台灣油杉之族群遺傳及適應性演化
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(2) 致謝 時光飛逝，兩年的研究所修業期間轉眼便將尾聲。這期間仰賴許 多人的協助與鼓勵，使我的學位論文終於得以順利完成。首先感謝指 導老師 黃士穎博士引領我進入這浩瀚的學術殿堂，並無私地給予我 最專業的指導。感謝口試委員 林讚標老師與 王俊能老師對我論文內 容細心的指正，並提供許多中肯的建議，使我的論文更加完善。感謝 林試所 鍾振德研究員、翠華姐以及國立中山大學 江友中博士協助收 集本研究之樣本並提供研磨設備，若沒有您們的協助本研究將無以完 備。感謝 張仲德博士對於本研究中氣象因子之收集給予的協助。 感謝研究室的夥伴們：嘉瑩、延衡、裔強、亭亘、明瑄、建山， 這一路上有你們的陪伴及相互扶持，讓我在學術研究這條路上充滿勇 氣且不孤單。感謝好友諠憶、茜茜、表哥、泳易、鈺婷、儀靜、孟勳、 阿胖和佳臻在研究期間的鼓勵，耐心的聽我講一堆不有趣的事，適時 給於我幫助與意見。 感謝我最親愛的父母，讓我無後顧之憂的完成學業，感謝外公、 外婆不時給予溫暖的關懷，謝謝舅舅們總是給予我最大的支持。您們 是我最強而有力的後盾，賦予我無形的動力。 欲感謝的人太多了，恕無一一列出，謹以此文，獻給所有曾幫助、 關懷過我的所有朋友們。. I.
(3) 目錄 致謝............................................................................................................. I 目錄............................................................................................................ II 表目錄...................................................................................................... IV 圖目錄...................................................................................................... VI 摘要............................................................................................................. 1 第一章前言................................................................................................. 3 第二章前人研究 ........................................................................................ 6 一、間斷分布對族群演化的影響 .....................................................6 二、台灣油杉之相關研究..................................................................8 三、族群遺傳研究工具 AFLP ......................................................... 11 第三章材料與方法 .................................................................................. 13 一、研究材料 ....................................................................................13 二、樣本採集 ....................................................................................13 三、樣本處理 ....................................................................................14 四、DNA 萃取、定量與稀釋 .......................................................... 14 五、擴增片段長度多型性( AFLP) ..................................................16 六、資料分析 ....................................................................................18 第四章結果............................................................................................... 25. II.
(4) 一、台灣油杉樹高與胸徑之比較 ...................................................25 二、擴增片段長度多型性引子的篩選 ...........................................25 三、遺傳歧異度................................................................................25 四、族群遺傳結構與分群................................................................ 26 五、台灣油杉環境因子的差異 .......................................................28 六、天擇作用受選汰的基因座 .......................................................29 七、適應性演化基因座與環境因子的關連 ...................................30 第五章討論............................................................................................... 32 一、AFLP 引子之篩選 .....................................................................32 二、族群遺傳歧異度........................................................................32 三、台灣油杉族群結構....................................................................33 四、台灣油杉適應性演化................................................................ 35 第六章結論............................................................................................... 39 第七章參考文獻 ...................................................................................... 40 第八章表目錄 .......................................................................................... 47 第九章圖目錄 .......................................................................................... 66. III.
(5) 表目錄 表一、台灣油杉及其他油杉物種樣本數及採集地資訊 ......................47 表二、CTAB-PVP 緩衝液配方 .............................................................. 48 表三、TB 緩衝液配方 ............................................................................48 表四、DIGESTION 緩衝液配方 ................................................................ 49 表五、AFLP 所使用的 ADAPTOR 及相關引子之序列 ........................... 49 表六、LIGATION 緩衝液配方 ..................................................................50 表七、PRESELECTIVE AMPLIFICATION 緩衝液配方 ..................................50 表八、PRESELECTIVE AMPLIFICATION 循環流程 ......................................51 表九、SELECTIVE AMPLIFICATION 緩衝液配方 .......................................51 表十、SELECTIVE AMPLIFICATION 循環流程............................................52 表十一、前擴增反應引子之序列 .......................................................... 52 表十二、選擇性擴增反應引子之序列及錯誤率 ..................................53 表十三、台灣油杉族群之多型性 .......................................................... 54 表十四、台灣油杉、鐵堅油杉及大陸其他油杉之遺傳歧異度 ..........55 表十五、台灣油杉、鐵堅油杉及大陸其他油杉之族群間兩兩比較 FST ............................................................................................................56 表十六、台灣油杉、鐵堅油杉及大陸其他油杉 FST 值的 P VALUE ....56 表十七、台灣油杉 AMOVA 分析結果 ..................................................57. IV.
(6) 表十八、以 PILLAI-BARTLETT 統計分析 11 個環境因子在台灣油杉 5 個 族群間之差異....................................................................................58 表十九、台灣油杉族群偏離中性演化之基因座 ..................................59 表二十、台灣油杉中與環境因子有顯著相關的基因座 ......................61 表二十一、台灣油杉各族群內適應性演化基因座間的連鎖不平衡檢測 ............................................................................................................62 表二十二、台灣油杉族群間之兩兩比較之 FST 值 .............................. 64 表二十三、台灣油杉族群間之兩兩比較 FST 值之 P VALUE ................64 表二十四、4 個適應性基因座和 11 個年平均環境因子的相關性 .....65. V.
(7) 圖目錄 圖 1. 各個採樣點分布圖 .......................................................................66 圖 2. 台灣油杉母數族群間樹高與胸徑之比較 .....................................67 圖 3. 台灣油杉族群間遺傳分化(FST)與地理距離之間的相關性. .......67 圖 4. STRUCTURE 檢測台灣油杉分群結果 ..............................................68 圖 5. STRUCTURE 檢測台灣油杉分群 ΔL(K)結果 ...................................69 圖 6. NEIGHBOR-JOINING 親源樹 .............................................................. 70 圖 7. 台灣油杉各族群間氣象因子之漸層圖 .........................................71 圖 8. 每月 11 個環境因子的相關係數進行主成分分析(PCA)之結果 72 圖 9. 單一環境因子與不同台灣油杉族群間之差異 ............................. 73 圖 10. 以 DFDIST 檢測受天擇選汰的基因座之結果........................... 75 圖 11. 以 BAYESCAN 檢測受天擇選汰的基因座之結果 .......................76 圖 12. 以 BAYESFST 檢測受天擇選汰的基因座之結果 ........................76 圖 13. 以 DETSEL 檢測金瓜寮族群與大武 41 林班族群間受天擇選汰 的基因座之結果 ....................................................................................77 圖 14. 以 DETSEL 檢測石槽族群與大武 41 林班族群間受天擇選汰的 基因座之結果 ........................................................................................78 圖 15. 台灣油杉個體間 FST 值頻率分布 ................................................79 圖 16. 11 個適應性演化基因座於各族群間 ALLELE FREQUENCY 之比較. VI.
(8) ................................................................................................................80 圖 17. 11 個適應性演化基因座於各族群間平均 FST 值之比較 ...........83 圖 18. 台灣油杉適應性基因出現頻率差值與地理距離間之迴歸分析 ................................................................................................................86. VII.
(9) 台灣油杉之族群遺傳及適應性演化 摘要 台灣油杉（Keteleeria davidiana var. formosana Hay.） 屬松科植物， 為台灣特有種。前人研究指出族群間斷分布容易導致族群間基因交流 受阻，以至於族群間分化程度逐漸增加，於演化歷程中可能趨於形成 在地適應性(local adaptation)之物種，甚至可能發生異域種化(allopatric speciation)的現象。台灣油杉分布於本島之兩端，呈現間斷分布。本 研究目的為探討台灣油杉族群間遺傳分化情形，是否因棲地環境明顯 差異而產生在地適應性演化。本研究使用擴增片段長度多態性 (amplified fragment length polymorphism, AFLP)的分子標記，共使用 12 組引子擴增，獲得 465 個有效條帶。依據 STRUCTURE 結果可將 台灣油杉分為 2 個歸群。分析族群結構時發現台灣油杉南北部族群間 具有顯著遺傳分化，台東大武 30 林班及 41 林班也具有顯著分化現象。 族群間基因交流與地理距離呈現顯著正相關。中性檢測，發現台灣油 杉族群內共有 27 個偏離中性演化的基因座，其中有 11 個與環境因子 呈現顯著關連性。經連鎖不平衡之檢測，發現台灣油杉族群內具有不 同的連鎖區域，推測台灣油杉可能受到地理距離與分歧型天擇的影響， 產生不同的適應性演化，族群基因組已有分化現象。 關鍵字：間斷分布、遺傳結構、擴增片段長度多態性、台灣油杉. 1.
(10) Population genetic structure and adaptive evolution of Keteleeria davidiana var.Formosana Abstract Keteleeria davidiana var. formosana (Pinaceae) is endemic to Taiwan. K. davidiana var. formosana distributed disjunctly in rocky ridges of northern and southern tips of Taiwan. Therefore, this species may provide as an invaluable material for the study of allopatric speciation in plants. Therefore, the main purpose of this study is to understand the patterns of genetic diversity and the spatial genetic structure of this species and formulate the fundamental information of widely separated northern and southern populations of this species by using Amplified fragment length polymorphism (AFLP). A total of 465 bands were detected by the 12 AFLP primer sets. According to the results of STRUCTURE and AMOVA, populations were clustered into two groups, northern and southern groups. Moreover, isolation by distance test showed that the differentiation is between populations associated with geographic distances. We also found population DO and EO differentiated significantly in southern group. Through the outlier-detected methods, we found 27 loci which deviated from neutral evolution,. of. which. 11. showed. significant. association. with. environmental factors. The detection of different linkage disequilibrium patterns in the K. davidiana var. formosana populations, indicating different linkage blocks within each population. We speculated that the differentiation among K. davidiana var. formosana population may be effected by geographic distances and differential selective pressures among habitats, which would promote adaptive evolution. Keyword: disjunction_ genetic structure_ amplified fragment length polymorphism _ Keteleeria davidiana Beissn. var. formosana Hay.. 2.
(11) 第一章前言 台灣油杉(Keteleeria davidiana var. formosana Hayata)為台灣特有 樹種，在分類上歸屬於松杉目(Pinales)、松科(Pinaceae)、油杉屬 (Keteleeria)，為德氏油杉(或稱鐵堅油杉)(K. davidiana)之變種。為多 年生綠喬木，雌雄同株。天然分布於臺灣南北兩端約在300公尺至900 公尺之間的低海拔地區、稜線或山坡的環境，呈不連續分布。 植物由於無法自我遷移及花粉主動散布的能力有限等因素，容易 因地理隔離與棲地環境的差異而形成局部性分布的地方種。此外人類 活動的干擾與生育地被破壞下，原來良好的生育地可能消失或破碎化， 因此可能造成當地族群的消失或是形成許多次族群(subpopulation)， 破碎化後的次族群之間可能會有基因交流、棲地大小、隔離程度等差 異 (Hanski & Gilpin, 1997)。物種演化的差異來自於物種本身的生態 特性以及其散布(dispersal)之能力，加上物種於過去所經歷的歷史事 件(history events)所受到的影響不相同，而產生的差異。目前不同的 生物所呈現出的遺傳結構以及地理分布的型式也不盡相同（Avise, 2000）。在第4紀冰河時期台灣曾經歷的多次海退作用中，多次與亞 洲大陸間相連接 (Teng, 1990)，而台灣島上的山脈多以南北走向在不 同的地質時期隆起的（Huang et al., 1997），可能會造成種種不同的 演化現象，如：散布（dispersal） 、建立（colonization） 、擴張（expansion）、 3.
(12) 隔離（vicariance） 、異域種化（allopatric speciation） 、再同域（Secondary contact）等等。其次是各物種有各自的生態需求，各自也會演化出一 套最適合生存的演化策略。 族群間斷分布，容易導致各族群為了適應生育環境，個體的基因 通常會隨著世代交替而持續演化，且分布於不同的生育地之族群通常 會有不同的演化歷程，導致各族群對於生育地環境逐漸地出現專一性 的適應，可能產生在地性適應(local adaptation)的物種，物種為適應不 同棲地環境所引發的專一性適應即稱為在地適應性演化，因此間斷分 布 的 族 群 演 化 可 能 會 趨 向 異 域 種 化 的 現 象 (allopatric speciation) (Schonswetter et al., 2003；Bernardi & Lape, 2005；Gaudeul, 2006； Hamilton, 2007；Rossi, 2009)。台灣曾經歷多次冰河時期的海退作用， 因此台灣島與鄰近之歐亞大陸上的許多物種都因受到地理上隔離的 影響，而有隔離分布的現象。 台灣油杉（Keteleeria davidiana var. formosana Hayata）屬於台灣 特有種，為德氏油杉(或稱鐵堅油杉)(K. davidiana)之變種。過去可能 由歐亞大陸經由陸橋的連接而遷移至台灣，油杉目前僅分布於本島之 兩端，生育地海拔高度約 300 至 900 公尺處，呈不連續分布（金平亮 三，1936）；北部於坪林地區設立台灣油杉自然保護區，南部則有大 武台灣油杉自然保護區。兩個生育地之間的地理分布呈現間斷分布 4.
(13) (disjunct distribution)，因此該物種正是於台灣研究生物異域種化 (allopatric speciation)研究之絕佳的研究材料。 基於台灣油杉僅分布於台灣南、北兩端。我們推測台灣油杉之族 群因受到地理隔離，族群逐漸受棲地環境的影響有在地適應性演化的 發生，並可能已產生異域種化的情形，因此本研究所設立的假說為台 灣油杉之族群是否有在地適應性演化的存在，適應性演化是否與環境 因子有關，進一步了解台灣油杉之族群是否已產生異域種化。本研究 目的為探討台灣油杉南北部之族群的遺傳分化情形，是否因棲地環境 明顯差異已產生在地適應性演化，進一步了解在地適應性是否和環境 因子有關聯。. 5.
(14) 第二章前人研究 一、間斷分布對族群演化的影響 植物分布的不連續現象，又稱之為間斷分布(disjunct distribution)。 一般是指一群有血緣關係的物種，分布於彼此距離遙遠的地區，中間 具有能阻斷植物傳播的障礙，例如：湖泊、高山、沙漠或海洋等或是 不是適合植物生長的環境。最常被研究的尺度為一個屬(genus)或一個 科(family)跨大陸性的間斷分布情形。間斷分布的發生可能受到生態 及歷史因素的影響。在生態因素上如:基質的特異性，一個著名的例 子為在歐洲阿爾卑斯山上，嗜鈣的植物物種僅分布於阿爾卑斯山北部 及南部具有石灰岩基質的生態環境 (Ewald, 2003) (Schonswetter et al., 2003)。於歷史因素上，生物族群可能受到地理隔離的影響而產生間 斷分布(disjunct distribution)的現象，舉例而言，在下加利福尼亞的一 種魚類(Anisotremus davidsonii)因受到巴拿馬地峽的隔離，族群因而 產生間斷分布的現象(Bernardi and Lape, 2005)。除此之外，過去的歷 史氣候或地質事件也可能是造成族群間斷分布的原因，舉例說明如: 在冰河時期位於不同地區的生物避難所，在歐洲阿爾卑斯山的植物族 群研究中發現更新世冰期是導致該地區植物族群呈現間斷分布的主 要因素之一(Schonswetter et al., 2003)。此外，地質事件也可以導致間. 6.
(15) 斷分布的發生，一個經典的例子為肖楠屬(Calocedrus)之針葉樹物種 (Shi et al., 2012)，因板塊分離使得物種間產生間斷分布成為東亞與北 美西部間斷分布的典型的例子，目前該屬共有四個種。分別為北美洲 的加州肖楠（Calocedrus decurrens）亞洲東部有三種，即台灣肖楠 (Calocedrus macrolepis var. formosana) 、 中 國 翠 柏 (Calocedrus macrolepis)與岩生肖楠（C. rupestris） 。 間斷分布(disjunct distribution)的族群能提供良好的機會在於研 究早期異域種化的特徵。(Mayr, 1963；Endler, 1977；Coyne & Orr, 2004； Wiens, 2004；Bernardi & Lape, 2005)。因物種長期受到隔離，各族群 為了適應不同生育環境以及隨著世代交替個體的基因通常會隨之演 化，導致各族群對於生育地環境逐漸產生在地性適應(local adaptation)。 物種為適應不同棲地環境所引發的專一性適應，可能導致族群演化趨 向於異域種化的方向進行。舉例而言，肖楠屬的物種全球分布型式屬 於東亞與北美西部間斷分布，該屬之物種長期受到隔離的影響。以現 生三種肖楠屬之物種（Calocedrus decurrens, Calocedrus macrolepis var. formosana, Calocedrus macrolepis）的 DNA 序列研究為例，產於東亞 與北美西部的肖楠彼此之間分化相當明顯，各自為一單系群，其分化 時間約在 25 百萬年前左右，亞洲肖楠的分化約在 15.2 百萬年前，中 國翠柏分出約在 9.1 百萬年前，台灣肖楠則約在 5.4 百萬年前分化。 7.
(16) 根據這個研究，亞洲地區的肖楠與美洲地區的肖楠，因經過長期隔離 已產生基因及型態上的分歧並且以達到完全分歧。台灣肖楠與翠柏之 間在分子層面差異也相當大，以達到種間差異的水準(Chen et al., 2009)。由此案例可得知長期受到間斷分布的族群，該族群的演化方 向可能趨於分化，甚至有異域種化的可能。. 二、台灣油杉之相關研究 Blokhina et al.(2006)利用檢定化石殘跡的方式，發現油杉屬的樹 木曾廣泛分布於北半球溫帶，其化石在歐洲、北美西部之漸新世至中 新世均有發現，歐洲及日本之上新世也有化石紀錄。由地質年代與化 石研判，油杉往昔的分布遠比現代廣闊，目前油杉屬僅分布於東亞地 區，為東亞地區的特有植物(Wang et al., 2006)。 Tsukada (1967) 於臺灣湖泊沈積物孢粉學研究中發現臺灣中部 山區約 745.5 公尺及 550 公尺處於更新世時曾有油杉屬之族群存在過， Tsukada 發現該地區的油杉屬之孢粉紀錄隨著當時氣候變遷而有所消 長，Tsukada 將該地區的所採集約 10 公尺之岩芯剖面區分成 4 個孢粉 層分別為:W-1、W-2、W-3 與 W-4(W=Waichiataoan)，以同位素 C14 追朔時代發現，W-1 孢粉層為更新世(Pleistocene)早期(約六萬年前)， 在此一孢粉層中發現少量的油杉屬之孢粉並發現該孢粉層中含有約 8.
(17) 24 公分的火山灰能追朔過去該地區曾經歷的歷史事件。W-2 層中因 氣候變得較 W-1 寒冷，較不適合好溫暖氣候之油杉屬的生存，因次 於該孢粉層中發現油杉屬之孢粉變得較少。W-3 層中顯示該時期氣候 逐漸暖化(約四萬年前)，雖然仍較今日寒冷，但在該孢粉層中發現許 多喜好溫暖氣候的物種孢粉紀錄，如:油杉屬、苦櫧屬及櫟樹屬等。 W-4 層(約一萬年前)為間冰期或小間冰期伴隨著亞熱帶溫暖的氣候， 然而此一孢粉層並未發現有油杉的孢粉，具推測可能因為油杉無法與 其他物種競爭而使族群逐漸消失。除此之外根據金平亮三(1936)的描 述，南部台灣油杉族群也曾分佈於恆春半島西側潮州郡枋山克拉油社 附近(海拔約 900 m)，但當時該族群受到人為大量伐採，族群明顯減 少。於今台灣油杉之族群僅存於坪林及大武兩個地區。 對於目前現存台灣油杉族群稀少的原因調查中，發現台灣油杉 99%的種子多屬於空粒，顯示台灣油杉的種苗繁殖率相當低 (洪西洲 等人，2004；何政坤與楊政川，1995)。何政坤等人(2000)對於台灣油 杉的種子做了研究，發現 80%的種子均有受精，但發育到成熟胚的階 段卻逐漸出現敗育的現象，因此台灣油杉種子空粒的形成可能的主因 是因為受精胚敗育造成。一般松類與異交的顯花的植物所得的有效種 子率為 39%(Owen et al., 1991)，但何政坤等人(2000)研究中發現在大 武地區所採集的毬果中，平均有效種子率僅有 6.06%，而坪林地區則 9.
(18) 僅有 2%。顯示現存的台灣油杉林分裡有效種子的生產率是偏低的， 可能因為族群密度過稀，授粉不足所致。洪西洲等人(2004)在台灣油 杉授粉研究中指出台灣油杉之族群本為異交收粉的物種，但在研究中 發現，現存的台灣油杉之天然族群授粉多來自自交，並且結果率不佳。 台灣油杉天然授粉之毬果有效種子率為不到 1%。利用人工異株授粉 的方式，可增加台灣油杉 2-3 倍的有效種子率。長時間下來，台灣油 杉之族群可能因為競爭力減弱造成族群逐漸減少或消失。 楊遠波(2007)曾整理過去對於台灣油杉生育地的資料並重新做 調查。依據植物生活型及生態習性，將植物組成分為 4 大類，分別為 木本植物、草本植物、藤本植物與附生植物，用以比較南北 2 個生育 地，植物組成差異，並利用 Jaccard 相似性指數以量化所觀察到的差 異性。結果顯示南部、北部樣區中植物各類組成的相似性介於 16.7% 至 30.3%有明顯分化的情形。根據 TWINSPAN 的植群分群結果，也 發現台灣油杉南北 2 族群有顯著差異。台灣油杉南北 2 族群，皆屬台 灣油杉群叢，但依據不同特徵種可區分為兩個亞群叢，分別為台灣赤 楠亞群叢，台灣油杉南族群即屬於此類型；烏心石亞群叢，台灣油杉 北族群即屬於類型。 過去關於台灣油杉遺傳多樣性的研究甚少，僅有 2001 年一篇碩 士論文及 1995 年林試所王維洋以逢機擴增多型性分子標記 (random 10.
(19) amplified polymorphic DNA, RAPD)探討一些基礎的遺傳多樣性的問 題：如族群遺傳歧異度及族群個體間的遺傳關係。其結果皆顯示台灣 油杉族群內的遺傳相似度高，坪林族群與大武族群間分化明顯。(王 維洋，1995；張淳琤，2001)。王維洋在研究中發現利用編號 OPS-10 的引子，可作為遺傳標記(molecular marker)來區分坪林、大武 41 林 班與 30 林班的天然台灣油杉族群。因此有可能台灣油杉南部及北部 族群有分化甚至有早期異域種化的可能性。其次，在各自族群內也可 能已產生分化。. 三、族群遺傳研究工具 AFLP 早期對於族群遺傳學的研究方法，起初是利用物種外表型態(例 如：植株高矮)、遺傳基因的初級產物(例如：蛋白質(Protein)、同工 異構酶(Allozyme))或 DNA 分子標誌等來做比較分析其差異性(Karp et al. 1996；陳述與范明仁，1999)。DNA 分子標誌的優點在於其不受外 在環境的影響，可利用的標記的數目較多，並且可直接反應出 DNA 序列上的差異，因此近幾年廣泛的被用其各種研究上。 本 研 究 將 選 用 擴 增 片 段 多 型 性 (Amplified fragment length polymorphism , AFLP)作為主要的 DNA 分子標記法，此方法的特點在 於 結 合 了 過 去 限 制 片 段 長 度 多 型 性 (Restriction fragment length 11.
(20) polymorphism , RFLP)及聚合酵素鏈鎖反應(Polymerase chainreaction, PCR)的各項優點，使得 AFLP 在評估瀕危族群間和族群內的遺傳歧 異度上增加許多優點。首先是此技術不需要得知物種最初的序列資訊， 只要少量的 DNA 就可分析出大量的多型性 DNA 條帶、再現性也較 高、可偵幅到較多的基因組，以提供族群之間精確的估算出遺傳距 離。. 12.
(21) 第三章材料與方法 一、研究材料 台灣油杉（Keteleeria davidiana var. formosana Hay.） ，隸屬於松 杉目、松科、油杉屬、為德氏油杉(或稱鐵堅油杉)(K. davidiana)之變 種。德氏油杉主要分布於中國大陸川、陜、鄂與雲南西南部(Farjon 1989)。目前現存的台灣油杉原生母族群相當稀少，僅分布於北部坪 林一帶與南部大武山區，並且結實率低，族群競爭力弱，為政府明令 保護的稀有植物，也是近年來林務局正積極保育的物種之一。. 二、樣本採集 在本研究期間，於台灣島上採集所有台灣油杉之原生母樹樣本， 以供後續分析使用，共採集 5 個族群，分別來自北部坪林地區的三個 族群：金瓜寮(AO)、姑婆寮(BO)、石槽(CO)；南部大武地區的兩個 族群：30 林班(DO)、41 林班(EO)，共計 163 株樣本。另外也收集中 國德氏油杉(Kd)、雲南油杉(CHKe)、油杉(CHKf)、江南油杉(CHKc)、 柔毛油杉(CHKp)及黃枝油杉(CHKca)作為分析上的外群，各族群詳細 資料見圖 1.及表一。 本研究於採集台灣油杉之樣本時，將同時測量原生母樹基本生長 資訊(包含樹高及胸徑)。實測每一棵母樹樣本樹高 1.3 公尺部位之胸 13.
(22) 徑，再以 Haga 測高器測定樹高。 採集枝條時，選取健康、無病蟲害的新鮮葉片。將採集到的樣本 枝條置於封口袋內，並註明採樣編號和基礎形態資料(樹高及胸徑)， 以便帶回研究室做後續的分析及處理。. 三、樣本處理 將採集來的樣本以清水洗淨後，再以 75%的酒精做表面滅菌，進 行乾燥後，取出少量之葉片樣本研磨成葉粉。步驟如下: 1. 將已乾燥的樣本取出剪碎/捏碎至於研缽中。 2. 緩緩將液態氮倒入研缽中後,以研杵快速搗壓研磨樣本。 3. 重覆步驟 2,直至樣本被研磨成粉末狀。 4. 趁粉末尚未回溫吸水前，以藥勺將葉粉裝於 2mL 之微量離心管中, 並於管蓋上標示清楚編號。 5. 置於攝氏-80℃之冷凍箱中儲存備用。. 四、DNA 萃取、定量與稀釋 本 研 究 將 引 用 Doyle and Doyle 於 1987 所 提 出 的 CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide)少量 DNA 快速萃取法，稍加 修改適用之，步驟如下： 1. 將保存於-80℃中之葉粉取出 0.5 克置於 2mL 離心管中。 14.
(23) 2. 於抽風櫥下，加入 800μl CTAB-PVP 緩衝液(CTAV-PVP 緩衝液， 配方見表二) 後，於震盪機上震盪，使萃取液與葉粉充份混合。 3. 置於 60℃之水浴槽中震盪 30 min，其間每 10 分鐘須取出反轉搖晃 一次。 4. 接著加入 500μl Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) 混合液，搖晃使 其充分混合後，以 13'000 rpm 的轉速在 4℃離心 20 分鐘。 5. 將上清液置入新的離心管(1.5ml)中，加入 500μl Chloroform/isoamyl alcohol 混合液混合後，以 13'000 rpm 的轉速再 4℃離心 10 分鐘。 6. 將上清液置入新的離心管(1.5ml)中，再加入 500μl 無水乙醇，輕晃 之，靜置-20℃中約 1 小時後，以 13'000 rpm 的轉速在 4℃離心 20 分鐘。 7. 倒掉上清液，留下沉澱物(pallet)，以 800μl 的 70%酒精潤洗，在 4℃ 離心 5 分鐘。 8. 倒掉上清液，將離[心管置於乾淨的空氣中乾燥約 20 分鐘。 9. 最後加入 50μl 的 TE 緩衝液 (TE 緩衝液，配方見表三)中，待沉 澱物回溶後，保存於-20℃中備用。 將萃取完成的 DNA 原液取出 1μl 放置於 Nano drop 1000(Thermo Fisher Scientific)測定濃度，再由已測定 DNA 濃度值的樣本中取出適 當量的樣本 DNA 原液和 ddH2O 稀釋，使稀釋後的樣本濃度為 20ng/μl， 15.
(24) 在置於-20℃之冷凍箱中儲存備用。. 五、擴增片段長度多型性( AFLP) 本研究選用 AFLP 作為主要的分子標記法。依據 1995 年 Vos 等 人所提出 AFLP 之實驗方法及接合子序列(adaptor)進行，AFLP 實驗 流程，分為三個部份。首先，利用兩種限制酶酵素(restriction enzyme) 切割基因組 DNA 後，在這些片段的兩端黏合上相對應的接合子序列， 其 序 列 包 含 核 心 序 列 (core sequence) 及 限 制 酶 專 一 序 列 (enzyme-specific sequence)，其次執行選擇性擴增限制片段，利用與接 合子序列對應的引子(primer)進行，引子的設計，包含一段核心序列、 一段限制酶專一性序列及具選擇性的衍伸序列(selective extension)， 衍伸序列由 0 到 3 個可任意組合的鹼基組成，此步驟需進行兩次聚合 酶連鎖反應(PCR)，分別為前擴增反應(pre-selective amplification)和選 擇性擴增反應(selective amplification)，在選擇性擴增時，添加螢光標 定於引子的 5' 端，透過引子的引導下，擴增出具有與引子相對應的 DNA 片段。最後，進行瓊膠電泳分析擴增的片段大小。 (一) 限制酶切割(Digestion)及 adaptor 接合(Ligation) 1. 取 200 ng 基因組 DNA，加入所需的限制酶酵素(EcoRI , MseI，見 表五)及相對應的反應試劑(Digestion 緩衝液配方，見表四)，於 37℃ 16.
(25) 下進行 1.5 小時切割 DNA 反應後升溫至 65℃處理 15 分鐘去除限 制酶活性。 2. 將設計完成的 adaptors(adaptors，見表五)及相對應的反應試劑 (Ligation 緩衝液，配方見表六)加入上述的 DNA 中，於 22℃作用 1 小時。. (二)前擴增反應 (Pre-selective amplification) 1. 將 Ligation 完成後的產物稀釋 10 倍備用。 2. 取 1μl 已稀釋 10 倍的 DNA 片段，加於 Preselective amplification 反應所需緩衝液中(Preselective amplification 緩衝液配方，見表七)， 以 BIO-RAD S1000TM Thermal Cycler 進行反應，引子接合溫度為 56℃(Preselective amplification 循環流程，見表八)。. (三)選擇性擴增反應 (selective amplification) 1. 將 Preselective amplification 之產物稀釋 20 倍備用。 2. 取 1μl 已稀釋 20 倍的產物，加入已添有螢光標定之 EcoRI 引子的 Selective amplification 反應所需緩衝液中(Selective amplification 緩 衝 液 配 方 ， 見 表 九 ) ， 進 行 Selective amplification 。 (Selective amplification 循環流程，見表十)。. 17.
(26) (四)電泳 PCR 反應後各樣本所得之產物各取 2 μl 加上 1 μl 的 Loading dye 於 2 % 洋菜膠、60 伏特、0.5× TBE 緩衝液中，進行瓊膠電泳 120 分 鐘後，在 UV 燈照射下用相機拍照記錄、確認產物並將剩餘產物送交 生技公司做基因分型(genotyping)的檢測。. 六、資料分析 (一) 台灣油杉樹高與胸徑之比較 根據採樣時，所獲得的基礎形態資訊(樹高及胸徑)，使用 JMP7.0 統計套裝軟體中的 ANOVA 檢定，來分析台灣油杉各族群間的基礎型 態是否有顯著差異。. (二) AFLP 條帶之取得 本研究所獲得的基因分型數據將以軟體 GeneMarker V1.91 來開 啟，依據軟體顯示之螢光訊號的強弱及 DNA 片段的長度，利於篩去 螢光訊號太高或太弱的數據，得到最終可分析的完整數據。我們所使 用的 mark 為 GS500，最終的數據篩選條件為螢光強度(intensity)必須 大於 100，DNA 片段介於 50 到 500 bp 之間。. (三) AFLP 有效條帶及多型性(Polymophism)條帶之獲得 18.
(27) 自不同族群中隨機選取兩個樣本，進行重覆 3 次的 12 組引子的 AFLP 實驗，利用所獲得的 genotyping 數據，刪除再現性較低的條帶， 並計算出各組引子的錯誤率，已獲得 AFLP 有效條帶數。 錯誤率的計算如下: 丟失的數據數(missing data) AFLP 條帶數×[族群數×每族群選取的數量×實驗重覆次數] 多型性(Polymophism)條帶之獲得，將藉由 AFLPsurv(Vekemans et al., 2002)的篩選，AFLPsurv 將篩選出對偶基因頻率介於 0.05 到 0.95 間的多型性條帶。. (四) 族群遺傳結構之分析 AFLP 為顯性分子標記，因此估算各種遺傳參數時將是利用條帶 出現與否來進行估算。估算參數包含遺傳分化值(Fst)、遺傳歧異度 (diversity)與階層式遺傳結構(AMOVA, analysis of molecular variance) 等 。 遺 傳 分 化 值 Fst(Weir & Cockerham 1984) ， 此 參 數 將 利 用 ARLEQUIN 3.5 (Excoffier & Lischer 2010) 來 估 算 兩 兩 族 群 間 的 pairwise FST 值，選用 Slatkin's distance，並進行 50000 次 permutation test 分析，所獲得的結果再經由 False discovery rate(FDR)校正(Benjamini et al., 2001)以確認 pairwiseFST 值是否具有顯著性。本研究也使用 19.
(28) AFLPSurv (Vekemans et al., 2002)及 Detsel1.0 (Vitalis et al., 2001)來分 析各族群間的遺傳分化值。階層式遺傳結構的分析能估算群體內的遺 傳變異，分辨哪種階層下有明顯的遺傳差異，可分析階層包含分群間 (among group)、分群內或族群間(within group or among population)與 族 群 內 (within population) ， 此 參 數 將 使 用 ARLEQUIN 3.5 中 的 AMOVA 分析，並執行 50,000 次的重覆排列加以估計得之。為獲得台 灣油杉之族群與大陸 6 種油杉族群間的關係，本研究將利用族群間 Fst 值做為 distance matrix 分析，中並建立 neighbor-joining 親源樹， 將操作於 MAGA4.0(Tamura et al. 2007)中。. (五) 適當的族群分群之建立 採用軟體 STRUCTURE (Hubisz et al. 2009)來分析 AFLP 所獲得 之基因型數據，已建立適當的分群數，STRUCTURE 假定所有樣本共 來自 K 個族群，接著對這些樣本每一個基因座的對偶基因頻率加以 定義，再利用貝氏分群策略(Bayesian clustering approach)來建立族群 結構並指定單一樣本歸屬於哪一個族群。 STRUCTURE 也可以加入採樣地點的資訊，可獲得更清楚的歸群 結果，並使用機率對數的改變值 ΔL(K)來校正所獲得的結果，以判斷 出最適當的歸群數為何(Evanno et al. 2005)。此軟體可以用來了解以 20.
(29) 地理位置劃分的族群是否符合 STRUCTURE 所得的歸群結果，並可 以對所有採集族群做出最適當的歸群。分析台灣油杉的族群結構 K 值的設定由 K=1 至 K=6，burnin length：100,000、MCMC (Markov Chain Monte Carlo)Raps：1,000,000 並皆使用 no admixture model 做分析。. (六) 檢測族群間基因交流的程度 Isolation by disrance 容易發生於基因交流受阻的族群內，導致族 群分化與地理距離有相關性。本研究使用 Mantal test，為檢測台灣油 杉之族群遺傳距離與地理距離間是否具有相關性，若有相關性存在， 表示族群內基因交流有受到某種程度上的阻礙而產生 isolation by distance 的 情 形 。 本 研 究 Mantal test 的 使 用 操 作 於 http://ibdws.sdsu.edu/~ibdws/此網頁所提供的 Isolation By Distance 檢 測功能，遺傳距離採用 pairwise FST 值，地理距離採用兩點間的的實 際地理距離來檢測(Jensen et al., 2005)，執行 30000 次 randomizations， 並使用 reduced major axis regression(RAM)來進行相關性的校正，以獲 得各族群內基因交流的情形。. (七) 天擇作用下受到選汰的基因座 為了解台灣油杉族群，在演化的過程中是否有受到天擇作用之影 響而發生基因組適應性的分歧。此部分本研究將藉由 DFDIST、 21.
(30) (Beaumont & Balding, 2004) 與 BayeScan (Foll & Gaggiotti, 2008)等中 性檢測方法，來檢測族群內是否有基因座受到天擇的影響。Fst 為遺 傳分化值，中性檢測的方式可藉由兩兩族群間所獲得的 Fst 值而找出 可能受到選汰壓力影響的離群基因座(outlier loci)。本研究將使用 MCHEZA 工作平台(Antao et al., 2011)中的 DFDIST(Caballero et al., 2008)來檢測族群中受到天擇的基因座，DFDIST 是依據中性假說及基 因交流模式符合 Wright's island model 為前提下，利用貝氏分析 (bayesian approach)獲得兩兩族群間的 Fst 值，並估算此情形下的 P-value，找出落於 95%信賴區間以外的離群基因座，最後結果再進行 Bonferroni 校正，除去可能逢機出現的離群基因座。軟體 Bayesfst 與 BayeScan 則允許族群間基因交流不等比的情形，並皆採用 MCMC 及 貝氏迴歸模型(Bayesian regression model)來檢測受到天擇的基因座。 Bayesfst 找出受天擇的群基因座是利用轉換後的 P-value 來判定，所 獲得的結果也將會進行 FDR 校正，以排除可能逢機出現的基因座。 BayeScan 則 是 利 用 Bayes factor 值 來 判 定 離 群 的 基 因 座 (Bayes factor=L(受到天擇作用)/L(符合中性假說)、L 為後機率值)。. (八) 環境因子的篩選 本研究收集 11 個環境因子做檢測，環境因子包含每月平均氣溫 22.
(31) (℃)、絕對最高溫度(℃)、絕對最低溫度(℃)、平均風速(m/s)、平均降 水量(mm /month)、相對濕度(%)、平均雲量(1-10)、日照時間(hours)、 最高氣溫>30℃的天數、最低氣溫<10℃的天數、降雨日數(每月降雨> 0.1 毫米的天數)。所收集到的環境因子，來自於台灣中央氣象局提供 (Central Weather Bureau of Taiwan)。台灣中央氣象局於全台共設立 390 個氣象站記錄過去 21 年(1990 年至 2011 年)的氣象因子。本研究各樣 地並非一定位於該氣象站範圍之內，因此本研究各樣地的環境因子之 獲得來自於 ArcGIS 軟體中 Kriging method 與 spherical model 的推估 而得之(Chiu and Lin 2004；Hunter &Meentemeyer 2005)。所獲得的各 樣 地 的 環 境 因 子 我 們 將 利 用 多 變 量 分 析 (MANOVA,multivariate analysis of variance)中的 Pillai-Bartlett 統計來分析 11 個不同的環境因 子是否造成台灣油杉 5 族群之間在棲地上有所差異，也利用主成分分 析(PCA, Principal component analysis)將每月 11 個環境因子在族群間 的相關係數形象化。其次，本研究也利用變異數分析(ANOVA, analysis of variance)分別比較單一環境因子在不同族群內是否有顯著差異。以 上的分析皆操作於 R 套裝軟體。. (九) 適應性演化基因座的檢測 為了瞭解族群在地適應性演化的差異是否與環境因子相關，本研 23.
(32) 究將使用 Spatial analysis method(SAM)(Joost et al.2008)來檢測各個基 因座的頻率和環境因子間是否有相關性。此分析方法主要採用的統計 方式的邏輯回歸檢測(logistic regression) (Joost et al.2008) 。為了檢驗 此相關性是否具有統計意義，本研究將使用 Wald test 統計方式來評 估，而為了避免統計結果的顯著性是來自於逢機出現，我們將採取 Bonferroni 校正以減少這類情形發生。本研究基於了解族群內是否有 受到分歧天擇(divergent selection)，而進一步針對各族群內的適應性 演化基因座進行 linkage disequilibrium 之檢測。. 24.
(33) 第四章結果 一、台灣油杉樹高與胸徑之比較 根據台灣油杉母樹樣本之樹高與胸徑，以 T 檢定，發現台灣油杉 族群間在樹高上有顯著的差異( t= 3.445, P < 0.05) (圖 2)。. 二、擴增片段長度多型性引子的篩選 本研究經由前測，篩選出再現性較高，錯誤率較低的引子組合。 於前擴增反應中使用了 1 組引子(表十一)，於選擇性擴增反應中使用 了 12 組引子(表十二)來篩選。選擇性擴增反應的引子，皆為 3 端延 伸三個鹼基之引子，以減少擴增出的條帶數，增加條帶的專一性，並 於 EcoRI 端增加螢光標定 Fam 或 Hex，以利後續分析。 本研究使用 12 組選擇性擴增引子，對 190 株樣本進行 AFLP 分 析。由 12 組選擇性擴增引子共篩選出 465 個有效條帶，平均每對引 子可獲得 38.75 個有效條帶，錯誤率約為 4%以內(表十二)，片段長度 介於 100 bp 至 500bp。. 三、遺傳歧異度 多型性條帶及遺傳歧異度，皆經由 AFLPsurv 的分析。台灣油杉 族群及其他種油杉族群中多型性百分比(Perenct polymophism)平均為 72.08 %，其中多型性百分比最高的族群是台灣油杉大武 30 林班(DO； 25.
(34) P= 98.5%)，其次為姑婆寮族群(BO；P = 85.2%)、石槽族群與大陸鐵 堅油杉族群(CO、Kd；P = 82.6%)，最低的是江南油杉族群(CHKf； P= 29.2%)(表十三)。本研究樣本包含台灣油杉五個族群、其他 4 種油 杉族群，共 188 株樣本。遺傳歧異度(diversity)最高的是台灣油杉大 武 30 林班族群(DO；He = 0.313，其次為鐵堅油杉族群(Kd；He = 0.268)、 台灣油杉姑婆寮族群(BO；He = 0.241)、大陸油杉)族群(CHKp；He = 0.211)、台灣油杉金瓜寮族群(AO；He = 0.210)，最低的是江南油杉 (CHKf；He = 0.150)。遺傳歧異度範圍介於 0.313 到 0.150 之間(表十 四)。. 四、族群遺傳結構與分群 台灣油杉 5 個族群、鐵堅油杉 1 個族群以及其他油杉視為 1 個族 群，總計共有 7 個族群下，遺傳分化值 Fst 值依據兩兩差異(pairwise difference)的方式估算(表十五、表十六)。台灣油杉金瓜寮(AO)、姑婆 寮(BO)、石槽(CO)族群間沒有顯著分化，但與大武 30 林班(DO)及 41 林班(EO)之族群間皆具有顯著分化(P < 0.0429, FDR)，分化值介於 0.04303 至 0.09943 之間。台灣油杉大武 30 林班(DO)與 41 林班(EO) 間呈現顯著分化 P < 0.001, FDR)，分化值為 0.0942。為檢測台灣油杉 之族群的遺傳距離是否與地理距離具有相關性(isolation by distance)， 26.
(35) 以 IBDWS ver 3.23 進行 Mantal test 來檢測其相關性，結果呈現台灣 油杉族群間遺傳距離與地理距離間具有顯著正相關(r = 0.935, P = 0.0078；圖 3)。 族群分群是將族群結構分類，進一步提供兩兩比較的分群數。 STRUCTURE 使用貝氏(Bayesian)的方法分析族群結構，估算可靠的 機率值，以獲得最適當的分群數。台灣油杉樣本分析結果顯示於圖 4， 以相同顏色表示相似的分群。分群結果建立於假設族群間不雜交(no admixture)，結果顯示 ΔL(K)值在 K=2 時介於 250 與 300 之間，其機 率值最高(圖 5)。台灣油杉族群金瓜寮(AO)、姑婆寮(BO)、石槽(CO) 族群可歸為同一群；族群大武 30 林班(DO)與 41 林班(EO)歸為另一群。 STRUCTURE 之結果與台灣油杉目前地理分布符合。 AMOVA 之分析，目的在於了解分群之間的差異，檢測階層性的 遺傳變異是否顯著。結果顯示台灣油杉族群不分歸群的條件下，族群 間(ΦST)有顯著分化(ΦST = 0.06316, P < 0.001)(表十七)；當族群依 STRUCTURE 之結果分為 2 歸群: 一群組為金瓜寮(AO)、姑婆寮(BO) 及石槽(CO)族群，另一群組為族群大武 30 林班(DO)與 41 林班(EO) 的條件下，AMOVA 結果顯示，2 歸群間(ΦCT)沒有顯著分化(ΦCT = 0.03554, P = 0.0988)，歸群下族群(ΦSC)及族群間(ΦST)有顯著分化(ΦSC = 0.04105,ΦST = 0.07513, P < 0.001)(表十七)。 27.
(36) 台灣油杉與大陸其他 4 種油杉的親緣關係樹以 Neighbor joining 的方式建立。以油杉(CHKf)、雲南油杉(CHKe)、江南油杉(CHKc)作 為主要的外群，結果發現台灣油杉族群間親緣關係相當密切，但可看 出南部與北部族群有些微的分化現象。鐵堅油杉(Kd)與台灣油杉於親 源關係尚未達到高度分化(見圖 6)。. 五、台灣油杉環境因子的差異 本研究各樣地的環境因子之獲得來自於 ArcGIS 軟體中 Kriging method 與 spherical model 的推估而得(圖 7)。為了理解台灣油杉 5 個 族群棲地環境是否有所差異，本研究利用多變量分析 (MANOVA, multivariate analysis of variance)中的 Pillai-Bartlett 統計值來分析台灣 油杉 5 個族群自 1990 至 2011 年 11 個不同的環境因子的差異。結果 顯示台灣油杉 5 個族群間在棲地環境上有顯著的差異(V4= 1.7859, F44, 192 =. 3.5199, P < 1.03e-09)(見表十八)，其中相對濕度(RH)、平均雲量. (CLO)等四個環境因子在族群間有顯著差異。本研究將基於每月 11 個環境因子的相關係數進行主成分分析(PCA, Principal component analysis)，結果顯示台灣油杉 5 個族群的環境因子可被區分為 2 群， 分別為北部族群(包含: 金瓜寮、姑婆寮、石槽)與南部族群(包含: 大 武 30 林班、大武 41 林班)(見圖 8)。另外，根據變異數分析(ANOVA, 28.
(37) analysis of variance)分析結果顯示，單一環境因子如相對濕度(RH)、 平均雲量(CLO)、潮濕日數(RainD)、日照日數(SunH)在台灣油杉之南、 北分群間具有顯著差異(圖 9a, b)。. 六、天擇作用受選汰的基因座 DFDIST、Bayescan 以及 Bayesfst 皆基於 Fst 值檢測離群基因座 (outlier loci)。主要受檢測對象為台灣油杉族群，經由 DFDIST 檢測後， 篩選出 31 個 outliers (包含: positive outlier : 18 個與 Balancing outlier: 13 個)(表十九，圖 10)；經 Bayescan 篩選出 2 個 positive selective outliers(圖 11)；經 Bayesfst 篩選出 9 個 positively selected outliers(表十 九，圖 12)。以一個方法檢測獲得顯著正向偏離中性演化之基因座 (outlier loci)共有 19 個。以二個以上方法檢測呈現顯著正向偏離中性 演化之基因座共有 8 個，分別是 24、104、195、234、253、367、372、 424。經三種方法檢測皆呈現顯著正向偏離中性演化的基因座有 2 個， 分別為 234、367。DETSEL 則是以兩兩比較的方式檢測正向偏離中 性演化的基因座，結果再經由 Bonferroni 之校正，結果顯示台灣油杉 金瓜寮(AO)與大武 41 林班(EO)間篩選出 21 個正向偏離中性演化之基 因座(圖 13)；台灣油杉石槽族群(CO)與大武 41 鄰班(EO)間篩選出 138 個正向偏離中性演化之基因座(圖 14)。經 DETSEL 發現有 13 正向偏 29.
(38) 離中性演化個基因座屬於台灣油杉大武 41 林班族群相較於坪林金瓜 寮及石槽族群間共有，分別為 18、30、82、195、234、271、285、 372、393、409、426、431、444(表十九)。. 七、適應性演化基因座與環境因子的關連 SAM 依據 Wald test 檢測各個基因座的頻率和環境因子間的關連 性，呈現顯著關連(P-value < 1.50E-07)的基因座共有 11 個，分別為 18、24、32、101、104、234、253、367、409、424 及 426。台灣油 杉族群中，SAM 所檢測出偏離中性演化的基因座正好符合其他檢測 方法篩選出偏離中性平衡的基因座。經由 SAM 所檢測出偏離中性演 化的基因座皆與 5 個以上不同的環境因子呈現顯著關連(表二十)。本 研究基於了解台灣油杉族群內是否有分歧天擇(divergent selection)的 情形，而進一步進行 linkage disequilibrium 之檢測，檢測結果顯示台 灣油杉各族群內皆具有顯著的適應性基因座間的連鎖。台灣油杉金瓜 寮族群(AO)、姑婆寮族群(BO)以及大武 41 林班族群(EO)內各具有獨 特適應性基因座間的連鎖。金瓜寮族群(AO)內有 3 個獨特的適應性基 因座間的連鎖，分別為 Pair(24,409)、Pair(32,431)、Pair(253,367)；於 姑婆寮族群(BO)內有 2 個獨特適應性基因座間的連鎖，分別為. 30.
(39) Pair(18,426)、Pair(367,424)；大武 41 林班族群(EO)內有 2 個獨特適應 性基因座間的連鎖，分別為 Pair(101,104)及 Pair(234,253)(表二十一)。. 31.
(40) 第五章討論 一、AFLP 引子之篩選 AFLP 屬於高度再現性的分子標誌，大部份的研究顯示錯誤率 (error rate )介於 2~5%間(Bonin et al. 2004)。本研究為正確的解釋數據 並獲得可靠的估算結果，在篩選條帶時，採取於各族群 2 個樣本並重 覆實驗流程 3 次，並在過程中排除錯誤率較高的引子及條帶，以維持 錯誤率低於 5%之內。. 二、族群遺傳歧異度 一物種之族群是否能長期存在，主要取決於能否維持族群內的遺 傳歧異度，遺傳歧異度也代表該物種之族群能否具有面對新選汰壓力 的適應力。本研究利用 AFLP 方式檢測，AFLP 屬於顯性標誌，因此 無法直接量化對偶基因的頻率，因此 AFLP 標誌在估算基因頻率時， 通常會需要符合一些假設性的條件(如: 假定在哈溫平衡原則下)加以 推估。由於估算的過程中有假設性的因子存在，因此估算出的遺傳歧 異度可能有所誤差，不過假使研究對象的交配方式屬於異交 (outcrossing)者，在此假定條件下，所估算出的數值並不會有很大的 錯誤(Yeh & Boyle, 1997)。反之，自交(selfing)體系的物種，可能就會 獲得不精確的數值。依據前人研究結果顯示，針葉樹大多屬於異交體 32.
(41) 系(Loveless & Harmrrick, 1984；Fazekas &Yeh, 2001)，故本研究對象 台灣油杉所估算所得之數值有一定的參考價值。本研究同時也利用不 需符合哈溫平衡原則下運算的 AMOVA 分析，因此所估算遺傳歧異度 與族群結構不受顯性標誌的問題影響。 本研究 AFLP 檢測台灣油杉之遺傳歧異度，發現北部金瓜寮(AO)、 姑婆寮(BO)、石槽(CO)的遺傳歧異度皆低於南部大武的族群，推估可 以因為北部之族群原生環境不佳及數量相較於大武族群來的少，導致 個體間基因交流有所阻礙(張淳琤，2001；林文龍，2004)。. 三、台灣油杉族群結構 依據 STRUCTURE 分析結果顯示，最適當的分群數為 2 群，將 坪林金瓜寮(AO)、姑婆寮(BO)、石槽(CO)之族群可歸為一群；大武 地區 30 林班(DO)及 41 林班(EO)可歸為另一群，此結果與 2001 年張 淳琤以 RAPD 標誌的研究結果不盡相同。張，2001 在文章中以 Nei and Li’s 相似性係數相似性指標將台灣油杉分為四大群。第一群，包含了 北部坪林油杉自然保留區文山事業區第 40 林班，第 41 林班(即是本 研究金瓜寮(AO)、姑婆寮(BO)、石槽族群(CO))、礁溪油杉自然保護 區宜蘭事業區第 24 林班、第 25 林班(因礁溪 24 林班及 25 林班族群 並非台灣油杉母樹族群，因此本研究並未將這些林班納入本次研究分 33.
(42) 析樣本之中)；第二群，包含了南部台東林管區管理處大武台灣油杉 自然保護區大武事業區第 41 林班(即是本研究大武 41 林班(EO)族群)； 第三群，包含了台東林管區管理處大武自然保留區大武事業區第 30 林班(即是本研究 30 林班(DO)族群)；第四群，包含了達仁山區第一 陵線及第二陵線(本研究因考慮達仁山區第一陵線及第二陵在生態族 群尺度下，應歸入大武 30 林班不應該因人為劃分而區分開來的原則 下，本研究將達仁山區第一陵線及第二陵線之樣本歸納入大武 30 林 班中)。本研究歸群結果雖然與張，2001 的研究中結果不同，但結果 均支持台灣油杉南北不連續分布的情形。在 2 歸群的階層性遺傳結構 (AMOVA)分析中，歸群間((ΦCT))無顯著分化，由於遺傳基因組的分 歧，大多受到基因流動(gene flow)的程度決定，因此藉由檢測 AFLP 篩選出的基因座其 FST 值之頻率，可進一步了解台灣油杉族群間基因 流動的程度，該結果顯示台灣油杉族群間有相當較高的基因流動情形 (圖 15)(Feder et al., 2012)，此結果可以說明 STRUCTURE 為何分群不 明顯以及 AMOVA 兩歸群間(ΦCT)為何無顯著分化的情形。2 歸群下 AMOVA 檢測發現歸群下族群間(ΦSC)及族群間(ΦST)有顯著分化之情 形(ΦSC = 0.04105,ΦST = 0.07513, P < 0.001)(表十七)。為確定歸群下族 群間(ΦSC)的顯著分化是發生於北部族群(包含金瓜寮(AO)、姑婆寮 (BO)、石槽(CO)族群)亦或是南部族群(大武 30 林班(DO)、41 林班(EO))， 34.
(43) 因此本研究進一步針對台灣油杉 5 個族群間做 pairwise FST 值的比較， 所獲得的結果再以 FDR 校正，以排除逢機顯著的可能。其結果顯示 北部族群間並沒有顯著的分化(P > 0.05)，但南部族群間存有顯著分化 (P<0.001)(表二十二，表二十三)。因此，台灣油杉南部族群大武 30 林班(DO)與 41 林班(EO)間存有分化情形，此結果與王，1995 年以 RAPD 的研究結果吻合。由親源關係樹的結果也顯示南部和北部的台 灣油杉有所差異，此結果也與 1995 年王維洋及 2001 年張淳琤的研究 結果吻合(圖 6)。 本 研 究 結 果 顯 示 台 灣 油 杉 族 群 間 基 因 交 流 符 合 isolation by distance 的模式(圖 3)，表示族群間基因交流可能受到地理阻礙，距離 越近的族群間基因交流相較於越遠的族群來的頻繁。 針對台灣油杉、鐵堅油杉及大陸其他油杉之族群間兩兩比較所獲 得的 Fst 值中，可發現台灣油杉與鐵堅油杉及大陸其他外群間皆有顯 著分化的情形(表十五)但以 neighbor-joining 親緣關係樹的結果顯示台 灣油杉與鐵堅油杉有極為相近之親源關係(圖 6)。. 四、台灣油杉適應性演化 物種基因交流的程度，在物種分布範圍中，容易受到地形和環境 因素的影響，其結果將反應於該物種的族群結構上。因此當物種族群 35.
(44) 分布於不同地理或氣候環境(如平均降雨量、溫度)之棲地時，物種族 群間基因交流的程度可能發生改變，族群也可能受到不同環境天擇的 壓力而產生不同程度的適應性改變。族群間基因交流與族群為適應環 境而發生的改變，都可能促進遺傳分化與適應性演化的發生 (Garcia-ramos & Kirkpatrick, 1997)。本研究使用 3 種方法值檢測偏離 中性演化的基因座，另外也使用一種基於兩兩比較的檢測方式。基於 不同的運算方法所獲得的檢測結果，使檢測偏離中性演化之基因座更 加具有可靠性。各種檢測方式所獲得的偏離中性演化的基因座，基於 台灣油杉各族群間環境棲地有所不同的條件下，經過 SAM 的檢測後， 可進一步了解哪些偏離中性演化基因座與環境適應性有關連。檢測結 果顯示共有 11 個偏離中性演化基因座與環境因子具關連性(以下稱為 適應性基因座)。依據這些基因座在族群內所出現的頻率，可發現， 所 有 的 適 應 性 基 因 座 皆 會 在 特 定 族 群 中 表 現 出 較 高 的 頻 率 ，例 如:marker-18 於大武 41 林班(EO)族群中出現的頻率相較於其他族群 高、marker-32 於大武 30 林班族群(DO)中出現頻率相較於其他族群來 的高等(圖 16a.16b.16c.)。如此之結果支持這些基因座可與適應環境壓 力有關。當利用這些適應性基因座做族群間兩兩比較(pairwise FST)時， 結果可呈現出一適應性基因座在某族群內相對於其他族群的 FST 值來 的高，該結果表示，這些適應性基因座不僅在特定族群中出現頻率較 36.
(45) 高 ， 在 平 均 pairwise FST 的 值 上 也 呈 現 較 高 的 分 化 值 ( 詳 見 圖 17a.17b.17c.)，舉例而言，marker-18 於大武 41 林班(EO)族群中出現 的頻率最高，且在適應性基因座兩兩比較時所獲得的平均 pairwise FST 的值上也呈現較高的分化值、marker-32 於大武 30 林班(DO)族群中出 現頻率最高，且在適應性基因座兩兩比較時所獲得的平均 pairwise FST 的值上也呈現較高的分化值等。這結果也支持這些適應性基因座的存 在可能是為了適應某種環境壓力，而且這樣的適應性基因座可能會造 成族群間的分化。為了解適應性基因座出現頻率是否與族群間地理距 離相關，本研究利用迴歸進行分析，結果顯示在 11 個適應性基因座 中有 4 個基因座的基因頻率之差值和族群間地理距離呈現正相關(圖 18a. 18b)，分別為 marker-18、marker-101、marker-104、marker-426， 此結果顯示這些基因座的基因頻率隨著地理距離越遠而有越不同的 基因頻率，如此可能與不同族群間的分化有關。進一步本研究將以線 性迴歸之方式，探討 4 個基因頻率差值與族群間地理距離呈現正相關 性的適應性基因座是否與 11 個年平均氣象因子相關。結果顯示除了 marker-18 以外其餘 3 個適應性基因座皆與 3 個以上不同的年平均氣 象因子呈現相關性(表二十四)。 本研究基於了解族群內是否有分歧天擇(divergent selection)，而 進一步進行 linkage disequilibrium 之檢測，檢測結果顯示台灣油杉各 37.
(46) 族群內皆具有顯著的適應性基因座間的連鎖。於台灣油杉金瓜寮族群 (AO)、姑婆寮族群(BO)以及大武 41 林班(EO)族群內各具有獨特適應 性基因座間的連鎖。基於本研究檢測 linkage disequilibrium 時，採用 個別族群分別分析的方式，又在不同的族群內找到不同的 linkage block，因此該結果可代表不同族群因環境條件不同而造成受天擇作 用的基因簇(gene cluster)有所不同，最終可能導致族群基因組受到分 歧型天擇的影響逐漸分化，甚至有趨於種化的可能(Hohenlohe et al., 2012)。因此，台灣油杉族群間可能已受到分歧型天擇的影響，產生 不同的適應性演化。. 38.
(47) 第六章結論 本研究經由環境因子之調查以及 AFLP 分子方法，發現台灣油杉 南、北族群間棲地環境差異大，族群間有分化的情形發生，在族群內 找到多個受天擇作用的基因座，並且發現該基因座與環境因子具有關 連性，除此之外也發現在台灣油杉不同的族群內具有不同的連鎖區域， 這代表台灣油杉可能已受到分歧型天擇的影響，產生不同的適應性演 化。. 39.
(48) 第七章參考文獻 金平亮三。1936。台灣樹木誌。台灣總督府中央研究所林業部。 王維洋。1995。分子生物技術於台灣特有及稀有植物遺傳變異研究之 應用。自然保育季刊 11: 10-13。 何政坤、楊政川。1995。台灣油杉空粒種子形成原因與體胚誘導之探 討。台灣林業試驗所簡訊 2 (2): 9-10。 陳述、范明仁。1999。淺談 AFLP 分子標幟-種原遺傳歧異分析與品 種鑑定的新寵兒。台灣省農業試驗所技術服務。37: 21-25。 何政坤、張淑華、蔡錦瑩。2000。台灣油杉空粒種子形成原因的探討。 台灣林業科學。15(2): 209-27。 張淳琤。2001。台灣油杉之遺傳歧異度分析。國立清華大學生命科學 研究所碩士論文。 林文龍。2004。台灣油杉的族群研究。國立台灣大學森林學研究所博 士論文。 洪西洲、林鴻忠、李明仁、鍾振德。 2004。台灣油杉復育。台灣林 業。30(3): 50-57。 楊遠波。2007。台灣油杉植群統整之研究。行政院農業委員會保育研 究系列 95-29號。 Antao T., Beaumont M. A. 2011. Mcheza: A workbench to detect 40.
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(55) 第八章表目錄. 表一、台灣油杉及其他油杉物種樣本數及採集地資訊 族群代號. 採集地. 樣本數(株). 緯度 N°. 經度 E°. 台灣油杉-Keteleeria davidiana Var. formosana Hayata AO-. A- 坪林金瓜寮. 20. 24°54'52.278''. 121°40'36.679''. BO-. B- 坪林姑婆寮. 10. 24°53'52.959''. 121°41'13.058''. CO-. C- 坪林石槽. 81. 24°53'35.246''. 121°41'48.236''. DO-. D- 大武 30 林班. 18. 22°36'42.394''. 121°0'19.435''. EO-. E- 大武 41 林班. 34. 22°25'38.369''. 120°51'3.006''. 10. 25°08'10". 102°44'31. 9. 25°12'12". 103°07'51". 1. 26°37'48". 106°43'42". 1. 25°04'38". 110°18'23". 3. 26°47'29". 118°56'32". 3. 25°46'07". 109°33'27". 鐵堅油杉-Keteleeria davidiana Kd-. 1- 雲南-昆明市. 雲南油杉-Keteleeria evelyniana CHKe-. 2- 雲南-崇明縣. 柔毛油杉-Keteleeria pubescens CHKp-. 3- 大陸-貴州植物園. 黃枝油杉-Keteleeria calcarea CHKca-. 4- 大陸-廣西植物園. 江南油杉-Keteleeria cyclolepis CHKc-. 5- 福建-屏南縣. 油杉-Keteleeria fortune CHKf-. 6- 福建-長樂市. 47.
(56) 表二、CTAB-PVP 緩衝液配方 藥品名稱. 濃度. CTAB. 2%. NaCl. 1.4 M. EDTA. 20 mM. Tris-HCl. 100 mM. PVP. 1%. β-mercaptoeethenol. 0.2 %. ddH2O pH=8.0. 表三、TB 緩衝液配方 藥品名稱. 濃度. EDTA. 1 mM. Tris-HCl. 10 mM. ddH2O pH=8.0. 48.
(57) 表四、Digestion 緩衝液配方 試劑. 濃度. 劑量(μl). EcoRI. 20U/µl. 0.25. MseI. 10U/µl. 0.5. 10× NEBuffer EcoRI＊. 2 10μg/ml. 100×BSA ddH2O. 0.2 7.05 Total. 10μl. ＊. 50mM NaCl, 100mM Tris-HCl, 10mM MgCl2 and 0.025% Triton X-100 (pH 7.5). 表五、AFLP 所使用的 adaptor 及相關引子之序列 EcoRI. MseI. Recognition. 5'-G↓AATT↑C-3'. 5'-T↓TA↑A-3'. site. 3'-C↓TTAA↑G-5'. 3'-A↓AT↑A-5'. 5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'. 5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'. 3'-CATCTGACGCATGGTTAA-5'. 3'-TACTCAGGACTCAT-5'. Preselective. E00. M00. PCR Primers. 5'-GACTGCGTACCAATTC-3'. 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'. Adaptors. M00ACT/ M00CTA Selective E00＋AGT / E00＋CTA. M00TAG/ M00GAT. PCR Primers M00TGT/ M00GTA. 49.
(58) 表六、Ligation 緩衝液配方 試劑. 濃度. 劑量(μl). EcoRI adapter. 1. MseI adapter. 1. 10× Buffer Aa. 3. 10× Buffer B. 1. YEA T4 DNA ligasec. 3U. 0.3. ddH2O. 3.7 Total. a. 10μl. 0.4M Tris-HCl, 0.1mM MgCl2, 0.1M DTT and 5mM ATP (pH 5.0). c. Yeastern Biotech. 表七、Preselective amplification 緩衝液配方 試劑. 濃度. 10× Taq Buffera. 劑量(μl) 1. dNTPs. 2.5 mM. 0.8. Preselective PCR Primer (E00). 10 mM. 0.5. Preselective PCR Primer (M00). 10 mM. 0.5. U-Taq DNA polymeraseb. 5U. 0.2. ddH2O. 6 Total. 9μl. a. 250mM KCl, 100mM Tris-HCl, 15mM MgCl2 and 1% Triton X-100 (pH 9.2). b. Bernardo Scientific. 50.
(59) 表八、Preselective amplification 循環流程 溫度. 時間. 次數. Pre-heating. 72℃. 2 min. 1. Pre-denature. 94℃. 3 min. 1. Denaturing. 94℃. 30 sec. Annealing. 56℃. 30 sec. Extension. 72℃. 1 min. Final ext.. 72℃. 5 min. 1. End. 10℃. Forever. 1. 25. 表九、Selective amplification 緩衝液配方 試劑. 濃度. 10× Taq Buffera. 劑量(μl) 1. dNTPs. 2.5 mM. 0.8. Selective PCR Primer Fb. 10 mM. 0.35. Selective PCR Primer R. 10 mM. 0.35. U-Taq DNA polymerasec. 5U. 0.2. ddH2O. 6.3 Total. 9μl. a. 250mM KCl, 100mM Tris-HCl, 15mM MgCl2 and 1% Triton X-100 (pH 9.2). b. EcoRI 端含有螢光標定(Fam or Hex). c. Bernardo Scientific. 51.
(60) 表十、Selective amplification 循環流程 溫度. 時間. Pre-denature. 94℃. 3 min. Denaturing. 94℃. 30 sec. Annealing. T＃. 30 sec. Extension. 72℃. 1 min. Final ext.. 72℃. 5 min. End. 10℃. Forever. 次數. 36＊. 1th~13th cycles: T＃由 65℃開始每個 cycle 降 0.7℃；14th~36th cycles: T＃維持在 56℃. ＊. 表十一、前擴增反應引子之序列 Name. Sequence(5'→3'). Products. 5'-GACTGCGTACCAATTC-3' ＋. E00/ M00 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'. 52.
(61) 表十二、選擇性擴增反應引子之序列及錯誤率 Number of Sequence(5'→3). Name. Error rate Marks. 1. 5'-GACTGCGTACCAATTCAGT-3'. 1.E00＋AGT / M00ACT. 34. 0.032. 39. 0.038. 36. 0.043. 50. 0.040. 21. 0.037. 28. 0.040. 61. 0.039. 46. 0.040. 31. 0.035. 39. 0.043. 51. 0.039. 29. 0.035. 5'-GATGAGTCCTGAGTAAACT-3' 2.E00＋CTA2/ M00ACT. 5'-GACTGCGTACCAATTCCTA-3' 5'-GATGAGTCCTGAGTAAACT-3'. 3.E00＋AGT1/ M00TAG. 5'-GACTGCGTACCAATTCAGT-3' 5'-GATGAGTCCTGAGTAATAG-3'. 4.E00＋CTA2/ M00TAG. 5'-GACTGCGTACCAATTCCTA-3' 5'-GATGAGTCCTGAGTAATAG-3'. 5.E00＋AGT1/ M00TGT. 5'-GACTGCGTACCAATTCAGT-3' 5'-GATGAGTCCTGAGTAATGT-3'. 6.E00＋CTA2/ M00TGT. 5'-GACTGCGTACCAATTCCTA-3' 5'-GATGAGTCCTGAGTAATGT-3'. 7.E00＋AGT1/ M00CTA. 5'-GACTGCGTACCAATTCAGT-3' 5'-GATGAGTCCTGAGTAACTA -3'. 8.E00＋CTA2/ M00CTA. 5'-GACTGCGTACCAATTCCTA-3' 5'-GATGAGTCCTGAGTAACTA -3'. 9.E00＋AGT1/ M00GAT. 5'-GACTGCGTACCAATTCAGT-3' 5'- GATGAGTCCTGAGTAAGAT-3'. 10.E00＋CTA2/ M00GAT. 5'-GACTGCGTACCAATTCCTA-3' 5'- GATGAGTCCTGAGTAAGAT-3'. 11.E00＋AGT1/ M00GTA. 5'-GACTGCGTACCAATTCAGT-3' 5'- GATGAGTCCTGAGTAAGTA-3'. 12.E00＋CTA2/ M00GTA. 5'-GACTGCGTACCAATTCCTA-3' 5'- GATGAGTCCTGAGTAAGTA-3'. 1. 螢光標定為Fam. 2螢光標定為Hex. 53.
(62) 表十三、台灣油杉族群之多型性 Population. N. Loc_p. PLP(%). 金瓜寮- AO. 19. 375. 80.6. 姑婆寮- BO. 10. 396. 85.2. 石槽- CO. 80. 384. 82.6. 大武 30 林班- DO. 18. 458. 98.5. 大武 41 林班- EO. 34. 334. 71.8. 鐵堅油杉-Kd. 9. 384. 82.6. 雲南油杉-CHKe. 8. 335. 72.0. 油杉-CHKf. 3. 215. 46.2. 江南油杉-CHKc. 2. 136. 29.2. 335.2. 72.08. Average N: number of individuals.. Loc_p: number of polymorphic loci at the 5% level. PLP(%):proportion of polymorphic loci at the 5% level, expressed as a percentage.. 54.
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