磁性冷凍對牙髓幹細胞數量與特性之影響

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(1)私立台北醫學大學口腔醫學院牙醫學系碩士班碩士論文 Graduate Institute of Dentistry College of Oral Medicine Taipei Medical University. 指導教授: 李勝揚教授 (Lee, Sheng-Yang) 共同指導教授: 黃豪銘教授 (Huang, Haw-Ming). 磁性冷凍對牙髓幹細胞數量與特性之影響 Influences of Magnetic Cryopreservation On the Dental Pulp Stem Cells. 研究生: 蔣寶漳 (Chiang, Pao-Chang) 撰中華民國九十九年一月. January, 2010.

(2) 致謝從前會覺得奇怪，ㄧ本論文為何總以致謝開始，直到自己論文完成的這一刻，才知道如此的成果的確都是承蒙各界幫助而來，心中滿滿地只有感謝。碩士班三年多的日子，點滴回憶在心頭，由衷感謝李勝揚所長因材施教地嚴格訓練砥礪我的心志，以及黃豪銘老師按部就班地耐心教學帶領我進入科學的殿堂。關於臨床方面，誠心感謝蔡吉陽老師引我入門，有幸得窺齒顎矯正的奧妙，享受為人服務，創造美麗人生的成就感。也要謝謝林利香老師、王蔚南老師、蘇志鵬老師、許必靈老師以及蔣金玉老師不厭其煩地指導，使我獲益良多。另外本篇論文的完成承蒙鄭景暉老師、黃彥華老師、郭宗甫老師、蔡郁惠老師、黃子舟老師、楊維中老師的提點與指正，以及蔡世音老師、吳育偉博士、張耀仁先生、熊兆男小姐、卓依依小姐、邱奕樺小姐、詹雅惠小姐、馮聖偉醫師以及卡文迪西實驗室全體同仁在實驗技術上的協助與幫忙，還有一直以來共患難的宴莊學長，以及為了申請人體試驗而奔走的福源與慧茹，在此謹致上最誠摯的謝意。胡俊弘校長和中華扶輪教育基金會則在最需要的時候給予最直接的獎學金補助，讓我能無後顧之憂地完成論文，相信您們大善大愛的種子一定會在社會生根發芽，持續發揮影響力。最後要感謝我最愛的家人還有芊秀，謝謝你們這些年來的ㄧ路支持，體諒我因為不善處理人際關係而造成的挫折，也包容我為了理想不顧現實的偏執。經由這段令人難忘的研究所歲月歷練過後，希望未來能更圓融更成熟地面對人生各種挑戰，更有勇氣更有能力地堅持下去，繼續努力完成夢想。. I.

(3) 論文摘要論文名稱：磁性冷凍對牙髓幹細胞數量與特性之影響私立台北醫學大學口腔醫學院牙醫學系碩士班齒顎矯正學組研究生：蔣寶漳畢業時間： 98 學年度第 1 學期指導教授：李勝揚台北醫學大學口腔醫學院教授兼牙醫學系主任/所長共同指導教授: 黃豪銘台北醫學大學口腔醫學院生醫材料暨工程研究所教授. 研究背景及目的：近年來，科學界已研發出能夠成功保存牙周韌帶的特殊磁性冷凍法，可在降溫中形成玻璃化而避免因冰晶產生所造成的細胞傷害。藉由此技術可保存因齒顎矯正需求或感染預防而拔下的健康牙齒，作為未來自體再植。而隨著幹細胞科技發展，人類牙髓間葉幹細胞已被成功培養並鑑定，有機會被應用於再生醫療。本研究旨在擴大磁性冷凍的應用範圍，讓此一技術不只是能完整冷凍保存牙周韌帶以供解凍後再植，更能長期保存齒內牙髓組織，以供未來解凍後其中間葉幹細胞之分離與應用。. 研究材料及方法：在牙齒銀行中保存的牙齒設定為程式降溫冷凍組，同一患者之對側牙齒不予冷凍，設為未冷凍組。另外，並設計傳統冰箱-20 ℃冷凍組（以-20 ℃冰箱取代磁性程式降溫儀）。三組牙齒皆以組織塊酶解法培養出牙. II.

(4) 髓幹細胞。首先評估三組牙髓幹細胞之培養成功率（以未冷凍組作為標準，評估程式降溫冷凍組與傳統冰箱-20 ℃冷凍組是否受到冷凍影響），進而比較分析程式降溫冷凍組與未冷凍組之生長曲線（以 MTT 法），形態差異（掃描式電子顯微鏡影像），表面特徵蛋白（CD44 與 STRO-1 之免疫螢光染色）以及分化能力（脂肪化與骨化）。. 結果：程式降溫冷凍組有 73 ％的牙齒並未受到冷凍影響，仍然能夠成功培養牙髓幹細胞，而傳統冰箱-20 ℃則僅有 20 %的牙齒能夠成功培養牙髓幹細胞。以 MTT 法評估程式降溫冷凍組與未冷凍組之生長曲線無統計上顯著差異（p < 0.05）；電子顯微鏡之影像在程式降溫冷凍組與未冷凍組間亦無明顯差異；程式降溫冷凍組與未冷凍組之牙髓幹細胞也都能表現 CD44 和 STRO-1 兩種表面特徵蛋白以及脂肪化與骨化的能力。. 結論：本研究結果顯示磁性冷凍可將齒內牙髓組織以整顆牙齒的方式進行程式降溫冷凍保存，並培養出同樣生長潛力與表面特徵蛋白之牙髓間葉幹細胞，也能同樣表現多元分化能力。牙科患者未來儲存牙齒在程式降溫冷凍牙齒銀行內，不僅可供未來解凍後再植，亦可望視需要而培養其中牙髓幹細胞以提供臨床利用。. 關鍵詞：牙髓幹細胞、冷凍保存、牙齒銀行、再生醫療、多元分化. III.

(5) Abstract Title of Thesis: Influences of Magnetic Cryopreservation On the Dental Pulp Stem Cells Graduate Institute of Dentistry, College of Oral Medicine, Taipei Medical University Author: Chiang, Pao-Chang Thesis directed by:. DDS. Lee, Sheng-Yang DDS, MS, PhD Professor, Dean, School of Dentistry, College of Oral Medicine, Taipei Medical University Huang, Haw-Ming. PhD. Graduate Institute of Biomedical Materials and Engineerings, Taipei Medical University. Background & Objectives: Recently, scientists have successfully cryopreserved the periodontal ligament with a special magnetic cryopreservation method, which could induce vitrification to avoid the injuries from ice crystals to the cells. Consequently, the healthy teeth extracted for orthodontic treatment or prevention of infection could be potential donor teeth for future auto-transplantation. With the advancement of stem cell technology, human dental pulp stem cells have been cultured and could be used in regenerative medicine. This study was aiming to expand. the. application. of. Tooth. Bank. from. cryopreservation. auto-transplantation to long-term storage of dental pulp stem cells.. IV. for.

(6) Materials & Methods: The teeth stored in Tooth Bank were designed as the programming cryopreserved group. The non-cryopreserved group was teeth on contralateral side of the same patient. Besides, there was a traditionally freezing group (cryopreserved with -20 ℃ traditional freezer instead of program freezer with magnetic field used in the programming cryopreserved group). Dental pulp stem cells were isolated with enzyme digestion method from these 3 groups. First, the successful rate of culturing dental pulp stem cells in these 3 groups would be evaluated (by the standard set in non-cryopreserved group). Furthermore, the growth curve (by MTT method), morphology (by scanning electronic microscope, SEM), surface markers of stem cells (by immunostaining of CD44 and STRO-1) and ability of differentiation (adipogenic and osteogenic differentiation) of the dental pulp stem cells in the programming cryopreserved group and the non-cryopreserved group were evaluated and compared.. Results: The dental pulp stem cells in 73 % of the teeth in the programming cryopreserved group were considered as not been influenced after cryopreservation, since they could be normally cultured. However, the dental pulp stem cells in only 20 % of the teeth in the traditionally freezing group could be normally cultured. The growth curves evaluated by MTT method had no statistical differences between programming cryopreserved and non-cryopreserved groups. The morphology observed from SEM showed similar variety of cells in both groups. Both of dental pulp stem cells isolated from the programming cryopreserved group and the non-cryopreserved groups showed positive surface markers of stem cells (CD44+ and STRO-1+) and ability of adipogenic and osteogenic differentiation.. V.

(7) Conclusion: The results of this study indicated that dental pulp stem cells would remain their growth potential, surface markers and multi-lineage differentiation ability even after magnetic programming cryopreservation of the whole teeth. Patients who store teeth in Tooth Bank will have teeth not only for auto-transplantation but also have the chance of later isolation of dental pulp stem cells in the future needs.. Keywords: Dental pulp stem cells, Cryopreservation, Tooth bank, Regenerative medicine, Multi-lineage differentiation. VI.

(8) 目錄致. 謝 …………………………………………………………..……Ⅰ. 中文摘要………………………………………………………………... II 英文摘要………………………………………………………………. IV 目. 錄…………………………………………………………….... VII. 第一章、緒論第一節研究動機與重要性…………………………………………. 1 第二節研究目的………………………………………..................... 5 第三節研究假設………………………………………..…………... 7 第四節名詞界定………………………………………..................... 8 第二章、文獻回顧與查證第一節牙齒銀行的觀念與重要性………………………………... 10 第二節磁性冷凍程式降溫儀在牙醫學的利用…………………... 13 第三節牙齒冷凍保存對其牙髓組織之影響……………………... 15 第四節牙髓幹細胞的發展與應用………………………………... 17 第三章、研究材料與方法第一節實驗牙齒之選取與製備…………………………………... 19 第二節牙髓幹細胞的初級培養與繼代培養……………………... 21 第三節評估各組牙髓幹細胞培養受冷凍影響程度……………... 24 VII.

(9) 第四節牙髓幹細胞活性 MTT 的測量……………………………. 25 第五節牙髓幹細胞生長曲線之製作……………………………... 26 第六節牙髓幹細胞在電子顯微鏡下之形態觀察………………... 27 第七節牙髓幹細胞表面特徵蛋白之螢光免疫染色……………... 28 第八節牙髓幹細胞的脂肪化能力測試…………………………... 31 第九節牙髓幹細胞的骨化能力測試……………………………... 33 第十節統計分析…………………………………………………... 35 第四章、實驗結果第一節評估各組牙髓幹細胞培養受冷凍影響程度……………... 36 第二節冷凍保存前後牙髓幹細胞的生長曲線…………………... 36 第三節冷凍保存前後牙髓幹細胞形態差異……………………... 37 第四節冷凍保存前後牙髓幹細胞表面特徵蛋白之表現………... 37 第五節冷凍保存前後牙髓幹細胞脂肪化之能力………………... 38 第六節冷凍保存前後牙髓幹細胞骨化之能力…………………... 38 第五章、研究討論…………………………….……………………... 40 第六章、結論與未來展望…………………………….……………… 45 第七章、參考文獻…………………………….……………………… 47 附錄…………………………………………………………………... 52. VIII.

(10) 第一章、緒論第一節、研究動機與重要性齒顎矯正致力追求的目標在於確立咬合功能、改善顏面美觀、促進齒列及周邊解剖構造與環境的健康與和諧。學者們致力於現代矯正學的發展，經過一世紀餘的努力，便是為了能夠更快速有效率地達到上述目標。二十世紀初，被譽為現代矯正學之父的 Edward H. Angle 成立世界第一所矯正專門學校，有系統地訓練出專業的矯正醫師。Angle 主張人類齒列生而完美，只要將牙弓擴張到一定大小，臼齒關係正確，成人所有的三十二顆牙齒都可整齊地排在齒列中，形成所謂的「正常咬合」（normal occlusion），亦即矯正的「非拔牙治療」理論（non-extraction therapy）。但與 Angle 同時期的學者 Case 以及 Angle 的學生們 Tweed、Begg 等人卻有不同的看法，他們認為非拔牙治療的結果常帶來不甚美觀的外型以及不穩定的齒列，故從四零年代（1940s）開始，矯正學界有了「拔牙治療」（extraction therapy）的潮流。然而二十世紀後半，矯正學從追求齒列整齊與咬合關係的觀念逐漸轉型為整體顏面美觀的考量下，矯正醫師發現許多拔牙治療的患者反而因此喪失了他們原有飽滿圓潤的外型，側面觀成為向內凹陷（dished-in），整體看來顯得老氣（aged），因此，非拔牙治療的方式又重新開始流行。. 1.

(11) 時至今日，拔牙與非拔牙的論戰在矯正學界不時興起，仍無結論。但是對於所有矯正醫師與患者來說，為了矯正治療需求而「拔牙」，尤其是拔除健康的牙齒，儘管是必要之惡，總有些猶豫與不捨，臨床上也常有患者於就診時即表明不接受拔牙的矯正治療。因為保有正常健康的牙齒一直是牙醫學界所努力並指導民眾的方向，如今卻經常必須讓許多健康的牙齒淪為醫療廢棄物，令人不勝唏噓。一顆健康的牙齒在口腔內除可執行其固有的咬合功能，還能維持齒槽骨健康，並藉由牙周韌帶組織傳遞咬合訊息，可刺激腦神經發育，其重要性已被證實(Tsutsui et al. 2007)。但被迫必須拔除後，除了成為醫療廢棄物外，是否還有更寬廣的實用價值，成為矯正牙醫學的一個思考方向。目前在臨床的操作中，若拔下的牙齒保留相當程度的牙周膜韌帶，則可以作為自體的牙齒移植(auto-transplantation)之用，來取代因牙周病或嚴重齲齒而造成的缺牙。自體牙齒移植的實行在臨床上成功率高，牙齒的存活率高達 90％以上(Andreasen et al. 1990)，同時能夠提供人工植牙所無法達到的自體感受(Robinson 1983)，也能維持齒槽骨的高度，甚至日後可以做矯正治療，可說是最佳的缺齒治療方法(Kawasaki et al. 2004)。雖然牙齒自體移植的好處很多，但並非隨時可以進行。可能的原因是沒有適當的移植位置，尚需時間矯正調整，由於從前沒有牙齒保存的觀念及方法，使得這些健康的牙齒成為醫療廢棄物。因此，「牙齒銀行」---冷凍保存牙 2.

(12) 齒的觀念(Kaku et al. 2007)，便應運而生，其目的在冷凍保存牙齒及牙齒周圍的牙周韌帶，使其解凍後可供再植，提供缺齒患者一項新的治療選擇(Oh et al. 2005)。近年來，新一代的醫療科技研發，以再生醫療與幹細胞醫療最受到關注。歐美先進國家的企業中，許多生技公司或實驗室已可成功證實藉由人類的幹細胞再生出器官的可能性。在日本，許多大學與創投企業合作，齊力研究包括:內臟器官的相關開發;人類胚胎幹細胞的製作;甚至是從人類胚胎幹細胞或誘導多能性幹細胞(iPS: induced pluripotent stem cell)(Donovan and Gearhart 2001)來再生出臟器等研究也正著手進行。在牙醫學方面，人類牙髓幹細胞已能夠被成功地分離出來(Gronthos et al. 2002; Gronthos et al. 2000)，近年來的研究發現牙齒中的牙髓幹細胞可分化為脂肪細胞（ adipocytes ）、類神經細胞（ neural-like cells ）、造牙母細胞（odontoblasts）(Gronthos et al. 2002; About et al. 2000)，具有成為幹細胞療法（stem cell therapy）(Lovell-Badge 2001; Segers and Lee 2008)的潛力。且因為齒顎矯正治療或感染預防需求而拔下的健全牙齒，其取得較其他身體來源的幹細胞不具侵入性（non-invasive），因此格外具有未來性(Iohara et al. 2008)。但有關牙髓幹細胞的研究目前仍然不多見，尤其牙髓組織在經過冷凍保存之後，是否仍能培養出具有活性且可分化之牙髓幹細胞則仍未被研究。. 3.

(13) 基於此，本實驗將利用具磁性刺激功能之程式降溫儀來冷凍保存整顆健康牙齒之基礎下，進而評估其中牙髓組織在磁性冷凍後的特性及功能，從而拓展牙齒銀行的應用範圍，並期待本研究結果能夠提供未來牙髓幹細胞的臨床應用。. 4.

(14) 第二節、研究目的再生醫療的基本理念，是在缺損部位的周圍，使用自體的細胞或自體的組織來回復原本的生理機能的能力。理想上，若缺損部位的周圍沒辦法由自己的組織來回復的話，退而求其次，則應由自體取得的生物材料(組織、細胞，加上人工材料)來回復機能。最後不得已，才是單獨使用人工材料（包括時下流行的「人工植牙」）來回復原本喪失的功能。幹細胞療法（stem cell therapy），便是以自身組織來進行再生醫療的絕佳方式 (Segers and Lee 2008; Lovell-Badge 2001)。隨著科技的日新月異，出生後幹細胞(post-natal stem cells)已成功地從許多人類組織中被培養出來，例如骨髓、神經組織(Servili et al. 2008)、骨骼肌、上皮組織、牙髓腔、牙周韌帶等(Otaki et al. 2007)。隨著幹細胞與組織工程技術的進步與未來性，如何有效長期保存幹細胞則成為幹細胞臨床治療的另一個重要課題。經過近數十年來科學界的努力，冷凍保存後的造血幹細胞已證實能在臨床疾病治療中成功地被應用(Broxmeyer et al. 2003) ，也証明了冷凍保存過後的幹細胞在解凍後恢復其功能是具有可行性的。在牙醫學方面，人類牙髓幹細胞已能夠被成功地分離出來(Gronthos et al. 2002; Gronthos et al. 2000)，因此，因為矯正治療或感染預防需求而拔下的健全牙齒，除具有健康的牙髓組織可供研究分析，同時也成為了牙髓幹細胞的最佳來源。. 5.

(15) 因此，本實驗的研究目的為證明使用具磁性刺激之程式降溫儀冷凍過之整顆牙齒，其中牙髓組織仍有活性，經復甦後仍具有可分化為其他細胞的能力，期待經由本研究能提供未來牙髓幹細胞的臨床應用，並因而拓展牙齒銀行的應用範圍，使存入牙齒的患者能有將來再植牙齒與牙髓幹細胞利用的雙重用途。. 6.

(16) 第三節、研究假設「牙齒銀行」的概念在經過日本廣島大學的研究開發後，已證實能成功冷凍保存牙齒，並在解凍後進行再植入手術，其關鍵在能夠成功保存牙周韌帶（Kaku et al. 2007）。然而近年來的研究發現，牙齒中的牙髓組織可分離出牙髓幹細胞，(Gronthos et al. 2002; Gronthos et al. 2000)，並提供未來發展幹細胞療法（stem cell therapy） (Segers and Lee 2008; Lovell-Badge 2001)，具有無限潛力，但此牙髓組織中的幹細胞經長期冷凍後之生理活性則仍然未知。本實驗假設，經由具磁性刺激之程式降溫儀處理後之牙齒可同樣成功地冷凍保存牙髓組織，亦即將整顆牙齒冷凍保存在牙齒銀行後，解凍後之牙髓組織仍能夠分離出牙髓間葉幹細胞，並仍具有間葉幹細胞應有之表面特徵蛋白與分化能力，從而推論其具有未來臨床幹細胞療法之潛力。. 7.

(17) 第四節、名詞界定 1. 牙髓組織牙髓（pulp）為一似膠質的疏鬆結締組織（loose connective tissue），提供了牙齒的造牙本質特性（dentinogenetic），以及營養、感覺和感染防禦的功能 (Tziafas et al. 2000) 。富含聚合多胺醣 (glycosaminoglycan) 與蛋白多醣 (proteoglycan)，有神經與血管供應。在牙根尖端的小孔與外邊的牙周膜韌帶相通。光學顯微鏡下，年輕成熟的牙髓組織可分為外層鄰近牙本質先驅細胞（predentin）的牙母細胞層(odontoblastic layer)、往內可見無細胞區(cell-free area，zone of Weil)、再向內為多細胞區(cell-rich zone)，三層細胞圍繞著一個核心（core）。核心含有最多的牙髓細胞，以及神經、血管（Walton et al. 2002）。. 2. 冷凍保存冷凍保存活體組織可在超低溫下停止所有生物反應，並保有其可回復的活性，其成功關鍵在於減少細胞內冰晶的形成以及降低因為細胞間水份凍結導致溶質濃度變高所造成的傷害。可依以下四種原則達成目的： (1)緩慢降溫使水分能離開細胞，但不能過慢而導致冰晶形成。 (2)利用親水性的冷凍保護劑來分離水分。 (3)儘可能地在最低溫保存細胞以減少高離子濃度對蛋白質的變性效應。. 8.

(18) (4)快速解凍以避免過程中冰晶形成及細胞內溶冰時造成的濃度梯度。生物組織可在-196 ℃低溫下保存百年以上，故冷凍保存的挑戰在於降溫過程與解凍過程如何保持細胞活性。其關鍵在於細胞內是否凍結（intracellular freezing），若細胞內的水分結凍形成固相，將會導致細胞死亡(Mazur 1984)。本實驗嘗試使用具有磁性刺激功能之程式降溫儀，在降溫過程中持續提供微小磁場，使細胞結凍時產生玻璃化的現象，保護細胞不受冰晶的傷害 (Kaku et al. 2007)，從而達到冷凍保存的目的。. 3. 牙齒銀行日本廣島大學牙齒銀行團隊(Kaku et al. 2007)於 2004 年成立全世界第一家牙齒銀行，在 2008 年將技術移轉至台北醫學大學，其冷凍牙齒之特殊技術乃利用帶有上述磁場的程式降溫儀來冷凍保存牙周膜韌帶細胞(Kaku et al. 2007)，以供日後患者再植之用。日本廣島大學的「牙齒銀行」已有 1600 顆牙齒儲存，在 106 例植回的結果中，牙根完全形成的移植齒成功率為 92.5%，牙根未完全形成的移植齒成功率更高達 100 %（http://www.teethbank.jp/）。. 9.

(19) 第二章、文獻回顧與查證第一節、. 牙齒銀行的觀念與重要性. 如果臨床上遇到患者缺牙時，以再生醫療的觀念而言，牙醫師會希望在缺牙部位重新培養出新的牙齒(Ohazama et al. 2004)，這也是現今有關幹細胞療法（stem cell therapy）(Lovell-Badge 2001)的研究正方興未艾的主要原因，但這樣理想中的醫療技術目前仍無法實踐，且有待日後學界的努力發展。故退而求其次，缺齒時若能以自體組織來修復缺損的部位，也就是用自己的牙齒來取代(Lee et al. 2001)，則應為臨床處置之第一選擇。就目前的牙醫學發展，治療缺齒問題的方式包括以活動假牙、牙橋，或是人工植牙贗復(Jonsson and Sigurdsson 2004)，也可以用矯正方式使牙齒移動來關閉缺牙空間(Burbridge et al. 2005)，再者，便是使用患者本身其他部位的牙齒進行自體移植（auto-transplantation)(Andreasen et al. 1990)。其中只有矯正治療或是自體移植符合現今再生醫療的趨勢，也就是以自體組織來修復缺損。然而，以矯正治療關閉一顆臼齒的空間約需要兩年以上的時間，對於患者來說也有必須適應矯正裝置的負擔，臨床上接受度不高。相較而言，自體移植的治療方式可避免鄰牙因為牙橋製作造成的健康齒質磨損(Kristerson et al. 1991)，另外由於擁有具有活性的牙周韌帶，可提供人工植牙所沒有的本體感覺（proprioception）(Robinson 1983)，亦能使缺齒部位的齒槽骨再生(Shimono. 10.

(20) et al. 2003)，甚至日後可利用矯正裝置來移動(Kawasaki et al. 2004)，可說是缺齒的最佳治療方式。以往由於沒有適當的保存方式，因此原本可用來作為再植來源的牙齒，例如因矯正拔除的健康小臼齒、因感染預防需求而拔除的智齒，或是多生牙、阻生齒等，過去都被當成醫療廢棄物丟棄(Yin et al. 2001)。近年來則因為冷凍保存牙周韌帶細胞的技術(Schwartz et al. 1985)日益成熟，臨床上便可將拔下的健康牙齒長期保存以作為日後再植之用，也因此逐漸浮現出「牙齒銀行」的新觀念(Oh et al. 2005)。「牙齒銀行」（tooth bank）的名稱在文獻上首見於西元 1966 年(Coburn et al. 1966) ， Andreasen 和 Schwartz 等學者則開始有系統的臨床應用與追蹤 (Schwartz et al. 1985)，但是第一個企業化的「牙齒銀行」--- 歯の銀行（ティースバンク）則是在西元 2004 年創始於日本國立廣島大學（http://www.teethbank.jp/research.html），其特色是改進以往冷凍保存的方式，進一步以帶有微弱磁場的程式降溫儀（CAS---Cells Alive system）（ABI Co. Ltd., Japan）來冷凍保存整顆牙齒，並證實能確保其牙周韌帶的活性 (Kaku et al. 2007)。西元 2007 年，台灣台北醫學大學與姐妹校日本廣島大學締結技術合作的結盟，成立世界第二家牙齒銀行，並於西元 2008 年 9 月開始運作。. 11.

(21) 也由於「牙齒銀行」的技術已漸成熟，能夠長期保存將來可供再植的牙齒及其牙周韌帶細胞的活性變為可行，此不僅對牙醫學臨床醫療有許多實質上的幫助，牙醫師們將來更能掌握再植齒牙根形成程度最佳的時機 (Temmerman et al. 2008)，以及提供某些患者先做矯正治療創造再植齒空間後進行自體移植(Laureys et al. 2001)，可說是牙醫學發展的一大突破。. 12.

(22) 第二節、. 磁性冷凍程式降溫儀在牙醫學的利用. 現今科學界已有相當多關於組織與器官冷凍保存的研究與應用，例如血庫（blood banks），骨髓銀行（bone marrow banks），臍帶血銀行（cord blood bank）等。另外像是精子銀行（sperm bank），已有多年的臨床應用，包括因惡性腫瘤須接受化療的患者可先行儲存精子以保留生育能力(Lass et al. 2001)，或是尚未有伴侶的男性可以趁年輕時先儲存品質較好之精子來培育更優質的下一代。就冷凍方式而言，有學者提出最好以每分鐘下降 1 ℃的速率來降溫(Leibo and Mazur 1971)以得到最好的效果。另外也有學者由動物實驗中指出，狗的精子在經過生物性降溫儀(biological freezer)的慢速冷凍(slow freezing)程序下（在 5 ℃到-10 ℃之間每分鐘降溫 0.5 ℃後繼續在-10 ℃到-60 ℃之間每分鐘降溫 8 ℃，最後放入液態氮內），相較於快速冷凍(rapid freezing)程序（在液態氮蒸氣中冷凍，距離液面 4 公分），其解凍後精子活動力(motility)較好(Rota et al. 2005)。證明以程式降溫儀循序漸進式的冷凍方式確實有其效果。生物體組織在冷凍過程中，細胞會因產生細胞內冰晶（intracellular formation of ice crystals）而受到傷害(Frederik and Busing 1981)，而在 0 ℃到 -4 ℃間，冰晶會形成最大量。近年來有學者嘗試使用磁場來減少細胞在冷凍過程中受到冰晶的傷害(Kaku et al. 2007)，該研究團隊基於日本食品冷凍業界（ABI Corporation）採用磁性冷凍法（稱為 Cells Alive System, CAS）使食物 13.

(23) 保鮮的方式，延伸利用於牙醫學界來保存牙周韌帶。應用該磁性冷凍系統在細胞冷凍過程中，其微弱的磁場將使細胞內外之水分子，產生電子順磁共振效應而達到過冷狀態，此時若瞬間改變冷凍物狀態則可以形成玻璃化冷凍，而細胞在玻璃化冷凍下較不會受到傷害。經由上述立論基礎，磁性冷凍程式降溫儀在牙醫學界開始被使用，牙周韌帶細胞的冷凍保存乃由整顆健康牙齒在加入 75 mA 電流後產生的微弱磁場下，經由程式降溫儀的程式降溫（降溫程序設定為-5 ℃維持 15 分鐘，之後以每分鐘下降 0.5 ℃的速率降溫至-32 ℃後放入-150 ℃冰箱保存），解凍過後能有 90 %的細胞存活率(Kaku et al. 2007)。本研究期望磁性冷凍程式降溫儀冷凍保存整顆健康牙齒的方式能夠同樣應用於牙髓組織的冷凍保存，如此一來，患者利用磁性程式降溫冷凍保存整顆健康牙齒將能有未來牙齒再植與牙髓幹細胞培養的雙重用途。. 14.

(24) 第三節、. 牙齒冷凍保存對其牙髓組織之影響. 時至今日，研究牙髓組織活性與牙齒冷凍保存之間關係的相關文獻不多，因此，關於牙齒冷凍保存對於牙髓組織的影響，至今尚無定論(Temmerman et al. 2006)。文獻上最早有相關結論是由 Price 和 Cserepfalvi 等學者發表，他們認為未完全成熟（immature）的牙齒若能在拔牙後立刻依照標準程序冷凍處理的話，能夠維持其牙髓活性(Price and Cserepfalvi 1972)。但 Andreasen 和 Schwartz 等學者則持相反意見，他們認為牙齒冷凍時，其牙髓組織無法接受到冷凍保護劑的保護，必然會失去活性，因此在移植手術過後必須進行根管治療(Schwartz and Andreasen 1983)。在研究方法上，兩派學者使用於評估牙髓活性的方式並不相同，Price 等學者是直接將牙髓細胞利用組織塊法(tissue explant method)評估細胞向外生長的情形；Andreasen 等學者則是由牙根的發炎性吸收（inflammatory resorption）推斷牙髓已失去活性。然而，牙髓細胞在牙齒冷凍保存後是否仍具有活性和再植後牙齒能否重新獲得血流供應（revascularization），或是牙髓再生（pulp regeneration），並沒有絕對的關係(Temmerman et al. 2006)。而牙髓幹細胞的發現在西元 2000 年正式被發表(Gronthos et al. 2000)，該研究是以組織塊酶解法來培養牙髓幹細胞，因此，本實驗選擇使用牙髓組織能否以組織塊酶解法培養出牙髓幹細胞來判斷其是否仍具有活性。. 15.

(25) 另一方面，因為 Price 等學者是使用 9 到 16 歲的牙齒作為樣本(Price and Cserepfalvi 1972)，而 Andreasen 等學者則是使用發育成熟（mature）的牙齒 (Schwartz and Andreasen 1983)。因此，有學者認為上述兩種研究結果的差異關鍵在於實驗用牙齒之牙根尖是否完全封閉(Temmerman et al. 2006)。依據口腔組織學的文獻指出，牙根發育的完成和根尖的閉合時間大約是在牙齒萌發三年後之內完成，意即除了智齒以外，第二大臼齒前二十八顆恆牙齒列若依照正常發育情形於十二歲左右萌發完成，十五歲以後的恆牙應該都是牙根發育成熟（mature）、根尖完全封閉的牙齒（closed apex）。但牙根尖閉合程度是否能作為判斷成功冷凍保存牙齒內牙髓組織的絕對依據仍有疑慮。本研究期望牙齒銀行冷凍保存整顆牙齒的技術也能成功冷凍保存其中的牙髓組織，使解凍後牙齒內之牙髓組織仍能分化牙髓細胞，提供未來牙髓幹細胞的來源。. 16.

(26) 第四節、. 牙髓幹細胞的發展與應用. 近年來的醫療方向以再生醫療為主流，其中「幹細胞療法」(Lovell-Badge 2001)更是科技發展的重點，因為「成人幹細胞」（adult stem cell）(Fraser et al. 2004)或是「出生後幹細胞」（postnatal stem cell）(Seo et al. 2005)已能成功地從許多人類組織中被培養出來。包括骨髓、神經組織(Servili et al. 2008)、骨骼肌、上皮組織、牙髓腔、牙周韌帶等(Otaki et al. 2007)。而不論是「成人幹細胞」或是「出生後幹細胞」，由於沒有道德上的問題，也具有自捐性，意即可以由患者本人的組織取得，臨床應用上優於「胚胎幹細胞」（embryonic stem cell） (Cordeiro et al. 2008)。所有成人幹細胞的來源中，臍帶血幹細胞（umbilical cord stem cell）的儲存一生只有一次機會，骨髓幹細胞（bone marrow stem cell）的取得會對患者造成不適，牙髓幹細胞（dental pulp stem cell）因為可以直接由拔下來的牙齒取得，幾乎完全沒有侵入性(Iohara et al. 2008)，因此可說是幹細胞的最佳來源。牙髓幹細胞可由乳牙(Cordeiro et al. 2008)、恆牙(Gronthos et al. 2000)，甚至多生牙(Huang et al. 2008a)中取得。近年來的研究發現，牙髓幹細胞能在有生物相容性的支架中，分化出造牙母細胞(Almushayt et al. 2006)、類牙本質/ 牙髓結構(Chang et al. 2005) ，以及再生出牙本質(Iohara et al. 2004)來修復牙齒結構；甚至可以分化為脂肪細胞（adipocytes）(Gronthos et al. 2002)、神經細胞(Arthur et al. 2008)等來治療中樞神經系統的神經病變(Huang et al. 2008b)； 17.

(27) 更有學者研究發現牙髓幹細胞用於治療心肌梗塞（myocardial infarct）(Gandia et al. 2008)，以及修復肝臟纖維化的肝功能(Ikeda et al. 2008)的可行性。這些研究均証明牙髓幹細胞未來發展的潛力無窮。本研究團隊期望以現有牙齒銀行之技術為基礎，研究以患者保存牙齒將來進行自體移植治療缺齒問題的可能性之外，同時亦希望能夠瞭解其中牙髓組織的活性是否也能成功保存。. 18.

(28) 第三章、研究材料與方法第一節、實驗牙齒之選取與製備本實驗目的為評估在牙齒銀行冷凍保存的牙齒中之牙髓組織是否仍有活性，牙齒的來源在台北醫學大學附設醫院及附屬萬芳醫院牙科部就診之患者（患者必須健康無全身系統性疾病，且患者本人或其法定代理人須在充分了解相關資訊的情形下簽署牙齒捐贈同意書）。同一名患者因齒顎矯正治療或感染預防而拔除的成對健康無缺損之小臼齒或是智齒將成為本實驗對照比較之樣本，其中一顆設定為程式降溫冷凍組，冷凍於牙齒銀行ㄧ週後再解凍後培養其牙髓幹細胞；另一顆則設定為未冷凍組，牙齒拔下後直接培養牙髓細胞 (如圖一所示) 。為證明本研究所使用的程式降溫儀的確能預防冰晶並有減少凍害之效果，本研究另設有傳統冰箱-20 ℃冷凍組，此傳統冰箱冷凍組的牙齒不限定為同一患者，其降溫程序以-20 ℃冰箱代替程式降溫儀。此外，為了去除年齡因素對牙髓活性造成之影響，故樣本選取限定於十五歲以上三十歲以下（西元 1979 年到 1994 年出生者），且所有牙齒在取樣後均進行正式的牙齒檢查，以確定實驗牙齒無其他病變。程式降溫冷凍組牙齒依照牙齒銀行所提供之牙齒冷凍標準作業程序操作 (Kaku et al. 2007)。臨床上將牙齒拔下後立即放入生理食鹽水，並在二十四小時之內移放至裝有冷凍保存液（BAMBANKER, LYMPHOTEC Inc., Japan）之. 19.

(29) 冷凍保存瓶內，然後放入配備有”Cells Alive System”(CAS)磁場設備的程式降溫儀(ABI Co., Japan)進行降溫(如圖二所示)。此時程式降溫儀應事先運轉，溫度保持在-5 ℃。牙齒放入前必須先按鈕啟動 CAS 磁場，並將指數設定為 6.0。降溫程序設定為-5 ℃維持 15 分鐘，之後以每分鐘下降 0.5 ℃的速率降溫至-32 ℃，故降溫時間為 54 分鐘。降溫完成後將冷凍保存瓶直接放入-150 ℃冰箱保存。冷凍保存ㄧ週後，再解凍牙齒並培養牙髓幹細胞。解凍程序為在 37 ℃水浴槽內快速解凍，待瓶中固態之冷凍保存液轉為液態時取出牙齒，並利用組織塊酶解法(Gronthos et al. 2000)（詳細步驟於後段另有詳述）培養其中牙髓幹細胞。未冷凍組為同一患者之另一顆牙齒，在拔牙後放入生理食鹽水，不經任何處理程序，直接在細胞培養室取出牙齒，並利用組織塊酶解法培養其中牙髓幹細胞。另一方面，為證明程式降溫儀的確有優異的預防冰晶減少凍害之效果，本研究另設有傳統冰箱-20 ℃冷凍組。傳統冰箱冷凍組的牙齒不限定為同一位患者，該組牙齒拔下後同樣立即放入生理食鹽水，並在二十四小時之內移放至裝有冷凍保存液（BAMBANKER, LYMPHOTEC Inc., Japan）之冷凍保存瓶內，然後放入-20 ℃降溫兩小時。後續處理過程與程式降溫冷凍組完全相同，同樣放入-150 ℃冰箱保存，冷凍保存ㄧ週後，再解凍培養牙髓幹細胞。解凍程序為在 37 ℃水浴槽內快速解凍，待瓶中固態之冷凍保存液轉為液態時取出牙齒，並利用組織塊酶解法培養其中牙髓幹細胞。. 20.

(30) 第二節、牙髓幹細胞的初級培養與繼代培養 1. 藥品製備 (1) α-MEM 培養基: 實驗中所使用之培養基為α-MEM（Minimum Essential Medium Alpha Medium）(Gibco 11900-024, U.S.A.)，提供牙髓細胞生長所需之養分。配製方法為將小包裝（可配成一公升培養基）的α-MEM粉末以二次水溶解，並加入 Sodium Bicarbonate 2.2 g/1 L、15 %的胎牛血清(FBS)(Gibco 26140-079, U.S.A.) 和加入含有penicillin、streptomycin 、amphotericin B 的Antibiotic-Antimycotic 10 ml/1 L （ Gibco 15240-062, U.S.A ）以及 L-ascorbic acid 2-phosphate （BioChemika 49752-10 G, stock=20 mM）5 ml/1 L，pH值調整至7.4，冷藏保存在4 ℃冰箱。 (2) D-PBS（Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline）溶液： D-PBS為一種磷酸緩衝生理食鹽水，多用於細胞生物學、生化學中之細胞實驗。此種緩衝溶液以生物體內常見的離子所構成，乃無毒性之等張溶液，可作為洗淨細胞與配製試藥之用。也可用於繼代過程中，將培養皿內殘留的鈣、鎂離子洗去，俾使附著凝集的細胞呈現游離狀態。本試藥D-PBS溶液（Sigma D5652, U.S.A.）分裝成可配製1 L之小瓶，以二次水溶解配製而成，保存於4 ℃冰箱中。. 21.

(31) (3) type I collagenase：以D-PBS將Type I collagenase（Sigma C0130, U.S.A）溶解為4 mg/ml之溶液，並以0.2 μm濾網過篩，保存於-20 ℃。 (4) dispase II：以D-PBS將Dispase II（Sigma D4693, U.S.A）溶解為2 mg/ml之溶液，並以0.2 μm濾網過篩，保存於-20 ℃。 (5) trypsin-EDTA: trypsin為胰蛋白酶，用於分解細胞附著在培養皿的附著蛋白。EDTA是鈣、鎂等二價金屬離子的螯合劑，其作用為去除金屬離子，以避免影響trypsin 的作用效果，讓附著的細胞得以與培養皿分開。本實驗使用之trypsin-EDTA （0.5 %, 10 x）(Gibco 15400-054, U.S.A.)含有 5.0 g/L trypsin (1:250), 2.0 g/L EDTA• 4 Na, 8.5 g/L NaCl, 需以D-PBS稀釋十倍，保存於-20 ℃。. 2. 牙髓幹細胞初代培養本實驗採用的牙髓幹細胞是由人類牙髓組織採用組織塊酶解法（tissue explant-collagenase digestion method）(Gronthos et al. 2000)於體外進行初代培養而來(如圖三所示)。實驗步驟如下，以中藥材研磨缽敲碎牙齒後取出牙髓組織，先將牙髓組織在 6 cm 培養皿中浸泡前述 α-MEM 培養基，待濕潤後移至另一 6 cm 培養皿以 15 號刀片切碎成泥狀，切碎的組織以 0.5 ml type I collagenase（4 mg/ml）與 0.5 ml dispase II（2 mg/ml）之 1 ml 混合溶液浸泡，. 22.

(32) 用微量吸管放入 15 ml 離心管中，在 37 ℃水浴槽內振動反應 30 分鐘至 1 小時。反應完成後加入 9 ml α-MEM 培養基，再以 600 g 離心五分鐘，捨棄上清液後將剩餘細胞以 10 ml α-MEM 培養基溶出並過篩（70 μm strainer, Falcon, U.S.A.），最後置於 6 cm 培養皿中培養於含 5 % CO2、37 ℃及 100 %濕度的細胞培養箱，隔日更換 α-MEM 培養基，培養時每週更換兩次培養基。此時定義為初代（第一代）細胞。. 3. 牙髓幹細胞繼代培養: 當細胞在培養皿裡形成聚落並達八分滿盤時，必須將細胞繼代培養（ subculture ），以幫助細胞繼續順利生長。實驗時使用濃度為 0.05 % trypsin-EDTA來進行繼代細胞培養，步驟如下：吸取舊培養基捨棄後，利用10 ml D-PBS 溶液清洗2次，再加入0.05 % trypsin-EDTA 1.5 ml作用數分鐘，於倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA溶液，然後將培養皿放回細胞培養箱靜待約十分鐘，於顯微鏡下觀察，確定細胞分離完全後加入適量新鮮培養基，與脫落之細胞或細胞團塊混和均勻，將細胞打下，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常條件繼續培養。每次細胞成功繼代後，依序定義為第二代、第三代…，以此類推。. 23.

(33) 第三節、評估各組牙髓幹細胞受冷凍影響程度各組牙髓幹細胞初代培養 30 天後，以標準繼代程序由 6 cm dish（內含 5 ml medium）繼代至 10 cm dish，此時進行細胞計數，細胞計數步驟遵循傳統血球計數方式，將牙髓幹細胞懸浮充分均勻打散後，利用trypan blue將細胞染色置於血球計數盤上，在顯微鏡下計算九宮格四角之細胞數，據以推算每單位體積之細胞數（單位為 104 cells/ml）。本實驗以未冷凍組牙齒培養牙髓幹細胞生長 30 天的細胞最少數量為基準（5 ml medium in 6 cm dish, 6x104 cells/ml），評估程式降溫冷凍組與傳統冰箱冷凍組各顆牙齒培養之牙髓幹細胞之生長情形。若生長 30 天後細胞數少於基準量（6x104 cells/ml），則定義該顆牙齒受到冷凍影響；若生長 30 天後細胞數大於基準量（6x104 cells/ml），則定義該顆牙齒未受到冷凍影響。. 24.

(34) 第四節、牙髓幹細胞活性 MTT 的測量黃色的MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a tetrazole)試藥會被活體細胞中的粒線體降解（reduced）為紫色的formazan salt 結晶(Mosmann 1983)。此結晶可用dimethyl sulfoxide（DMSO）溶出成為有色液體，細胞活性越高，其所呈現的顏色越深，再以免疫酵素分析儀(Model 2020, Anthos Labtec Instruments, Austria )以 570/690 nm 的波長讀取吸光值。藉以定量分析細胞活性的狀況。本實驗將進行為期一週的牙髓細胞生長曲線測試（第 0~5 天）。程式降溫冷凍組為冷凍保存齒中取出之牙髓細胞；未冷凍組為牙齒拔下後直接取出之牙髓細胞。每一時間點進行三重複的測定，並以培養基為空白組(blank)。. 測試進行前將牙髓細胞打下，並將細胞懸浮液作計數，調整細胞濃度至 1x104 cells/ml，然後於 24 孔盤中每孔注入 500 μl。在前述的測試時間(第 0~5 天)，每天固定時間於該日需測試之細胞培養液內加入 50 μl MTT，並放回細胞培養箱中待其作用 4 小時。之後小心移除細胞培養液，加入 500 μl DMSO 將結晶溶解，以每格 100 μl注入 96 孔盤中。5 分鐘後利用免疫酵素分析儀 (Model 2020, Anthos Labtec Instruments, Austria )以 570/690 nm 的波長讀取吸光值。. 25.

(35) 第五節、牙髓幹細胞生長曲線之製作將 MTT 分析結果做圖，將受試樣本（共 4 人，每人各有 1 顆磁性冷凍組與未冷凍組的牙齒）吸光值之平均與標準差算出，並以 X 軸為天數，分別是細胞接種後第 0 天、第 1 天、第 2 天、第 3 天、第 4 天、第 5 天。製作牙髓細胞 MTT 生長曲線。. 26.

(36) 第六節牙髓幹細胞在電子顯微鏡下之形態觀察本實驗以掃描式電子顯微鏡（scanning electronic microscope, SEM）觀察冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞在形態上是否有差異。實驗進行時將細胞培養於 24 孔培養盤中，內有消毒洗淨後之蓋玻片。實驗分為磁性冷凍組與未冷凍組，首先去除細胞培養液，並以 PBS 清洗細胞 3 次，接著將細胞以 2.5 % 戊二醛(glutaraldehyde)及 2 %三聚甲醛(paraformaldehyde)固定 20 分鐘，然後再以 1 % (in 0.1 M PBS)四氧化鋨(osmium tetroxide)固定 30 分鐘。在初步固定之後，樣品再以 1 %鋨酸後固定 1 小時。接著將樣品以 PBS 清洗並依序以 70 %、 80 %、90 %、95 %及 100 %酒精進行脫水與臨界點乾燥(HCP-2, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)。脫水乾燥後的樣品以鍍金器(IB-2, Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan)噴鍍一層鈀金(palladium gold)。處理後的細胞利用 Hitachi S-2400 電子顯微鏡系統加以觀察(Hitachi, Ltd, Tokyo, Japan)。. 27.

(37) 第七節、牙髓細胞表面特徵蛋白之螢光免疫分析為分析冷凍保存後的牙齒中培養出的牙髓細胞能否表現其特殊之表面特徵蛋白，本實驗利用螢光免疫染色法來比較程式降溫冷凍組與未冷凍組牙髓幹細胞之表面特徵蛋白表現有何異同。本實驗單一染色所測試之牙髓幹細胞表面特徵蛋白為CD34、CD44 與 STRO-1(Shi et al. 2005)。其中CD34 與CD44 採用不帶螢光之一抗與帶有螢光之二抗交互反應進行染色。使用抗體分別如下，CD 44 ㄧ抗：HCAM (F-4) sc-9960, mouse monoclonal IgG 1 (Santa Cruz)；CD 34 ㄧ抗：(ICO115) sc-7324, mouse monoclonal IgG 1 (Santa Cruz)；二抗(綠光)：DyLightTM488-conjugated AffiniPure. Goat. Anti-Mouse. IgG(H+L). 115-485-003-15. μl. (Jackson. ImmunoResearch)。 STRO-1 抗原則是直接使用帶有螢光之抗體進行染色。另外，本實驗為加強印證牙髓幹細胞應同時擁有 CD44 與 STRO-1 兩種抗原，故進一步選用帶有紅色螢光之 CD44 抗體與帶有綠色螢光之 STRO-1 抗體同時進行雙染。使用抗體分別如下，CD44(紅色):HCAM AF647 sc-7297 (Santa Cruz)；STRO-1(綠色):STRO-1 FITC sc-47733 (Santa Cruz)。本實驗進行螢光免疫染色時須準備無菌之細胞培養用六孔盤以及消毒洗淨後之蓋玻片。蓋玻片消毒洗淨之標準流程如下，將蓋玻片用乾淨的鑷子夾住一角，以清水沖洗濕潤後，以清潔劑(detergent)搓洗蓋玻片。再以去離子水. 28.

(38) (DD water)將清潔劑徹底沖洗乾淨後以氣槍吹乾，接著依序以 acetone 及 IPA 沖洗，再以去離子水將 IPA 徹底沖洗乾淨。最後以氣槍將蓋玻片吹乾，放入塑膠封套中高溫高壓消毒。消毒完成後予以 UV 照射保存，使用前拆封。ㄧ抗與二抗交互反應染色步驟如下，將各實驗組別之牙髓幹細胞以 1x104 cells/ml，1 ml/plate的濃度接種於 6 孔盤培養（6 孔盤內每孔各放入 1 片消毒洗淨後之蓋玻片），待細胞成長至約六分滿時進行實驗。染色開始前先吸去 medium，將細胞以PBS溶液洗淨，然後加入 4 %的福馬林（paraformaldehyde） 1 ml/plate，於室溫進行細胞固定約 20 分鐘。細胞固定完成後重新以PBS溶液洗淨，再加入 0.5 % triton X100（1 ml/plate）(0.5 % triton X-100, 2 % BSA and 0.05 % NaN 3 in PBS. To 190 ml PBS, add 4 g BSA, 1 mL triton X100 and 10 mL 1 % NaN 3 )對細胞做打孔處理。10 分鐘之後，倒掉triton X100，接著加入 1 :500 溶於triton X100 之一抗，於室溫搖晃反應overnight。反應完成後將一抗回收，重新以PBS溶液徹底洗淨一抗後，於暗室避光加入 1:500 溶於triton X100 之二抗，並於 37 ℃反應一小時。之後吸去抗體，用PBS反覆洗淨三次，最後小心將每孔內之蓋玻片取出蓋到洗淨之載玻片上（有細胞貼附的面朝向載玻片，載玻片上可先滴上少許PBS避免細胞過於乾燥），蓋上時小心避免氣泡產生。樣本製作時可將蓋玻片四角以指甲油黏著於載玻片上，並以錫箔紙包覆，再將樣本以雷射共軛焦顯微鏡之油鏡觀察。. 29.

(39) 使用帶有螢光之抗體直接染色步驟如下，將各實驗組別之牙髓幹細胞以 1x104 cells/ml，1 ml/plate的濃度接種於六孔盤培養（六孔盤內每孔各放入ㄧ片消毒洗淨後之蓋玻片），待細胞生長至約六分滿時進行實驗。染色開始前先吸去medium，將細胞以PBS溶液洗淨，然後加入 1 ml/plate 的 4 %福馬林，於室溫進行細胞固定約 20 分鐘。細胞固定完成後重新以PBS溶液洗淨，再加入 0.5 % triton X100（1 ml/plate）對細胞做打孔處理約 10 分鐘，之後倒掉 0.5 % triton X100。接著於避光環境下，加入以 1:500 比例溶於 0.5 % triton X100 之抗體（可同時溶入兩種抗體進行雙染）。在室溫下搖晃反應overnight。之後吸去抗體，用PBS反覆洗淨三次，最後小心將每孔內之蓋玻片取出蓋到洗淨之載玻片上（有細胞貼附的面朝向載玻片，載玻片上可先滴上少許PBS避免細胞過於乾燥），蓋上時小心避免氣泡產生。樣本製作時可將蓋玻片四角以指甲油黏著於載玻片上，並以錫箔紙包覆，再將樣本以雷射共軛焦顯微鏡之油鏡觀察。. 30.

(40) 第八節、牙髓幹細胞的脂肪化能力測試為檢驗牙髓幹細胞在牙齒銀行冷凍保存後仍有多元分化的能力，本研究分別對冷凍組及未冷凍組細胞進行其脂肪細胞分化能力的測試。實驗時先將程式降溫冷凍組與直接培養（未冷凍組）之牙髓幹細胞以 1x105 cells/well分別接種於 24 孔盤內，上排 12 孔設為脂肪化組，下排 12 孔設定為脂肪化控制組。每週固定天數將培養基更換兩次，待細胞生長至八分滿盤時，於脂肪化組更換脂肪化之培養基，脂肪化控制組則維持牙髓幹細胞專用之培養基，同樣每週固定天數將培養基更換兩次，4 週後進行oil red O染色並以顯微鏡觀察實驗結果。脂肪化培養基成分為牙髓幹細胞專用培養基中內含 0.5 mM isobutylmethylxanthine(MIX)，60 μM indomethacin， 0.5 μM hydrocortisone，以及 10 μg/ml insulin。 oil red O庫存溶液(stock solution)為由oil red O試藥（Sigma O0625, FW 408.5）0.14 g溶於 40 ml isopropanol中，stir overnight並過 0.2 μm filter，存放於 4 ℃。實驗進行時所使用之oil red O染劑(working solution)則必須於使用前將庫存溶液與二次水(QH 2 O)以六比四比例稀釋，並靜置於室溫二十分鐘，再離心去除沉澱後使用。. 31.

(41) 進行 oil red O 染色時，先將培養基倒掉，加入 D-PBS 500 μl/well 沖洗ㄧ次，並以 4 % formaldehyde 250 μl/well 進行細胞固定 15 分鐘後吸去 formaldehyde，再加入 60 % isopropanol 500 μl/well 沖洗ㄧ次後置於室溫風乾 5 分鐘，然後加入 oil red O 染劑(working solution) 250 μl/well（注意不要滴到管壁），反應 10 分鐘後吸去 oil red O 染劑(working solution)，並立刻以二次水 500 μl/well 反覆沖洗四次以上去除多餘染劑，最後以顯微鏡觀察拍照。. 32.

(42) 第九節、牙髓幹細胞的骨化能力測試為檢驗牙髓幹細胞在牙齒銀行冷凍保存後是否仍有多元分化的能力，本研究特進行其骨化能力的測試。實驗進行時，將程式降溫冷凍組與直接培養（未冷凍組）之牙髓幹細胞以 1x105 cells/well分別接種於 24 孔盤內，上排 12 孔設為骨化組，下排 12 孔設定為骨化控制組。每週固定天數將培養基更換兩次，待細胞生長至八分滿盤時，於骨化組更換骨化之培養基，骨化控制組則維持牙髓幹細胞專用之培養基，同樣每週固定天數將培養基更換兩次，3 週後進行alizarin red S染色並以顯微鏡觀察實驗結果。骨化培養基成分為牙髓幹細胞專用培養基中加入 0.01 μM dexamethasone，以及 1.8 mM KH 2 PO 4 。 alizarin red S 染劑須由 alizarin red S 試藥（Sigma A5533）0.8 g 先溶於 35 ml 二次水中，以氫氧化鈉(NaOH)調整 pH 值至 4.2 後（需注意若 pH 值超過 5.0 會凝固），再將二次水加到 40 ml，存放於室溫。每次使用前必須檢查 pH 值，若 pH 值改變則必須重新配製。進行 alizarin red S 染色時，先將培養基倒掉，加入 D-PBS 500 μl/well 沖洗ㄧ次(此時應小心勿使細胞飄起），並以 4 % formaldehyde 250 μl/well 進行細胞固定 15 分鐘後吸去 4 % formaldehyde，再以 D-PBS 500 μl/well 沖洗兩次，. 33.

(43) 然後加入 alizarin red S 染劑 250 μl/well（可用 dropper，每 well 約加四滴，蓋過細胞即可，注意不要滴到管壁），反應兩分鐘後吸去 alizarin red S 染劑，並以 D-PBS 500 μl/well 反覆沖洗三次以上去除多餘染劑（配合使用 Elisa shaker，背景必須洗乾淨），最後以顯微鏡觀察拍照。. 34.

(44) 第十節、統計分析本研究中在比較冷凍前後牙齒培養牙髓幹細胞之生長曲線時，運用統計學判定冷凍前後有無差異，所有的測定和觀察均進行三重複實驗，實驗結果的數據則以平均值±標準差(SD)表示，程式降溫冷凍組與未冷凍組的差異以 t-test 進行比較。以 p 值＜0.05 表示有統計學上的差異。. 35.

(45) 第四章、實驗結果第一節、評估各組牙髓幹細胞培養受冷凍影響程度將各組牙髓幹細胞初代培養三十天後，以標準繼代程序由 6 cm繼代至 10 cm培養皿時進行細胞計數，以未冷凍組牙齒培養牙髓幹細胞生長三十天的細胞最少數量為基準（5 ml medium in 6 cm dish, 6x104 cells/ml），評估程式降溫冷凍組與傳統冰箱冷凍組各顆牙齒培養之牙髓幹細胞之生長情形。若生長三十天後細胞數少於基準量，則定義該顆牙齒受到冷凍影響；若生長三十天後細胞數大於基準量，則定義該顆牙齒未受到冷凍影響。結果顯示磁性冷凍組有高達 73 %（8/11）的牙齒可定義為未受冷凍影響（如圖四所示），而傳統冰箱冷凍組則僅有 20 %（1/5）未受冷凍影響。. 第二節、冷凍保存前後牙髓幹細胞的生長曲線在研究過程中，可明顯感覺到剛解凍復甦的牙髓中所培養之牙髓幹細胞數目較少，生長速率也明顯較慢（如圖五、圖六所示）。但本研究以四名患者成對之牙齒作為樣本（分為磁性冷凍組與未冷凍組），以 MTT 法測試牙髓幹細胞之生長曲線，結果發現冷凍前後牙髓幹細胞在繼代十代之後，生長曲線無統計上之顯著差異（t-test, p>0.05）（如圖七所示）。程式降溫冷凍組與未冷凍組均能在繼代一週內順利形成滿盤。（如圖八、圖九所示） 36.

(46) 第三節、冷凍保存前後牙髓幹細胞形態差異本研究使用掃描式電子顯微鏡觀察冷凍前後牙髓幹細胞之形態差異，由圖可知磁性冷凍組與未冷凍組有相類似的細胞形態，混合著不規則狀及長突觸之類神經細胞狀之細胞，同樣擁有細胞的多樣性（如圖十所示），視野中均可看見大小不一，如破布狀的不規則細胞，或是長突觸的類神經細胞狀細胞。（如圖十一、圖十二所示），但是經由神經細胞 marker CRMP-2、GAP-43 的染色確認，此長突觸之細胞並無神經細胞 marker CRMP-2、GAP-43 的呈色反應，且在 neuron growth factor (NGF)的環境之下，亦無神經細胞 marker CRMP-2、GAP-43 的表現。（如圖十三、圖十四所示）. 第四節、冷凍保存前後牙髓幹細胞表面特徵蛋白之表現本研究使用免疫螢光染色法測試冷凍前後牙髓幹細胞表面特徵蛋白之表現，並以共軛焦顯微鏡進行觀察。結果顯示 CD34 抗原不論在冷凍前後牙齒所培養牙髓幹細胞中，表現均相當微弱，幾不可見(-)(如圖十五所示)。而 CD44 抗原不論在冷凍前後牙齒所培養牙髓幹細胞中，表現均相當強烈(++)（如圖十六所示）。另外，STRO-1 抗原的表現上，不論在冷凍前後牙齒所培養牙髓幹細胞中，表現均具變異性，亦即可視為部分表現（+/-）（如圖十七、圖十八所示）。同時選用帶有紅色螢光之 CD44 抗體與帶有綠色螢光之 STRO-1 抗體進行雙染時。結果顯示冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞均能有 CD44 (紅色) 37.

(47) 與 STRO-1 (綠色)的表現（如圖十九所示）。. 第五節、冷凍保存前後牙髓幹細胞脂肪化之能力本研究使用促進脂肪化之特殊培養基測試冷凍前後牙髓幹細胞脂肪化之能力，並 oil red O 進行脂肪細胞的染色確認。結果顯示不論冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞，在脂肪化培養基的環境下培養四週後，皆可明顯看到空泡狀的脂肪滴形成。經由 oil red O 染色法確認，脂肪細胞呈現紅色（如圖二十、圖二十一所示）。脂肪化控制組未加入促進脂肪化之特殊培養基，同樣培養四週後以 oil red O 進行脂肪細胞的染色確認，結果顯示控制組中不論冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞，皆無脂肪細胞的呈色反應（如圖二十二、圖二十三所示）。. 第六節、冷凍保存前後牙髓幹細胞骨化之能力本研究使用促進骨化之特殊培養基測試冷凍前後牙髓幹細胞骨化之能力，並以 alizarin red S 進行鈣沉積的染色確認。結果不論冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞，在骨化培養基的環境下培養三週後，再經由 alizarin red S 染色法確認鈣沉積的存在，結果均呈現明顯的紅色，以肉眼即可辨別（如圖二十四所示）。. 38.

(48) 顯微鏡下則可看到，不論冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞，其旺盛的骨化作用均使染成紅色的鈣質沉積佈滿了整個視野（如圖二十五、圖二十六所示）。骨化控制組未加入促進骨化之特殊培養基，同樣培養三週後以 alizarin red S 進行鈣沉積的染色確認，結果顯示骨化控制組中不論冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞，皆無鈣沉積的呈色反應（如圖二十七、圖二十八所示）。. 39.

(49) 第五章、研究討論本研究首先對於牙齒銀行冷凍後之牙齒是否能夠成功培養出牙髓幹細胞加以嘗試與努力，發現在研究過程中，可明顯感覺到剛解凍復甦的牙髓中與未冷凍組之牙齒相比，其所培養之牙髓幹細胞數目較少，生長速率也明顯較慢（如圖五、圖六所示）。但若由未冷凍組牙齒培養牙髓幹細胞生長三十天的細胞最少數量為基準（5 ml medium in 6 cm dish, 6x104 cells/ml），在牙齒銀行磁性程式降溫冷凍保存的牙齒僅 23 %的比例受到冷凍影響；而傳統冰箱冷凍組則有高達 80 %的比例受到冷凍的影響（如圖四所示）。進一步繼代培養後，則可發現冷凍前後牙髓幹細胞在繼代十代左右之後，以MTT法測試牙髓幹細胞之生長曲線並無統計上之差異（t-test, p>0.05）。（如圖七所示）由上述結果可合理推測牙髓組織在牙齒銀行之整顆牙齒冷凍保存後，其分化為牙髓幹細胞的能力會稍微受到影響，導致培養出來的牙髓幹細胞在數量以及生長速率方面和未冷凍的未冷凍組相較為弱（如圖五、圖六所示），但並不會比未冷凍組中牙髓活性較弱者差，若和傳統冰箱冷凍組的冷凍方式相比，更能確定其冷凍保存的效果（如圖四所示）。另ㄧ方面，即使是程式降溫冷凍過後的牙齒培養出之牙髓幹細胞經過繼代五代之後，其生長曲線便和未冷凍的未冷凍組相差無幾（如圖七所示），由顯微鏡觀察紀錄一週內之生長情形亦無明顯差異（如圖八、圖九所示）。亦即可推論在牙齒銀行冷凍保存過後. 40.

(50) 的牙齒，未來同樣能夠培養出具有旺盛生長潛力的牙髓幹細胞。根據以往研究牙髓幹細胞的文獻指出，牙髓幹細胞在形態上類似骨髓幹， (Huang et al. 2008b) 為長形梭狀（long 細胞（bone marrow stem cells, BMSC） and spindle shaped ） (Huang et al. 2008a) 。同時也與纖維母細胞類似（fibroblast-like cells）(Gronthos et al. 2000)。但從前的文獻都是以光學顯微鏡觀察，本研究為更進一步觀察冷凍前後牙齒所培養出牙髓幹細胞其形態差異，採用掃描式電子顯微鏡（scanning electron microscope, SEM）進行觀察比較。結果發現無論有無經過冷凍保存，牙髓幹細胞均表現細胞的多樣性（如圖十所示），視野中可看見大小不一，形態不規則的細胞，或是長突觸的類神經細胞狀細胞（如圖十一、十二所示），可推論冷凍並未對牙髓幹細胞之形態造成影響。另一方面，針對牙髓幹細胞中形態類似神經細胞的長突觸狀細胞，本研究團隊特針對神經細胞marker CRMP-2、GAP-43 進行染色確認，結果顯示此長突觸之細胞並無神經細胞marker CRMP-2、GAP-43 的呈色反應，且在 neuron growth factor (NGF)的環境之下，亦無神經細胞marker CRMP-2、GAP-43 的表現。（如圖十三、圖十四所示）欲確認本研究所培養之牙髓幹細胞均具備其特有之表面特徵蛋白，本實驗室參考施松濤教授研究團隊在西元 2000 年最早發表牙髓幹細胞的文獻 (Gronthos et al. 2000) ，以及同團隊在西元 2005 年發表有關牙髓幹細胞與其他間葉幹細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）的研究文獻(Shi et al. 2005)，內. 41.

(51) 容指出牙髓幹細胞雖然沒有造血幹細胞（haematopoietic stem cells）所表現的 CD34 抗原(-)，但有 CD44 抗原之強烈表現（++），與 STRO-1 抗原的部分表現（++/+/-）。其中 STRO-1 抗原被用於分離（isolate）與純化（purify）骨髓幹細胞（bone marrow stromal stem cells, BMSSC），也被認為是幹細胞記號（putative stem cell marker）(Shi et al. 2005)。本研究進行上述三種表面特徵蛋白（CD34、CD44、STRO-1）的免疫螢光染色，結果相當符合現有的文獻資訊，如圖十五所示，CD34 抗原不論在冷凍前後牙齒所培養牙髓幹細胞中，表現均相當微弱，幾不可見(-)。而 CD44 抗原不論在冷凍前後牙齒所培養牙髓幹細胞中，表現均相當強烈(++)（如圖十六所示）。另外，STRO-1 抗原的表現上，不論在冷凍前後牙齒所培養牙髓幹細胞中，表現均具變異性，亦即可視為部分表現（+/-）（如圖十七、十八所示）。本實驗為加強印證牙髓幹細胞應同時擁有 CD44 與 STRO-1 兩種抗原，故進一步選用帶有紅色螢光之 CD44 抗體與帶有綠色螢光之 STRO-1 抗體同時進行雙染。結果顯示，冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞均能有 CD44 (紅色) 與 STRO-1 (綠色)的表現（如圖十九所示）。由上述結果可推知本實驗所採用之組織塊酶解法確實能夠將牙髓幹細胞有效地分離出來，符合現今牙髓幹細胞研究領域的定義，也同時證明牙齒銀行的磁性程式降溫冷凍技術並不會影響到牙髓幹細胞表面特徵蛋白的表現。. 42.

(52) 成人幹細胞（adult stem cells, ASCs）因為有自我更新以及多元分化（multi-lineage differentiate）的能力而被視為有治療疾病的潛力(Huang et al. 2008b)。施松濤教授的研究團隊也在西元 2002 年正式發表牙髓幹細胞具有高度增殖潛力（high proliferative potential），且能自我更新與多元分化，可視為新興的成人幹細胞族群(Gronthos et al. 2002)。根據該團隊早期的資料，牙髓幹細胞在體外能形成發散（sporadic）但濃密的鈣化顆粒（calcified nodules），且無法形成脂肪細胞(Gronthos et al. 2000)。然而根據許多後繼研究者的文獻指出，牙髓幹細胞不但可成功分化為造牙母細胞（odontoblasts）(Couble et al. 2000)，脂肪細胞（adipocytes）與軟骨細胞（chondrocytes）(Kawazoe et al. 2008)，也能進行骨化作用（Osteogenesis） (Huang et al. 2008b)，甚至形成類神經細胞（neural-like cells）(Iohara et al. 2006)。綜上所述，牙髓幹細胞可說是相當具有未來幹細胞療法（stem cell therapy）的潛力。本研究為證明牙髓幹細胞經由牙齒銀行磁性冷凍保存過後仍有多元分化的能力，選擇脂肪化與骨化作用來進行測試。脂肪化方面，結果顯示不論冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞，在脂肪化培養基的環境下培養四週後，皆可明顯看到空泡狀的脂肪滴形成。經 oil red O 染色法確認，脂肪細胞呈現紅色（如圖二十、二十一所示）。而在未加入促進脂肪化之特殊培養基的脂肪化控制組，同樣在培養四週後 oil red O 進行脂肪細胞的染色確認，結果顯示不論有無冷凍的牙齒所培養的牙髓幹細胞之脂肪化控制組並無脂肪細胞. 43.

(53) 的呈色反應。（如圖二十二、二十三所示）由此可推論牙髓幹細胞僅會在特定環境中(有促進脂肪化的特殊培養基中)才會分化為脂肪細胞。另外，在骨化方面，不論冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞，在骨化培養基的環境下培養三週後，再經由 alizarin red S 染色法確認鈣沉積的存在，結果均呈現明顯的紅色，以肉眼即可辨別（如圖二十四所示）。顯微鏡下則可看到，不論冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞，其旺盛的骨化作用均使染成紅色的鈣質沉積佈滿了整個視野（如圖二十五、二十六所示）。另外，在未加入促進骨化之特殊培養基的骨化控制組中，同樣在培養三週後以 alizarin red S 進行鈣沉積的染色確認，結果顯示未冷凍組與程式降溫冷凍組的牙齒中之牙髓幹細胞，在骨化控制組內皆無鈣沉積的呈色反應。（如圖二十七、二十八所示）。由此可推論牙髓幹細胞僅會在特定環境中(有促進骨化的特殊培養基中) 才會進行骨化作用。由上述結果可以合理推論，牙髓幹細胞的多元分化能力並沒有因為牙齒銀行的磁性程式降溫冷凍流程而受到影響。因此，患者將牙齒儲存於牙齒銀行冷凍保存後，其中的牙髓幹細胞將來可視需要培養出來作為幹細胞療法的應用。. 44.

(54) 第六章、結論與未來展望臨床上有許多情況，牙醫師必須將患者健康的牙齒拔除，例如齒顎矯正治療過程中，因為空間需求而拔除患者的第一小臼齒，或是對於阻生齒、多生齒、智齒等也都因為阻礙正常咬合或咀嚼功能，雖然牙齒本身並無病變，但也多將其拔除。一顆健康的牙齒不僅可供將來患者再植使用，其中的牙髓幹細胞亦具有提供未來幹細胞療法的潛力。磁性冷凍牙齒銀行的技術成熟後，牙齒長期保存不再是夢想，日本廣島大學的牙齒銀行已成功保存牙周韌帶的活性以供將來患者再植使用，並已進入商業化經營階段。而牙髓幹細胞相較於骨髓等其他成人幹細胞的來源而言，是最不具侵入性的。因為矯正治療或感染預防需求而必須拔下的健全牙齒，便是牙髓幹細胞的最佳來源。臍帶血幹細胞的儲存ㄧ生只有一次機會，失去這項機會的每個人，卻不代表已經跟幹細胞治療絕緣。本研究成功地證明牙齒銀行的完整牙齒整顆冷凍保存流程，除了可成功保存牙周韌帶的活性，亦能用於牙髓幹細胞的保存。牙髓幹細胞的功能及特性都未受牙齒銀行的磁性程式降溫冷凍法影響，可藉由長期保存，在未來充分發揮幹細胞療法的潛力，實現牙醫學再生醫療的願景。再生醫療乃是現今醫學與牙醫學發展的趨勢，我們衷心盼望科技的進步能夠改變臨床上常見的利益導向之不當醫療，方為醫者之樂，患者之幸與社稷之福。 45.

(55) 關於未來實驗進行的思考方向，本研究由於實驗時程的限制，僅進行七天的冷凍，未來則可對冷凍數月，甚至數年的牙齒進行分析。另一方面，本實驗中細胞計數以傳統血球計數由九宮格放大推算的方式以及人為操作的易有的誤差常導致細胞數目的誤判，未來在進一步研究冷凍對於細胞生長能力的影響時，希望能有更快速準確的科學方式來評估。關於幹細胞表面記號的免疫螢光染色，本研究著重於定性方面的觀察，後續研究方向應利用流式細胞儀等設備進行定量的確認。另外本研究測試牙髓幹細胞在體外進行脂肪化與骨化之能力，同樣在定性觀察之外應能進一步做定量分析，未來更應朝向動物體內再生組織器官的研究，以及更多元分化能力的方向努力，俾使牙髓幹細胞能早日應用於臨床，提升醫療水準以造福社會大眾。期望本研究能為未來關於牙齒冷凍保存與牙髓幹細胞的研究領域提供有益的參考資料。. 46.

(56) 第七章、參考文獻 About, I., M. J. Bottero, P. de Denato, J. Camps, J. C. Franquin, and T. A. Mitsiadis. 2000. Human dentin production in vitro. Exp Cell Res 258 (1):33-41. Almushayt, A., K. Narayanan, A. E. Zaki, and A. George. 2006. Dentin matrix protein 1 induces cytodifferentiation of dental pulp stem cells into odontoblasts. Gene Ther 13 (7):611-620. Andreasen, J. O., H. U. Paulsen, Z. Yu, T. Bayer, and O. Schwartz. 1990. A long-term study of 370 autotransplanted premolars. Part II. Tooth survival and pulp healing subsequent to transplantation. Eur J Orthod 12 (1):14-24. Arthur, A., G. Rychkov, S. Shi, S. A. Koblar, and S. Gronthos. 2008. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells 26 (7):1787-1795. Broxmeyer, H. E., E. F. Srour, G. Hangoc, S. Cooper, S. A. Anderson, and D. M. Bodine. 2003. High-efficiency recovery of functional hematopoietic progenitor and stem cells from human cord blood cryopreserved for 15 years. Proc Natl Acad Sci U S A 100 (2):645-650. Burbridge, L., B. O. Cole, R. S. Hobson, and R. R. Welbury. 2005. Auto-transplantation in the restorative management of traumatized anterior teeth: a case report. Dent Update 32 (9):529-530, 532-524. Chang, J., C. Zhang, N. Tani-Ishii, S. Shi, and C. Y. Wang. 2005. NF-kappaB activation in human dental pulp stem cells by TNF and LPS. J Dent Res 84 (11):994-998. Coburn, R. J., B. L. Henriques, and L. E. Francis. 1966. The development of an experimental tooth bank using deep freeze and tissue culture techniques. J Oral Ther Pharmacol 2 (6):445-450. Cordeiro, M. M., Z. Dong, T. Kaneko, Z. Zhang, M. Miyazawa, S. Shi, A. J. Smith, and J. E. Nor. 2008. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J Endod 34 (8):962-969. Couble, M. L., J. C. Farges, F. Bleicher, B. Perrat-Mabillon, M. Boudeulle, and H. Magloire. 2000. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures.. 47.

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