘述可以得知威靈仙是因具有快速又 有效的治療效果而得其名。而在方劑中常用來治療風濕、關節炎、腰痛、腳氣 浮腫等，其水煎劑對平滑肌痙攣有鬆弛作用，可治骨骾之症，外洗則可解毒止 癢。 在威靈仙的藥理試驗方面，其水浸劑在試管試驗中具有抑制皮膚癬菌的能 力，同屬植物 C](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/9libinfo/8962235.277347/19.892.113.776.103.792/一威靈本草綱目曰一名能等其水煎劑對平滑肌痙攣有鬆弛作用可治C.webp)
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