光學同調繞射顯微術之HIO與Ptychography影像重建

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(1)國立臺灣師範大學理學院物理學系碩士論文 Department of Physics College of Science. National Taiwan Normal University Master's Thesis. 光學同調繞射顯微術之 HIO 與 Ptychography 影像重建 Hybrid Input Output and Ptychographic Reconstructions of Coherent Optical Diffraction Microscopy. 廖宇新 Yu-Hsin Liao. 指導教授：傅祖怡博士、黃英碩博士 Advisor: Dr. Tsu-Yi Fu, Dr. Ing-Shouh Hwang 中華民國一○九年七月 July 2020.

(2) 致謝兩年的碩士生活過得飛快卻很充實，實驗的訓練讓我深刻體會到理論與實務的差距，也開始會從實驗的角度思考，學習克服技術上的困難。回想剛拿到題目時，從對光學實驗毫無經驗，直到終能搭出一個 CDI 實驗架構，並且收圖來計算，簡直不可思議！要歸功於許多人給予我幫助。首先，要感謝我的兩位指導老師黃英碩老師和傅祖怡老師的指導，感謝黃英碩老師給我的研究方向與過程中關鍵性的指導，提供我實驗與計算上所需的儀器設備，並教導了我做研究的態度。感謝傅祖怡老師常在 ARML 週會中，關心我的研究生活與身心健. 康，並對我的報告給予指導，增益我對於單原子針的知識。感謝陳明彰老師在要開始搭建實驗時，提供我可參考的架構。感謝林宮玄老師與修哥在雷射知識與光學實驗上的分享。感謝陳育霖老師，在課堂中傳授我物理教育的實作技巧，提示我光學在演示教學上的優勢。感謝育廷給我一些科教方面的建議。感謝君岳學長與維哲學長，在實驗與撰寫論文上給我的幫助。感謝豐哥在畫工程圖上的經驗分享，感謝賴董與 Strube 在相機知識方面的分享。特別要感謝文勤學長從加入 SAT LAB 就教導我關於 PPM 實驗操作與 HIO 演算法的相關知識。在本實驗開始後，幾乎參與了當中的每個環節，與我一同架設儀器、收圖，從細微之處幫我偵錯，最直接的幫助我改善實驗，提供我演算法以及數據處理的程式，還不厭其煩的解釋給我聽。另外，也要感謝實驗室所有成員的陪伴，為研究生活增添不少歡樂。我也要感謝我的家人們：感謝我的父親，鼓勵我繼續念物理所，在我做重要決定的時候，傾聽我的想法，並給我中肯的建議，也在需要時，往返南港、公館的載我；感謝我的母親，每天在出門前都擁抱我、為我祈禱，常關心我在實驗室與學校的生活，支持我走向成為老師的路；還有我可愛的妹妹，我總能在與她的談笑中排解壓力，謝謝他們的關愛與照顧。讓我能順利完成學業。最後，我要感謝上帝，謝謝祂一步步的帶領，讓我遇到這麼多愛我、願意幫助我的人，各樣美善的事物，都是從祂而來！. i.

(3) 摘要使用以單原子針為電子源的低能量點投影顯微鏡(point projection microscope, PPM in short)可收取能見度高的繞射影像。以相位取回技術重建該影像，可到達原子級解析度。這表示PPM具有在不造成輻射損害的情況，觀察二維材料、生物分子和奈米材料方面的潛力。本篇的主要工作，是架設光學同調繞射成像 (Coherent Diffraction Imaging, CDI) 之實驗系統，為正在改良中的 PPM，建立一套可靠的影像重建方法。我們的系統以氦氖雷射作為發射源、以市售相機作為感測器，收取實際繞射影像進行重建，作為電腦模擬繞射成功重建後的二次確認。使用HIO(Hybrid Input-Output)演算法與PIE(Ptychographic Iterative Engine) 兩種相位取回演算法來進行影像重建。本論文應用多種數據處理的方法，得到信噪與動態空間比較高的繞射影像，成功重建針孔影像，並初步重建出生物樣品上部分精細的特徵點。. 關鍵字：同調繞射成像術、相位取回技術、低能量點投影顯微鏡、HIO 演算法、PIE 演算法. ii.

(4) Abstract High visibilty diffraction patterns of samples can be acquired by the low energy electron point projection microscope(PPM) based on a single-atom-tip(SAT) emitter. Using the phase retrieval technique, we can obtain image with atomic resolution. This implies that PPM has the potential to observe 2D materials, biomolecules, and nanomaterials without causing radiation damage. The main purpose of this work is to establish a reliable method for PPM image reconstruction. We build our own optical coherent diffraction imaging(CDI) system with a He-Ne laser and a commercial camera. The actual diffraction image is collected and reconstructed as a second confirmation after we successfully reconstruct the computer-simulated diffraction. In the thesis, two phase retrieval algorithms: HIO (Hybrid Input-Output) algorithm and PIE (Ptychographic Iterative Engine) are applied to reconstruct images. We use several data processing methods to obtain diffraction patterns with higher signal-tonoise and dynamic range. We have successfully recovered the pinhole sample image and some fine features on the biological sample.. Keywords: coherent diffraction imaging; phase retrieval technique; low energy electron point projection microscope; Hybrid Input Output algorithm; Ptychographic Iterative Engine. iii.

(5) 目錄致謝 …………………………………………………………….…..…i 摘要 …………………………………………………………….……..ii Abstract ………………………………………………………………..iii 目錄. …………………………………………………………….……iv. 圖目錄 ………………………………………………………………...vii 第一章. 緒論. ..………………………………………………....……1. 1.1 背景. ……………………………………………....……1. 1.2 研究動機 ………………………………………………5 第二章. 理論與文獻回顧. ………………………………………….6. 2.1 繞射理論與離散傅立葉轉換 ………………………...6 2.2 CDI 的使用條件. …………………………………...…9. 2.2.1 過取樣條件 ……………………………………9 2.2.2 光源同調性…………………………………….11 2.3 相位取回演算法. ……………………………………..14. 2.3.1 Fienup 演算法 ………………………………..14 2.3.2 Ptychography 演算法 …………………………..16 2.4 CDI 實驗. ……………………………………………..20. iv.

(6) 第三章實驗儀器、步驟與細節. …………………………………22. 3.1 實驗儀器架設與規格 ……………………………….22 3.2 實驗步驟與數據處理 …………………………….…26 3.2.1 光路架設 ……………………………………26 3.2.2 檢驗過曝 ……………………………………29 3.2.3 去除髒點 ……………………………………30 3.2.4 疊合影像、扣除背景 ………………………33 3.2.5 裁切成方形、計算解析度 …………………34 3.3 影像重建的模擬與實驗選擇 ……………………….35 3.3.1 誤差計算 ……………………………………35 3.3.2 一般 CDI 的重建 …………………………...35 3.3.3 掃描式 CDI 的重建 ………………………...37 第四章影像重建結果與討論. …………………………………….40. 4.1 一般 CDI ………………………………………….....40 4.1.1 針孔樣品 ……………………………………40 4.1.2 棉花葉樣品 …………………………………44 4.2 掃描式 CDI ………………………………………….49. v.

(7) 第五章結論與未來展望. …………………………………….……51. 5.1 CDI 實驗的後續工作 …………………………….…52 5.2 科教用途 ………………………………………….....53 參考文獻 ……….…………………………………………………..57. vi.

(8) 圖目錄第一章緒論. ..………………………………..……………....……1. 圖1.1 顯微鏡種類與顯微鏡解析度演進史. ……………………2. 圖1.2 傳統顯微成像技術與CDI原理圖 ……………………….3 圖1.3 PPM架設示意圖第二章. ………………………………………….4. 理論與文獻回顧 …………………………………….…6. 圖2.1 點光源、樣品平面與繞射平面的相對位置示意圖 ……6 圖2.2 繞射取樣與同調性示意圖. ………………………………9. 圖2.3 CDI繞射圖樣與重建無密度區域的示意圖 ……………10 圖2.4 取樣比例接近2時，訊息重現的示意圖圖2.5 時間同調性示意圖. ………………11. ……………………………………..12. 圖2.6 雙狹縫干涉儀示意圖 …………………………………..13 圖2.7 單原子針發射源的能見度. ……………………………..13. 圖2.8 相位取回演算法原理圖 ………………………………..14 圖 2.9 Fienup 演算法的迭代流程圖 ……………………….….16 圖 2.10 PIE 演算法單一位置的迭代流程圖…………………….18 圖 2.11 PIE 演算法移動位置示意圖 ………………………….18 圖 2.12 參考文獻中的可見光 CDI-HIO 實驗 ………………..20 圖 2.13 參考文獻中的可見光 CDI-PIE 實驗 ………………...21. vii.

(9) 第三章實驗儀器、步驟與細節. …………………..……………22. 圖 3.1 一般 CDI 實驗架設圖與實驗照片記錄 ………………22 圖 3.2 光圈後光斑影像與 profile ………….…………………23 圖 3.3 掃描式 CDI 實驗架設圖與藍眼視角的照片……………24 圖 3.4 5 × 5 個收取繞射圖的位置 ……………………………...25 圖 3.5 校準光路示意圖. ……………………………………….26. 圖 3.6 TEM grid 在 OM 下的影像 …………………………….27 圖 3.7 不同距離拍攝 TEM grid 樣品繞射影像 ……………...28 圖 3.8 拜爾濾色鏡與濾色示意圖 …………………………….30 圖 3.9 去除髒點示意圖. ……………………………………….31. 圖 3.10 HIO 去除髒點之前後比較 ……………………………32 圖 3.11 PIE 去除髒點之前後比較 …………………………….32 圖 3.12 不同曝光時間平均前後之影像 ……………………...33 圖 3.13 相同曝光時間平均前後之影像 ……………………...33 圖 3.14 依繞射圖中心裁切成方形陣列 ……………………...34 圖 3.15 重建影像輸入 ER 演算法之前與之後 …………...….36 圖 3.16 重建影像輸入 ER 演算法之前與之後的收斂情形 …37 圖 3.17 模擬探測光源與樣品 ……………………………...…38 圖 3.18 模擬 PIE 演算法迭代 100 次重建結果 ………………39. viii.

(10) 第四章影像重建結果與討論. …….…………………………….40. 圖 4.1 100 μm 針孔繞射圖 …………………………………….40 圖 4.2 100 μm 針孔 OM 影像與重建圖的比較 ……………....41 圖 4.3 100 μm 針孔繞射與重建圖繞射的比較 ……………….42 圖 4.4 針孔在 Fienup 演算法中的收斂情形. …………………43. 圖 4.5 不同迭代次數的針孔重建 …………………………….43 圖 4.6 棉花葉樣品製備圖與在 OM 下放大圖. ……………….44. 圖 4.7 棉花葉在對數尺度下的繞射圖 ……………………….44 圖 4.8 棉花葉 OM 影像與重建圖的比較. ……………………45. 圖 4.9 棉花葉繞射與重建圖繞射的比較(對數尺度) ……….45 圖 4.10 棉花葉在 Fienup 演算法中的收斂情形 ……………..46 圖 4.11 不同迭代次數棉花葉重建圖的比較. ………………...47. 圖 4.12 7 萬與 10 萬次 HIO 棉花葉重建圖的比較 ……..…...48 圖 4.13 不同迭代次數棉花葉重建圖繞射的比較(對數尺度) 48 圖 4.14 棉花葉 9 個位置繞射 …………………………………49 圖 4.15 棉花葉在光學顯微鏡下放大圖與重建 ………………50 圖 4.16 棉花葉在 PIE 中迭代 500 次的收斂情形 ……………50. ix.

(11) 第五章結論與未來展望. …………………………….…….……51. 圖 5.1 解析度片 ……………………………………………….51 圖 5.2 多次與單一照射的 CDI-PIE 實驗比較 …………….....52 圖 5.3 雷射彈簧實驗架構圖與其繞射圖樣. ………………….53. 圖 5.4 選擇 12 種不同 DNA 形貌生成繞射. ……………...….54. 圖 5.5 與「照片 51」相似的雷射繞射圖樣. …………………54. 圖 5.6 首張直接拍攝的 DNA 雙股螺旋照片. ………………..55. x.

(12) 第一章緒論 1.1 背景自 17 世紀初期，顯微鏡在生物、醫學、材料、物理等領域研究上就扮演極重要的角色，它是觀察微小物體的利器。光學顯微鏡(Optic Microscope, OM)是最早被發明出來的顯微鏡，利用可見光與透鏡組來放大微小的樣品。然而，光學顯微鏡受到繞射極限的限制，解析度僅能到微米等級。因此發展擁有更短波長發射源的電子顯微鏡(Electron Microscope, EM)。. 電子顯微鏡主要分為兩種，一種是 1931 年由 Knoll 與 Ruska 提出的穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope, TEM) [1]，可觀察樣品內部結構；另一種是 1937 年由 Manfred von Ardenne 發明的掃描式電子顯微術 (Scanning Electron Microscope, SEM) [2]，可觀察樣品表面形貌。. TEM 作用原理可類比光學顯微鏡，1960 年代後透射電子顯微鏡的加速電壓越來越高，能透視越來越厚的物質。這個時期電子顯微鏡達到了可以分辨原子的能力，能以 0.1～0.2 奈米的解析度觀察樣品的結構，被廣泛應用於癌症研究、病毒學、奈米技術、半導體研究等。常見顯微鏡架種類與顯微鏡解析度的演進，如圖 1.1。. 1.

(13) (a). (b). 圖 1.1. 顯微鏡種類(a)與顯微鏡解析度演進史(b) [3,4]. 不過，TEM 在觀察二維材料、生物樣品與輕元素(如：H、C、N、O 等)樣品時，面臨一些挑戰。. 首先，根據 Scherzer 定理(1936)，因電磁透鏡的像差必為正數，無法像光學顯微鏡一樣用正像差與負像差的透鏡組來相消除像差，必須配備像差修正 (Aberration corrected，AC)儀器，如圖 1.1(b)紅點處，而 ACTEM 的球面像差修正器造價不斐，造成實驗成本大幅上升。. 其次，TEM 因電子易散射或被物體吸收，工作電壓在通常上百 keV 的能量以利穿透樣品，如此高的能量容易損壞樣品。以二維材料為例，TEM 照射石墨烯時，80keV 以上的電子會將石墨烯的碳原子擊出，造成 knock-on 破壞；20100keV 會造成由電子束引發之蝕刻破壞(beam-induced etching)，通常發生在石墨烯表面大範圍缺陷、有吸附物的位置 [5]。除此之外，高能量的電子對輕元素的散射截面越小，導致其影像對比與信噪比(Signal-to-Noise Ratio, SNR)不佳 [6]，而生物分子與部分二維材料，主要是由這些輕元素構成。. 2.

(14) 欲改善物鏡成像造成的像差問題，同調繞射顯微術(Coherence Diffraction Imaging, CDI)是個可行的方案。CDI 利用電腦計算代替物鏡成像，配合相位取回演算法來成像。. 圖 1.2 傳統顯微成像技術與 CDI 原理圖 (a)傳統顯微成像技術利用光學與電磁透鏡系統作為物鏡來成像。(b)沒有物鏡的 CDI 系統則是記錄樣品的繞射圖，藉由反傅立葉轉換重建出實數空間的原始影像。. 當發射波源穿過樣品時，波的光強度與相位隨著樣品的形貌改變。收取繞射圖樣僅能記錄強度資訊、相位資訊被丟失了，必須重建相位，在物理學上稱為相位問題(phase problem)，而重建相位的技術是 CDI 演算法的主要特色。. 其中，Hybrid Input Output(HIO)演算法被廣泛應用於一般 CDI 的重建上，適合觀察侷限(finite)樣品；Ptychography 演算法被應用於掃描式 CDI，具有能看延伸(extended)樣品的特性，改進了 HIO 僅能看侷限樣品的限制。 3.

(15) 本實驗室林君岳博士等人設計了以單原子針作為發射源的低能量同調電子繞射成像顯微鏡(Point-projection microscope, PPM) [7]。電子源越小，則同調性越好，繞射條紋的可見度(visibility)也會越高，能記錄高對比的繞射條紋和全像圖。尖端只有一顆原子的單原子針，是電子繞射最理想的發射源。發射源的操作電壓控制在 1-10 keV，能記錄到對應 0.62 埃解析度的石墨烯繞射圖案。若能使用 CDI 技術重建，將能克服傳統電子顯微鏡的像差與輻射損害問題。. 圖 1.3 PPM 架設示意圖 [8] 以單原子針為發射源的 PPM，在電子由針尖發出時，會經過電磁透鏡的加速，再照射於樣品。要注意的是這個透鏡是用來加速而非用來成像的，加速電子可以增加取樣比例(將於第二章詳述)。微通道板 (Microchannel plate, MCP)具有將訊號放大的功用。. PPM 目前正在改良，使其到達 CDI 的過取樣條件(將於第二章詳述)，並嘗試擴充其時間解析度的功能。此期間欲為 PPM 建立一套可靠的重建方法，先以電腦模擬測試 HIO 與 Ptycography 兩種相位取回演算法的 Matlab 程式，成功重建模擬的繞射。. 4.

(16) 1.1 研究動機本論文欲以實際繞射數據來測試兩種演算法的程式，以氦氖雷射作為發射源，因使用雷射源或電子源做同調繞射成像，原理皆相同。光學實驗的目的在於二次確認這兩套程式的可用性，並習得在操作實驗上一些數據處理方法。. 光學實驗有操作便利的優勢，除了光學儀器較容易操作與架設之外，實驗環境也不需在超高真空當中進行，發射源亦不用控制高壓、擔心燒壞針尖，直接轉開氦氖雷射的開關即可收取繞射圖。. 5.

(17) 第二章理論與文獻回顧 2.1 繞射理論與離散傅立葉轉換同調光源穿透樣品所形成的繞射圖樣，其波函數可由惠更斯-菲涅耳原理 (Huygens–Fresnel principle)計算而出：. 𝑈(𝑥2 , 𝑦2 ) =. 1 exp(𝑖𝑘𝑟10 + 𝑖𝑘𝑟21 ) ∬ 𝑇(𝑥1 , 𝑦1 ) 𝑑𝑥1 𝑑𝑦1 𝑖𝜆 𝑟10 𝑟21. (2.1). 在上式中， 𝑈(𝑥2 , 𝑦2 )為繞射平面上的波函數，λ為光源的輻射波長，氦氖雷射的波長𝜆𝐻𝑒𝑁𝑒 為 632.8 nm，若是使用電子源則輻射波長𝜆𝑒 為. 1.22 √𝐸. nm，E 為. 光束能量的電子伏特(eV)。T 為樣品穿透函數(transmission function)或稱為庫侖位能。. 圖 2.1 點光源、樣品平面與繞射平面的相對位置示意圖 [7]. 𝑟10 = √𝑥1 2 + 𝑦1 2 + 𝑧1 2，𝑟21 = √(𝑥2 − 𝑥1 )2 + (𝑦2 − 𝑦1 )2 + 𝑧2 2 ，如圖。點光源與樣品平面的距離為𝑧1 ，𝑥1 與𝑦1 代表該平面上的座標；樣品平面與繞射平 6.

(18) 面的距離為𝑧2 ，𝑥2 與𝑦2 代表該平面上的座標。在遠場繞射的情況下，𝑧2 遠大於 (𝑥2 − 𝑥1 )與(𝑦2 − 𝑦1 )，就可以將 𝑟21 做泰勒展開、取近似值：. 𝑟21. = √(𝑥2 − 𝑥1 )2 + (𝑦2 − 𝑦1 )2 + 𝑧2 2 ≈ 𝑧2 (1 +. 1 (𝑥2 − 𝑥1 )2 + (𝑦2 − 𝑦1 )2 ) (2.2) 2 𝑧2 2. 由 2.2 式，可將 2.1 式重新整理為：. 𝑈(𝑥2 , 𝑦2 ) =. 𝑖𝑘 exp(𝑖𝑘𝑧2 ) exp[2𝑧 (𝑥2 2 + 𝑦2 2 )] 2. 𝑖𝑧2 𝜆. ∬ 𝑇(𝑥1 , 𝑦1 ) × 𝑔(𝑥1 , 𝑦1 ). −𝑖𝑘 (𝑥 𝑥 + 𝑦1 𝑦2 )]𝑑𝑥1 𝑑𝑦1 𝑧2 1 2. × exp[. 上式具有傅立葉轉換的形式，其中𝑔(𝑥1 , 𝑦1 ) =. (2.3). [exp(𝑖𝑘𝑟10 )exp[. 𝑖𝑘 (𝑥 2 +𝑦1 2 )] 2𝑧2 1. 𝑟10. ，描. 述點發射源的特性，使用單原子針時此 g 函式尤為重要，而本論文的雷射可視為平行光發射源，此時 g 函式可以視為 1 來計算。. 𝑈(𝑥2 , 𝑦2 ) =. 𝑖𝑘 [exp(𝑖𝑘𝑧2 ) exp[ (𝑥 2 + 𝑦2 2 )] 2𝑧2 2 𝑖𝑧2 𝜆. × 𝐹𝑇{𝑇(𝑥1 , 𝑦1 ) × 𝑔(𝑥1 , 𝑦1 )}. (2.4). 由於成像在相機上，收取訊號是數位化的，應將傅立葉轉換改寫為離散傅 −𝑖𝑘. 立葉轉換，將 2.3 式中 ∬ 𝑇(𝑥1 , 𝑦1 ) × 𝑔(𝑥1 , 𝑦1 ) × exp[ 𝑧 (𝑥1 𝑥2 + 𝑦1 𝑦2 )]𝑑𝑥1 𝑑𝑦1 2. 轉換為：. 𝑀−1 𝑁−1. ∑ ∑ 𝑇(𝑛Δ𝑥1 , 𝑚Δ𝑦1 ) × 𝑔(𝑛Δ𝑥1 , 𝑚Δ𝑦1 ) × exp [ 𝑚=0 𝑛=0. 7. −𝑖2𝜋 𝑧2 𝜆. (𝑥2 ∙ 𝑛Δ𝑥1 + 𝑦2 ∙ 𝑚Δ𝑦1 )] 𝑑𝑥1 𝑑𝑦1 (2.5).

(19) 二維的離散傅立葉轉換函數為𝐹(𝑘𝑥 , 𝑘𝑦 )：. 𝑀−1 𝑁−1. 𝐹(𝑘𝑥 , 𝑘𝑦 ) = ∑ ∑ 𝑓(𝑛Δ𝑥1 , 𝑚Δ𝑦1 ) × exp[ 𝑚=0 𝑛=0. −𝑖2𝜋𝑘𝑦 −𝑖2𝜋𝑘𝑥 𝑛+ 𝑚)]∆𝑥∆𝑦 (2.6) 𝑁 𝑀. 將 2.5 式與 2.6 式比較，可以得出以下關係：. 𝑘𝑥 ∙ 𝑛 𝑥2 ∙ 𝑛∆𝑥1 𝑘𝑦 ∙ 𝑚 𝑦2 ∙ 𝑛∆𝑦1 = ， = ， 𝑁 𝑧2 𝜆 𝑀 𝑧2 𝜆 𝑧2 𝜆 𝑥2 𝑧2 𝜆 𝑦2 = = ∆𝑥2 ， = = ∆𝑦2 𝑁 ∙ ∆𝑥1 𝑘𝑥 𝑀 ∙ ∆𝑦1 𝑘𝑦. (2.7). 𝑧 𝜆. 2 故此，在遠場繞射的情況下，實空間一個像素大小∆𝑥1 = 𝑀∙∆𝑥 ，𝑀為一個 2. 維度有幾個像素，𝑀 = 𝑁， ∆𝑥2 為相機像素大小為，∆𝑥2 = ∆𝑦2，可以透過快速傅立葉轉換(Fast Fourier Transform, FFT)來計算 2.3 式，實驗得到的繞射強度可如下計算：. 𝐼(𝑥2 , 𝑦2 ) = |𝑈(𝑥2 , 𝑦2 )|2 = |. 2 1 × 𝐹𝑇{𝑇(𝑥1 , 𝑦1 ) × 𝑔(𝑥1 , 𝑦1 )}| 𝑧2 𝜆. 8. (2.8).

(20) 2.2 CDI 的使用條件 2.2.1 過取樣條件. 圖 2.2 繞射取樣與同調性示意圖 [7] (a)一個亮紋範圍內至少要有兩個以上的像素，故像素大小 Δs 應小於 Lλ/2W。(b)紅線 XT 與 YT 的差 Δ，為任兩道光線的最大路徑差，該路徑差應小於同調長度 Lc。. 若一個繞射圖中，最精細的楊式干涉條紋間距為 Lλ/W，如圖 2.2 (a)。λ 是同調光束的波長，L 是樣品到偵測屏幕的距離。根據 Nyquist-Shannon 取樣定. 9.

(21) 理，每個強度週期(period of the intensity)內需要兩個取樣，因此∆s ≤ Lλ/2W，∆s 是偵測器上每個像素的實際長度。在實驗中∆s 是固定的，我們通常不會讓 L 太遠以避免雜訊、解析度差等問題。L 的限制，使得 W 也受到限制，樣品的寬度或樣品被照明的光束寬度必須符合這個條件：W < Lλ/2∆s [9]。. Miao 證明了樣品視野大小跟取樣的關係。依據 Nyquist 取樣定理，被取樣訊號的最高頻率或帶寬之內要有超過兩個取樣，才可以重現原本的訊號。實空間的資訊分為樣品區域以及無密度區域(no density region)，如圖 2.3。因為樣品與繞射平面互為倒數關係，無密度區域越大，取樣越精細。而無密度區域若超過樣品區域，即滿足 Nyquist 取樣定理的條件，理論上便足以重建相位 [10]。. 圖 2.3 CDI 繞射圖樣與重建無密度區域的示意圖 [7]. 雖然以上理論表明，要收取某繞射影像，一個最精細亮紋或週期內，至少要有兩個以上的像素，但若僅只略大於兩個像素，將如下一頁的圖 2.4 一樣失準，能夠取樣越多，所呈現影像更接近原貌。取樣比例的計算方式為整個視野的大小除以樣品的大小，所以樣品佔全視野內越小比例，取樣比例是越高的。. 10.

(22) 圖 2.4 取樣比例接近 2 時，訊息重現的示意圖. 2.2.2 光源同調性同調性(Coherence)分為時間與空間的同調性。時間同調性指的是發射源光波傳遞一段時間後，相位的一致性。反映時間同調性的物理量為時間同調長度 (temporal coherence length)，以 Lc 表示。如下一頁的圖 2.5，紅色波是綠色波經過 τ 時間後的波形。若 τ 為無限長的時間，兩者如 (a)重疊、相位一致，則該波具有完美時間同調性；而若 τ 為某有限時間，紅色波相位已如圖(b)，有明顯偏離綠色波，不再彼此重疊，則τ 即為同調時間(coherence time)，以 𝜏𝐶 表示。在 𝜏𝐶 內，波傳遞的距離即為 Lc。時間同調性越好，以可見光來說，代表單色性越好，實驗所使用的雷射約 Lc 為 30 cm。. 11.

(23) (a). (b). 圖 2.5 時間同調性示意圖紅波為綠波經過 τ 時間的波形，(a)兩波無相位偏移，(b)兩波有相位偏移。. 發射源的 Lc = 2λE/δE，E 是發射源光束的能量，δE 是光束能量分布(beam energy spread)。如圖 2.2 (b)，Lc 應大於等於任意一對干涉光束的最大路徑差Δ = (XT-YT)。Δ約等於 Wθmax，因此 2E/δE > Wθmax/λ。如果最精細的空間頻率是 dmin= λ/θmax，則 W/dmin= 2E/δE。如果影像中像素的數量 N(linear number)跟繞射圖樣相等，意即 W/dmin= N = 2E/δE，重建的過程將會丟失資訊。因此，像素的數量被光束的能量分布所限制 [9]。. 空間同調性則指發射源同一時間，在空間中相位的一致性。反映空間同調性的物理量為橫向同調寬度(transverse coherence width)，以 Xc 表示。如圖 2.6，一個波源經過與其等距的雙狹縫後，在屏幕上形成繞射紋。之所以選擇等距是為了確保 S1 與 S2 處同時產生波擾。空間同調性越佳，經過雙狹縫所形成的亮、暗紋深淺越明顯。空間同調性可用可見度(visibility)作為指標： 𝑉 ≡ (𝐼𝑚𝑎𝑥 − 𝐼𝑚𝑖𝑛 )/(𝐼𝑚𝑎𝑥 + 𝐼𝑚𝑖𝑛 )，具有高可見度繞射區域的寬度即為 Xc。. 12.

(24) 圖 2.6 雙狹縫干涉儀示意圖. 若侷限樣品的寬度為 W，或是延伸樣品被直徑為 W 的同調光束照到。樣品被照射的寬度 W 經傅立葉轉換後的自相關函數(autocorrelation function)為 2W [50]。Van Cittert–Zernike 定理給出 Xc 在樣品處約為 λ/θc，λ是發射源波長， θc 是從樣品中心點延伸到發射源邊界的張角，如圖 2.6。由此可知，空間同調性隨發射光束縮小而變小，本實驗室的單原子針發射源，光束小，同調性良好，如圖 2.7。根據 Spence 等人的論文，在樣品處的 Xc 應該要大於 2W。欲進行做同調繞射成像實驗，該 Xc 是對光源同調性的基本要求 [9]。. (b). (a). 圖 2.7 單原子針發射源的能見度 (a)單原子針照射單層奈米碳管樣品之繞射紋， (a)中藍線剖面的強度 profile 為(b)，能見度為 0.78。[12]. 13.

(25) 2.3 相位取回演算法現存多種將繞射圖相位取回的演算法，其原理如圖 2.8，首先，輸入初始的光場(initial light field)，必須粗略的估計一個複數方程，再用迭代的迴圈，每次迭代輸入上個迴圈新產生的光場，慢慢修正光場，越來越接近原始影像。. 圖 2.8 相位取回演算法原理圖 [13]. 迴圈的運算會不斷的持續，過程中滿足一到多種的限制(constraint)。讓傅立葉空間的輸出符合繞射圖樣的振幅資訊，就是其中一種限制，稱為傅立葉限制(Fourier constraint)。除了傅立葉限制，也有實空間的限制如有限遮罩(finite support)與正向限制(positive constraint)；測量繞射時的一些參數也可以是限制，例如收取多重繞射時的移動間距。在輸出結果與傅立葉限制的誤差小於某個數值後，我們會定義其收斂，這是我們確定是否成功重建影像的其中一個指標。. 2.3.1 Fienup 演算法第一個被普遍接受的演算法，在 1971 年由 Gerchberg 與 Saxton 提出，主要被用來重建非週期性樣品 [14]。而後 Fienup 奠基於 Gerchberg-Saxton 演算法之上，發展出兩種演算法：Error-Reduction (ER) 迭代演算法，以及 Hybrid InputOutput (HIO) 迭代演算法 [15,16]，被廣泛應用於同調繞射成像術，可視為 CDI 重要的里程碑。. 14.

(26) Fienup 使用有限遮罩(finite support)與正向限制(positive constraint)作為實空間的限制。有限遮罩的大小就是粗估的樣品大小；正向限制則指實空間的每一點都不可小於零。ER 與 HIO 迭代演算法的步驟如下：. (i). 將繞射的振幅√𝐼(𝑘)，乘上一個隨機相位𝜙𝑟𝑎𝑛𝑑𝑜𝑚 ，輸入初始Ψ′ (𝑘)。. (ii). Ψ′ (𝑘)經過反傅立葉轉換到實空間，是為Ψ ′ (𝑟)。. (iii). 將Ψ′ (𝑟)作 2.9 式中的運算，S 為有限遮罩的範圍，前一個迭代中Ψ′ (𝑟)位於有效遮罩內、又實數部分為正數的值，被保留下來；非前述者，則被扣掉 β 倍的Ψ′ (𝑟)，得到Ψ(𝑟)。. (iv). Ψ(𝑟)經過傅立葉轉換回到傅立葉空間，是為Ψ𝑛 (𝑘)，依據 2.10 式將其相位保留，乘上(i)中的原始振幅，成為新的Ψ′ (𝑘)。. (v). 重複(ii)-(iv)步驟，直到經過(iii)步驟的Ψ(𝑟)的振幅與原始繞射振幅√𝐼(𝑘)之誤差小於所選定的數值，定義為收斂。. , 𝑖𝑓 𝑟 ∈ 𝑆 𝑎𝑛𝑑 𝑟𝑒𝑎𝑙[𝛹 ′ 𝑛−1 (𝑟)] ≥ 0 𝛹 ′ 𝑛−1 (r) (𝑟) 𝛹𝑛 ={ 𝛹𝑛−1 (𝑟) − 𝛽𝛹 ′ 𝑛−1 (r) , 𝑜𝑡ℎ𝑒𝑟𝑤𝑖𝑠𝑒 𝛹 ′ 𝑛 (𝑘) = √𝐼(𝑘) ×. 𝛹𝑛 (𝑘) |𝛹𝑛 (𝑘)|. (2.9). (2.10). 𝑊ℎ𝑒𝑟𝑒 𝑛 𝑟𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑡 𝑡ℎ𝑒 𝑛𝑡ℎ 𝑖𝑡𝑒𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛𝑠. ER 與 HIO 演算法的差別在於，較早被提出來的 ER 迭代演算法，β 等於 1，這個方法的收斂速度在前幾個迭代很快，但是在之後的迭代就會變得相當緩. 慢，重建效果有限。HIO 迭代演算法，β 為接近 1 的常數，本章選用 0.9。如此一來，一旦某個輸出的Ψ ′ (𝑟)遮罩範圍內的值為負數，不會直接被減為零，經過幾個迭代，Ψ(𝑟)會變得越來越大，使得輸出不再為負，這可以減少迭代停滯在區域最小值的現象，因此重建效果優於 ER。現今最常被運用於 CDI 實驗中的 Fienup 演算法，主要以 HIO 為基礎進行改良，適合重建多維且侷限視野樣品 [15,16]。 15.

(27) (2.10). (2.9). 圖 2.9 Fienup 演算法的迭代流程圖. 2.3.2 Ptychography 演算法然而，ER 與 HIO 演算法因為使用有限遮罩做為限制，成像的視野會被侷限，除此之外，如果樣品結構過於簡單或對稱，可能會得到非唯一解，影響重建影像的可信度。. Ptychography 原先是 Walter Hoppe [17-19]為了解 X 光與電子晶體學的相位問題所構想出來的方法。為了解決非唯一解與視野侷限的問題，Rodenburg 與 Faulkne 提出了解 CDI 相位的新方法 [20, 21]，他們將 ptychography[19]與傳統的相位取回迭代演算法結合，克服了非唯一解的限制，也可以增加視野，此法稱為 ptychography iterative engine (PIE)。. 16.

(28) PIE 藉由移動樣品與入射光波的相對位置來得到多個繞射影像。跟 HIO 相比，除了傅立葉限制、遮罩限制，還多了重疊區域與移動距離的資訊所帶來的限制，讓取得唯一解更容易、收斂更快速，因此 PIE 比 HIO 演算法的運算次數少三個數量級，並且可以看延伸視野的樣品。雖然 PIE 比起 HIO 有諸多優點，但所需使用的數據量大，收取與處理的程序較為繁複，所以 HIO 仍在本篇中討論。PIE 演算法迭代的步驟如下：. (i). 猜測初始位置的樣品(object)形貌函數𝑂(𝑟)，並依據發射源特性估計探測光源(probe)函數𝑃(𝑟) ，相乘輸入初始Ψ𝑗 (𝑟)。. (ii). Ψ𝑗 (𝑟)經過傅立葉轉換回到傅立葉空間，是為Ψ𝑗 (𝑘)，依據 2.10 式將其相位保留，乘上 (i) 中的原始振幅，得到Ψ′𝑗 (𝑘)。. (iii). Ψ′𝑗 (𝑘)經過反傅立葉轉換到實空間，是為Ψ ′𝑗 (𝑟)。. (iv). 由初始位置移動到下一個座標𝑹𝑠(𝑗) ，如圖 2.11，直到每一個位置都經歷 (i)-(iii)的步驟。. (v). 將每個位置的Ψ ′𝑗 (𝑟)代入 2.11 與 2.12 式的運算估計下一個迭代的𝑂(𝑟)與. 𝑃(𝑟)，相乘為下一個光場波函數Ψ′𝑗+1 (𝑟)的預估值。 (vi). 重複(ii)-(v)步驟，直到經過(ii)步驟的Ψ(𝑟)的振幅與原始繞射振幅√𝐼(𝑘)之誤差小於所選定的數值，定義為收斂。. 17.

(29) (2.11) (2.12) (2.10). 圖 2.10 PIE 演算法單一位置的迭代流程圖. 圖 2.11 PIE 演算法移動位置示意圖 18.

(30) 𝑂𝑗+1 (𝒓) = 𝑂𝑗 (𝒓) + 𝛼. 𝑃𝑗+1 (𝒓) = 𝑃𝑗 (𝒓) + 𝛽. 𝑃𝑗∗ (𝒓−𝑹𝑠(𝑗) ) 2. |𝑃𝑗 (𝒓 − 𝑹𝑠(𝑗) )|𝑚𝑎𝑥 𝑂𝑗∗ (𝒓 + 𝑹𝑠(𝑗) ) 2. |𝑂𝑗 (𝒓 + 𝑹𝑠(𝑗) )|𝑚𝑎𝑥. (𝜓′ 𝑗 (𝒓) − 𝜓𝑗 (𝒓)). (2.11). (𝜓′ 𝑗 (𝒓) − 𝜓𝑗 (𝒓)). (2.12). 𝑊ℎ𝑒𝑟𝑒 𝑗 𝑟𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑡 𝑡ℎ𝑒 𝑗𝑡ℎ 𝑖𝑡𝑒𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛𝑠. 𝑅𝑠(𝑗) 為移動到的位置座標，α與β控制著迭代回饋的數值，該數值介於0.5 到1之間，本篇同樣選定為0.9。. 𝑃𝑗∗ (𝒓−𝑹𝑠(𝑗) ) |𝑃𝑗 (𝒓−𝑹𝑠(𝑗) )|. 具有權重的效果，訊號強者會被. 𝑚𝑎𝑥. 放大。有趣的是，當α為1，上式回復成類似Fienup演算法的形式，𝑃𝑗 (𝒓 − 𝑹𝑠(𝑗) ) 的作用相當於有限遮罩，可以看出兩種演算法微妙的相似之處。. PIE 的種類繁多，本篇使用延伸 PIE (extended PIE, ePIE)，它與傳統 PIE 與差別僅在於，後者在進入下一個迭代時，僅使用 2.11 式來修正𝑂(𝑟)，𝑃(𝑟)維持不變；而前者使用 2.11 式與 2.12 式來修正 O(𝑟)與 P(𝑟)。由此可見，傳統 PIE 必須輸入較精確的光源資訊，而 ePIE 具有解探測光源函數的效果，不必事先知道精確的光源資訊。. PIE演算法須輸入兩個以上的繞射圖，繞射圖間會重疊，本實驗運用的重疊比例的定義方式是 [35]：. 𝑂𝑣𝑒𝑟𝑙𝑎𝑝 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 = 1 −. 𝑎 𝑑. (2.13). 𝑎為移動的距離，𝑑為探測光源的直徑。. 19.

(31) 2.4 CDI 實驗第一個成功演示 CDI 的實驗是以 X 光為發射源，在 1999 年由 Miao 等人完成 [22]，使用 HIO 演算法重建影像。而後有許多觀測原子等級樣品的電子源 CDI 實驗，成功重建影像[23-31]。本論文以可見光雷射 CDI 為題，HIO 重建影像參考 Spence 等人的工作[32]，以下為其實驗架設以及重建 HIO 的效果。. 圖 2.12 參考文獻中的可見光 CDI-HIO 實驗[32] (a)實驗架設，(b)光學顯微鏡下的樣品，(c)樣品繞射圖樣，(d)HIO 重建影像。. 近年來有許多以 PIE 重建的可見光雷射實驗[13, 33-35]。其中 Bunk 等人的研究指出，當所移動的位置影像重疊的面積越大，能夠將樣品結構解重建越精細，然而越高的重疊影像意味著視野較小或所取的數據量必須增加，大量的數據處理仰賴功能強大的電腦。在增進重建品質與節制數據取量的平衡下，擁有 50-70%重疊比例的移動位置，具有最佳的重建效率[13,35]。 20.

(32) 圖 2.13 參考文獻中的可見光 CDI-PIE 實驗 [35]，本圖顯示重疊比例與重建結果的關係，圖(a)為重疊比例是 0%的重建結果，可以看出每一塊是獨立的，每次增加 10%的重疊比例，(b) 10%、(c) 20%、(d) 30%直到(k) 100%，每個圖上的白色比例尺皆為 0.5 mm，並以(k)圖中振幅與相位的帶狀比例尺為準。(l) 為 OM 下的樣品的形貌，這是一個蜜蜂翅膀的樣品。. 21.

(33) 第三章實驗儀器、步驟與細節 3.1 實驗儀器架設與規格同調光學繞射成像架設主要可分為三項，發射源、樣品、偵測器。實驗的流程分為兩部分，先從事拍攝一般的 CDI；在熟悉光學元件與基本操作後，移動樣品，拍攝掃描式的 CDI。實驗的照片如圖 3.1 (a)，進行實驗時，光圈到相機都被關在黑箱，避免其他光源影像數據。第一部分的實驗設置如圖 3.1 (b)。. (a). Laser. M2. ND. (a). CMOS. I S. M1 (a) (b). 圖 3.1 一般 CDI 實驗架設圖與照片記錄 22.

(34) 光源經過兩個平面鏡的反射，再經過衰減片與光圈調整亮度和形狀後，入射於樣品上，樣品繞射影像投影於後方的相機感光元件，收取影像。我們使用 Thorlabs 公司所出型號為 HNL100LB 的氦氖雷射作為光源，其輸出的波長為 632.8 nm，TEM00 的 1/e2 光束直徑為 0.68 mm，張角為 1.2 mrad。圖 3.2 (b)為光束通過光圈後，實際量測、擬合出的 profile。1/e2 光束直徑約為 0.54 mm，以此張角，光束達到樣品的位置時，1/e2 光束直徑擴張到超過 1 mm，所以我們稍後會在樣品上貼針孔來增加過取樣比例。. (a). (b). 圖 3.2 光圈後光斑影像與 profile. 我們使用 Nikon D600 相機，其 CMOS 感光元件大小為 35.9 mm × 24 mm 以及 6016 × 4016 像素，每個像素大小為 5.95 μm，ISO 感光度動態範圍 (Dynamic-Range)為 50-25600，原始影像格式為 14 bit RGB 的 RAW 檔。經由程式轉為 16 bit 的 TIFF 檔 [36]，再進行數據處理與影像重建。相機機身上的鏡頭接環到 CMOS 感光元件的距離稱為法蘭距，D600 相機的法蘭距為 46.5 mm。. 23.

(35) 第二部分的實驗設置如下:. (a). (b). 圖 3.3 掃描式 CDI 實驗架設圖與藍眼視角的照片. 與圖 3.1 的差別僅在於，將一直徑 100 μm 的針孔架設於光圈後，並將樣品固定於 X-Y 軸移動平台，以利拍攝多重且重疊區域相等的繞射影像，移動平台的最精細刻度為 10 μm。針孔與樣品間距為z1 、樣品與 CMOS 間距為z2 。共照射 25 個區域，重疊大小的定義方式如 2.13 式，本文選用 50 μm 作為移動距離。. 24.

(36) 圖 3.4. 5 × 5 個收取繞射圖的位置. 收取繞射圖後，以 Matlab 軟體做數據處理，以 HIO 演算法為一般 CDI 重建影像，以 PIE 演算法為掃瞄式 CDI 重建影像。此兩種相位取回演算法的程式，由本實驗室黃文勤碩士提供，並透過電腦模擬測試，成功重建相位。. 25.

(37) 3.2 實驗步驟與數據處理本節依實驗步驟逐一詳細說明，可作為光學 CDI 實驗之參考指南：. 3.2.1 光路架設 A.校準光路在欲放置樣品與相機的區域前後鎖上兩高度相同的光圈，並製作簡易指高器。將光圈半開，確認光路通過兩個光圈後，將前光圈 I1 關小，調整前平面鏡 M1，使光路瞄準、穿過 I1 中心；再打開 I1，關小後光圈 I2，調整後平面鏡 M2，使光路瞄準、穿過後光圈中心。此步驟來回操作數次，即可讓光路通過兩個關閉狀態的光圈，此時光路是校直的。校直的光路上，再依指高器調整針孔、樣品、相機等高度，逐一擺設於光路上。. I1. I2. 關閉狀態的光圈指高器. 3.5 圖校準光路示意圖 [37]，使用 M1 來調整光瞄準穿過 I1，使用 M2 來調整光瞄準穿過 I2。I1 與 I2 具有相同的高度，以圖最右邊的指高器作為高度標準，對齊每一個元件。簡易指高器可由六角板手、墊片、螺絲與基座組裝而成。. 26.

(38) B.確認遠場在演算法的過程中，使用傅立葉轉換。必須確認感光元件位置為實驗系統的遠場(2.2、2.3 式)，依據 2.7 式，遠場時. 𝑧2 𝜆 𝑁∙∆𝑥1. 𝑥. = 𝑘2 ，可寫為 𝑥. 𝑧2 𝑥2. =. 𝑁∙∆𝑥1 𝑘𝑥 𝜆. =. 定值，𝑧2 為樣品到感光元件的距離，𝑥2 為繞射平面上的繞射大小，可選擇明顯的形狀或間距作為標準。成正比時若𝑧2 與𝑥2 成正比時，繞射在𝑧2 時即具有遠場特性。我們使用具有週期性結構的 TEM grid 作為樣品來測試遠場。圖 3.6 為樣品在 OM 下的影像。圖 3.7 為雷射照在樣品所形成的繞射。我們將樣品固定，感光元件分別移動到距離樣品 5cm、10cm、20cm 來拍攝繞射，選擇中心亮點與其最鄰近的左側亮點的距離作為𝑥2 ，𝑧2 與𝑥2 成正比，𝑧2 為 5cm 處即為遠場。. (b). (a). 60𝛍𝐦. 120𝛍𝐦. 圖 3.6 TEM grid 在 OM 下的影像黃色區域是邊長為 500 μm 的正方形窗，正方形窗是透光的部分，其上有規律的孔洞、英文字母與羅馬數字，(b)為(a)的兩倍放大圖。. 27.

(39) (a). (b). (c). 圖 3.7 不同距離拍攝 TEM grid 樣品繞射影像分別取𝑧2 為 5 cm (a)、10 cm (b)、20 cm (c)，中心亮點到最鄰近左側亮點的距離分別為 1068、2124 與 4269 個像素。與𝑧2 成比例，表示 5 cm 即為遠場。. 28.

(40) 3.2.2 檢驗過曝[36] 每個像素能夠記錄光強度的範圍稱為動態範圍，當光強度超過這個動態範圍時，相機就無法記錄該訊息，我們實驗上將這種情況稱為過曝。我們用改變快門與增加中性衰減片的方式來調整光強度，避免過曝。每個感光的像素因加工上的實況，動態範圍可能略高或略低，所以我們不會讓光強度很靠近動態範圍的頂點，而是選擇頂點值 60-70%倍的光強度。取得數據後，我們第一步需要檢驗每個像素是否有過曝的現象，以免繞射的訊息失真，拍照的原始檔案為 Nikon 公司發明的 NEF 檔，Matlab 無法讀取。我們經過幾個數據處理的程序得到可以輸入 Matlab 運算的繞射光訊息。. A.線性化為了節省儲存空間，相機非線性的壓縮像素的資訊，並將壓縮的函數紀錄於檔案中。我們使用 Adobe 所出的 DNG 傳換器，先將 NEF 檔轉為 DNG 檔，如此以來，便可在 Matlab 中讀取原始檔的資訊。DNG 檔案中的結構 meta_info.SubIFDs{1}收錄了壓縮函數，藉此可將被壓縮的原始檔線性化 (Linearization)。屆時即可找出陣列中的最大值，檢查過曝。. B.白平衡光源、樣品與相機決定了影像的色溫，肉眼無法判定數據顏色是否正確，需要找一個數值的參考點。白光中 RGB 三種色彩的強度是相同的，可以做為參考點，找出陣列上白色，將其 RGB 調到相同數值，會得到一個比例尺，應用在整個矩陣，就能校正數據的色溫，此過程稱為白平衡(white balance)。DNG 檔案中的陣列 meta_info.AsShotNeutral 已收錄了 RGB 光的顯色比例，舉例來說，若顯色比例為(0.52,1,0.71)，在白平衡校正所需的比例為(1.91,1,1.39)。. 29.

(41) C.去馬賽克 CMOS 感測器收取純量數值(scalar value)，但彩色相機為了顯示 RGB 色彩，會將拜爾濾色鏡(Bayer filter)附著在感測器，人眼對綠光較敏銳，所以濾色鏡每四格當中使用兩綠一紅一藍的陣列，該濾色陣列依排列情況分為 RGGB、 BGGR、GRBG、GBRG，如圖 3.8 (a)，Nikon D600 的濾色陣列是 RGGB。. 3.8 圖拜爾濾色鏡與濾色示意圖 (a)拜爾濾色鏡的種類，(b)光通過不同濾色鏡所造成的結果。[38]. 各種光訊息皆可以用 R、G、B 三個維度紀錄，但光訊號通過濾色鏡會被馬賽克化(mosaicing)，感測器上 1/2 的像素僅紀錄 G 維度的訊息，各 1/4 的像素僅記錄 R 與 B 維度的訊息，如圖 3.8 (b)。若要將原始光訊息呈現出來，需要把原為一個矩陣的原始數據分成三個矩陣，沒有數值的地方內插，再計算三者的平均作為光訊息。這個過程稱為去馬賽克化(demosaicing)，我們使用 Matlab 內建的去馬賽克函式得到繞射的光訊息，用以重建。. 3.2.3 去除髒點繞射影像上，會出現與周邊不連續的圓形或橢圓形光斑，是因為光學元件表面的髒污產生繞射。實驗上移除的方式，是移動檢查 CMOS 之前的平面鏡、 30.

(42) 衰減片、樣品等容易附著灰塵粒子的元件表面，看光斑是否隨之移動，確認哪一個元件造成光斑後，小心擦拭。實驗無法排除的光斑，則在進行演算時，同步輸入光斑位置的函式。同樣的方式可以處理部分像素光線過曝或故障的問題，去除實驗限制所造成的髒點，增進重建的正確性。圖 3.9 以一張針孔繞射的影像為例，擷取近中心處的局部放大，(b)中的髒點輸入演算法運算時用(c)中的函數擋掉。. (c). 圖 3.9 去除髒點示意圖 (a) 針孔繞射，(b)紅框處局部放大的髒點與(c)數據處理擋住髒點。. 為了確定這個擋掉髒點的方法是可行的。我們將擋掉髒點與沒有擋掉髒點的繞射用同樣的初始相位，分別在 HIO 與 PIE 中進行重建、比較。如圖 3.10 與 3.11，在誤差與對比強度上，擋掉髒點的繞射略優於沒有擋掉髒點的繞射，或者至少透過這個測試，我們得知擋掉這些點，並不會導致重建效果變差的情形。. 31.

(43) 圖 3.10 HIO 去除髒點之前後比較使用同樣次數的 HIO 與 ER 演算法，並輸入相同的初始相位，我們可以得到誤差較小的影像。(a)未運用髒點函式的針孔重建，(b)運用髒點函式的針孔重建。. 圖 3.11 PIE 去除髒點之前後比較使用同樣次數的 PIE 演算法，並輸入相同的初始相位，我們可以得到對比更強的影像。(a)未運用髒點函式的棉花葉重建，(b)運用髒點函式的棉花葉重建。. 32.

(44) 3.2.4 疊合影像、扣除背景我們收取兩種曝光時間的影像，如圖 3.12，一種是未過曝影像(a)、一種是 100 倍時間拍攝的過曝影像(b)，利用曝光時間的比例 1:100 疊合，即 100 × (a) + (b) = (c)，由圖 3.12 (c)的局部放大可看到中心周邊繞射訊號的增強。另外，我們也發現，將多張相同時間未過曝的影像加總平均，可增加動態範圍，如圖 3.13。最後我們將影像扣除相同時間下拍攝的背景值，排除背景光的影響。. 圖 3.12 不同曝光時間平均前後之影像 (a) 1/100 秒曝光影像 profile (b) 1 秒曝光影像 profile (c)疊合影像 profile. 圖 3.13 相同曝光時間平均前後之影像 (a) 單張 1/100 秒曝光針孔繞射 (b) 疊合十張 1/100 秒曝光針孔繞射 33.

(45) 3.2.5 裁切成方形、計算解析度重建影像的解析度是由繞射圖的視野決定，根據 2.7 式，在x、y軸方向的視野分別是 N∆x2 和 M∆y2，∆x2和∆y2是相機像素的大小，Nikon D600相機的像素大小為5.95 μm × 5.95 μm。為使x、y軸擁有相同的空間解析度，我們找出繞射圖中心、將繞射圖截成方形陣列。. 圖 3.14 依繞射圖中心裁切成方形陣列運用 2.7 式推算重建影像理論上可達到的解析度，若樣品離感光元件71.1 mm，並裁切成3799 × 3799的像素，其解析度如下計算：. ∆𝑥1 = ∆𝑦1 =. 𝜆 ∙ 𝑧2 0.6328𝜇m ∙ 7.11 × 104 𝜇m = = 1.99𝜇m ∆𝑥2 ∙ 𝑁 5.95𝜇m ∙ 3799. 34. (3.1).

(46) 3.3 影像重建的模擬與實驗選擇本節呈現電腦模擬的重建結果，並說明在實際應用 HIO 與 PIE 演算法時，我們所選用的參數、初始條件與搭配方法。兩種演算法的程式皆由黃文勤碩士提供。. 3.3.1 誤差計算我們根據傅立葉限制定義以下兩式來計算誤差 [11]，選定當誤差 Err 小於 0.32 時為收斂。𝛹𝑛 (𝑘)是將我們的重建影像作傅立葉轉換而得到的繞射振幅，𝐼 是實驗得到的繞射強度。. 𝑠𝑢𝑚((|𝛹𝑛 (𝑘)| − √𝐼)2 ) 𝐸𝑟𝑟 = 𝑠𝑢𝑚(𝐼). (3.2) . 2. 𝑠𝑢𝑚 ((|𝛹𝑛,𝑗 (𝑘)| − √𝐼) ) 1 𝐸𝑟𝑟 = ∑ 𝐽 𝑠𝑢𝑚(𝐼) 𝑗. (3.3). 3.3.2 一般 CDI 的重建 A. 選擇有限遮罩的大小選擇有限遮罩必須先粗估樣品的範圍。Fienup 演算法因為非唯一解的問題可能偏離中心、方向顛倒，而且每次迭代會扣除有限遮罩外的資訊，所以遮罩範圍不能恰好等於樣品大小，免得扣除掉有意義的資訊；有限遮罩也不能選得太大，否則無法達到取樣條件，或因取樣少導致運算難以收斂。當我們不知道樣品的大小，可以將它的繞射紋作反傅立葉轉換到實空間，找出無密度區域與有密度區域。. 假設樣品寬度或被照射到的寬度為 W，密度區域的邊長應為 2W，可作為有限遮罩的邊長 [50]。但是因為光學實驗的樣品都可以在 OM 下觀察得知大 35.

(47) 小，所以我們實驗上會在 2W 與 W 之間選擇一個值，兼顧遮罩應略為寬鬆的需求與取樣條件。. B. HIO 與 ER 演算法搭配使用因為 HIO 的重建能力較 ER 強，而 ER 具有迅速將非正向與有限遮罩以外的值扣為零的特性，能夠讓畫面更乾淨清晰，也會讓誤差驟減。所以我們實驗上選擇先以 HIO 迭代上千甚至上萬次，確保重建的計算足夠，再搭配數百次的 ER 迭代，以期獲得重建形貌完整、清晰、誤差小的影像。圖 3.14 呈現經過 1000 次 HIO 的運算後，輸入 ER 迭代 100 次的前後比較。可以明顯觀察到遮罩外的斑紋消失了，遮罩內的影像也有更清晰的趨勢。圖 3.15 呈現上述模擬條件的收斂情形，可以看到誤差一輸入 ER 演算法時就驟降。. (b). (a). 圖3.15 HIO重建影像輸入ER演算法之前與之後. 36.

(48) 圖 3.16 重建影像輸入 ER 演算法之前與之後的收斂情形。使用 1000 次 HIO 與 100 次 ER 解 Lena 影像，HIO 在前幾次迅速降到 0.4 附近後，緩慢且穩定的下降，紅色箭頭處的驟降是第一次 ER 後，誤差約由 0.34 變為 0.022。. 3.3.3 掃描式 CDI 的重建 A. 選擇探測光源如圖 3.3，我們讓光通過針孔後，照射在樣品上，所以輸入 PIE 的探測光源函數 𝑃(𝑟)應為針孔傳播到樣品上的繞射紋，依據 3.1 式可以知道直徑 100 微米針孔佔幾個像素，由 2.1 式可運算光通過針孔傳播𝑧1 距離到樣品上的繞射，將此陣列設為初始的𝑃(𝑟)，如圖 3.17 (a)。圖 3.16 所呈現的是針孔探測光源照射於樣品上所能看見的視野，(a)為探測光源，(b)為樣品，(c)為探測光源照在樣品其中一個位置時的影像。(d)圖呈現 PIE 可重建的區域，因為針孔繞射漣漪狀的，這樣的探測光源沒有一個明顯的邊界，所以我們以強度為中心最亮處的 0.1 倍為準，0.1 倍以上算探測光源，0.1 倍以下不算，每一個照射位置的範圍加起來，可以看出掃描完每個位置後，PIE 所能重建的視野，如圖 3.17 (d)。. 37.

(49) 圖3.17 模擬探測光源與樣品。(a)依據實驗參數設定的探測光源，為雷射光通過針孔的繞射𝑧1 距離的繞射，(b)Lena樣品，(c)在其中一個探測位置，探測光源照射在樣品上的情況，(d)樣品經過25個位置，總共被照射的範圍。以(a)中心最大值的0.1倍為準，0.1倍以上算照射區域，反之不算。數據由黃文勤碩士提供。. B. 選擇樣品形貌函數樣品形貌函數 O(𝑟)可以設為每個像素為 1 的陣列、隨機變數陣列，若知道樣品資訊也可以設為類似遮罩的陣列。我們在實驗中使用 1 陣列。. 將𝑃(𝑟)與 O(𝑟)相乘得到初始 𝛹(𝑟)，與樣品繞射一同輸入 PIE 演算法。圖 3.17 是模擬 PIE 經過 100 次迭代後，解探測光源與解樣品的情形，圖中除了呈現錄兩者的強度(a)、(b)，還呈現了兩者的振幅(c)、(d)。 38.

(50) 圖3.18 模擬PIE演算法迭代100次重建結果。(a)探測光源函數𝑃(𝑟)的振幅，(b)樣品函數𝑂(𝑟)的振幅，(c)𝑃(𝑟)的相位，(d) 𝑂(𝑟)的相位。數據由黃文勤碩士提供。. 39.

(51) 第四章影像重建結果與討論 4.1 一般 CDI 4.1.1 針孔樣品選用直徑 100 μm 的針孔樣品，圖 4.1(a)、(b)為其 1/100 秒和 1 秒之曝光時間的繞射圖，(c)、(d)為前述兩者對數尺度(logarithmic scale)下的繞射圖。. (a). (b). (c). (d). 圖 4.1 100 μm 針孔繞射圖，(a) 曝光 1/100 秒之繞射，(b) 曝光 1 秒之繞射，(c) 對數尺度下曝光 1/100 秒之繞射，(d) 對數尺度下曝光 1/100 秒之繞射。. 圖 4.1 的實驗參數為𝑧2 = 71.1𝑚𝑚，裁切成 3799 × 3799 的方形矩陣，理論解析度約為 1.99 μm。配合適度的遮罩輸入演算法，使用 10 萬次 HIO 與 100 次 ER 的迭代來重建，可得到圖 4.2 的重建結果。圖 4.2 (a) 為雷射光照射區域在 OM 下放大圖。圖 4.2 (b) 則為針孔 HIO 重建圖，橫軸、縱軸數值單位是像素的個數，整個矩陣有 3799 × 3799 的大小，該圖僅呈現樣品區域。 40.

(52) 圖 4.2 100 μm 針孔 OM 影像與重建圖的比較 (a) 雷射光照射區域在 OM 下放大圖。(b) 針孔 HIO 重建圖。. 我們使用四個方法確認重建出的影像就是樣品，其一是運用 3.1 式來計算樣品寬度在繞射平面佔幾個像素，可見圖 4.2，理論解析度 1.99 μm 的情況下， 100 μm 對應的就是約 50 個像素。圖 4.2 (b)中的物體高度接近 50 個像素，寬度亦有 40 多個像素。. 其二是將矩陣中物體以外的區域(無密度區域)的數值設為零，將新的矩陣做傅立葉轉換與原繞射比較，圖 4.3 即兩者比較圖，圖(c)、(d)為(a)、(b)在對數尺度下的圖形。由圖 4.3 可看出，重建物體的形貌的確來自原始的繞射訊息。. 41.

(53) 圖 4.3 100 μm 針孔繞射與重建圖繞射的比較 (a) 針孔繞射，(b)針孔重建的繞射圖。(c)、(d)為(a)、(b)在對數尺度下的圖形。. 其三是以 3.2 式計算誤差，觀察迭代過程中誤差的升降情形，下一頁的圖 4.4 為針孔隨迭代次數的誤差變化。由圖 4.4 (b)可見 Err 經過 80 次 HIO 的迭代漸趨穩定，後幾萬次都在約 0.6 左右震盪，如圖 4.4(a)。在 10 萬次迭代後的使用 ER 可讓 Err 降至 0.23 左右，如圖(c)。已達到我們實驗所訂定的標準 0.32 以下。. 42.

(54) Err. (b)Err. (c). 圖 4.4 針孔在 Fienup 演算法中的收斂情形，(a)為 100100 次完整收斂情形，將 (b)前 200 次與(c)後 200 次局部放大。(b)HIO 約在第 80 次迭代後趨於穩定，在 0.6 左右之間震盪。(c)驟降發生於第一次 ER 後，Err 約由 0.6 變為 0.23。. 其四是迭代過程中，重建圖形是否在迭代過程中趨於穩定，主要形狀不變、並越解越清楚，如圖 4.5。完成這四步驟確認，可判定針孔樣品成功重建。. 圖 4.5 不同迭代次數的針孔重建，(a)第 80 次 HIO，(b)第 10 萬次 HIO。 43.

(55) 4.1.2 棉花葉樣品選用市售之棉花葉玻片作為樣品，由於 3.1 節所述，光斑到達樣品上的大小超過 1 mm，為了提升高無密度區域的面積、以提高取樣比例，我們在玻片上貼一個直徑為 600 μm 針孔，如圖 4.6。. 圖 4.6 棉花葉樣品製備圖與在 OM 下放大圖，(a)將 600 微米針孔貼於市售生物玻片上，以達到較高的過取樣比例。(b)為照射區域的局部放大。. 圖 4.7 (a)、(b)為棉花葉樣品在對數尺度(logarithmic scale)下，1/100 秒和 1 秒的曝光時間的繞射圖。. (a). (b). 圖 4.7 棉花葉在對數尺度下的繞射圖 (a) 曝光 1/100 秒之繞射，(b)曝光 1 秒之繞射。. 圖 4.7 的實驗參數為 𝑧2 = 53.5𝑚𝑚，裁切成 3919 × 3919 的方形矩陣，理論解析度約為 1.43 μm。配合適度的遮罩輸入演算法，使用 10 萬次 HIO 與 100 次 ER 的迭代來解棉花葉樣品，可得到圖 4.8 的重建結果。 44.

(56) 圖 4.8 棉花葉 OM 影像與重建圖的比較，(a)雷射光照射區域在 OM 下放大圖。 (b)棉花葉 HIO 重建圖。當中包含 T 形、心形與啞鈴狀的結構，可左右對應。. 圖 4.8(b)，從(a)、(b)中約略可以找出大小相似的結構，但特徵點的邊界不清晰。而且，當我們將無密度區域的數值設為零、做傅立葉轉換與原繞射比較的結果差異較大，如圖 4.9，繞射中心較深的結構沒有解出來。. (a). (b). 圖 4.9 棉花葉繞射與重建圖繞射的比較(對數尺度) (a) 棉花葉繞射，(b) 棉花葉重建的繞射圖。. 45.

(57) 圖 4.10 為棉花葉隨迭代次數的誤差變化，與針孔的情況很類似，由圖 4.10 由圖 4.10 (b)可見 Err 經過 90 次 HIO 的迭代漸趨穩定，後幾萬次都在約 0.6 到 0.63 間震盪，如圖 4.10 (a)。在 10 萬次迭代後的使用 ER 可讓 Err 降至 0.23 左右，如圖(c)。已達到我們實驗所訂定的標準 0.32 以下。. 圖 4.10 棉花葉在 Fienup 演算法中的收斂情形，(a)為 100100 次完整收斂情形，將(b)前 200 次與(c)後 200 次局部放大。(b)HIO 約在第 80 次迭代後趨於穩定，在 0.6 到 0.63 之間震盪。(c)驟降發生於第一次 ER 後，Err 約由 0.62 變為 0.23。. 46.

(58) 為了確認圖 4.8 是否為成功重建圖，我們記錄每 1 萬次 HIO 迭代的重建情形，來觀察重建圖形在是否在過程中的某次迭代後便趨於穩定，主要結構不改變、並且越解越清楚。第 1 萬到 9 萬次 HIO 的迭代搭配 100 次 ER 的重建結果，如圖 4.11 所示。可以看到樣品區域除了因 HIO 非唯一解的問題不斷移動，其上的主要結構也不斷改變，找不到相似的結構、所以也無法判定越解越清楚的現象。故我們判定圖 4.8 尚未收斂，並非成功重建的影像。圖 4.12 是迭代 7 萬與 10 萬次的圖形，它們的圖形明顯不同，但是將它們的無密度區域補零後做傅立葉轉換與原圖比較，看起來很相似，如圖 4.13。. 圖 4.11 不同迭代次數棉花葉重建圖的比較，由(a)開始，分別為 10000 次 HIO、 (b) 20000 次 HIO、(c) 30000 次 HIO 依此類推，到(i) 90000 次 HIO，並且每個圖經過該次數的 HIO 運算後，皆搭配 100 次 ER 運算。 47.

(59) 圖 4.12 7 萬與 10 萬次 HIO 棉花葉重建圖的比較 (a) 7 萬次 HIO 棉花葉重建圖，(b) 10 萬次 HIO 棉花葉重建圖。. (a). (b). 圖 4.13 不同迭代次數棉花葉重建圖繞射的比較(對數尺度) (b) 7 萬次 HIO 棉花葉重建的繞射圖，(b) 10 萬次 HIO 棉花葉重建的繞射圖。. 48.

(60) 4.2 掃描式 CDI 使用圖 3.4 的方式移動棉花葉樣品，照射 25 個區域，圖 4.14 呈現其中九個區域的繞射圖。實驗參數為𝑧1 = 6.7𝑚𝑚, 𝑧2 = 61.5𝑚𝑚，裁切成 3687 × 3687 的方形矩陣。使用反映針孔特性的探測光源函數和 1 陣列的樣品函數，輸入 ePIE 演算法，收斂情形如圖 4.15。. 圖 4.14 棉花葉 9 個位置繞射. 49.

(61) 圖 4.15 棉花葉在光學顯微鏡下放大圖與重建. 由上圖可約略看到條狀的結構，葉片的上下表皮在圖中呈現深色，中間的柵欄組織呈現條狀細紋。使用 3.3 式計算每一次迭代的誤差。可發現 ePIE 的收斂情形是穩定下降的，不像 HIO 驟降以後就沒有很大的變化，如圖 4.16。. 圖 4.16 棉花葉在 PIE 中迭代 500 次的收斂情形 PIE 在第 1 次迭代時會驟降，第 2 次迭代後穩定地緩降，故將第 1 次迭代的值去掉，以便觀察演算的收斂情形，誤差最後在 0.31 左右震盪。. 50.

(62) 第五章結論與未來展望本文的主要貢獻在於搭建光學 CDI 的實驗架設與測試數據處理的方法，包含使用 Nikon 相機影像轉檔、數據處理、去除雜訊，並初步嘗試了 HIO 與 PIE 兩種演算法，探討其解實際影像的可行性。成果可以看到針孔的形貌與生物樣品上部分細節的約略影像，實際重建比起模擬重建如我們所預期，有許多實際的問題要解決。若想要得到更顯而易見的重建影像，可以探究樣品的顏色、厚度、結構大小如何影響重建影像，找出更適合的樣品的性質，選擇邊界清晰、厚度均勻、大小適合該解析度的樣品，例如解析度片，可能得到較好的重建效果。後續欲進行光學 CDI 實驗，有效與合理的數據處理方法與適切的樣品性質仍為有待探討的主題。. 圖 5.1 解析度片解析度片具有顏色邊界分明、厚度均勻的特性、多種大小的解析目標。. 51.

(63) 5.1 CDI 實驗的後續工作由於收取 PIE 的實驗步驟較繁複，數據量大，若在樣品前放置一個光柵，單次即收取多位置繞射，可以增加實驗的效率。[39]. 圖 5.2 多次與單一照射的 CDI-PIE 實驗比較 [39] (a)為原本使用針孔做為探測光源形貌的實驗架設，其重建結果為(d)。(b)則使用光柵一次收取多位置影像，(c)為(b)所收取的影像繞射，其重建結果為(e)。. 另外我們正嘗試克服 PPM 在 CDI 實驗上的問題，以期這兩種演算法可以用在重建 PPM 實驗的影像。屆時，發射源就會變成單原子針，必須考慮 2.3 式中的 g 函數。. 52.

(64) 5.2 科教用途在進行光學實驗個過程中，發現光學方法是非常適合教學演示的材料，讓中學生透過看得見的實驗建模 [40]，去了解不同尺度下的相同原理的科學，例如，用可見光發射源實驗，讓學生了解 X 光與電子源的實驗。而雷射實驗、繞射相關內容皆屬高中課程既有的內容，故以下將提議一個可以就地取材、融入課綱的教案。. 中學課本常出現 Watson 與 Click 用以解出去氧核醣核酸(Deoxyribose Nucleic Acid, DNA)結構的繞射圖樣「相片 51」(攝於 1952)[41][42]，說明 DNA 雙股螺旋的發現以及 X 光的發明、繞射等物理章節。但由這副圖像如何得知 DNA 是雙股螺旋，則學子不易理解。常見的說明方式有二：其一是 Gregory Braun 等人用實驗，彈簧模仿 DNA 的結構，以雷射光打在其上生成類似「相片 51」的 X 狀結構，並輔以繞射理論(近似)作為說明，此方法的限制為，單股螺旋(彈簧)繞射紋的解釋已經很複雜、無法重現雙股螺旋的奧妙。[43,44]. (a). (b). 圖 5.3 雷射彈簧實驗架構圖與其繞射圖樣 [43] 53.

(65) 另一種方法則是Amand A Lucas 等人使用電腦模擬，嘗試將多種DNA形貌直接用惠更斯-菲涅耳原理算出繞射圖樣，並找出與「相片51」最相似的一種，並模擬該DNA形貌的雷射繞射圖樣。[45-47]. 圖 5.4 選擇 12 種不同 DNA 形貌生成繞射 [47]. 圖 5.5 與「照片 51」相似的雷射繞射圖樣 [46] 54.

(66) 前者可以與課綱中雙狹縫章節合併進行，以實驗的方式讓學生對波動光學的有實感的理解；後者則忠實的呈現DNA形貌與繞射圖的對應關係。本論文的提議是結合這兩者的好處。Franklin使用X光照在寬度約為3.4 nm的B型DNA 上，仿照這個比例，以紅光雷射製造對應寬對的樣品，能在屏幕上呈現出放大版的「相片51」給學生們觀察，觀察為隨即放進相位取回演算法去重建，能讓同學在不用計算複雜數學的情形下，理解並相似的體驗繞射紋如何被取得，被技術性的重建，並且解出真的來是雙股螺旋。. 如第二章所述，繞射圖與樣品並非只是傅立葉轉換的關係，當中還丟失了相位的資訊，普遍適用的相位取回方法是在1980年才發展出來，在那之前，不同的繞射圖樣必須要藉由其他的先驗資訊(prior information)，以DNA來說，就是化學鹼基的排列、鍵結方式 [48]，並且要等到「相片51」這張結構較簡單的繞射圖，才能將雙股螺旋的結構解出來，因此才是那麼非凡難得的成就。真正直接拍攝的DNA影像在2012年才問世。[49]. 圖 5.6 首張直接拍攝的 DNA 雙股螺旋照片 [49]. 55.

(67) 作者認為這項教案適合作為探究與實作課程的原因分為內容與取材方面，此教案包含中學的既有內容：DNA雙股螺旋的發現以及X光的發明、狹縫干涉繞射實驗，能連結並強化對這些章節的學習；又能藉由顯微鏡的演進史、光源、解析度，使學生對於尺度(Scale)這個物理中的重要概念印象深刻；最終，還能介紹這種越來越被廣泛應用的顯微術 — CDI。學生能藉由實驗的過程理解，CDI顯微術所做的工作，正如Watson與Click在電子顯微鏡解析度還未到達 10 nm之前，就解出寬度為3.4 nm的週期性結構。而本篇HIO、PIE演算法，能夠重建更多樣的樣品，是顯微技術上值得研究、發展的方向。. 可見光作為光源的CDI除了方便操作以外，可視化使其更適合作為教學演示之用，所使用的實驗用品甚至與既有的雙狹縫干涉高度重疊，僅需製作適當比例的DNA樣品即可。若能選取較適當的樣品、並將數據處理的過程合併於一個應用程式中，HIO相位取回演算法將很適合這樣的課程設計來使用。. 56.

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