行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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國人第三型高脂血症之分子研究
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計畫類別：■個別型計畫
□整合型計畫
計畫編號：NSC89－2314－B－002－270－
執行期間：
89 年
8 月
1 日至 90 年
7 月 31 日
計畫主持人：高照村
共同主持人：
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：台大醫學院醫事技術學系
中
華
民
國
90 年
10
月
23
日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
國人第三型高脂血症之分子研究
Molecular Study of Type III Hyperlipoproteinemia in Taiwan
計畫編號：NSC 89-2314-B-002-270
執行期閒： 89 年 8 月 1 日 至 90 年 7 月 31 日
主持人： 高 照 村
台大醫學院醫事技術學系
一. 中文摘要 第三型高脂蛋白血症又稱家族性 劣 質 脂 蛋 白 血 症 （ Familial dysbetalipoproteinemia）。臨床上 的 特 徵 是 血 漿 中 三 酸 甘 油 酯 （ Triglyceride ； TG ） 、 總 膽 固 醇 （Total Cholesterol；TC）的濃度增 加 ， 極 低 密 度 脂 蛋 白 （ Very Low Density Lipoprotein；VLDL）在血清 電 泳 形 成 一 寬β帶 （β-migrating band），結締組織有脂肪瘤的產生， 病患易罹患早發性冠狀動脈硬化及周 邊血管的動脈硬化。 第三型高脂蛋白血症主要是由於 脂蛋白元 E（Apolipoprotein E；apoE） 異常所致，使得肝臟失去代謝脂蛋白 剩餘體（Lipoprotein remnant）的能 力。ApoE 是一由 299 個胺基酸所組成 的 蛋 白 質 ， 存 在 乳 糜 微 粒 （Chylomicron）、VLDL 及高密度脂蛋 白 （ High Density Lipoprotein ； HDL）。主要的功能是作為脂蛋白與細 胞接受器結合的配位基（ligand）。 由於基因的多形性，apoE 有三種異構 型，分別是 apoE2、apoE3 及 apoE4。 歐美國家的研究報告指出患有第三型 高脂蛋白血症的病人 90%以上是屬於 apoE2 型，apoE2 與接受器結合的能力 約只有正常的 1%。本研究是以血清電 泳具有β-migrating、測量 VLDL-C/TG 比值大於 0.3，在台大醫院高三酸甘油 酯及高膽固醇的病患中篩檢出第三型 高脂蛋白血症。探討台 灣 地 區 第 三 型 高 脂 蛋 白 血 症 病 患 與 脂 蛋 白 元 E 基因型（genotype）之 關 聯 性，並 比較台灣地區第三型高脂蛋白血症病 患其 apoE 基因型與其他國家所報告的 結果的差異。同時利用聚合酵素鏈鎖 反應（Polymerase Chain Reaction； PCR）加上直接定序來偵測 apoE 基因 的變異，探討是否有除了 apoE2/2 以 外的變異型，並且測試溫度梯度電泳 法 （ Temperature Gradient Gel Electrophoresis ；TGGE），應用於 偵測脂蛋白元 E 基因分型之可行性。 在總數 10 位第三型高脂蛋白血症 的病患中，只有 2 位病患是 apoE2/2 （20%）的基因型，但帶有ε2 對偶基因 的頻率佔 50%，顯示國人第三型高脂蛋 白血症的病患主要是以異合子的形式 存在。而對於高 GC 含量，表現子（exon）DNA 長度又長的脂蛋白元 E，利用 TGGE 做脂蛋白元 E 基因分型，因其靈敏度 及再現性均不佳，因此尚不可行。 關鍵詞：第三型高脂蛋白血症、脂蛋 白元 E、基因定序、溫度梯度電 泳法 Abstract
Type III hyperlipoproteinemia (type
III HLP; familial
dysbetalipoproteinemia ) is a condition characterized by elevated serum total cholesterol (TC) and triglyceride (TG)
levels, and by a cholesterol-enriched very low density lipoprotein (VLDL) designated floating-â lipoprotein or â-VLDL. Affected individuals may rarely have yellowish lipid deposits in the creases of the palms of the hands called xanthoma striata palmaris. In addition, eruptive and tuberous xanthomas are occasionally seen. Coronary heart disease and peripheral vascular disease both occur prematurely in type III HLP. More than 90% of the patients are homozygous for apolipoprotein E2 in most populations analyzed thus far.
Apolipoprotein E (apoE) is a polypeptide comprised of 299 amino acids found in chylomicrons (CM), VLDL, and high density lipoproteins (HDL). The structure gene for apoE is polymorphic. Three common isoforms of the protein (apoE2, apoE3, apoE4), due to three different alleles (â2, â3, â4) inherited in a codominant fashion, account for six common phenotypes (apoE2/2, apoE2/3, apoE2/4, apoE3/3, apoE3/4, apoE4/4). These isoforms interact differently with specific lipoprotein receptors, and thereby alter circulating lipid levels. When compared with the most common apoE3 isoform, the apoE2 isoform has a significantly reduced affinity for the LDL receptor, this may result in the homozygous state in accumulation of cholesterol-enriched lipoprotein remnants and in some individuals this phenotype is associated with type III hyperlipoproteinemia.
The aim of this study was to determine the relationship between apoE genotype and type III HLP patients and to evaluate the apoE genotyping with temperature gradient gel electrophoresis (TGGE). Type III HLP was defined by elevated serum triglyceride and cholesterol concentrations and by the presence of both â-VLDL and a ratio of VLDL cholesterol to plasma triglyceride
of > 0.30. The genotype and the allele frequencies of type III HLP were also compared between Taiwanese and other populations.
In 10 patients with type III HLP, only two were apoE2/2 homozygous. The â2 allele frequency was 0.5, which indicated that the heterozygotes were the major genotypes. This result was different from that of Caucasian but similar to Japanese. In addition to the common apoE genotype, no other apoE variant was found by direct sequencing. Due to the poor reproducibility, apoE genotyping with temperature gradient gel electrophoresis technique was not feasible and modification of the technique is necessary.
Keywords: Type III
Hyperlipoproteinemia, Apo E, Gene sequencing, Temperature Gradient Gel Electrophoresis Technique 二、緣由與目的 第三型高脂蛋白血症是於 1950 年 為 Gofman 首先發表[1]，他起初稱這 種病為黃色瘤結節並指出這是一種家 族性的脂質代謝異常的疾病。病患血 漿 中 三 酸 甘 油 酯、 膽 固 醇 的濃度 增 加，皮膚有脂肪瘤的產生，尤其是結 節性黃色瘤和掌紋黃色瘤。目前，掌 紋黃色瘤為第三型高脂蛋白血症所特 有。病患血漿內累積許多極低密度脂 蛋白剩餘體。第三型高脂蛋白血症的 臨床徵狀呈多樣性，多數第三型高脂 蛋白血症病患易罹患早發性冠狀動脈 硬化及周邊血管的動脈硬化。然而， 大多數的病患在年輕時血漿脂質並不 會特別的升高，通常是因為其他的疾 病，如甲狀腺低能、糖尿病、肥胖等 因 素 ， 才 進 一 步 引 發 高 血 脂 的 惡 化 [2]。 第三型高脂蛋白血症形成的 主要原因是由於脂蛋白元 E 異常，改
變了脂蛋白元 E 與細胞表面接受器結 合的能力，降低血漿內脂蛋白剩餘體 代謝的速率，使得病患增加罹患心血 管疾病的機率[3]。一般診斷第三型高 脂蛋白血症的依據有三：第一、病患 血漿中三酸甘油酯、膽固醇的濃度高 於 95%正常人之值，第二、病患血清電 泳呈一寬β帶，這是由於脂蛋白內充滿 膽固醇所致，第三、病患 VLDL 內膽固 醇含量與病患血漿中三酸甘油酯的比 值大於 0.3（正常人則在 0.2 以下） [4]。Utermann 等人發現絕大多數第三 型高脂蛋白血症病患其 apoE 是屬於 apoE2/2 的型式[5]。 脂蛋白元 E 是於 1973 年首先被 Shore 和 Shore 所發表[6]。它是一種 富含精胺酸的蛋白質，主要存在富含 三酸甘油酯的 VLDL 上。脂蛋白元 E 的 胺 基 酸 序 列 於 1982 年 首 先 被 定 出 [7]，它含有 299 個胺基酸，分子量為 34,200。其由 mRNA 反轉錄出來的 cDNA 也在 1984 年被定序出來[8]。藉由二 方向電泳分析，Zannis 和 Breslow 提 出脂蛋白元 E 的基因存有三個對偶基 因（alleles），並在轉譯後有醣化的 過程，使得各個脂蛋白元 E 的分子量 和 pH 有些許差異，確立了脂蛋白元 E 是一基因上存有三個對偶基，並可轉 譯出三種同合子表現型，三種異合子 表現型[9]。從分子生物學方面研究脂 蛋白元 E 的多形性顯示，脂蛋白元 E 的 三 種 異 構 體 是 起 源 於 蛋 白 質 上 第 112 與 158 二個位置的胺基酸的不同 [10]，脂蛋白元 E 是一媒介脂蛋白與 apoB,E （ LDL ） receptors 或 apoE receptors 結合的蛋白質[11]；藉由離 子的交互作用力[12]，由其 N 端第 136-150 位置的胺基酸與接受器結合 [13]。當脂蛋白元 E 的 N 端第 158 個 胺基酸由 Arg 轉變成 Cys 時，其與接 受器結合的能力便只剩 1% [14]，導致 脂蛋白剩餘體的清除受到障礙。因此 建立一套簡單、可以大量篩檢脂蛋白 元 E 異構體的方法便有其重要性。本 研究是探討台灣地區第三型高脂蛋白 血症病患與脂蛋白元 E 基因型之關聯 性，並比較台灣地區第三型高脂蛋白 血症病患其 apoE 基因型與其他國家所 報告的結果的差異。同時利用聚合酵 素鏈鎖反應直接定序來偵測 apoE 基因 的變異，探討是否有除了 apoE2/2 以 外的變異型，並且測試溫度梯度電泳 法，應用於脂蛋白元 E 基因分型之可 行性。 三、結果與討論 本研究對象為來自台大醫院高三 酸甘油酯、高膽固醇的病患，共 407 位。其篩選條件為：三酸甘油酯高於 280 mg/dl 且小於 1500 mg/dl；總膽 固 醇 高 於 280 mg/dl 且 小 於 500 mg/dl，LDL-C 小於 130 mg/dl。利用 血清電泳篩檢出帶有 â-VLDL 的病患 37 位，其中 VLDL-C/TG>0.3 的病患 10 位，包括 4 位女性，6 位男性，平均年 齡 63 歲（表一及表二）。以 PCR-RFLP 分 析 高 脂 血 檢 體 （ â-VLDL （ + ） 或 VLDL-C/TG>0.3）的基因型（圖一）。 在總數 10 位第三型高脂蛋白血症的病 患中，只有兩位是 apoE2/2（20%）， 與歐美地區大於 90%[5]相差甚多。若 是比較對偶基的分佈情形，å2 則佔有 50%（表二），顯示國人主要是以異合 子（heterozygote）的形式存在，與 日本出現的頻率類似。 為了更進一步探討脂蛋白元 E 在 高脂血症病人上的分布情形，接著將 帶有 â-VLDL 或 VLDL-C/TG>0.3 檢體的 基因型加總之後，分析其對偶基出現 之 頻 率 ， 結 果 發 現 å2=0.195 ， å3=0.627 ， å4=0.178 ， 對 照 正 常 者 å2=0.082，å3=0.871，å4=0.047[15]， 其中 å2、å4 的頻率皆高於正常者，顯 示脂蛋白剩餘體清除障礙可能與 å2 較 相關，而帶有 å4 對偶基也比 å3 較具脂 質代謝異常的危險性。經由聚合酵素 鏈鎖反應直接定序法分析，再次確認
脂蛋白元 E 基因型分析的結果，然而 在本論文收集的樣本裡，並沒有除了 脂蛋白元 E 異構體以外的變異型。利 用溫度梯度電泳可將正常的 DNA 和受 測的變異的 DNA 加以區分。理論上 apoE3 帶的是 GC 的鹼基配對，Tm 值比 apoE2 高，應有較快的電泳速度；同樣 的 apoE4 的電泳速度應比 apoE3 快。 然而，經過多次的實驗發現此電泳跑 出來的樣式沒有一致性，系統的再現 性不佳(圖二及三)，對於用來篩檢高 GC 含量，表現子 DNA 長度又長的脂蛋 白元 E，可能需要進一步的評估。 四、計畫成果自評 本研究已達到原來預期的目標， 同時參與之工作人員也學到了脂蛋白 電泳，基因型分析，聚合酵素鏈鎖反 應直接定序法分析及溫度梯度電泳法 等的技術。且所得的結果具有學術參 考之價值。 五、參考文獻
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表一：高脂血症病患脂質測定值 No. SEX （F/M） AGE （years） TC （mg/dl） TG （mg/dl） HDL-C （mg/dl） LDL-C （mg/dl） VLDL-C/TG β-VLDL N=10 4/6 63.1±4.3 400±64.2 616±46.2 30±2.5 93.1±15.1 >0.3 + N=6 1/5 64.2±5.8 328±17.6 426±30.4 50.17±4.6 120±34.3 >0.3 -N=27 15/12 51.6±2.5 284.6±7.9 684.2±71.2 40.2±1.9 121±9.2 <0.3 + 數值是以mean±SEM表示
表二：第三型高脂蛋白血症病患之生化檢查資料 HLP編號 性別 年齡 TC （mg/dl） TG （mg/dl） HDL-C （mg/dl） LDL-C （mg/dl） VLDL-C/TG β-VLDL ApoE genotype 26 F 74 272 564 21 66 0.328 + 2/2 77 M 51 416 647 25.5 96 0.455 + 2/2 110 F 82 323 562 42 103 0.317 + 3/3 119 F 64 269 412 39 103 0.308 + 2/3 195 M 64 361 518 18 118 0.434 + 2/3 268 M 76 315 653 30 51 0.358 + 2/4 283 M 45 485 841 28.5 198 0.307 + 2/3 304 M 51 300 504 34.5 109 0.311 + 3/3 329 M 48 945 876 25.5 21 1.026 + 2/3 366 F 76 312 578 37.5 66 0.361 + 2/3
