藉基因工程產製天然抗菌物質乳鐵蛋白素(1/2)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告

藉基因工程產製天然抗菌物質乳鐵蛋白素(1/2)

計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2313-B-002-378-執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學畜產學系暨研究所 計畫主持人： 林慶文 計畫參與人員： 余佳恆 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢

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國 92 年 5 月 29 日

行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

藉基因工程產製天然抗菌物質乳鐵蛋白素

計畫編號：NSC91-2313-B-002-378 執行期間：91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 計畫主持人：林慶文 國立台灣大學畜產學系 共同主持人：陳全木 國立中興大學生命科學系 計劃參與人員：余佳恆 國立台灣大學畜產學系 一、中英文摘要 牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin)為乳中的 一種運鐵蛋白，其具有很多生理功能。牛乳 鐵蛋白素(bovine lactoferricin)是乳鐵蛋白位 於 N 端的一段多 ，其大小約為 25 個胺基 酸。在哺乳動物體內，乳鐵 蛋 白 被 胃蛋白  截切後可得到乳鐵蛋白素，而此片段具有比 乳鐵蛋白更強的抗菌活性，係利用乳鐵蛋白 素作為抗菌物質之開發。本研究旨在探討運 用重組嗜甲醇酵母菌於體外產製乳鐵蛋白素 之可行性。首先利用人工合成不同物種之乳 鐵蛋白素以及乳鐵蛋白素抗菌中心片段之多 ， 並 直 接 對色葡 大 腸 金桿 菌 、黃 菌 球萄 及 念珠球菌進行抗菌試驗。結果顯示，最佳殺 菌 效 果 之 多以及為 牛 白乳 鐵 蛋素 菌 抗其 中 心片段。挑選牛乳鐵蛋白素 25 個胺基酸當中 含 11 個胺基酸之抗菌核心片段作為本研究 欲進行產製、分析、試驗之目標片段。將可 轉錄出此多 之 DNA 序列以核酸合成法取 得後，再將目標基因放入酵母菌表現型載體 當中。確定帶有乳鐵蛋白素之質體建構無誤 後，以電穿孔方式將此建構好的質體轉型至 Pichia pastoris 細胞，藉以產製生物性抗菌多 。 關 鍵 詞 酵： 乳 鐵 蛋 白 素 、抗 醇 菌 多、 嗜甲 母菌、酵母菌表現型載體 Abstract

Bovine lactoferrin is a transferrin protein found in milk, which has many biological functions. Lactoferricin is a short fragment from the N-terminus of lactoferrin. This peptide is about 25 amino acids. Lactoferricin is generated upon gastric pepsin cleavage of lactoferrin in mammalian animals. This peptide is much more effective in antibacterial properties than lactoferrin. And we could use the peptide to develop new style probiotic products. Our study is focus on the generation of the recombinant yeast, Pichia pastoris, containing

the bovine lactoferricin gene fragment and the feasibility of large-scale production. First, we got synthetic lactoferricin and it’s antibacterial core peptide of different species by peptide synthesis, and then tested the antimicrobial activities against Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Candida albicans.

Results revealed that the bovine lactoferricin and its antibacterial core peptide show the better ability of antimicrobial than the others. We selected 11-amino acids antibacterial core peptide of bovine lactoferricin, which has the same antibacterial activity as the native lactoferricin. Using oligonucleotide synthesis to get oligonucleotides of desired peptides, and cloned the target gene into yeast-expression

vectors. After the constructed bLFcin/pPICZα B vectors were confirmed, we transformed the recombinant vectors into Pichia pastoris by

electroporation and selected the transformants to express the biological antibacterial peptides. Key Words: Lactoferricin, antibacterial peptide,

Pichia pastoris, yeast expression cassette

二、前言及目的 現今，在食品加工處理方面，如何增加產品 的保存性是一門相當重要的學問。新開發的 防腐劑尤其是化學合成之防腐劑，需經繁雜 的毒性試驗才能被認定為 GRAS(Generally Recognized As Safe)。故目前之研究方向側重 存在於動、植物中天然抑菌劑之找尋以及供 作為食品配料之抑菌評估，其成分必須是對 人體無害且具有可食性者為佳。乳鐵蛋白為 哺乳動物體內的蛋白質，在乳汁中的含量最 多 ， 而 其 經產生胃 蛋 白後水 具解會 段一 有 更 強 的 抗 菌乳鐵能 力 之稱多 ，素為 白蛋 ， 不同物種乳鐵蛋白素大小有些許不同。乳鐵 蛋白素的立體結構是呈扭曲且反平行狀的雙 平板狀。以 25 個胺基酸大小的牛乳鐵蛋白素 來看，其中第 1-13 個胺基酸形成一個α -helix，而第 12-15 個胺基酸形成一個轉折， 之後的胺基酸形成一個β-sheet。在第 3 及 20 個 胺 基 酸 序 列 的 地 方 為 半 胱 胺 酸 (cysteine)，兩個半胱胺酸可構成雙硫鍵使得 乳鐵蛋白素彎曲且穩定其構造。但此雙硫鍵 存在與否對於乳鐵蛋白素抗菌能力並未有影 響。乳鐵蛋白素有個特點，就是其比例上含 有 較 多 的 鹼 性 胺 基 酸 － 精 胺 酸 (arginine, Arg)、離胺酸(lysine, Lys)以及芳香族胺基酸 －色胺酸(tryptophan, Trp)。乳鐵蛋白素中的 疏水性胺基酸，此等胺基酸會形成疏水性界 面，而其他有親水性胺基酸及帶正電胺基酸 環 繞 在 其 周性圍極 ， 形兩成 有具  多 ， 的 此 特性是為乳鐵蛋白素能夠抗菌之主要因素﹔ 其正電基團可與帶負電的菌膜結合，而疏水 性基團也可與菌膜上疏水性基團結合，經由 與細菌菌膜結合，使得菌膜主要構造－脂多 醣(lipopolysaccharide, LPS)大量釋出，而破壞 細菌細胞膜之完整性，使得膜內外滲透壓之 不同導致菌體破裂。乳鐵蛋白素對於許多微 生物具有抑菌或是殺菌之效果，因此乳鐵蛋 白素於天然防腐劑方面具有很大之潛能。本 研究係利用酵母菌微生物工程進而產製具有 天然抗菌效果之乳鐵蛋白素，可應用於食品 保存方面，而達到產品品質的保存功效。 三、結果與討論 (一)、合成不同物種間乳鐵蛋白素 本研究參照 Vorland 等人於 1998 所發表 的不同物種間乳鐵蛋白素之胺基酸序列，選 擇合成人類、牛及豬之乳鐵蛋白素之胺基酸 片段進行抗菌活性試驗。乳鐵蛋白素(20 個胺 基酸)係由國科會貴重儀器中心合成，而乳鐵 蛋白素抗菌中心片段(9 個胺基酸)則由快興 生物科技公司合成 (表一)。 表一. 人工合成之人類、牛及豬之乳鐵蛋白 素胺基酸序列

Peptide Amino acid sequence LfcinB KCRRWQWRMKKLGAPSITCV LfcinH KCFQWQRNMRKVRGPPVSCI LfcinP KCRQWQSKIRRTNPIFCIRR LFcinB9 RRWQWRMKK LFcinH9 FQWQRNMRK LFcinP9 RQWQSKIRR

B 為 bovine﹔H 為 human﹔P 為 porcine

(二)、比較各乳鐵蛋白素片段之抗菌能力 首先進行最小殺菌濃度試驗(MBC)﹔依 照 NCCLS 的稀釋方法，將合成出的乳鐵蛋 白素及乳鐵蛋白素抗菌中心片段依不同濃度 (最終濃度為 512、256、128、64、32、16μ

g/ml)配置好，再分別添加於菌中進行最小殺 菌濃度試驗。選取的菌種為具代表性之大腸 桿菌 Escherichia coli(CCRC 11509)、金黃色 葡萄球菌 Staphylococcus aureus(CCRC 10781) 及念珠球菌 Candida albicans(CCRC 20511)。其試驗結果如表二所示：在乳鐵蛋 白素(20 個胺基酸)之殺菌能力方面，對於大 腸桿菌之殺菌效果牛乳鐵蛋白素優於人及豬 乳鐵蛋白素，但效果差異並不顯著。而在較 小之抗菌片段(9 個胺基酸)的殺菌能力方 面，牛乳鐵蛋白素抗菌中心片段之殺菌能力 明顯優於人及豬之乳鐵蛋白素之中心片段， 且差異較大。在金黃色葡萄球菌及念珠球菌 之作用結果皆與大腸桿菌之結果相似。豬乳 鐵蛋白素之抗菌中心片段並無抗菌能力，其 可 能 是 由 於時是設 計 此片一 多 段 較比 人 及 牛之序列順序所決定其序列而合成，故可能 與真實之乳鐵蛋白素片段序列有所出入，所 以並無顯著之殺菌能力。 表二、不同乳鐵蛋白素對於大腸桿菌、金黃 色葡萄球菌及念珠球菌之最小殺菌濃度 MBC(μg/mL) Peptide

E. coli S. aureus C. albicans

1. LFcinB 64 64 32 2. LFcinH 128 128 64 3. LFcinP 128 128 128 4. LFcinB9 32 32 32 5. LFcinH9 256 512 512 6. LFcinP9 >512 >512 >512 (三)、牛乳鐵蛋白素於酵母菌表現型載體之 建構 根據 Kang 等(1996)的報告指出，位於牛 乳鐵蛋白素中央約含 11 個 胺 基 酸 的多片 段，即具有相當於全長 25 個胺基酸的抑菌效 力。因此，選擇合成中央 11 個胺基酸之 cDNA 序列的寡核甘酸片段，用以進行牛乳鐵蛋白 素之研究。合成的寡核甘酸除了牛乳鐵蛋白 素之 cDNA 本身之外，並在其前後設計了 Kpn I 以及 Xba I 切位以利後續實驗。設計的 兩 段 單 股 核 酸 片 段5’-CGC 序 為： 分 列別 CGA TGG CAG TGG AGG ATG AAG AAG

CTG GGT-3’、5’-CTA GAC CCA GCT TCT TCA TCC TCC ACT GCC ATC GGC GGT

AC-3’。將 合 成 的 兩 段 單 股 寡 段， 酸  片 核 各 取 4.9ìL (100pnol/ìL)混合後，再加入 0.2ìL dimethyl sulfoxide(DMSO)，接著以 60℃、1 小時的條件進行黏合。黏合後的產物迅速與 質體進行接合(ligation)實驗，本實驗之質體 為酵母菌表現型載體 pPICZαB。之後再將接 合 產 物 轉 型 至 大 腸 桿 菌 DH5α 中 。 經 由 zeocin 篩選後所獲得的菌株，萃取其質體進 行 聚 合 連 鎖 反 應 檢 測 ， 分別以待測之質體

DNA 為模板(template)，應用 bLFcin cDNA 序列部分片段作為上游引子：bLFcin primer (5’-CAGTGGAGGATGAAGAAGCT-3’) ， 而 下 游 引 子 則 是 3’ AOX1 primer (5’-GGATGTCAGAATGCCATTTGC-3’)進 行 增值。圖一顯示 PCR 結果得到預期大小之 DNA 片段 (191bp) ， 即 可 推 測 待 測 之 質 體 4-1、4-3、4-4、4-5、4-6 及 4-8 具有牛乳鐵 蛋白素 cDNA 之序列，再將 4-8 選殖株進行 定序，而從序列圖確定其含有牛乳鐵蛋白素 之序列(圖二)。 圖一、牛乳鐵蛋白素表現載體之構築與 PCR 篩 選 之 結 果 。 (A) 酵母 菌 表 現 載 體內 含 有 á-factor 訊息蛋白、牛乳鐵蛋白素抗菌中心片 段、c-myc 序列與組胺酸序列。而圖上之引 子用於 PCR 篩選﹔(B)PCR 篩選結果，左側 為分子量指標，產物之長度為 191bp。

圖二、4-8 選殖株之定序結果；其含有牛乳鐵 蛋白素之序列、酵素截切位置、Ste13 訊息蛋 白與 Kex2 蛋白截切位置、c-myc 與組胺酸之 序列。 (四)以電穿孔(electroporation)進行酵母菌之 轉型作用 本實驗採 用 Invitrogen 公司的 Pichia pastoris GS115 為表現用的宿主細胞。將構築 好的 bLFcin/pPICZαB 質體利用 EcoRI 截切 成線性 DNA，取 5~10μg 線形 bLFcin/pPICZ αB 質體及準備好的勝任酵母菌 80μl 混 合，再移入已預冷至 0℃的 0.2cm cuvette 中。 電 穿 孔 使 用 的 設 備 為 Multipurpose Electroporation System （ EJ-002 ） EasyjecT Plus並設定條件為電壓 4500V，電容 150 μF，電阻 99Ω，電擊後立刻移入 YPD 中培 養 2 小時，之後將菌液均勻塗於含 zeocin(100 μg/ml)的 YPD 培養盤上，再放入 30℃培養 2~3 天。為了篩選嵌入 bLFcin 套數較多的轉 型酵母菌，從上述的培養盤中挑取菌落，再 移植到含有 5、10 及 20 倍等高倍 Zeocin YPD 培養盤中，以篩選出嵌入 bLFcin 基因套數多 的菌株，期能有較佳之 bLFcin 表現效果。將 長在含有 20 倍 Zeocin YPD 培養盤中的重組 酵母菌之染色體 DNA 萃取出以便進行 PCR 篩選，使用 bLFcin primer 及 3’ AOX1 primer 為引子進行 PCR 擴增反應，並將 PCR 產物 跑洋菜膠電泳（0.8%），由圖三可看到預期 PCR 產物之片段 191bp，因而確認轉殖株酵 母菌 GS115-bLFcin-6 染色體上確實有嵌入 bLFcin 之序列。 圖三、酵母菌染色體 DNA 進行 PCR 分析結 果，左側為分子量指標，使用之引子為 bLFcin primer 及 3’ AOX1 primer ， 而 產 物 長 度 為 191bp。

四、參考文獻

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lactoferricin B, a potent bactericidal peptide derived from the N-terminal region of bovine lactoferrin. J. Appl. Bacteriol. 73: 472-479.

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