第三章、 研究材料與方法
第五節 牙髓幹細胞生長曲線之製作
將 MTT 分析結果做圖，將受試樣本（共 4 人，每人各有 1 顆磁性冷凍組 與未冷凍組的牙齒）吸光值之平均與標準差算出，並以 X 軸為天數，分別是 細胞接種後第 0 天、第 1 天、第 2 天、第 3 天、第 4 天、第 5 天。製作牙髓 細胞 MTT 生長曲線。
第六節 牙髓幹細胞在電子顯微鏡下之形態觀察
本實驗以掃描式電子顯微鏡（scanning electronic microscope, SEM）觀察 冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞在形態上是否有差異。實驗進行時將細胞 培養於 24 孔培養盤中，內有消毒洗淨後之蓋玻片。實驗分為磁性冷凍組與未 冷凍組，首先去除細胞培養液，並以PBS 清洗細胞 3 次，接著將細胞以 2.5 % 戊二醛(glutaraldehyde)及 2 %三聚甲醛(paraformaldehyde)固定 20 分鐘，然後再 以 1 % (in 0.1 M PBS)四氧化鋨(osmium tetroxide)固定 30 分鐘。在初步固定之 後，樣品再以 1 %鋨酸後固定 1 小時。接著將樣品以 PBS 清洗並依序以 70 %、
80 %、90 %、95 %及 100 %酒精進行脫水與臨界點乾燥(HCP-2, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)。脫水乾燥後的樣品以鍍金器(IB-2, Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan)噴 鍍一層鈀金(palladium gold)。處理後的細胞利用 Hitachi S-2400 電子顯微鏡系 統加以觀察(Hitachi, Ltd, Tokyo, Japan)。
第七節、牙髓細胞表面特徵蛋白之螢光免疫分析
為分析冷凍保存後的牙齒中培養出的牙髓細胞能否表現其特殊之表面特 徵蛋白，本實驗利用螢光免疫染色法來比較程式降溫冷凍組與未冷凍組牙髓 幹細胞之表面特徵蛋白表現有何異同。
本實驗單一染色所測試之牙髓幹細胞表面特徵蛋白為CD34、CD44 與 STRO-1(Shi et al. 2005)。其中CD34 與CD44 採用不帶螢光之一抗與帶有螢光 之二抗交互反應進行染色。使用抗體分別如下，CD 44 ㄧ抗：HCAM (F-4) sc-9960, mouse monoclonal IgG1 (Santa Cruz)；CD 34 ㄧ抗：(ICO115) sc-7324, mouse monoclonal IgG1 (Santa Cruz)；二抗(綠光)：DyLightTM488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) 115-485-003-15 μl (Jackson ImmunoResearch)。
STRO-1 抗原則是直接使用帶有螢光之抗體進行染色。另外，本實驗為加 強印證牙髓幹細胞應同時擁有 CD44 與 STRO-1 兩種抗原，故進一步選用帶有 紅色螢光之 CD44 抗體與帶有綠色螢光之 STRO-1 抗體同時進行雙染。使用抗 體分別如下，CD44(紅色):HCAM AF647 sc-7297 (Santa Cruz)；STRO-1(綠 色):STRO-1 FITC sc-47733 (Santa Cruz)。
本實驗進行螢光免疫染色時須準備無菌之細胞培養用六孔盤以及消毒洗 淨後之蓋玻片。蓋玻片消毒洗淨之標準流程如下，將蓋玻片用乾淨的鑷子夾 住一角，以清水沖洗濕潤後，以清潔劑(detergent)搓洗蓋玻片。再以去離子水
(DD water)將清潔劑徹底沖洗乾淨後以氣槍吹乾，接著依序以 acetone 及 IPA medium，將細胞以PBS溶液洗淨，然後加入 4 %的福馬林（paraformaldehyde）
1 ml/plate，於室溫進行細胞固定約 20 分鐘。細胞固定完成後重新以PBS溶液 洗淨，再加入 0.5 % triton X100（1 ml/plate）(0.5 % triton X-100, 2 % BSA and 0.05 % NaN3 in PBS. To 190 ml PBS, add 4 g BSA, 1 mL triton X100 and 10 mL 1 % NaN3)對細胞做打孔處理。10 分鐘之後，倒掉triton X100，接著加入 1 :500 溶於triton X100 之一抗，於室溫搖晃反應overnight。反應完成後將一抗回收，
重新以PBS溶液徹底洗淨一抗後，於暗室避光加入 1:500 溶於triton X100 之二 抗，並於 37 ℃反應一小時。之後吸去抗體，用PBS反覆洗淨三次，最後小心 將每孔內之蓋玻片取出蓋到洗淨之載玻片上（有細胞貼附的面朝向載玻片，
載玻片上可先滴上少許PBS避免細胞過於乾燥），蓋上時小心避免氣泡產生。
樣本製作時可將蓋玻片四角以指甲油黏著於載玻片上，並以錫箔紙包覆，再 將樣本以雷射共軛焦顯微鏡之油鏡觀察。
使用帶有螢光之抗體直接染色步驟如下，將各實驗組別之牙髓幹細胞以 1x104 cells/ml，1 ml/plate的濃度接種於六孔盤培養（六孔盤內每孔各放入ㄧ片 消毒洗淨後之蓋玻片），待細胞生長至約六分滿時進行實驗。染色開始前先吸 去medium，將細胞以PBS溶液洗淨，然後加入 1 ml/plate 的 4 %福馬林，於室 溫進行細胞固定約 20 分鐘。細胞固定完成後重新以PBS溶液洗淨，再加入 0.5
% triton X100（1 ml/plate）對細胞做打孔處理約 10 分鐘，之後倒掉 0.5 % triton X100。接著於避光環境下，加入以 1:500 比例溶於 0.5 % triton X100 之抗體（可 同時溶入兩種抗體進行雙染）。在室溫下搖晃反應overnight。之後吸去抗體，
用PBS反覆洗淨三次，最後小心將每孔內之蓋玻片取出蓋到洗淨之載玻片上
（有細胞貼附的面朝向載玻片，載玻片上可先滴上少許PBS避免細胞過於乾 燥），蓋上時小心避免氣泡產生。樣本製作時可將蓋玻片四角以指甲油黏著 於載玻片上，並以錫箔紙包覆，再將樣本以雷射共軛焦顯微鏡之油鏡觀察。
第八節、牙髓幹細胞的脂肪化能力測試
isobutylmethylxanthine(MIX)，60 μM indomethacin， 0.5 μM hydrocortisone， 以 及 10 μg/ml insulin。oil red O庫存溶液(stock solution)為由oil red O試藥（Sigma O0625, FW 408.5）0.14 g溶於 40 ml isopropanol中，stir overnight並過 0.2 μm filter，存放於 4 ℃。實驗進行時所使用之oil red O染劑(working solution)則必須於使用前將庫 存溶液與二次水(QH2O)以六比四比例稀釋，並靜置於室溫二十分鐘，再離心 去除沉澱後使用。
進行 oil red O 染色時，先將培養基倒掉，加入 D-PBS 500 μl/well 沖洗ㄧ 次 ， 並 以 4 % formaldehyde 250 μl/well 進 行 細 胞 固 定 15 分 鐘 後 吸 去 formaldehyde，再加入 60 % isopropanol 500 μl/well 沖洗ㄧ次後置於室溫風乾 5 分鐘，然後加入 oil red O 染劑(working solution) 250 μl/well（注意不要滴到管 壁），反應 10 分鐘後吸去 oil red O 染劑(working solution)，並立刻以二次水 500 μl/well 反覆沖洗四次以上去除多餘染劑，最後以顯微鏡觀察拍照。
第九節、牙髓幹細胞的骨化能力測試
養基，同樣每週固定天數將培養基更換兩次，3 週後進行alizarin red S染色並 以顯微鏡觀察實驗結果。然後加入 alizarin red S 染劑 250 μl/well（可用 dropper，每 well 約加四滴，蓋 過細胞即可，注意不要滴到管壁），反應兩分鐘後吸去 alizarin red S 染劑，並 以 D-PBS 500 μl/well 反覆沖洗三次以上去除多餘染劑（配合使用 Elisa shaker，
背景必須洗乾淨），最後以顯微鏡觀察拍照。
第十節、統計分析
本研究中在比較冷凍前後牙齒培養牙髓幹細胞之生長曲線時，運用統計學
判定冷凍前後有無差異，所有的測定和觀察均進行三重複實驗，實驗結果的 數據則以平均值±標準差(SD)表示，程式降溫冷凍組與未冷凍組的差異以 t-test 進行比較。以 p 值＜0.05 表示有統計學上的差異。
第四章、實驗結果
第三節、冷凍保存前後牙髓幹細胞形態差異
本研究使用掃描式電子顯微鏡觀察冷凍前後牙髓幹細胞之形態差異，由 圖可知磁性冷凍組與未冷凍組有相類似的細胞形態，混合著不規則狀及長突 觸之類神經細胞狀之細胞，同樣擁有細胞的多樣性（如圖十所示），視野中均 可看見大小不一，如破布狀的不規則細胞，或是長突觸的類神經細胞狀細胞。
（如圖十一、圖十二所示），但是經由神經細胞 marker CRMP-2、GAP-43 的 染色確認，此長突觸之細胞並無神經細胞marker CRMP-2、GAP-43 的呈色反 應，且在 neuron growth factor (NGF)的環境之下，亦無神經細胞 marker CRMP-2、GAP-43 的表現。（如圖十三、圖十四所示）
第四節、冷凍保存前後牙髓幹細胞表面特徵蛋白之表現
與 STRO-1 (綠色)的表現（如圖十九所示）。
顯微鏡下則可看到，不論冷凍前後牙齒所培養之牙髓幹細胞，其旺盛的 骨化作用均使染成紅色的鈣質沉積佈滿了整個視野（如圖二十五、圖二十六 所示）。骨化控制組未加入促進骨化之特殊培養基，同樣培養三週後以alizarin red S 進行鈣沉積的染色確認，結果顯示骨化控制組中不論冷凍前後牙齒所培 養之牙髓幹細胞，皆無鈣沉積的呈色反應（如圖二十七、圖二十八所示）。
第五章、研究討論
胞之生長曲線並無統計上之差異（t-test, p>0.05）。（如圖七所示）由上述結果可合理推測牙髓組織在牙齒銀行之整顆牙齒冷凍保存後，其
的牙齒，未來同樣能夠培養出具有旺盛生長潛力的牙髓幹細胞。
根據以往研究牙髓幹細胞的文獻指出，牙髓幹細胞在形態上類似骨髓幹 細胞（bone marrow stem cells, BMSC）， (Huang et al. 2008b) 為長形梭狀（long and spindle shaped ） (Huang et al. 2008a) 。 同 時 也 與 纖 維 母 細 胞 類 似
（fibroblast-like cells）(Gronthos et al. 2000)。但從前的文獻都是以光學顯微鏡 觀察，本研究為更進一步觀察冷凍前後牙齒所培養出牙髓幹細胞其形態差 異，採用掃描式電子顯微鏡（scanning electron microscope, SEM）進行觀察比 較。結果發現無論有無經過冷凍保存，牙髓幹細胞均表現細胞的多樣性（如 圖十所示），視野中可看見大小不一，形態不規則的細胞，或是長突觸的類神 經細胞狀細胞（如圖十一、十二所示），可推論冷凍並未對牙髓幹細胞之形態 造成影響。另一方面，針對牙髓幹細胞中形態類似神經細胞的長突觸狀細胞，
本研究團隊特針對神經細胞marker CRMP-2、GAP-43 進行染色確認，結果顯 示此長突觸之細胞並無神經細胞marker CRMP-2、GAP-43 的呈色反應，且在 neuron growth factor (NGF)的環境之下，亦無神經細胞marker CRMP-2、GAP-43 的表現。（如圖十三、圖十四所示）
欲確認本研究所培養之牙髓幹細胞均具備其特有之表面特徵蛋白，本實 驗室參考施松濤教授研究團隊在西元 2000 年最早發表牙髓幹細胞的文獻 (Gronthos et al. 2000) ，以及同團隊在西元 2005 年發表有關牙髓幹細胞與其他 間葉幹細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）的研究文獻(Shi et al. 2005)，內
容指出牙髓幹細胞雖然沒有造血幹細胞（haematopoietic stem cells）所表現的 CD34 抗原(-)，但有 CD44 抗原之強烈表現（++），與 STRO-1 抗原的部分表 現（++/+/-）。其中 STRO-1 抗原被用於分離（isolate）與純化（purify）骨髓 幹細胞（bone marrow stromal stem cells, BMSSC），也被認為是幹細胞記號
（putative stem cell marker）(Shi et al. 2005)。
本研究進行上述三種表面特徵蛋白（CD34、CD44、STRO-1）的免疫螢
成人幹細胞（adult stem cells, ASCs）因為有自我更新以及多元分化
（multi-lineage differentiate）的能力而被視為有治療疾病的潛力(Huang et al.
2008b)。施松濤教授的研究團隊也在西元 2002 年正式發表牙髓幹細胞具有高 度增殖潛力（high proliferative potential），且能自我更新與多元分化，可視為 新興的成人幹細胞族群(Gronthos et al. 2002)。根據該團隊早期的資料，牙髓幹 細胞在體外能形成發散（sporadic）但濃密的鈣化顆粒（calcified nodules），且 無法形成脂肪細胞(Gronthos et al. 2000)。
然而根據許多後繼研究者的文獻指出，牙髓幹細胞不但可成功分化為造 牙母細胞（odontoblasts）(Couble et al. 2000)，脂肪細胞（adipocytes）與軟骨 細胞（chondrocytes）(Kawazoe et al. 2008)，也能進行骨化作用（Osteogenesis）
(Huang et al. 2008b)，甚至形成類神經細胞（neural-like cells）(Iohara et al. 2006)。
綜上所述，牙髓幹細胞可說是相當具有未來幹細胞療法（stem cell therapy）
的呈色反應。（如圖二十二、二十三所示）由此可推論牙髓幹細胞僅會在特定 促進骨化之特殊培養基的骨化控制組中，同樣在培養三週後以 alizarin red S 進行鈣沉積的染色確認，結果顯示未冷凍組與程式降溫冷凍組的牙齒中之牙
第六章、結論與未來展望
關於未來實驗進行的思考方向，本研究由於實驗時程的限制，僅進行七
關於未來實驗進行的思考方向，本研究由於實驗時程的限制，僅進行七