綠竹筍生長與老化機制之探制及相關功能基因之利用─綠竹及綠竹筍老化過程中抗氧化機制之角色及其應用性探討(2/2)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

綠竹及綠竹筍老化過程中抗氧化機制之角色及其應用性探

討(2/2)

計畫類別： 整合型計畫 計畫編號： NSC92-2317-B-002-014- 執行期間： 92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學植物科學研究所 計畫主持人： 靳宗洛 共同主持人： 楊健志 報告類型： 完整報告 處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 94 年 2 月 2 日

行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

綠竹筍生長與老化機制之探討及相關功能基因之利用─綠竹及綠竹筍

老化過程中抗氧化機制之角色及其應用性探討(2/2)

計畫編號：NSC 92-2317-B-002-014 執行期限：92 年 8 月 1 日至 93 年 7 月 31 日 主持人：靳宗洛 國立台灣大學植物學系暨研究所 一、摘要 分析綠竹及其竹筍採收後不同部位之 SOD 活性及 SOD 同功脢鑑定，發現 綠竹筍主要的 SOD 活性是由 CuZnSOD 及 MnSOD 所構成。與過去所分析過的 一百多種植物 SOD 同功脢相比較，綠竹筍之 CuZnSOD、MnSOD 在 Native PAGE 活性染色顯現出極大的差異(Pan et al., 1999)，反應出綠竹 CuZnSOD 基因其複雜 性，因此推測綠竹筍 SOD 同功脢分子結構及生化特性可能具其特異性。

目前的研究己完成了在不同組織、不同生長階段、及採收後老化過程中；以 及利用綠竹筍的懸浮細胞經處理 UV-B、強光、高溫、低溫及 ABA 等逆境之模 擬過程，來分析綠竹筍 SOD 活性及 mRNA 的變化情形。

一方面也成功地選殖出四個綠竹的 CuZnSOD cDNA 及兩個 MnSOD cDNA 全長。但是從 Southern blot 結果預估 CuZnSOD 可能有四到五個基因，MnSOD 可能有四到五個基因。從 MnSOD 3’-end RACE 的結果也顯示有五個不近相同的 3’-end UTR，可能綠竹所擁有 CuZnSOD 及 MnSOD 基因較其他植物多。

現已在大腸桿菌中大量表現並純化三個 GST-CuZnSOD 重組蛋白及兩個 GST-MnSOD 重組蛋白，在 Native PAGE 活性染色下，得到不同的活性染色結果， 並將藉由一些生化分析測試，了解其生化特性。

另外也對綠竹 CuZnSOD 及 MnSOD 的 promoter region 進行釣取，以了解 CuZnSOD 或 MnSOD 的 promoter 是否因為容易受到氧化逆境的誘導，來提高抗 氧化力。

未來這些綠竹的 SOD 基因將會被表現在阿拉伯芥中，証明其是否為特定的 CuZnSOD 或是 MnSOD 基因。也將假借阿拉伯芥來測試綠竹的這些 SOD 基因是 否能推供良好的抗氧化機能。

Abstract

Activity staining and isozymes identification of SODs in the different part of bamboo

shoot and leaf (Bambusa oldhamii) indicated that primary SOD activity in green

bamboo shoots was composed of MnSOD and CuZnSOD activities. As compared to

SOD isozymes from over one hundred plants, green bamboo’s CuZnSOD and

MnSOD showed great difference in native PAGE activity staining. (Pan et al., 1999),

reflecting green bamboo’s CuZnSOD gene complexity, therefore inferring possible

molecular structures and biochemical activities specificity in green bamboo’s SOD

isozymes. We have completed the SODs activity and mRNA gene expression assay by

Northern blotting using different tissues from various growth stages of green bamboo

and suspension cell treated with UV-B, intensive light, heat, cold and ABA. We show

that there are 4 to 5 CuZnSOD and MnSOD genes, respectively according to the

Southern blotting data. We cloned 4 different full length CuZnSOD cDNAs and 2 full

length MnSOD cDNAs. The 3'-RACE sequence results from MnSOD shows 5

different 3’-UTRs sequences, which is in agreement with the data that green bamboo,

has more CuZnSOD and MnSOD gene families. Now we have conducted 3

GST-CuZnSOD and 2 GST-MnSOD recombinant proteins expression in E. coli and

acquired different native PAGE activity stain patterns. In the future, we will express

these genes in Arabidopsis and analyze these recombinant protein’s biochemical

activities in vitro.

二、緣由與目的 目前在臺灣栽種面積最廣的品種爲綠竹（Bambusa oldhamii），其竹筍質地細 嫩，味道甜美，深受國內外人士喜愛，為高經濟價值的食用作物。 竹筍生長快速，然而採收後竹筍切面易産生褐化並迅速木質化而變老，使其 保存及銷售受到影響。竹的生長、開花與老化現象在植物界中也獨具特色。成長 中的竹筍生長速率極快，以剛竹 (Phyllostachys bambusoides) 為例，一天內可生 長約 90 公分。雖然綠竹生長較剛竹慢，其生長量也有 10 公分，其生長速度較 生長最快速的一般樹木快上 100 倍以上。所以推測，竹筍必須能夠解除在快速生 長過程中所造成的氧化逆境，進而演化出特殊而有效的抗氧化系統。 竹的開花週期被認為是受到遺傳控制，而強光、乾旱、低溫、臭氧、機械傷 害等環境因子所造成之氧化逆境亦可能與誘導竹之開花有關。在竹筍成長的過程 或一旦受到創傷、病害等逆境時，其受傷部位之組織會快速纖維化。這種快速老 化 的 現 象 與 竹 筍 採 收 時 ， 受 到 的 創 傷 及 水 分 缺 乏 所 引 發 之 氧 化 逆 境 有 關 （Kleinhenz et al., 2000）。 超氧自由基，是所有生物在正常有氧代謝過程中自然產生的活性氧分子，會 造成氧化逆境，產生連鎖反應，破壞細胞，是老化及疾病的元兇。粒腺體因它是 細胞內進行氧化作用產生能量的主要場所，推測有 3 至 5 ％的氧會轉變形成超 氧自由，是產生超氧自由基最主要地點，可利用超氧歧化脢 (superoxide dismutase, SOD) 以消除超氧自由基，使它們轉換成無害的水及氧氣。生物具有嚴密的調控 機制來控制生長發育過程中體內活性氧分子的含量，以及因應氧化逆境所產生的 大量活性氧分子。竹類生長快速的現象顯示其能具有特殊及有效的抗氧化系統， 才能解除快速生長過程所造成的氧化逆境。本計畫將研究綠竹筍的抗氧化機制， 探討竹筍在對抗快速生長的氧化逆境及採收後老化過程中所 SOD 所扮演的角 色，以期能由增加竹筍的抗氧化能力解決此快速老化現象。

三、結果與討論 3.1 綠竹筍的外觀、不同組織、不同生長階段 （A） （B） （C） （D）

c 尖端幼葉

b 中間節

a 基部

圖一、綠竹筍的外表型、不同組織、及不同生長階段。 （A）未出土的綠竹筍，左-外表型；右-縱切面。 （B）出土10 ㎝（總長17 ㎝ ）的綠竹筍，左-外表型；右-縱切面。 （C）出土30 ㎝（總長35 ㎝ ）的綠竹筍，左-外表型；右-縱切面。 （D）綠竹筍的縱切面， a-基部 ； b-中間節 ；c-尖端幼葉。

3.2 綠竹筍之不同生長階段總 SODs 活性分析及綠竹 SODs 之 SOD 同功脢的鑑定

由圖二(A)顯示，綠竹筍在出土後會快速誘導 SODs 活性表現，而且在出土 30

公分的快速生長延長部分，有更強的 SODs 活性表現。由綠竹 SODs 同功脢

的鑑定，發現綠竹 SODs 活性由 CuZnSOD 及 MnSOD 構成。

圖二：綠竹筍之不同生長階段：未出土（W）、出土10公分（G10）、出土30公 分（G30）等不同組織的尖端（c）、中間（b）、底部（a）及葉子（L） 之總SODs同功脢活性分析。 等量的綠竹筍蛋白質 (10 µg) 在12 % native polyacrylamide 膠體中進 行電泳分析之後，（A）進行總SODs活性分析；（B）SODs之各種不同 同功脢的鑑定，並無法鑑定出有FeSOD的存在。

(B)

(A)

CuZnSOD CuZnSOD MnSOD CuZnSOD

+ H

2

O

2

+ KCN

MnSOD

總SODs

L

W

G

10

G

30

a b c

a b c

a b c

圖三：阿拉伯芥、綠竹筍及水稻總SODs同功脢活性之比較。

(A) 阿拉伯芥不同組織總SODs同功脢活性，Rf: rosette leaf，Cf: cauline leaf，St; stem，Fl: flower，Si: silique。(B) 為綠竹筍及 (C) 水稻中總SODs同功脢活性分析。箭頭處為各種不同之SOD。 3.3 綠竹與其他物種總 SODs 活性比較 相較於阿拉伯芥及水稻的 SODs 活性染色的結果，綠竹具有更多的活性條 帶，顯示其 SODs 在基因群或是分子層次方面，更具複雜性。

MnSOD

Rf Cf St Fl Si

FeSOD

CuZnSOD

CuZnSOD

CuZnSOD

MnSOD

CuZnSOD

CuZnSOD

MnSOD + CuZnSOD

(A)

(B)

(C)

3.4 由 3’,5’RACE 所得到的第一條綠竹 CuZnSOD cDNA 全長 --- BoCZSOD1 ACGCGGGGAGGACACAGGGAGTCGGGAACCTTCCAGAAGCGCAA GATTCCAAGGTCGTCGCCGCCTCCTCCTCGTCACAGGGGTCGCCTGAGAACACATAAACA 105 ATGGTGAAGGCTGTTGCTGTGCTTGCTAGCAGCGAGGGTGTTAAGGGCACCATCTACTTT 164 1 M V K A V A V L A S S E G V K G T I Y F 20 165 GTCCAAGAGGGAGATGGTCCGACCACTGTGACCGGAAGCGTCTCTGGCCTCAAGCCTGGT 224 21 V Q E G D G P T T V T G S V S G L K P G 40 225 CTCCATGGGTTCCATGTGCATGCACTGGGTGACACCACAAATGGCTGCATGTCAACTGGA 284 41 L H G F H V H A L G D T T N G C M S T G 60 285 CCACATTTCAATCCTGCGGGTAAGGAACATGGGGCACCAGAAGATGAGAACCGCCATGCT 344 61 P H F N P A G K E H G A P E D E N R H A 80 345 GGTGATCTTGGAAACGTGACGGCCGGAGCAGATGGTGTTGCTAATGTCAATGTTGTCGAC 404 81 G D L G N V T A G A D G V A N V N V V D 100 405 AGCCAGATCCCCCTTACTGGACCACAGTCAATCATTGGCCGAGCTGTTGTTGTCCATGCT 464 101 S Q I P L T G P Q S I I G R A V V V H A 120 465 GATCCTGATGATCTTGGCAAAGGTGGACATGAGCTTAGCAAGAGCACTGGAAACGCTGGT 524 121 D P D D L G K G G H E L S K S T G N A G 140 525 GGACGTGTTGCTTGTGGGATCATTGGGCTCCAGGGTTAGACGTCGTCTTCTTCGCTGGCC 584 141 G R V A C G I I G L Q G * 153 AACAGACAGATCTGGGCACTTTCAGACAAGCTGTTCCGGTACCCTTATCCAACATACTTG GCGTGGCTATTTAAAATAAGCACCTGATCTATGATCACTGATCAGTGTACCATTCGCATC ATTTCCTATATGCTACTCTTGAACATTGCATAACTGCCATTTGGTTTGAATGCATAGTGT CTGTTTTGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 圖四、BoCZSOD1 cDNA 之核甘酸序列與推衍之胺基酸序列。 胺基 酸序列以單一字母呈現在核甘酸序列之下；數字代表核

甘酸的數目；粗黑體字為 cDNA 的 poly (A) tail；核甘酸序列底下 劃線者為 polyadenylation signal 的位置；星號代表 stop codon。

BoCZSOD1 3.5 在不同生長階段觀察 BoCZSOD1 mRNA 的表現量 BoCZSOD1 mRNA 的表現量也隨著綠竹筍生長而增加。 rRNA

W G

10

G

30

a

_b

c

a b c

a b c

L

圖五：綠竹筍之不同生長階段：未出土（W）、出土10公分（G10）、出土30公 分（G30）等不同組織的尖端（c）、中間（b）、底部（a）及葉子（L） 之BoCZSOD1基因之表現。 北方氏雜合分析，等量的綠竹筍RNA (12 µg) 在甲醛洋菜膠體中進行電 泳，再轉印到尼龍膜上，利用 261 bp 之BoCZSOD1 cDNA部分片段作 為探針，與尼龍膜上的綠竹筍total RNA進行雜合反應。以EtBr染色的 rRNA量作為loading control。

3.6 觀察綠竹懸浮細胞在ABA處理下，對於 BoCZSOD1 mRNA表現量及總SODs 活性的影響

由圖六(A)、(B)可得到ABA處理可誘導BoCZSOD1 mRNA表現量及總SODs 活性的增加，並且在加入ABA後4小時得到最高表現，圖七(A)、(B)。 CuZnSOD CuZnSOD CuZnSOD MnSOD 圖六：ABA不同濃度對綠竹筍懸浮細胞BoCZSOD1的基因表現及總SODs同功脢 活性的影響。 懸浮細胞以含0 M、10-5 M、10-4 M、10-3 M ABA之MS液體培養基在25 ℃避光培養24小時，不以ABA處理當作對照組(CK)。(A) 北方氏雜合分 析。以32

P標定261 bp BoCZSOD1 cDNA 序列當作探針，EtBr染色的rRNA 當作loading control。(B) 處理後的懸浮細胞總SODs同功脢活性分析。

(A)

BoCZSOD1

rRNA

CK 10

-5

M 10

-4

M 10

-3

M

(B)

ABA

CK

10-5 10-4 10-3 (M)

ABA

圖七：10-4 M ABA處理後不同培養時間對綠竹筍懸浮細胞BoCZSOD1的基因表 現及總SODs同功脢活性的影響。 懸浮細胞以含10-4 M ABA之MS液體培養基在25℃避光培養0小時、2小 時、4小時、8小時、12小時、24小時；培養細胞不含ABA處理當作對 照組(CK)。(A) 北方氏雜合分析。以32 P標定的261 bp BoCZSOD1 cDNA 序列當作探針; EtBr染色的rRNA 當作loading control。(B) 處理後的懸 浮細胞總SODs同功脢活性分析。 CuZnSOD CuZnSOD MnSOD CuZnSOD

BoCZSOD1

rRNA

CK 2 4 8 12 24 （h）

(A)

(B)

ABA (10

-4

M)

CK 2 4 8 12 24 （h）

ABA (10

-4

M)

1 2 3

1 2 3

3.7

觀察綠竹懸浮細胞在高低溫逆境處理下，對於 BoCZSOD1 mRNA表現量及 總SODs活性的影響 高低溫都會誘導BoCZSOD1 mRNA表現量及總SODs活性的增加，圖八(A)、 (B)。

4℃

25℃

37℃

(A)

BoCZSOD1

rRNA

(day)

(B)

CuZnSOD CuZnSOD MnSOD CuZnSOD

4℃ 25℃ 37℃

1 2 3 1 2 3 1 2 3 (day)

圖八：不同溫度及處理天數對綠竹筍懸浮細胞BoCZSOD1基因表現及總 SODs同功脢活性之影響。 懸浮細胞在MS液體培養基避光處理後分別在 4℃、25℃、37℃各 培養1至3天。(A) 北方氏雜合分析，以32 P標定的261 bp BoCZSOD1 cDNA序列當作探針; EtBr染色的rRNA當作loading control。(B) 處 理後的懸浮細胞總SODs同功脢活性分析。

圖九：強光照對綠竹筍懸浮細胞BoCZSOD1基因表現及總SODs同功脢活性 之影響。 懸浮細胞在MS液體培養基(25℃)以強光(60μmol/m-2 s-2)照射1至3 天。不光照處理當作對照組(CK)。(A) 北方氏雜合分析，以32 P標定 的261 bp BoCZSOD1 cDNA序列當作探針；EtBr染色的rRNA當作 loading control。(B) 處理後的懸浮細胞總SODs同功脢活性分析。 箭頭處為新誘導之SOD，推測為葉綠體型之SOD。

3.8

觀察綠竹懸浮細胞在強光處理下，對於 BoCZSOD1 mRNA表現量及總 SODs活性的影響 強光處理並未造成BoCZSOD1 mRNA表現量增加，圖九(A)。但是在總SODs 活性染色結果，發現有不同的活性條帶被誘導出來，圖九(B)。

BoCZSOD1

rRNA

CK 1 2 3 (day)

(A)

(B)

Light

CK 1 2 3 (day)

Light

圖十： UV-B對綠竹筍懸浮細胞BoCZSOD1基因表現及總SODs同功脢活 性之影響。

懸浮細胞在MS液體培養基25℃以UV-B光照射1至3天。不光照處

理當作對照組(CK)。(A) 北方氏雜合分析。以32

P標定的261 bp

BoCZSOD1 cDNA序列當作探針; EtBr染色的rRNA當作loading

control。(B) 處理後的懸浮細胞總SODs同功活性分析。箭頭處 為增強表現之SOD。

3.8

觀察綠竹懸浮細胞在UV-B處理下，對於 BoCZSOD1 mRNA表現量及總

SODs活性的影響 由圖十(A)可發現，BoCZSOD1 mRNA表現量在處理第二天達到最高。但是 在活性染色結果，圖十(B)。發現活性到第三天仍有提高。和強光處理的結 果比較，可知被強光或UV-B所誘導的SOD各有不同

(A)

(B)

BoCZSOD1

rRNA

CK 1 2 3 (day)

UV light

CK 1 2 3 (day)

UV light

3.9 綠竹 genomic DNA Southern blot

由圖十一、十二的結果推論，綠竹 CuZnSOD 可能有 4~5 個基因，MnSOD 可能也有 4~5 個基因，相較其他物種，其 SODs 基因群可能更複雜。

EcoRV BamHI

kb

23.1-

9.4-

6.6-

4.4-

2.3-

2.0-圖十一：綠竹筍CuZnSOD基因之南方氏雜合分析，預估可能有五個基因。 綠竹筍 genomic DNA (15 µg) 經由EcoRV 及 BamHI 限制脢處理 後，在0.8 % TAE膠體中進行電泳，再轉印到尼龍膜上，利用261 bp 的 BoCZSOD1 cDNA部分片段作為探針，與尼龍膜上的綠竹筍 genomic DNA 雜合。左邊標示為 λ / Hind III DNA marker之各片段 大小。

1 2 3 4

kb

23.1-

9.4-

4.4-

2.3-

2.0-

6.6-

圖十二：綠竹筍MnSOD基因之南方氏雜合分析，預估可能有四至五個基因。 綠竹筍 genomic DNA (15 µg) 經由1: Bam HI, 2: Eco RV, 3: Hind III 及 4: Xba I 限制脢處理後，在0.8 % TBE膠體中進行電泳，再轉印到 尼龍膜上，利用 306 bp 的 MnSOD cDNA部分片段作為探針，與尼 龍膜上的綠竹筍 genomic DNA 雜合。左邊標示為 λ / Hind III DNA marker之各片段大小

3.10 由 3’,5’RACE 得到的 4 個 CuZnSOD , 2 個 MnSOD cDNA coding regions 以及 MnSOD 3’UTR 的序列比對

經 DNA STAR 軟體比對結果，發現 4 個 CuZnSOD 及 2 個 MnSOD 的 cDNA

序列，都具有很高的相似度，圖十三(A)、(B)。在 MnSOD 3’UTR 的比對結

果，圖十四。也顯示其很可能有更多 MnSOD 基因，儘管 coding region 相似

度很高。

（A）

（B）

圖十三：經由3’,5’RACE所得到的(A)四個綠竹CuZnSOD基因之cDNA Coding region及(B) 兩個MnSOD基因之cDNA coding region，經 由DNA STAR軟體比對結果

圖十四：MnSOD cDNA 序列在其 5’端設計專一性引子與 SMART RACE cDNA synthesis kit 中所付之 primers 進行 3’-end RACE 後，經 TA cloning，任選 10 clones 進行 sequencing，經 DNAStar 軟體比對之結 果。此部份序列為由 stop codon (TGA)至 poly(A)- tail 比對

3.11 大量表現 GST-CuZnSOD 及 GST-MnSOD 重組蛋白於大腸桿菌中，純化並

進行活性染色

純化後的 GST-CuZnSOD 經活性染色的結果，圖十五(A)，觀察到重組蛋白 具有 SOD 活性，並且能受到 CuZnSOD 的抑制劑所抑制，證明其應為 CuZnSOD。並發現 cDNA 相似度極高的重組蛋白，在 Native PAGE 上 SOD 活性條帶的位置，和活性強度各有不同。另外，純化的 GST-MnSOD 也在 Native PAGE 上有 SOD 活性表現。往後更可以進一步研究這些重組蛋白的 生化特性。

+ +

-

-

+

-

T

T

T

CuZnSOD3 CuZnSOD16

CuZnSOD28

MnSOD11 MnSOD31 圖十五：(A)大量表現三個綠竹CuZnSOD基因的GST-CuZnSOD重組蛋白在大腸桿菌 (BL21-DE3)中, 經純化後做活性染色及抑制劑處理(T) 經誘導大量表現重組 蛋白的大腸桿菌的總蛋白，(-)4µg的重組蛋白(+)4µg的重組蛋白, 經40mM DDC處理, 37℃,1hr (DDC:Diethyldithiocarbamate) (B)大量表現二個綠竹MnSOD基因的GST-MnSOD重組蛋白在大腸桿菌 (BL21-DE3)中, 經純化後做活性染色, loading量皆為5µg

(B)

3.12 未來研究方向

對於 CuZnSOD、MnSOD 重組蛋白的生化特性分析；釣取 CuZnSOD、 MnSOD promoter region 並轉殖到阿拉伯芥中，觀察其是否易受逆境誘導？ 受何種逆境誘導？轉殖綠竹 SOD 基因到阿拉伯芥中，能否提高其抵抗逆境 能力？

四、參考文獻

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