第三章、 研究材料與方法
第二節 牙髓幹細胞的初級培養與繼代培養
1. 藥品製備
(1) α-MEM 培養基:
實驗中所使用之培養基為α-MEM（Minimum Essential Medium Alpha Medium）(Gibco 11900-024, U.S.A.)，提供牙髓細胞生長所需之養分。配製方 法為將小包裝（可配成一公升培養基）的α-MEM粉末以二次水溶解，並加入 Sodium Bicarbonate 2.2 g/1 L、15 %的胎牛血清(FBS)(Gibco 26140-079, U.S.A.) 和加入含有penicillin、streptomycin 、amphotericin B 的Antibiotic-Antimycotic 10 ml/1 L （ Gibco 15240-062, U.S.A ） 以 及 L-ascorbic acid 2-phosphate
（BioChemika 49752-10 G, stock=20 mM）5 ml/1 L，pH值調整至7.4，冷藏保 存在4 ℃冰箱。
(2) D-PBS（Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline）溶液：
D-PBS為一種磷酸緩衝生理食鹽水，多用於細胞生物學、生化學中之細
胞實驗。此種緩衝溶液以生物體內常見的離子所構成，乃無毒性之等張溶液，
可作為洗淨細胞與配製試藥之用。也可用於繼代過程中，將培養皿內殘留的 鈣、鎂離子洗去，俾使附著凝集的細胞呈現游離狀態。本試藥D-PBS溶液
（Sigma D5652, U.S.A.）分裝成可配製1 L之小瓶，以二次水溶解配製而成，
保存於4 ℃冰箱中。
(3) type I collagenase：
以D-PBS將Type I collagenase（Sigma C0130, U.S.A）溶解為4 mg/ml之溶 液，並以0.2 μm濾網過篩，保存於-20 ℃。
(4) dispase II：
以D-PBS將Dispase II（Sigma D4693, U.S.A）溶解為2 mg/ml之溶液，並 以0.2 μm濾網過篩，保存於-20 ℃。 explant-collagenase digestion method）(Gronthos et al. 2000)於體外進行初代培 養而來(如圖三所示)。實驗步驟如下，以中藥材研磨缽敲碎牙齒後取出牙髓組 織，先將牙髓組織在 6 cm 培養皿中浸泡前述 α-MEM 培養基，待濕潤後移至 另一 6 cm 培養皿以 15 號刀片切碎成泥狀，切碎的組織以 0.5 ml type I collagenase（4 mg/ml）與 0.5 ml dispase II（2 mg/ml）之 1 ml 混合溶液浸泡，
用微量吸管放入 15 ml 離心管中，在 37 ℃水浴槽內振動反應 30 分鐘至 1 小 ml D-PBS 溶液清洗2次，再加入0.05 % trypsin-EDTA 1.5 ml作用數分鐘，於倒 立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA溶液，
然後將培養皿放回細胞培養箱靜待約十分鐘，於顯微鏡下觀察，確定細胞分 離完全後加入適量新鮮培養基，與脫落之細胞或細胞團塊混和均勻，將細胞 打下，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常條件繼續培養。每次細胞成 功繼代後，依序定義為第二代、第三代…，以此類推。
第三節、評估各組牙髓幹細胞受冷凍影響程度
各組牙髓幹細胞初代培養 30 天後，以標準繼代程序由 6 cm dish（內含 5 ml medium）繼代至 10 cm dish，此時進行細胞計數，細胞計數步驟遵循傳統血 球計數方式，將牙髓幹細胞懸浮充分均勻打散後，利用trypan blue將細胞染色 置於血球計數盤上，在顯微鏡下計算九宮格四角之細胞數，據以推算每單位 體積之細胞數（單位為 104 cells/ml）。
本實驗以未冷凍組牙齒培養牙髓幹細胞生長30 天的細胞最少數量為基準
（5 ml medium in 6 cm dish, 6x104 cells/ml），評估程式降溫冷凍組與傳統冰箱 冷凍組各顆牙齒培養之牙髓幹細胞之生長情形。若生長 30 天後細胞數少於基 準量（6x104 cells/ml），則定義該顆牙齒受到冷凍影響；若生長30 天後細胞數 大於基準量（6x104 cells/ml），則定義該顆牙齒未受到冷凍影響。
第四節、牙髓幹細胞活性 MTT 的測量
黃色的MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a tetrazole)試藥會被活體細胞中的粒線體降解（reduced）為紫色的formazan salt 結晶(Mosmann 1983)。此結晶可用dimethyl sulfoxide（DMSO）溶出成為有色 液體，細胞活性越高，其所呈現的顏色越深，再以免疫酵素分析儀(Model 2020, Anthos Labtec Instruments, Austria )以 570/690 nm 的波長讀取吸光值。藉以定 量分析細胞活性的狀況。本實驗將進行為期一週的牙髓細胞生長曲線測試（第 (Model 2020, Anthos Labtec Instruments, Austria )以 570/690 nm 的波長讀取吸 光值。
第五節、牙髓幹細胞生長曲線之製作
將 MTT 分析結果做圖，將受試樣本（共 4 人，每人各有 1 顆磁性冷凍組 與未冷凍組的牙齒）吸光值之平均與標準差算出，並以 X 軸為天數，分別是 細胞接種後第 0 天、第 1 天、第 2 天、第 3 天、第 4 天、第 5 天。製作牙髓 細胞 MTT 生長曲線。
第六節 牙髓幹細胞在電子顯微鏡下之形態觀察
本實驗以掃描式電子顯微鏡（scanning electronic microscope, SEM）觀察 冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞在形態上是否有差異。實驗進行時將細胞 培養於 24 孔培養盤中，內有消毒洗淨後之蓋玻片。實驗分為磁性冷凍組與未 冷凍組，首先去除細胞培養液，並以PBS 清洗細胞 3 次，接著將細胞以 2.5 % 戊二醛(glutaraldehyde)及 2 %三聚甲醛(paraformaldehyde)固定 20 分鐘，然後再 以 1 % (in 0.1 M PBS)四氧化鋨(osmium tetroxide)固定 30 分鐘。在初步固定之 後，樣品再以 1 %鋨酸後固定 1 小時。接著將樣品以 PBS 清洗並依序以 70 %、
80 %、90 %、95 %及 100 %酒精進行脫水與臨界點乾燥(HCP-2, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)。脫水乾燥後的樣品以鍍金器(IB-2, Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan)噴 鍍一層鈀金(palladium gold)。處理後的細胞利用 Hitachi S-2400 電子顯微鏡系 統加以觀察(Hitachi, Ltd, Tokyo, Japan)。
第七節、牙髓細胞表面特徵蛋白之螢光免疫分析
為分析冷凍保存後的牙齒中培養出的牙髓細胞能否表現其特殊之表面特 徵蛋白，本實驗利用螢光免疫染色法來比較程式降溫冷凍組與未冷凍組牙髓 幹細胞之表面特徵蛋白表現有何異同。
本實驗單一染色所測試之牙髓幹細胞表面特徵蛋白為CD34、CD44 與 STRO-1(Shi et al. 2005)。其中CD34 與CD44 採用不帶螢光之一抗與帶有螢光 之二抗交互反應進行染色。使用抗體分別如下，CD 44 ㄧ抗：HCAM (F-4) sc-9960, mouse monoclonal IgG1 (Santa Cruz)；CD 34 ㄧ抗：(ICO115) sc-7324, mouse monoclonal IgG1 (Santa Cruz)；二抗(綠光)：DyLightTM488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) 115-485-003-15 μl (Jackson ImmunoResearch)。
STRO-1 抗原則是直接使用帶有螢光之抗體進行染色。另外，本實驗為加 強印證牙髓幹細胞應同時擁有 CD44 與 STRO-1 兩種抗原，故進一步選用帶有 紅色螢光之 CD44 抗體與帶有綠色螢光之 STRO-1 抗體同時進行雙染。使用抗 體分別如下，CD44(紅色):HCAM AF647 sc-7297 (Santa Cruz)；STRO-1(綠 色):STRO-1 FITC sc-47733 (Santa Cruz)。
本實驗進行螢光免疫染色時須準備無菌之細胞培養用六孔盤以及消毒洗 淨後之蓋玻片。蓋玻片消毒洗淨之標準流程如下，將蓋玻片用乾淨的鑷子夾 住一角，以清水沖洗濕潤後，以清潔劑(detergent)搓洗蓋玻片。再以去離子水
(DD water)將清潔劑徹底沖洗乾淨後以氣槍吹乾，接著依序以 acetone 及 IPA medium，將細胞以PBS溶液洗淨，然後加入 4 %的福馬林（paraformaldehyde）
1 ml/plate，於室溫進行細胞固定約 20 分鐘。細胞固定完成後重新以PBS溶液 洗淨，再加入 0.5 % triton X100（1 ml/plate）(0.5 % triton X-100, 2 % BSA and 0.05 % NaN3 in PBS. To 190 ml PBS, add 4 g BSA, 1 mL triton X100 and 10 mL 1 % NaN3)對細胞做打孔處理。10 分鐘之後，倒掉triton X100，接著加入 1 :500 溶於triton X100 之一抗，於室溫搖晃反應overnight。反應完成後將一抗回收，
重新以PBS溶液徹底洗淨一抗後，於暗室避光加入 1:500 溶於triton X100 之二 抗，並於 37 ℃反應一小時。之後吸去抗體，用PBS反覆洗淨三次，最後小心 將每孔內之蓋玻片取出蓋到洗淨之載玻片上（有細胞貼附的面朝向載玻片，
載玻片上可先滴上少許PBS避免細胞過於乾燥），蓋上時小心避免氣泡產生。
樣本製作時可將蓋玻片四角以指甲油黏著於載玻片上，並以錫箔紙包覆，再 將樣本以雷射共軛焦顯微鏡之油鏡觀察。
使用帶有螢光之抗體直接染色步驟如下，將各實驗組別之牙髓幹細胞以 1x104 cells/ml，1 ml/plate的濃度接種於六孔盤培養（六孔盤內每孔各放入ㄧ片 消毒洗淨後之蓋玻片），待細胞生長至約六分滿時進行實驗。染色開始前先吸 去medium，將細胞以PBS溶液洗淨，然後加入 1 ml/plate 的 4 %福馬林，於室 溫進行細胞固定約 20 分鐘。細胞固定完成後重新以PBS溶液洗淨，再加入 0.5
% triton X100（1 ml/plate）對細胞做打孔處理約 10 分鐘，之後倒掉 0.5 % triton X100。接著於避光環境下，加入以 1:500 比例溶於 0.5 % triton X100 之抗體（可 同時溶入兩種抗體進行雙染）。在室溫下搖晃反應overnight。之後吸去抗體，
用PBS反覆洗淨三次，最後小心將每孔內之蓋玻片取出蓋到洗淨之載玻片上
（有細胞貼附的面朝向載玻片，載玻片上可先滴上少許PBS避免細胞過於乾 燥），蓋上時小心避免氣泡產生。樣本製作時可將蓋玻片四角以指甲油黏著 於載玻片上，並以錫箔紙包覆，再將樣本以雷射共軛焦顯微鏡之油鏡觀察。
第八節、牙髓幹細胞的脂肪化能力測試
isobutylmethylxanthine(MIX)，60 μM indomethacin， 0.5 μM hydrocortisone， 以 及 10 μg/ml insulin。oil red O庫存溶液(stock solution)為由oil red O試藥（Sigma O0625, FW 408.5）0.14 g溶於 40 ml isopropanol中，stir overnight並過 0.2 μm filter，存放於 4 ℃。實驗進行時所使用之oil red O染劑(working solution)則必須於使用前將庫 存溶液與二次水(QH2O)以六比四比例稀釋，並靜置於室溫二十分鐘，再離心 去除沉澱後使用。
進行 oil red O 染色時，先將培養基倒掉，加入 D-PBS 500 μl/well 沖洗ㄧ 次 ， 並 以 4 % formaldehyde 250 μl/well 進 行 細 胞 固 定 15 分 鐘 後 吸 去 formaldehyde，再加入 60 % isopropanol 500 μl/well 沖洗ㄧ次後置於室溫風乾 5 分鐘，然後加入 oil red O 染劑(working solution) 250 μl/well（注意不要滴到管 壁），反應 10 分鐘後吸去 oil red O 染劑(working solution)，並立刻以二次水 500 μl/well 反覆沖洗四次以上去除多餘染劑，最後以顯微鏡觀察拍照。
第九節、牙髓幹細胞的骨化能力測試
養基，同樣每週固定天數將培養基更換兩次，3 週後進行alizarin red S染色並 以顯微鏡觀察實驗結果。然後加入 alizarin red S 染劑 250 μl/well（可用 dropper，每 well 約加四滴，蓋 過細胞即可，注意不要滴到管壁），反應兩分鐘後吸去 alizarin red S 染劑，並 以 D-PBS 500 μl/well 反覆沖洗三次以上去除多餘染劑（配合使用 Elisa shaker，
背景必須洗乾淨），最後以顯微鏡觀察拍照。
第十節、統計分析
本研究中在比較冷凍前後牙齒培養牙髓幹細胞之生長曲線時，運用統計學
判定冷凍前後有無差異，所有的測定和觀察均進行三重複實驗，實驗結果的 數據則以平均值±標準差(SD)表示，程式降溫冷凍組與未冷凍組的差異以 t-test 進行比較。以 p 值＜0.05 表示有統計學上的差異。
第四章、實驗結果
第三節、冷凍保存前後牙髓幹細胞形態差異
本研究使用掃描式電子顯微鏡觀察冷凍前後牙髓幹細胞之形態差異，由 圖可知磁性冷凍組與未冷凍組有相類似的細胞形態，混合著不規則狀及長突 觸之類神經細胞狀之細胞，同樣擁有細胞的多樣性（如圖十所示），視野中均 可看見大小不一，如破布狀的不規則細胞，或是長突觸的類神經細胞狀細胞。
（如圖十一、圖十二所示），但是經由神經細胞 marker CRMP-2、GAP-43 的 染色確認，此長突觸之細胞並無神經細胞marker CRMP-2、GAP-43 的呈色反 應，且在 neuron growth factor (NGF)的環境之下，亦無神經細胞 marker CRMP-2、GAP-43 的表現。（如圖十三、圖十四所示）
第四節、冷凍保存前後牙髓幹細胞表面特徵蛋白之表現
與 STRO-1 (綠色)的表現（如圖十九所示）。
顯微鏡下則可看到，不論冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞，其旺盛的 骨化作用均使染成紅色的鈣質沉積佈滿了整個視野（如圖二十五、圖二十六 所示）。骨化控制組未加入促進骨化之特殊培養基，同樣培養三週後以alizarin red S 進行鈣沉積的染色確認，結果顯示骨化控制組中不論冷凍前後牙齒所培 養之牙髓幹細胞，皆無鈣沉積的呈色反應（如圖二十七、圖二十八所示）。