第一節、 牙齒銀行的觀念與重要性
如果臨床上遇到患者缺牙時，以再生醫療的觀念而言，牙醫師會希望在 缺牙部位重新培養出新的牙齒(Ohazama et al. 2004)，這也是現今有關幹細胞療 法（stem cell therapy）(Lovell-Badge 2001)的研究正方興未艾的主要原因，但 這樣理想中的醫療技術目前仍無法實踐，且有待日後學界的努力發展。故退 而求其次，缺齒時若能以自體組織來修復缺損的部位，也就是用自己的牙齒 來取代(Lee et al. 2001)，則應為臨床處置之第一選擇。
就目前的牙醫學發展，治療缺齒問題的方式包括以活動假牙、牙橋，或 是人工植牙贗復(Jonsson and Sigurdsson 2004)，也可以用矯正方式使牙齒移動 來關閉缺牙空間(Burbridge et al. 2005)，再者，便是使用患者本身其他部位的 牙齒進行自體移植（auto-transplantation)(Andreasen et al. 1990)。其中只有矯正 治療或是自體移植符合現今再生醫療的趨勢，也就是以自體組織來修復缺損。
然而，以矯正治療關閉一顆臼齒的空間約需要兩年以上的時間，對於患 者來說也有必須適應矯正裝置的負擔，臨床上接受度不高。相較而言，自體 移植的治療方式可避免鄰牙因為牙橋製作造成的健康齒質磨損(Kristerson et al. 1991)，另外由於擁有具有活性的牙周韌帶，可提供人工植牙所沒有的本體 感覺（proprioception）(Robinson 1983)，亦能使缺齒部位的齒槽骨再生(Shimono
et al. 2003)，甚至日後可利用矯正裝置來移動(Kawasaki et al. 2004)，可說是缺 齒的最佳治療方式。
以往由於沒有適當的保存方式，因此原本可用來作為再植來源的牙齒，
例如因矯正拔除的健康小臼齒、因感染預防需求而拔除的智齒，或是多生牙、
阻生齒等，過去都被當成醫療廢棄物丟棄(Yin et al. 2001)。近年來則因為冷凍 保存牙周韌帶細胞的技術(Schwartz et al. 1985)日益成熟，臨床上便可將拔下的 健康牙齒長期保存以作為日後再植之用，也因此逐漸浮現出「牙齒銀行」的 新觀念(Oh et al. 2005)。
「牙齒銀行」（tooth bank）的名稱在文獻上首見於西元 1966 年(Coburn et al. 1966) ， Andreasen 和 Schwartz 等 學 者 則 開 始 有 系 統 的 臨 床 應 用 與 追 蹤 (Schwartz et al. 1985)，但是第一個企業化的「牙齒銀行」--- 歯の銀行（ティ ー ス バ ン ク ） 則 是 在 西 元 2004 年 創 始 於 日 本 國 立 廣 島 大 學
（http://www.teethbank.jp/research.html），其特色是改進以往冷凍保存的方式，
進一步以帶有微弱磁場的程式降溫儀（CAS---Cells Alive system）（ABI Co. Ltd., Japan）來冷凍保存整顆牙齒，並證實能確保其牙周韌帶的活性 (Kaku et al.
2007)。西元 2007 年，台灣台北醫學大學與姐妹校日本廣島大學締結技術合作 的結盟，成立世界第二家牙齒銀行，並於西元 2008 年 9 月開始運作。
也由於「牙齒銀行」的技術已漸成熟，能夠長期保存將來可供再植的牙 齒及其牙周韌帶細胞的活性變為可行，此不僅對牙醫學臨床醫療有許多實質 上 的 幫 助 ， 牙 醫 師 們 將 來 更 能 掌 握 再 植 齒 牙 根 形 成 程 度 最 佳 的 時 機 (Temmerman et al. 2008)，以及提供某些患者先做矯正治療創造再植齒空間後 進行自體移植(Laureys et al. 2001)，可說是牙醫學發展的一大突破。
第二節、 磁性冷凍程式降溫儀在牙醫學的利用
現今科學界已有相當多關於組織與器官冷凍保存的研究與應用，例如血 庫（blood banks），骨髓銀行（bone marrow banks），臍帶血銀行（cord blood bank）等。另外像是精子銀行（sperm bank），已有多年的臨床應用，包括因 惡性腫瘤須接受化療的患者可先行儲存精子以保留生育能力(Lass et al.
2001)，或是尚未有伴侶的男性可以趁年輕時先儲存品質較好之精子來培育 更優質的下一代。
就冷凍方式而言，有學者提出最好以每分鐘下降 1 ℃的速率來降溫(Leibo and Mazur 1971)以得到最好的效果。另外也有學者由動物實驗中指出，狗的 精子在經過生物性降溫儀(biological freezer)的慢速冷凍(slow freezing)程序下
（在 5 ℃到-10 ℃之間每分鐘降溫 0.5 ℃後繼續在-10 ℃到-60 ℃之間每分鐘 降溫 8 ℃，最後放入液態氮內），相較於快速冷凍(rapid freezing)程序（在液 態氮蒸氣中冷凍，距離液面 4 公分），其解凍後精子活動力(motility)較好(Rota et al. 2005)。證明以程式降溫儀循序漸進式的冷凍方式確實有其效果。
生物體組織在冷凍過程中，細胞會因產生細胞內冰晶（intracellular formation of ice crystals）而受到傷害(Frederik and Busing 1981)，而在 0 ℃到 -4 ℃間，冰晶會形成最大量。近年來有學者嘗試使用磁場來減少細胞在冷凍 過程中受到冰晶的傷害(Kaku et al. 2007)，該研究團隊基於日本食品冷凍業界
（ABI Corporation）採用磁性冷凍法（稱為 Cells Alive System, CAS）使食物
保鮮的方式，延伸利用於牙醫學界來保存牙周韌帶。應用該磁性冷凍系統在 細胞冷凍過程中，其微弱的磁場將使細胞內外之水分子，產生電子順磁共振 效應而達到過冷狀態，此時若瞬間改變冷凍物狀態則可以形成玻璃化冷凍，
而細胞在玻璃化冷凍下較不會受到傷害。
經由上述立論基礎，磁性冷凍程式降溫儀在牙醫學界開始被使用，牙周 韌帶細胞的冷凍保存乃由整顆健康牙齒在加入 75 mA 電流後產生的微弱磁場 下，經由程式降溫儀的程式降溫（降溫程序設定為-5 ℃維持 15 分鐘，之後以 每分鐘下降 0.5 ℃的速率降溫至-32 ℃後放入-150 ℃冰箱保存），解凍過後能 有 90 %的細胞存活率(Kaku et al. 2007)。
本研究期望磁性冷凍程式降溫儀冷凍保存整顆健康牙齒的方式能夠同樣 應用於牙髓組織的冷凍保存，如此一來，患者利用磁性程式降溫冷凍保存整 顆健康牙齒將能有未來牙齒再植與牙髓幹細胞培養的雙重用途。
第三節、 牙齒冷凍保存對其牙髓組織之影響
時至今日，研究牙髓組織活性與牙齒冷凍保存之間關係的相關文獻不 多，因此，關於牙齒冷凍保存對於牙髓組織的影響，至今尚無定論(Temmerman et al. 2006)。文獻上最早有相關結論是由 Price 和 Cserepfalvi 等學者發表，他 們認為未完全成熟（immature）的牙齒若能在拔牙後立刻依照標準程序冷凍處 理的話，能夠維持其牙髓活性(Price and Cserepfalvi 1972)。但 Andreasen 和 Schwartz 等學者則持相反意見，他們認為牙齒冷凍時，其牙髓組織無法接受 到冷凍保護劑的保護，必然會失去活性，因此在移植手術過後必須進行根管 治療(Schwartz and Andreasen 1983)。
在研究方法上，兩派學者使用於評估牙髓活性的方式並不相同，Price 等 學者是直接將牙髓細胞利用組織塊法(tissue explant method)評估細胞向外生長 的情形；Andreasen 等學者則是由牙根的發炎性吸收（inflammatory resorption）
推斷牙髓已失去活性。然而，牙髓細胞在牙齒冷凍保存後是否仍具有活性和 再植後牙齒能否重新獲得血流供應（revascularization），或是牙髓再生（pulp regeneration），並沒有絕對的關係(Temmerman et al. 2006)。而牙髓幹細胞的發 現在西元 2000 年正式被發表(Gronthos et al. 2000)，該研究是以組織塊酶解法 來培養牙髓幹細胞，因此，本實驗選擇使用牙髓組織能否以組織塊酶解法培 養出牙髓幹細胞來判斷其是否仍具有活性。
另一方面，因為 Price 等學者是使用 9 到 16 歲的牙齒作為樣本(Price and Cserepfalvi 1972)，而 Andreasen 等學者則是使用發育成熟（mature）的牙齒 (Schwartz and Andreasen 1983)。因此，有學者認為上述兩種研究結果的差異關 鍵在於實驗用牙齒之牙根尖是否完全封閉(Temmerman et al. 2006)。
依據口腔組織學的文獻指出，牙根發育的完成和根尖的閉合時間大約是 在牙齒萌發三年後之內完成，意即除了智齒以外，第二大臼齒前二十八顆恆 牙齒列若依照正常發育情形於十二歲左右萌發完成，十五歲以後的恆牙應該 都是牙根發育成熟（mature）、根尖完全封閉的牙齒（closed apex）。但牙根尖 閉合程度是否能作為判斷成功冷凍保存牙齒內牙髓組織的絕對依據仍有疑 慮。
本研究期望牙齒銀行冷凍保存整顆牙齒的技術也能成功冷凍保存其中的 牙髓組織，使解凍後牙齒內之牙髓組織仍能分化牙髓細胞，提供未來牙髓幹 細胞的來源。
第四節、 牙髓幹細胞的發展與應用
近年來的醫療方向以再生醫療為主流，其中「幹細胞療法」(Lovell-Badge 2001)更是科技發展的重點，因為「成人幹細胞」（adult stem cell）(Fraser et al.
2004)或是「出生後幹細胞」（postnatal stem cell）(Seo et al. 2005)已能成功地從 許多人類組織中被培養出來。包括骨髓、神經組織(Servili et al. 2008)、骨骼肌、
上皮組織、牙髓腔、牙周韌帶等(Otaki et al. 2007)。而不論是「成人幹細胞」
或是「出生後幹細胞」，由於沒有道德上的問題，也具有自捐性，意即可以由 患者本人的組織取得，臨床應用上優於「胚胎幹細胞」（embryonic stem cell）
(Cordeiro et al. 2008)。
所有成人幹細胞的來源中，臍帶血幹細胞（umbilical cord stem cell）的儲 存一生只有一次機會，骨髓幹細胞（bone marrow stem cell）的取得會對患者 造成不適，牙髓幹細胞（dental pulp stem cell）因為可以直接由拔下來的牙齒 取得，幾乎完全沒有侵入性(Iohara et al. 2008)，因此可說是幹細胞的最佳來源。
牙髓幹細胞可由乳牙(Cordeiro et al. 2008)、恆牙(Gronthos et al. 2000)，甚 至多生牙(Huang et al. 2008a)中取得。近年來的研究發現，牙髓幹細胞能在有 生物相容性的支架中，分化出造牙母細胞(Almushayt et al. 2006)、類牙本質/
牙髓結構(Chang et al. 2005) ，以及再生出牙本質(Iohara et al. 2004)來修復牙齒 結構；甚至可以分化為脂肪細胞（adipocytes）(Gronthos et al. 2002)、神經細 胞(Arthur et al. 2008)等來治療中樞神經系統的神經病變(Huang et al. 2008b)；
更有學者研究發現牙髓幹細胞用於治療心肌梗塞（myocardial infarct）(Gandia et al. 2008)，以及修復肝臟纖維化的肝功能(Ikeda et al. 2008)的可行性。這些研 究均証明牙髓幹細胞未來發展的潛力無窮。
本研究團隊期望以現有牙齒銀行之技術為基礎，研究以患者保存牙齒將 來進行自體移植治療缺齒問題的可能性之外，同時亦希望能夠瞭解其中牙髓 組織的活性是否也能成功保存。