玉山杜鵑複合群物種於更新世冰期過後之族群退縮與物種分歧

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(1)Postglacial population bottleneck and species divergence in Rhododendron pseudochrysanthum species complex. : Bo-Kai Liang. : Dr. Shih-Ying Hwang. I.

(2) 謝誌本研究得以完成，首先要感謝指導教授黃世穎博士的悉心指導，不厭其煩給予指引與解惑，使我獲益良多，在此謹致上最誠摯的敬意與謝意。感謝林讚標博士與廖培鈞博士在論文的架構上給予的指導，也因為你們在口試時的卓見，使本文更加完整，在此深表感激。授業期間承蒙系上師長之教導與教誨，授業恩情永誌難忘。再來要感謝研究室的夥伴，謝謝在統計上面非常幫助我的嘉瑩，提供我人生經驗的延衡，常常解答我疑問的亭亘，幫助我瞭解分析方法的裔強與為人善良的寓雯，你們使我的研究生活在辛苦之餘也不會枯燥。還要感謝好友，在教會的你們都是我的好夥伴，尤其啟光給予精神上不斷的支持。台大的建宏學長在我最徬徨時也一直鼓勵我，感謝你們。特別感謝珮茹與我的家人，在研究生的生涯中你們給予我極大的鼓勵。感謝珮茹，我不會忘記在一年當中與妳走過的互相鼓勵的時間，以後也將繼續彼此扶持。感謝我的父母在我最需要時給予我支援，並且契而不捨的鼓勵我，因為你們的支持讓我順利完成學業。. 梁博凱謹誌於國立台灣師範大學中華民國一百年二月. II.

(3) 目錄摘要.............................................................................................................1 壹、研究背景與動機 ................................................................................3 貳、前人研究成果 ....................................................................................5 一、氣候變遷影響植物族群變動與演化.............................................5 二、冰河期與間冰期交替影響植物的遷移.........................................5 三、族群破碎化使族群縮小並促進分化.............................................9 四、玉山杜鵑複合群的文獻探討.......................................................11 五、族群遺傳研究工具 EST-SSR.......................................................14 參、材料與方法 ......................................................................................16 一、研究材料 .......................................................................................16 二、實驗方法 .......................................................................................16 (一) Genomic DNA 萃取...................................................................16 (二) EST-SSR Genotyping.................................................................17 三、族群變動與族群結構的分析方法...............................................19 (一) 族群遺傳參數與遺傳歧異度...................................................19 (二) 族群結構 ...................................................................................20 (三) 族群縮小(bottleneck)................................................................22. III.

(4) (四) 早期族群變動與當代有效個體數量.......................................24 (五) 族群之間的遷移率...................................................................26 (六) 分析在天擇之下受到受到選汰的基因座...............................28 (七) 檢測氣候因素與 EST-SSR 對偶基因的相關 .........................31 肆、結果...................................................................................................32 一、遺傳歧異度 ...................................................................................32 二、族群結構 .......................................................................................34 (一) 族群分化 ...................................................................................34 (二) 族群結構的分群.......................................................................35 三、族群縮小(BOTTLENECK)歷史........................................................37 四、族群變動(DEMOGRAPHY) .............................................................38 五、族群遷移 .......................................................................................39 (一) 長期遷移(long-term migration)分析........................................39 (二) 近期遷移(recent migration)分析..............................................40 六、適應性演化 ...................................................................................40 伍、討論...................................................................................................42 一、遺傳歧異度 ...................................................................................42 二、玉山杜鵑複合群早期的有效族群數量大...................................44. IV.

(5) 三、玉山杜鵑複合群族群退縮的歷史...............................................45 四、族群退縮後物種分歧 ...................................................................46 五、族群破碎化與適應性演化 ...........................................................48 陸、參考文獻 ..........................................................................................52 柒、表附錄...............................................................................................60 捌、圖附錄...............................................................................................75. V.

(6) 表附錄表一、PCR 反應試劑..............................................................................60 表二、PCR 反應條件..............................................................................60 表三、玉山杜鵑複合群台灣杜鵑的遺傳歧異度 ..................................61 表四、檢測玉山杜鵑複合群與台灣杜鵑每個基因座符合哈溫平衡 ..62 表五、27 個 EST-SSR 基因座連鎖平衡 ................................................63 表六、對偶基因大小對於估算遺傳結構是否有效率之檢測 ..............64 表七、玉山杜鵑複合群與台灣杜鵑族群間兩兩比較 FST 值 .............65 表九、玉山杜鵑複合群與台灣杜鵑的 AMOVA 分析結果 .................67 表十、玉山杜鵑複合群 HETEROZYGOSITY EXCESS......................68 表十一、玉山杜鵑複合群族群變動 ......................................................69 表十二、玉山杜鵑複合群的早期有效族群數量與族群變動時間 ......70 表十三、玉山杜鵑複合群的每代遷移個體數 ......................................71 表十四、檢測玉山杜鵑複合群偏離中性演化基因座 ..........................72 表十五、DETSEL 檢測偏離中性演化基因座的分析結果 ..................73 表十六、EST-SSR 對偶基因顯著相關的環境因子 ..............................74. VI.

(7) 圖附錄圖一、本研究中玉山杜鵑複合群之採樣族群地理位置 ......................75 圖二、玉山杜鵑複合群個體之間的遺傳關係 ......................................76 圖三、玉山杜鵑複合群個體的分群結果 ..............................................78 圖四、遺傳分化(FST)與地理距離之間的相關性 ..................................79 圖五、UNROOTED NEIGHBOR-JOINING 親緣樹 ............................81 圖六、MC 值與 95% M-RATIO 值的信賴區間....................................82 圖七、玉山杜鵑複合群族群縮小或是擴張的起始時間 ......................83 圖八、玉山杜鵑複合群近期的遷移率 ..................................................84 圖九、WALD AND G TESTS 顯著偏離中性平衡的基因座 ...............85. VII.

(8) 玉山杜鵑複合群物種於更新世冰期過後之族群退縮與物種分歧摘要玉山杜鵑複合群的成員包括紅星、南湖、玉山、森氏杜鵑，均為台灣特有種，形態相似並且分佈的海拔也相當接近。過去的研究發現玉山杜鵑複合群為單一起源，也發現族群過去有擴張的歷史。本研究目的是以遺傳學的方法研究玉山杜鵑複合群在氣候變遷之後族群破碎化的情形下受到族群縮小的影響。本研究使用微衛星 DNA 片段做多型性的分子標記，收集族群中的遺傳變異。藉由這些遺傳多型性的資料估計各種族群遺傳參數與檢測族群結構。本研究發現紅星杜鵑相對於玉山杜鵑複合群其他物種，其遺傳歧異度明顯低於台灣杜鵑。另外，依據長期基因交流量與 MSVAR 的檢測發現玉山杜鵑複合群早期的有效族群數量大，M-ratio 分析檢測到玉山杜鵑複合群經歷族群縮小的歷史，以上證據顯示玉山杜鵑複合群經歷族群縮小，由以紅星杜鵑比其他物種更嚴重。玉山杜鵑複合群族群隨距離而升高分化的程度，顯示族群因為縮小事件而降低基因交流的量導致分化，遺傳結構的分析顯示距離相近的族群其遺傳結構相似，以上兩點顯示玉山杜鵑複合群盤據於各山上的族群正在分歧。不同方法檢測到玉山杜鵑複合群天偏離中性演化的基因座，顯示玉山杜鵑複合群族群破碎化之後進行在地適應演化。. 1.

(9) Postglacial population bottleneck and species divergence in Rhododendron pseudochrysanthum species complex Abstract Rhododendron pseudochrysanthum species complex constitutes of R. pseudochrysanthum, R. morii, R. rubropunctatum and R. hyperythrum. Species in the R. pseudochrysanthum complex are all endemics to Taiwan and they are morphologically similar. Previous studies revealed that R. rubropunctatum was the origin of this species complex in which Pleistocene range expansion was found and population fragmentation occurred since the last glacial maximum. Aims of this study were to gather information to trace the effect of bottleneck that resulted in reduction of effective population size and genetic structure. Based on expressed sequenced tag (EST)-derived simple sequence repeats (SSRs) marker system, genotyping data of 27 EST-SSRs were analyzed and population genetic parameters were estimated. Severe bottleneck was found in the R. rubropunctatum populations and high level of genetic divergence in comparison with populations of other species in the R. pseudochrysanthum complex. In addition, high level of genetic divergence is associated with local climatic factors and resulted in local adaptation.. 2.

(10) 壹、研究背景與動機物種的種化模式最常見同域種化與異域種化，其中異域種化來自於因地理環境上的分離，族群間的基因交流機會降低，迫使不同族群分化。氣候會影響植物棲息地的分佈，氣候變遷使得植物的棲息地隨著時間擴張或者縮小，甚至造成棲息地分裂。冰河時期地表溫度下降，間冰期則溫度上升，過去的研究發現冰河期的出現與消退，使植物族群在經歷溫度升降，造成棲息地分裂，進而族群的個體數量下降。當族群個體數少時，遺傳漂變與自交讓族群遺傳變異程度進而下降，尤其自交會使得對生存有危害的基因突變在累積在族群裡，並且棲息地分裂使族群之間的基因交流受到限制，進而促使族群開始分化。最後分散各地的族群，因為面臨不同環境而可能有在地適應(local adaption)的發生。臺灣因地形的變化，特別是海拔的差異，使植物相豐富而存在很多特有種。台灣的杜鵑屬於 Hymenanthes 亞屬有五個物種，均為特有種，包括 Rhododendron formosanum、Rhododendron rubopuntatum、 Rhododendron hyperythrum、Rhododendron pseudochrysanthum、 Rhododendron morii，其分布的範圍有相當大的差異。除了屬 Hymenanthes 亞屬的台灣杜鵑(Rhododendron formosanum)以外，紅星杜鵑(Rhododendron rubopuntatum)、南湖杜鵑(Rhododendron. 3.

(11) hyperythrum)、玉山杜鵑(Rhododendron pseudochrysanthum)、森氏杜鵑(Rhododendron morii)四個物種因形態相近，而為玉山杜鵑複合群(R. pseudochrysanthum complex)，有關玉山杜鵑複合群親緣地理的研究，發現玉山杜鵑複合群的起源物種為紅星杜鵑。玉山杜鵑複合群物種之間的遺傳差異性低，分化的程度也低，因此過去的研究結果推論玉山杜鵑複合群在冰河時期擴張，而在間冰期時退縮，如此棲息地的擴張與退縮，改變可能的種化發生。本研究的目地是探討玉山杜鵑複合群族群變動時是否造成瓶頸效應而減少遺傳變異，甚至對族群的繁衍造成影響。研究假說為玉山杜鵑複合群在進入間冰期時因為族群破碎化導致族群縮小與族群分化。. 4.

(12) 貳、前人研究成果一、氣候變遷氣候變遷影響植物族群變動與演化變遷影響植物族群變動與演化植物無法像動物一樣倚靠移動尋找適合的生存環境，但是植物的分布會隨著時間進行動態的變化。新生代(Cenozoic era)的第四紀 (Quaternary period)時間範圍約 250 萬年前至今，文獻研究曾經預測第四紀的氣候變盪或是近期的人為因素都會影響環境的生存條件，使植物改變地理分布(Hewitt 2004)。氣候變盪對植物造成生存壓力也同時產生適合生存的棲息地，木本植物會拓殖(colonization)到適合生存的地點，但是被強迫留在原地無法藉由種子拓展的族群開始面臨生存壓力，被圍困的族群因為氣候改變的次數增加會使族群面臨負面影響 (Smulders 2009)。木本植物借由拓殖而遷移到適合生存的棲地也可能面臨生存的壓力，因為受到地形與氣候限制的族群被迫往較小的棲息地遷移，往往會造成連續分布族群因此而破碎化(Dechaine 2005)。地理分布的破碎化進一步可能造成族群分化與物種的形成。殘餘的棲息地就像孤立的島嶼，存活在不同生態環境的族群進行適應性演化 (Gavrilets and vose 2005)。. 二、冰河期與間冰期交替影響植物的遷移冰河期與間冰期交替影響植物的遷移地球進入第四紀(Quaternary)之後直到今時出現過多次冰河時期 (Ice Ages)。冰河時期是指全地球溫度重複下降的時期，同時會使地球. 5.

(13) 上冰原(ice sheets)的範圍擴大，直到間冰期溫度才會回升，冰原的範圍縮減，整個第四紀的範圍當中，地球經歷不斷的氣候變盪(Hewitt 2004)。台灣在第四紀的冰河時期，多次經歷與亞洲大陸之間的連結改變的事件。約三百多萬年前，台灣島形成於第三紀(Tertiary Period)當中的漸新世(Oligocene)時期，現今的地形結構和山脈約為兩百五十萬年前形成，當時地殼變動使使台灣島的地塊快速隆升，地質學家稱當時的事件為「蓬萊造山運動」(魏等, 1997)。台灣二百萬年前大約在上新世(Pliocene)到第四紀更新世(Pleicetocene)之間開始進入冰河時期。冰河時期來臨時地球上大量的水在南北極形成冰帽，導致海平面下降，中國大陸與台灣之間互相連結形成陸橋(land-bridge)，但是當間冰期來臨則海水大量增加，使海平面大幅上升造成陸橋沒入海中 (魏等, 1997)。在冰河期作用最強時期，南北極冰帽大量擴張，使全球海平面下降大約 120 公尺(Rohling et al., 1998)，此時陸橋已經出現。冰河期台灣並未覆冰，生長於高緯度的寒帶植物族群為了生存，可能經由台灣島與中國大陸陸橋向南遷移進入台灣，此可能為重要的物種遷入事件。大約一萬年前，第四紀更新世(Pleistocene)晚期，玉木冰期結束，最後一次冰河時期退去，氣溫回暖冰帽溶解使得海平面上升，海水再次大量增加，台灣和大陸之間的陸橋被淹沒至海中，而. 6.

(14) 形成現在的島嶼(Ota et al., 1997)。冰河時期來臨的時候環境溫度下降。冰川作用發生的時候，極地的冰川會往外擴散，同時溫暖氣候帶的範圍，海洋的範圍與植物棲息的範圍會往赤道的方向壓縮而變小，而在比較溫暖的氣候帶，物種從山上往平地遷移，熱帶雨林的棲息區域被切割而且分離(Hewitt 2000)。冰河時期植物會遷移到避難所(Refugia)以繼續存活，歐洲與北美的花粉化石提供證據，在冰河時期的避難所位於冰原與凍土 (permafrost)的南方(Hewitt 2000)，並且北美的海岸地區與洛磯山脈的冰川邊緣有發現避難所的所在(Abbott and Brochmann 2003)。由以上的研究可以知道，冰河時期植物棲息的區域會收縮至適合生存的地區，這些地區可能位在冰川的邊緣或是冰川未覆蓋的地表。冰河期結束後進入間冰期，氣候開始回暖，植物從避難所往外擴張，此時的棲息地雖然比避難所寬闊，卻無法完全回復上一次間冰期的分布形態(Hewitt 2000)。溫帶物種的棲息地在冰河期因冰川作用而被冰原覆蓋，到了間冰期時北方的族群遺傳多樣性比南方低，可以見到位於北方的族群是由避難所裡的族群擴張而來(Petit et al., 2002)。第四紀間冰期與冰河期的交替，使得族群不斷在收縮與擴張之間變化，因此避難所的族群是物種拓殖(recolonization)的來源(Alsos et al., 2005)。. 7.

(15) 一些文獻暗示植物在冰河期與間冰期的會出現不同的遷移行為 (Dechaine 2005)。分子遺傳的研究與花粉植物的化石顯示間冰期族群變動的形態，研究顯示當氣候變暖與冰原消退時，低海拔的植物往北方擴張，而高海拔的物種卻會往上坡(upslope)的方向延伸(Vierling 1998)。美國洛磯山脈的高海拔植物在冰河期廣泛分布，並且族群之間彼此相連，相反地，近代的調查卻顯示這些植物棲息地，明顯分離成群島的形態，並且族群被限制在高海拔的區域(Elias 1996)。由以上證據可以了解冰河期由於物種廣泛分布，使族群之間彼此相連，而 Dechaine (2005)根據 Hewitt (2000)的研究內容與美國洛磯山脈的間冰期族群分布，提出間冰期族群受限於地形變化比大與高海拔的山地，溫暖的氣溫可能迫使族群往高處遷移而使得棲息地破碎化 (fragmented)。台灣在冰河時期雖然只有少數的山頂被冰層覆蓋(Siame et al., 2007)，但是溫度急遽改變與氣候變動，仍然有可能影響植物的分布與造成族群變動。Tsukada(1966)等人以台灣的日月潭沉積於湖底的土，找尋孢子粉化石痕跡並加上 C14 同位素推估當時的年代，由此調查最後的冰河時期該區的植物族群。日月潭湖底的沉積土中孢子粉多為生活於冷溫帶的針葉類樹種，跟今日的植物族群分布地點比較，發現當時冰河時期生長在日月潭附近的植物族群，於今日則約生長於海. 8.

(16) 拔 2500 公尺山區。以氣溫與海拔的關係來看，海拔上升 100 公尺氣溫便下降 0.6℃，可以推測在同一海拔的平均溫度當時比現在低 8~11℃，低地勢的植物群以生活於高海拔的物種為主(Tsukada 1966)。由此當時台灣本島的寒帶植物族群可能會往低緯度或是低海拔的地區遷移，而寒帶植物族群在冰河退去之後，則向台灣北部或是高海拔地區遷移以尋求適合的生長環境，此時族群可能會經歷異地分離或是新環境的適應性演化而加速物種的種化。由於不同植物物種需要的生存的條件上有所不同，因此氣候變遷對不同的植物物種會造成不同的遷移結果。. 三、族群破碎化族群破碎化使族群縮小並促進分化使族群縮小並促進分化不論是人為或是自然因素均族群有機會造成植物族群破碎化。族群破碎化後會影響物種族群生態結構，分布與生態功能。族群破碎化之後，立即的影響包含喪失棲息地、降低族群裡個體的數量，並且增加殘餘族群之間隔離的程度(Lowe et al., 2005)。近十年有越來越多的研究者，對破碎化之後的族群的遺傳變化有興趣，開始朝向族群遺傳 (population genetic)的方向研究(Honnay and Jacquemyn 2007)。受到破碎化影響的族群，其遺傳改變主要在於遺傳歧異度降低、異質結合度降低與增加族群之間的分化，這些後果都是起因於隨機的遺傳漂變 (random genetic drift)和自交(inbreeding)以及基因交流下降(Lowe et al.,. 9.

(17) 2005)。破碎化的族群面臨不同的生態環境，會導致族群結構分歧，不同的生態環境也可能導致適應性演化(Laurance et al., 2007), (Gavrilets and Vose 2005)。族群縮小會影響族群的遺傳，族群數量下降的程度與持續的時間決定嚴重的程度(Lowe et al., 2005)。族群失去棲息地之後族群的數量變少，數個世代之後族群對偶基因歧異度下降，有效族群數量下降時 rare alleles 會先消失，經過數個世代更多的 common alleles 也會消失，造成遺傳歧異度降低(Ellstrand and Elam 1993)。有效個體的數量減少會增加遺傳漂變(genetic drift)的強度。遺傳漂變是由隨機而產生的事件，對於個體數量少的族群有較大的影響力，因為個體不一定都可以將基因傳給下一代，過程將會造成對偶基因頻率隨機變化，甚至是固定或消失在族群裡(Ellstrand and Elam 1993)。族群破碎化會增加族群地理上的隔離，預期會降低基因交流。基因交流的比例減少並且加上遺傳漂變的影響，使無法接收外來對偶基因的族群增加遺傳分化 (Young et al., 1996)。有效個體的數量減少還會增加自交(inbreeding) 的機率，自交首先會影響對偶基因的異質結合度，不斷與相似的基因型交配，會降低異質結合度並提升同質結合度。近親交配的另一個缺點便是有害的隱性遺傳會累積在族群裡(Lowe et al., 2005)。遺傳的變異程度是植物族群承受環境變化的能力的重要關鍵，環. 10.

(18) 境給予的挑戰以氣候變化為主，當植物族群裡的遺傳歧異度降低時會影響族群適應環境的能力，增加族群滅亡的機率(Booy et al., 2000)。不過，植物族對群棲息地破碎化的感受性會受生活史的特性而不同，例如壽命長短、繁殖系統的形式和種子的散佈方式(Lowe et al., 2005)。某些植物的族群分布破碎化之後仍然保持高的遺傳歧異度與低的族群分化程度，所以植物對於棲息地破碎化的反應也許不會都相似(Lowe et al., 2005)。破碎化後的殘餘族群可能存活在不同的生態環境，不同的生態環境會使族群遺傳結構改變，也可能進行在地適應 (local adaption)(Gavrilets and vose 2005), (Laurance et al., 2007)。. 四、玉山杜鵑複合群的文獻探討玉山杜鵑複合群分類上是杜鵑花科(Ericacae)杜鵑花屬 (Rhododendron)，廣泛分布於全球，除了南美與非洲之外的寒帶與溫帶均有分布。總共有 70 個屬，生存於台灣則有 6 個屬(黃等, 2005)。杜鵑花主要分布於北半球，台灣則從低地到 3000 公尺以上高山均有分布，在中國的紀錄達到 650 個種以上(Mabberley, 1997)。 Hymenanthes 是杜鵑花屬中常見的亞屬，包含 225 個物種 (Mabberley, 1997)。台灣的特有種杜鵑包含 13 個種以及 2 個亞種，其中 5 個特有種杜鵑被分類在 Hymenanthes 亞屬之下，這 5 個物種為台灣杜鵑(Rhododendron formosanum)、紅星杜鵑(Rhododendron. 11.

(19) rubropunctatum)玉山杜鵑(Rhododendron pseudochrysanthum)森氏杜鵑 (Rhododendron morii)與南湖杜鵑(Rhododendron hyperythrum)，玉山杜鵑、森氏杜鵑和紅星杜鵑分類屬於 Maculifera subsection，南湖杜鵑則是 Hymenanthes 亞屬裡面唯一屬於 Ponica subsection(Li et al., 1998)。複合群是在族群之間具有微小差異的外表型的物種集合。雖然有一些物種被建議分類為同一個物種，但是他們之間仍然存在著稍微不同的外型差異，其中紅星，玉山，森氏，南湖 4 個物種因外貌形態皆有極相似之處，由此物種複合群(species complex)的特性我們可以稱之為玉山杜鵑複合群(Rhododendron psedochrysanthum complex) (Chung, Lin et al., 2007)。玉山杜鵑複合群分布均在山地，紅星杜鵑生長於北部中海拔山區，紅星杜鵑至今在野生的環境只剩下少數的殘餘族群，並且已經被認為是瀕臨絕種的物種。森氏杜鵑與玉山杜鵑生長於高山的頂端，某些情況也被發現分佈在相近的地方，這些地點多在台灣中部與南部並且海拔在 3000~3950 公尺(Li et al., 1998)。森氏杜鵑與玉山杜鵑的開花時期互相重疊。森氏杜鵑開花時期為 3 月到 5 月，玉山杜鵑則為 4 月到 6 月。相反，紅星杜鵑分佈在台灣北部的山區，海拔約為 600~1200 公尺，南湖杜鵑的分佈則在台灣中部南湖大山 3000 公尺的海拔高度。玉山與森氏杜鵑也有形態與分佈上的雷同，經研究後發現極為相. 12.

(20) 似，故有人主張將其二者合併於同一物種(Lu et al., 1989)(Li et al., 1998)。前人使用分子遺傳的材料研究玉山杜鵑複合群的親緣關係，研究結果表示物種間親緣關係很接近，以葉綠體 DNA 基因 trnF-trnL 序列分析 8 種台灣特有種杜鵑，其中包含玉山杜鵑複合群 4 個物種，其結果顯示複合群裡 4 個物種為同一個物種(黃等, 2001)。更進一步以葉綠體 DNA 基因序列分析森氏及玉山杜鵑的親緣演化樹，發現森氏與玉山杜鵑會擁有相當多相似的單套型使兩者無法清楚分開，顯示森氏與玉山杜鵑為非常相似的物種(黃等, 2005)。以前的研究者指出葉綠體 DNA 在演化上的特性為母系遺傳，所以具有高度保守性，低變異會使得親緣分析的效果變差，另有研究使用核基因 ITS(internal transcribed spacer)分析南湖杜鵑，森氏杜鵑及玉山杜鵑親緣關係，發現此三者的遺傳距離為 0，紅星杜鵑與南湖杜鵑的遺傳距離則有 0.4(Tsai et al., 2003)，因此近期以葉綠體 DNA 與核基因 ITS 的序列分析得知親緣關係非常接近，但若以演化的研究來看，前人以葉綠體 DNA 基因 atpB-rbcL 的序列分析，可以得知由紅星杜鵑演化出玉山杜鵑與森氏杜鵑的趨勢(Chung et al., 2007)。前人推論玉山杜鵑複合群過去經歷過族群擴張，接著在間冰期 (Interglacial)經歷族群的破碎化(Chung et al., 2007)。目前玉山杜鵑複. 13.

(21) 合群呈現塊狀分布，可能是遠距離遷移的結果，也可能是由廣泛分布所剩下來的殘餘族群。第四紀末期環境氣候回暖，木本植物的族群往高海拔地方生長(Davis and Shaw, 2001)。以台灣地區來說，冰河時期雖然使得環境溫度下降，但是大部份的土地並未有冰層覆蓋，因此許多的物種為了生存，會遷移至適合生存的海拔而改變棲息地，造成族群的個體數量縮減或是增加。由 Chung et al., (2007)與 Tsukada (1966) 的研究結果可以推測，玉山杜鵑複合群很可能在冰河時期廣泛分布於中海拔地區，這是因為低海拔環境的溫度低，適合玉山杜鵑複合群生存。另外 Chung et al., (2007)的遺傳歧異度研究結果與玉山杜鵑複合群當代的棲息地分布可以推論，當冰河期結束之後氣候溫度會開始上升，造成族群個體數量縮減，而降低族群的遺傳多樣性。擴張-收縮的族群變動可能會造成玉山杜鵑複合群的棲息地破碎化，因此進一步推論分散在各山頂的族群難以基因交流，而分化出不同的遺傳結構。. 五、族群遺傳研究工具 EST-SSR 近年來在族群遺傳研究當中，簡單重複序列常被當作研究工具。簡單重複序列(simple sequence repeats, SSR)是微衛星 DNA(microsatellite DNA)的序列，含有短片段並連續重複排列，一個短片段單位約 1~6 個鹼基(Gupta 1996)。基因表現序列(express sequence tag)簡稱 EST，EST 位於基因譯碼區內，近年來許多 EST 資. 14.

(22) 料庫的建置可從其中發現有微衛星序列的存在，他們可簡稱為 EST-SSR (Ellis and Burke 2007)。EST-SSR 相比於其他的分子標誌 (molecular marker)有兩個優點，分別是鄰近基因表現區域跨物種使用效果佳，鄰近表現區域可以提供研究者探討基因在演化上的變異，判斷物種是否發生適應性演化。進一步，鄰近表現區域的特性使得具有相似基因的不同物種，可以偵測並比較其基因型，因此有良好的跨物種使用性。 EST-SSR 具有高度多型性，並且可以利用聚合酶連鎖反應擴增其序列以利研究者尋找變異之處(Ashley and Dow 1994)。EST-SSR 是 codominant marker，使其具有高度多型性，能夠偵測不同的基因座的遺傳參數，更進一步可以偵測基因座內的異質結合個體(heterozygote) 或是同質結合個體(homozygote)，進而推論族群的族群變動 (demography)或是族群結構(population structure)。利用 EST-SSR 的多型性，可以幫助研究者準確估算族群遺傳的參數如遺傳歧異度、族群間之分化差異、自交與雜交程度和有效族群數量等。EST-SSR 可以用於估計瓶頸效應和有效族群數量，也可以估算族群變動的歷程與時間點，文獻提出微衛星 DNA(microsatellite DNA)可以提供研究並區分早期與近期的族群變動過程(Faubet et al., 2007)。. 15.

(23) 參、材料與方法一、研究材料研究的對象為台灣特有種杜鵑 Hymenanthes 亞屬。此亞屬包含台灣杜鵑(Rhododendron formosanum)與玉山杜鵑複合群(Rhododendron pseudochrysanthum complex)。玉山杜鵑複合群包含四個物種，紅星杜鵑(Rhododendron rubopuntatum)、南湖杜鵑(Rhododendron hyperythrum)、玉山杜鵑(Rhododendron pseudochrysanthum)與森氏杜鵑(Rhododendron morii)。台灣杜鵑：特性為廣泛分佈，樣本數棲蘭山 13 個體、大雪山 15 個體、里龍山 15 個體、杉林溪 10 個體、思源 15 個體。紅星杜鵑：主要分布於島嶼北部，樣本數燦光寮 23 個體、菜公坑 14 個體。玉山杜鵑：主要分布於中南部山上，樣本數大雪山 20 個體、合歡山 19 個體、鹿林山 20 個體。森氏杜鵑：與玉山杜鵑的分佈地點相似，皆為高海拔分佈，樣本數大雪山 9 個體、阿里山 19 個體、合歡山 15 個體。南湖杜鵑：分佈集中於南湖大山山頂，樣本數南湖大山 45 個體。共計 253 個樣本。樣本採集地點的位置如圖一所示。. 二、實驗方法 (一一) Genomic DNA 萃取仿 Doyle and Doyle (1987)之 CTAB(hexadecyltrimethylammonium. 16.

(24) bromide)少量 DNA 快速萃取法，對杜鵑的葉片進行 DNA 萃取。採集回來之樣本，以清水沖淨，再以 75%的酒精表面滅菌，晾乾後至於研缽中，加入海砂及液態氮，快速將研缽內的葉片樣本磨成細粉狀。在葉粉回溫吸水前，放入-70℃的冷凍箱儲存備用。. (二二) EST-SSR Genotyping 以聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction)大量擴增 SSR 片段。為了鑑定 SSR 片段長度，使用螢光標定過的引子擴增目標序列，對於擴增後的 SSR 片段進行基因型鑑定。 1.設計引子：利用 NCBI 已有之 Rhododendron catawbiense 的 EST 資料庫下載序列，並以 CAP3 軟體分析取得非重複與完整長度之 EST 序列。接下來用 Tandem repeat finder (Benson 1999)軟體搜尋 EST 序列中簡單重複序列為 mono-, di-, tri-, tetra-及 pentanucleotide 為單位的重複序列。去除序列過短與 polyA 序列不用，再以 Primer3 軟體設計引子。被獲選進行擴增的 EST 序列，會使用 ESTSCAN2 軟體檢測 SSR 序列是否位於基因譯碼區，以利區別基因譯碼區與非基因譯碼區的引子。總共設計 27 個基因座的引子，再測試是否多樣性(polymorphism)可以提供足夠鑑別度，區別不同族群。 2.測試引子的可用性：. 17.

(25) 將設計完成的 EST 簡單重複序列引子，測試是否在 Hymenanthes 亞屬能夠跨物種使用。同一組引子對物五個物種進行擴增反應(同一個基因座)，PCR 反應條件列在表一與表二，PCR 產物於溴化乙啶螢光染劑染色後，以 1%瓊脂凝膠(agarose gel)進行電泳。PCR 產物於 1% 瓊脂凝膠內分離之後，再照射紫外光以確認是否得到正確的產物，以及是否每個物種都能有產物。經由測試得知 27 組引子的使用狀況良好，五個物種都能得到擴增的 EST-SSR 的產物。擴增效率越佳，產物的螢光強度就可以遠高於背景干擾的強度，越有利於分辨基因型的準確性。因此為了增進 PCR 的擴增效率，以溫度梯度的反應環境尋找最適合的反應溫度。目前得知最佳的反應溫度分為 42℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 62℃(表一)(表二)。 3.鑑定基因型多型性：為了追蹤並標記片段，會使用不同的螢光物質標定不同的引子，用作 PCR 產物的標誌。三種螢光物質發出不同的螢光波長，以不同顏色的螢光鑑定三個基因座的基因型，增加鑑定基因型的效率。為了鑑定片段長度，將以受到螢光標記的引子擴增 EST-SSR 後，以自動定序儀進行基因型的鑑定(genotyping)。擴增之後的 PCR 產物稀釋後用酒精沉澱 DNA，再以毛細管電泳方式分離片段。片斷大小的判讀以螢光 marker 的位置當作標準，再判定螢光 PCR 產物的大小。自動. 18.

(26) 定序儀為 MegaBACE 500 ( MegaBACE™ DNA Analysis System )，判讀的軟體為 MegaBACE Genetic Profiler Analyzer Version 2.2.。自動定序儀所得之 peak 即代表一個片段，讀取 peak 位置則可以的之片段長度。自動定序儀對於 SSR 有一些缺點，如 peak 含糊不清或是雜亂，此時可以重複試驗直到 peak 穩定下來。其他諸如 null allel、short allele 及 stutter bands 的問題的解決方法，將以 MICRO-CHECKER 軟體檢測可能之錯誤並剔除，避免影響資料分析(Van oosterhout 2004)。. 三、族群變動與族群結構族群變動與族群結構的分析方法與族群結構的分析方法 (一一) 族群遺傳參數與遺傳歧異度經由 genotyping 得到的數據會先使用 MSAnalyser(Dieringer and schlotterer 2003)進行初步的分析，並且 MSAnalyse 的檔案格式轉換功能被用在不同的軟體輸入檔案。分析偏離哈溫平衡的基因座。偏離哈溫的基因座的對偶基因頻率會與影響整個族群的基因型頻率，若集中一起分析，則會降低預測族群變動的準確率。為了針對各族群分析偏離哈溫平衡的基因座，方法為 Fisher’s exact test，並設定為 900,000 Markov chain 重覆，由 GENEPOP ver3.4 提供這個分析(Raymond and Rousset 1995)。基因座在染色體上的位置距離若是相近，則有機會於減數分裂時互相影響基因型，影響族群分析。各基因座之間是否存在連鎖平衡. 19.

(27) (linkage equilibrium)。Arlequin(Excoffier et al., 2005)提供的分析方法 likelihood-ratio statistic。多重比較的結果會藉由 Bonferroni-corrected 的方式校正 p-value，主要為將顯著性 p-value 修正，使顯著性的標準可以得到調整。分析族群遺傳參數是為了提供分析，例如 lnRV 和 lnRH 需要異質結合觀察值參數，並且初步比較玉山杜鵑複合群相較於台灣杜鵑是否擁有較低的遺傳歧異度。族群遺傳參數包括：對偶基因頻率與數目 (allele number)、私有對偶基因數目(private allele number)、對偶基因豐富度(allelic richness)、私有對偶基因豐富度(private allelic richness)、重複序列變異數(repeat number variance)、異質結合觀察值 (observe heterozygosity)、異質結合期望值(expect heterozygosity)等。可以利用 GENEPOP 軟體估算以上族群遺傳參數，並且還能計算族群是否符合哈溫平衡、族群分化程度與找尋 null allel (Raymond and Rousset 1995)。. (二二) 族群結構為了研究玉山杜鵑複合群族群之間的分化程度。分化程度利用以 ARLEQUIN vers. 3.5 估算遺傳分化值 FST(Weir &Cockerham 1984)與 RST(Slatkin 1995)並檢測這些值的顯著程度。為了決定 FST 或是 RST 個對於複合群的分化效率比較好，使用 allele size permutation test 檢. 20.

(28) 測 allele size 是否有效。SPAGEDI vers. 1.3 的 allele size permutation test，虛無假設為 allele sizes 對於遺傳分化不有效，以檢測 allele sizes 的效率。FSTAT 可以計算三個數值，FST 表示族群間分化程度，FIS 表示自交程度。族群的有效個體數目較低時會提高自交(Inbreeding)的情形，藉由 FIS 則可以測定自交的情況是否有提高的趨勢。階層式遺傳結構(hierarchical)的分析能夠估計群體或群體內的遺傳變異，分辨什麼分群具有明顯的遺傳差異，分析的階層包括分群間(among group)、分群內與族群間(within group or among population)、族群內(within population)。ARLEQUIN 的 AMOVA(total molecular variance)分析執行 50,000 次的重覆排列，用以估計階層式遺傳結構。為了建立玉山杜鵑複合群適當的族群分群，並暸解 group 之間基因組成的相似度，會使用 STRUCTURE 分析數據(Pritchard et al., 2000)。STRUCTURE 由多基因座的數據估算族群結構，以貝氏分群策略(Bayesain clustering approach)來建造族群結構並指定單一樣本歸屬於哪一個族群。分析模式中假定有 k 個族群，分別這些族群則是由單一個基因座的對偶基因頻率加以定義再分別，k 值可由使用者設定一個範圍。不同 k 值建立的分群可以互相比較，找出適合的分群。使用機率對數的改變值 delta L(K)，比較不同的 K 值所建立的分群 (Evanno et al., 2005)。分析複合群的族群結構 K 值的設定從 K=1 至. 21.

(29) K=10 重複次數設定為 1,000,000 次 iteration 與 100,000 次 burn-in iteration，並使用 nonadmixture model 與 admixture model。使用 PCAGEN 進行 multivariate coordination analysis。PCAGEN 根據族群內基因型的組成內容進行分析，並且不需要對族群下任何定義。PCAGEN 分離族群之間的遠近關係，單純的表示所有族群差異的型態，可以與 STRUCTURE 運算得到的族群結構互相印證族群的分群是否合理。PCAGEN 使用 10000 次的 randomization step，偵測多個不同的軸，並以百分比代表分群效果。 Isolation-by-distance 可能出現在基因交流受限的族群裡，使族群的分化與族群的地理距離有相關性。分析此兩者之間的相關性可以使用 IBDWS vers. 3.16。IBDWS 使用 mental test 與 Reduced Major Axis (RMA) 回歸分析，由以上方法分析族群的 pairwise FST 矩陣與族群地理距離矩陣(Jensena et al., 2005)。為了使 mental test 有最好的效率，設定 10,000 次 randomization，再使用 one-tail 表示地理距離與遺傳分化彼此的關係為正相關。. (三三) 族群縮小(bottleneck) 族群縮小為了觀測近期發生的族群縮小，玉山杜鵑複合群是否經歷有效族群數量下降導致遺傳歧異度降低，對偶基因數目減少與異質結合度下降。使用 BOTTLENECK 分析異質結合期望值與異質結合觀察值有無. 22.

(30) 顯著差異(Cornuet and Luikart 1996)。BOTTLENECK 從族群的對偶基因數量(k)值中計算每個族群和每個基因座的異質結合預期值，並且在 mutation-drift equilibrium 假設下算出樣本數量(n)。異質結合預期值的分佈是由兩個 Model 模擬而來 (IAM, infinit allele model 和 SMM, single step model)。TPM(two phase model)是 IAM 與 SMM 合併在一起計算異質結合值，SMM 的比例由使用者調整。以上的方法可以計算出預期的異質結合度(Hexp)與觀察的異質結合度(Hobs)，這兩者互相比較可以得知基因座上的異質結合度是否有下降的趨勢。更進一步，由 mutation-drift equilibrium 計算出的異質結合度分佈的標準偏差 (SD)，能夠計算各基因座標準化之後的差異( ( Hobs-Hexp ) /SD )。由 Model 模擬而得到的分佈則能夠針對異質結合觀察值計算 P-value，以利進行檢定。分析瓶頸效應之前顯著偏離哈溫平衡的基因座會被剔除，減少干擾(Cornuet and Luikart 1996)。微衛星的序列片段以 3~5 個鹼基為一個重複單位，會遵循 stepwise mutation model(SMM)(Ohta and Kimura 1973)，另外以 2 個鹼基或是 compound motif 的方式當做重複單位，則會偏向 infinite allele model(IAM)(Cornuet and Luikart 1996)。經由計算，本研究 27 個基因座的 SMM 比例接近 35%，因此設定 SMM 的比例從 35%增加至 95%。Replications 設定為 1000 次。另外，再嘗試前人的條件設定以參考分析的效果。Piry et al.,(1999)的. 23.

(31) 文獻建議，微衛星 DNA 的數據形式設定的條件為變異數 12 並且 SMM 95%。 M-ratio 統計值使用比例計算個體數量是否下降，且每個基因座獨立計算，分別由對偶基因的數目(k)與最大減最小對偶基因的差異值 (r)相除即為 M 值(Garza & Williamson 2001)。所有基因座 M 值的平均值可以偵測族群中個體數量有沒有下降，其原理為族群個體數量下降時，對偶基因數目降低的趨勢會快於對偶基因長度降低的程度(Garza & Williamson 2001)。計算出的 M 平均值與 Mc 值比較即可知道族群有無瓶頸效應。Mc 值為模擬正常沒有數量下降的族群而算出的 M 值，也會經由 10000 次模擬算出 95%的模擬值，Mc 即為 95%的下限邊緣。若 M 值低於 95%的模擬值，則可以判定 M-ratio 顯著過低，族群在以前曾經遭受個體數量下降的事件。分析瓶頸效應之前會去除單型的基因座，這是因為單型(monomorphic)的基因座只存在單一對偶基因，會錯誤的增加 M-ratio 值。. (四四) 早期族群變動與當代有效個體數量早期族群變動與當代有效個體數量為了追蹤早期的族群個體數量下降事件，MAVAR vers. 1.3 可以使用微衛星 DNA 的數據估算事件的時間點，並基於 coalescent-based approach 使分析能夠準確的接近瓶頸效應出現的時間(Storz and Beaumont; 2002)。MAVAR 能夠追蹤早期的族群變動事件，族群擴張. 24.

(32) 或是縮小、時間點近代或是早期都能分析。MAVAR 運算的過程中使用親緣演化與族群變動的參數進行運算，最後才輸出四個參數： N0 和 Ne 為早期與當代的有效族群數量，µ 和 ta 則為族群變動的起始時間和結束時間。MSVAR 假設所有基因座突變模式接近 SMM，並假設所有的基因座皆處於哈溫平衡。MSVAR 輸出的數據則使用 R 裡面的 locfit package 分析(Locfit 2.0: http;//locfit.herine.net)。模擬的參數設定皆參考 MSVAR 的操作手冊，使用建議的最佳化設定，並且一個世代的時間設定為 10 年。模擬時兩個模式 exponential model 和 linear model 模式模式皆使用，兩者皆執行 5 個獨立程序，每個程序兩萬點。 exponential model 可以偵測早期與近代的時間點，而 liner mode 則只偵測較早的時間點(Storz and Beaumont 2002)。三種不同的參數設定使用在起始的分析，三個不同的設定的意義各為族群擴張(expansion)、族群縮小(decline)、族群穩定不變(stable)。MSVAR 模擬的結果會得到 20000 筆資料，三種參數的資料會合併，60000 筆的資料將進行重疊的分析。Convergent diagnostic 分析可檢測資料是否能夠彼此重疊。 R environment 的套件 BOA package(Smith 2005)執行 Convergent diagnostic，若 0.975 的 reduction factor 小於 1.2 則代表五種條件的模擬結果彼此相當接近。最後三種參數的資料綜合在一起，再使用 locfit package 估計 summary statistic。. 25.

(33) (五五) 族群之間的遷移率族群之間的遷移率代表個體移動的情形，遷移的情況與族群間的距離有相關性，越遠的距離使得個體移動到另一族群的可能性下降。遺傳分化越明顯的族群也使得遷移的難度提高。族群間的距離會使得族群之間遷移的難度上升，觀察玉山杜鵑複合群遷移率可以評估過去的遷移情況。近期的遷移率可以幫助判斷分化的程度。短期的遷移率：BAYESASS vers. 1.3 使用 Bayesian approach 估計現在至前幾個世代的遷移率(Wilson & Rannala 2003)。程式所使用的 Bayesian approach 為 multilocus genotyping procedure，適合短期內的族群變動評估。Bayesian multilocus genotyping procedure 與 MCMC method 一起合併使用，即使偏離哈溫平的的族群也能夠分析。分析的參數設定為：3 × 106 次 MCMC 重複，burn-in 為 1× 106 steps，抽樣頻率為 2000。長期的遷移率：MIGRATE-N ver. 2.4.3 使用 Bayesian inference 與 maximum likelihood modes 估計族群的遷移率與有效族群數量(Beerli and Felsenstein 2001)。MIGRATE-N 採用的 Bayesian approach 與 BAYESASS 的方法不相同，MIGRATE-N 使用 coalecent approach 偵測長期的遷移率(Beerli and Felsentein 2001)，而 BAYESASS 則採用 multilocus approach(Faubet et al., 2007)。MIGRATE-N 利用 coalecent. 26.

(34) approach 計算 θ 參數，從 θ 參數可以計算長期以前的有效族群數量 (4Neµ，Ne 是有效族群數量而 µ 是每個突變點的突變率)，並再計算遷移率 M(M=m/µ，m 代表每一個世代個體遷移的比率) (Beerli and Felsenstein 2001)。對於微衛星序列，MIGRATE-N 採取 Brownian motion model 作為模擬突變的模式，Brownian motion model 假設所有的微衛星序列突變都接近 stepwise mutation model(Kimura & Ohta 1978)。MIGRATE-N 的計算方法 Metropolis-Hastings algorithm 是探測 genealogies 後在估計族群變動的參數，而 Markov Chain-Monte Carlo(MCMC)則是以隨機的跳躍方式模擬數據並找到最佳的 θ 與 M 值。 MIGRATE-N 用親緣演化樹當作起始的參數來估計 θ 與 M 值。初步分析會先建立 θ 與 M 值的初始估計值，最終分析使用初始估計值當作起始值並重複計算直到結果出現。對於最終的 MCMC 模擬運算，有數個 short chains(104 個基因樹為樣本)與數個 long chains(2.5×106 個基因數為樣本)兩個運算部分。第一個 104 的部份會被忽視用以確認運算的參數維持穩定。此次分析將使用 maximum likelihood modes 的方式運算，設定 10 個 short chain 與 3 個 long chain 使其產生 10000 與 100000-recorded 個親緣演化樹。再設定每 20 個親緣演化樹會同時在 short chain 與 long chain 抽樣。此外，symmetric model 或是 no. 27.

(35) migration model 都會使用 likelihood ratio test 檢測，也就是在每個族群之間，所有可能的 symmetric model 與 no migration model 的結合都會被 likelihood 結合 null-hypothesis 的方式檢測。. (六六) 分析在天擇之下受到受到選汰的基因座分析在天擇之下受到受到選汰的基因座此部分分析的目的為觀察玉山杜鵑複合群演化的過程中有無天擇作用，或是屬於何種天擇。分析適應性演化採用 multiple-marker-based 的中性檢測(Vasemagi and Primmer 2005)。受到選汰壓力的基因座其遺傳變異形式，會偏離大多數基因座的遺傳形式，利用 genotyping 的方式可以找出基因組中比較突出的遺傳變異。為了找出特別的遺傳變異的基因座(以下簡稱離群基因座)，以下的數個分析方法都會使用，並且彼此印證確實有受天擇篩選。 lnRV 和 lnRV：Selective sweep 是染色體上因鄰近受到天擇篩選的區域或本身就是受篩選的區域，因天擇篩選只留下良好的基因而導致變異程度降低，而 lnRV 和 lnRH 方法可以偵測 selective sweep。lnRV 和 lnRH 的計算原理是同一個基因座的變異度兩兩相除，以顯現比值。天擇作用越強，其比值就會偏離 1。MICROSATELLITE ANALYZER vers. 4.05 可以估算微衛星片段的對偶基因變異數(allelic variance)與異質結合期望值(observed heterozygosity)(Dieringer & Schlotterer 2003)，這兩個值即為 lnRV 和 lnRH 所使用的參數。lnRH. 28.

(36) 的原理是計算遺傳歧異度比值，這是因為受到天擇作用的區域會導致遺傳歧異度下降(Schlotterer 2002)。lnRV 的原理是計算微衛星序列重複片斷數量的比值(Schlotterer and Dieringer 2005)。這二個值在中性學說的情形下呈現自然曲線分佈，如果某一族群受到強力的天擇，lnRV 及 lnRH 值會明顯偏離自然曲線分佈。另外，電腦模擬在族群變動下族群的 lnRV 和 lnRH 的值的分佈，包括族群擴張與縮小，其族群的中性基因座仍然遵循常態分布(Schlotterer & Dieringer 2005)。lnRV 和 lnRH 經由標準化(95%, mean=0, SD=1)其值會被預期落在-1.96 與 1.96 之間，只要基因座的值掉落在此區間之外，就會被考慮為程度為 α=0.05 顯著偏離群體。族群間的遺傳分化值也可找出天擇的基因座，以兩兩比較 Fst 值為主，此 FST 值可以 FDIST2 估算(Beaumont and Nichols 1996)，可用於 lnRV 和 lnRH 互相比較增加可信度。針對 hierarchical population structure，可以使用內附於 ARLEQUIN 的 hierarchical island model 檢測分群之間是否有適應性演化的痕跡(Excoffier et al., 2009)。Hierarchical island model 的意義是考慮 hierarchical population structure 會導致分析結果偏離正確的分析結果並且增加 false positives。雖然 BAYESFST 與 BAYESCAN 的分析方式假設族群的結構不相等，但是使用 Hierarchical island model 的方. 29.

(37) 式分析則更能避免族群結構影響分析結果。Hierarchical island model 的分析方式為分群間與分群內族群間的兩種階層，此法考慮實驗上得到的數據與分析程式假設的條件有相同的性質，也就是分群之間與族群之間彼此分化。以上所述的方法使用 F statistic 做為運算的方式，以族群間(FST)與分群間(FCT)的遺傳分化值，並使用模擬的遺傳分化值 95%信賴區間來判斷基因座是否為 outlier。在缺乏準確的數據時，描述族群的歷史與結構的參數的數量很大，如同前人所研究的結果(Felsenstein 1982)。許多研究者建議，解決無限多參數的問題要集中在一個簡單、通用的族群分歧的模式 (Tsakas and Krimbas 1976)。基於這樣的推論，Vitalis et al., (2001)提出一個以 pure random drift 的族群分歧的模式，檢測適應性演化的方法。在這個模式中，一個族群分離成兩個族群，稱為 populations 1 與 populations 2。Vitalis et al (2001)定義族群特有的參數 F1 與 F2，兩者是經由族群分歧的時間(t)與族群的數量(N)依據模式模式所算出的參數。下一步，建立 F1 與 F2 聯合的分布，並以不同的對偶基因數量之下建立不同條件的分布，使族群對於誤差參數(nuisance parameters)(如早期有效數量與突變率等)的影響降低。所以，如果創造單一基因座的 F1 與 F2 值的預期的分布，再使用多基因座估計 F1 與 F2 的值與誤差參數的範圍，再以不同的對偶基因數量之下建立不. 30.

(38) 同條件的分布，使用者就可以檢測偏離中性演化基因座，以落在中性演化基因座 95%區域外為判斷。. (七七) 檢測氣候因素與 EST-SSR 對偶基因的相關 SAM 可以分析環境變異與 EST-SSR alleles 之間的關聯性(Joost et al., 2008)。本部份分析使用的參數是從中央氣象局 390 觀測站於 1989~2009 年得到的 12 個氣候參數。月平均氣候數據包含溫度，最高溫度，最低溫度，降雨量，降雨日數，最高溫大於 30℃日數，最低溫小於 10℃日數，紫外線強度，相對溼度(%)，雲量(1-10)，與風速(m/s)。玉山杜鵑複合群抽樣地點的 12 個氣候數據的月平均值被放在由經度與緯度構成的網格上，每網隔實際為 1 km2。當分析環境變異時變異程度可以比 model 更良好的解釋對偶基因的分布，會使用虛無假設拒絕對偶基因與環境變異沒有相關性。P value<0.001 會採用 likelihood ratio G 和 Wald tests 一起判斷顯著性。. 31.

(39) 肆、結果一、遺傳歧遺傳歧異度本研究的材料包括玉山杜鵑複合群五個物種(此後以複合群略稱五個物種)，一共 9 個族群 185 個樣本，以及廣泛分布的台灣杜鵑 5 個族群 68 個樣本。物種階層的遺傳參數是由族群的平均值而來，數值列於表三。族群私有基因數量(Apriv)最高為南湖杜鵑 20 個，其次是台灣杜鵑 11 個，接下來是森氏杜鵑 9 個，玉山杜鵑 8 個，紅星杜鵑 7 個。對偶基因豐富度(AR)最高為南湖杜鵑 3.890，其次是森氏杜鵑 3.874，接下來是玉山杜鵑 3.580，台灣杜鵑 3.277，紅星杜鵑 2.988。私有基因豐富度(PR)最高為台灣杜鵑 0.381，複合群的物種皆低於台灣杜鵑並且範圍在 0.24 到 0.34 之間。重複序列變異數(VR)最高為森氏杜鵑 33.182，其次是台灣杜鵑 32.264，其後為南湖、玉山、紅星杜鵑並且值介於 24 到 30 之間。異質結合期望值(HE)最高為南湖與森式杜鵑皆為 0.426，其次為玉山杜鵑、台灣杜鵑、紅星杜鵑並且範圍介於 0.3 到 0.45 之間。異質結合觀察值(HO)最高為森氏杜鵑 0.451，其次是南湖杜鵑、玉山杜鵑、台灣杜鵑介於 0.4 與 0.44 之間，最低為紅星杜鵑 0.382。多型性基因座百分比(P)最高為南湖杜鵑與玉山杜鵑 0.889，其後依序為台灣杜鵑、紅星杜鵑與森氏杜鵑介於 0.790 與 0.8745 之間。. 32.

(40) 族群偏向自交或是異交可以從自交系數(FIS)的值判斷。複合群 FIS 值介於-0.141 與 0.029 之間，台灣杜鵑的 FIS 值介於-0.090 到 0.046 之間。紅星杜鵑菜公坑族群 FIS 值為-0.141 (P = 0.0015)，玉山杜鵑大雪山族群 FIS 值為-0.074(P = 0.0168)，森氏杜鵑大雪山族群 FIS 值為 -0.102(P = 0.0123)，以上族群因為 FIS 值顯著所以偏向異交，其餘族群 FIS 值不顯著。台灣杜鵑大雪山族群 FIS 值為-0.09(P = 0.0142)，思源族群 FIS 值為-0.065(P = 0.0324)，以上的族群因為 FIS 值顯著所以偏向異交。基因座的對偶基因頻率偏離哈溫平衡時會導致分析結果偏差，因此檢測基因座是否偏離哈溫平衡。檢測結果如表四所示，檢測結果顯示複合群與台灣杜鵑的基因座大部分皆不偏離哈溫平衡，只有玉山杜鵑合歡山族群的 5557、6637，玉山杜鵑里龍山族群的 1655 有偏離哈溫(Bonferroni correction)。連鎖平衡是染色體重組互換之後對偶基因 50%的機率會與對偶基因重新組合。基因座之間的距離在染色體上過近，兩個基因座重新組合機會低於 50%時即為連鎖不平衡。連鎖不平衡使基因座互相影響對偶基因頻率，因此檢測基因座偏離連鎖平衡的狀況，檢測結果如表五。顯著連鎖不平衡的基因座為 6499、1892 與 6615、5944(Bonferroni correction, P < 0.002)。檢測結果顯示大部分基因座的連鎖不平衡不顯. 33.

(41) 著。. 二、族群結構 (一一) 族群分化 RST 是以 allele size 估計遺傳分化值。為了檢測 FST 或是 RST 對於本研究數據比較適合估計遺傳分化，使用 allele size permutation test 檢測 allele size 與 allele variation 估算的遺傳分化值是否有意義。檢測結果列在表六，RST 不顯著(P = 0.2722, 2-sided test)顯示 allele size 計算遺傳分化值效果不佳。玉山杜鵑複合群的遺傳分化值以兩兩差異(pairwise difference)的方式估算 FST(表七)。紅星杜鵑族群對玉山杜鵑、森氏杜鵑與南湖杜鵑顯著分化(P < 0.0013, Bonferroni correction)分化值介於 0.1 與 0.3 之間。玉山、森氏與南湖杜鵑族群彼此顯著分化(P < 0.0013)分化值介於 0.03 與 0.1 之間，而玉山杜鵑合歡山族群對森氏杜鵑大雪山族群、玉山杜鵑合歡山族群對森氏杜鵑合歡山族群分化不顯著(P > 0.0013)。表九是玉山杜鵑複合群與台灣杜鵑的族群遺傳分化值。台灣杜鵑族群與玉山杜鵑複合群分化值顯著，同種內族群之間分化值也顯著(P <0.0005, Bonferroni correction)，台灣杜鵑的族群間分化值介於 0.09 到 0.20 之間。族群分化的分析結果顯示紅星杜鵑與玉山杜鵑、森氏杜鵑、南湖杜鵑三者遺傳差異大於後面三者之間遺傳差異。玉山杜鵑. 34.

(42) 合歡山族群與森氏杜鵑大雪山族群，玉山杜鵑合歡山族群與森氏杜鵑合歡山族群的遺傳差異顯示三者之間的族群結構很相似。. (二二) 族群結構族群結構的分群結構的分群檢測族群的遺傳關係(genetic relationship)使用 PCAGEN 檢測差異並繪圖。圖二(1)是以個體分析的結果，顯示紅星杜鵑個體明顯的與玉山杜鵑複合群其他種的個體都分離，分為清楚兩群。圖二(2)採用族群分析的結果，顯示有三群，森氏杜鵑阿里山族群與玉山杜鵑鹿林山族群一群，森氏杜鵑合歡山族群、玉山杜鵑合歡山族群與森氏杜鵑大雪山族群一群，南湖杜鵑與玉山杜鵑大雪山一群。PCAGEN 與 FST 值的分析互相支持，森氏杜鵑合歡山族群、玉山杜鵑合歡山族群與森氏杜鵑大雪山族群的遺傳結構相似。分群是將族群結構分類，並提供兩兩比較的分群。STRUCTURE 使用 Bayesian 的方法分析族群結構並找出分群，再估算分群的可靠機率。玉山杜鵑複合群分析結果在圖三，相似的族群結構以顏色表示。圖三(1)為假設族群之間不雜交(no admixture)的分析結果，∆L(k)值在 k=2 時介於 1600 與 1800 之間，顯示分 2 群機率最高。圖中顏色的區分明顯紅星杜鵑一群，玉山、森氏和南湖杜鵑三個物種一群。圖三(2) 假設族群間雜交(admixture)的分析結果，∆L(k)值在 k=2 時介於 250 與 300 之間，顯示分 2 群機率最高。玉山、森氏和南湖杜鵑的分群參. 35.

(43) 雜紅星杜鵑的結構，而紅星杜鵑分群也參雜其他種的結構。 STRUCTURE 的分析結果與 PCAGEN 個體階層的分析結果能夠互相支持，紅星杜鵑與玉山、森氏、南湖杜鵑族群結構明顯差異。 AMOVA 為分析分群之間的差異，檢測分群之間遺傳變異是否顯著。表九顯示玉山杜鵑複合群與台灣杜鵑的分群之間有顯著遺傳差異 (P <0.001)。表九只有玉山杜鵑複合群，表上方的分群為紅星杜鵑一群與玉山、森式、南湖杜鵑一群，分群之間有顯著遺傳差異(P <0.001)。表九下方的分群以物種為主分成四群，分群之間有顯著遺傳差異(P <0.001)。AMOVA 的分析結果與 STRUCTURE 的分群結果互相支持，紅星杜鵑為第一個分群並且玉山、森氏與南湖杜鵑為第二個分群。 RMA regression analysis 檢測地理距離與分化程度的相關，並判斷顯著性。估計玉山杜鵑複合群 Paiewise FST 值與地理距離的相關。圖四顯示正相關回歸線並且顯著(P < 0.05)，由此可判斷玉山杜鵑複合群 Paiewise FST 值與地理距離顯著正相關。玉山杜鵑複合群的親緣關係樹以 Neighbor joining 的方式建立並且估算 bootstrap 值。台灣杜鵑當做外群，玉山杜鵑複合群的族群都在位於同一個 clade，並且分為紅星杜鵑一個分支，玉山、森氏、南湖杜鵑一個分支，bootstrap 值到達 100 (圖五)。玉山、森氏與南湖杜. 36.

(44) 鵑族群的 bootstrap 值未達 70 顯示分支不甚明顯。森氏杜鵑三個族群、玉山杜鵑鹿林山族群與玉山杜鵑合歡山族群 bootstrap 值未達 50。雖然 bootstrap 值未達 50，Neighbor joining tree 與 PCAGEN 的分析結果相似，玉山杜鵑合歡山族群靠近森氏杜鵑合歡山族群，玉山杜鵑鹿林山族群靠近森氏杜鵑阿里山族群、南湖杜鵑與玉山杜鵑大雪山也是如此. 三、族群縮小(bottleneck)歷史歷史族群縮小 BOTTLENECK 檢測族群近代的族群縮小事件，one-tailed Wilcoxon signed rank tests 檢測族群的異質結合度是否顯著改變， mode-shift test 檢測對偶基因頻率類型的分布並推測族群穩定或是族群縮小。表十顯示玉山杜鵑複合群與台灣杜鵑的檢測結果。不論是玉山杜鵑複合群或是台灣杜鵑族群，在不同 SMM 比例之下的分析皆表示 heterozygosity deficiency 顯著(P < 0.05)，heterozygosity excess 不顯著(P > 0.05)。玉山杜鵑複合群對偶基因頻率類型分布沒有扭曲，屬於正常 L-shape 顯示對偶基因頻率類型未受族群縮小影響。 BOTTLENECK 的分析結果顯示玉山杜鵑複合群在 0.2-4Ne 的時間點內並沒有發生族群縮小的事件。為了檢測時間更早以前的族群縮小事件，估計族群 M ratio 值是否顯著低於臨界值(MC)。M ratio 的檢測包括玉山杜鵑複合群與台灣. 37.

(45) 杜鵑。圖六紅星杜鵑燦光寮族群、玉山杜鵑大雪山族群、玉山杜鵑合歡山族群、森氏杜鵑合歡山族群 M ratio < MC 值，顯示過去有族群縮小歷史。台灣杜鵑族群的 M ratio 值皆高於 Mc，顯示沒有經歷族群縮小事件。台灣杜鵑的檢測呈現沒有明顯族群縮小歷史，與玉山杜鵑複合群的檢測結果相反。M ratio 的檢測顯示約 1000~3000 年以內紅星杜鵑燦光寮、玉山杜鵑合歡山、玉山杜鵑大雪山與森氏杜鵑合歡山族群曾經縮小。. 四、族群變動(Demography) 族群變動 MSVAR 以 MCMC(Markov chain Monte Carlo)方法估算族群變動的時間點與有效族群數量。早期有效族群數量(N1)與當代有效族群數量(N0)可以用做預測族群變動擴張或縮減。表十一的統計值代表族群變動趨勢，r 值為有效族群數量比例(r = N0/N1)，tf 為族群變動時間與當代有效族群數量的比值(tf=ta/N0)。玉山杜鵑複合群 Log(r)的 Mode(眾數)介於-1 到-3 之間，表示所有的族群縮小 10 到 1000 倍之間。台灣杜鵑 Log(r)的 Mode(眾數)介於-2 與-3 之間。Log(r)值顯示玉山杜鵑複合群族群縮小 100 到 1000 倍之間。Log(tf)值的意義是發生族群變動時間的久遠程度，複合群 Log(tf)的 Mode 介於 40 與 160 之間。台灣杜鵑 Log(tf)的 Mode 介於 41 與 185 之間。Log(tf)值顯示複合群族群發生變動的時間點在早期而不是現代。三個參數包括早期有. 38.

(46) 效族群數量(N1)、當代的有效族群數量(N0)與發生族群變動的時間點 (t,單位：years)。玉山杜鵑複合群族群 t 的 Mode 介於 10000 與 73000 之間(表十二)。台灣杜鵑族群 t 的 Mode 介於 12000 與 35000 之間。分析結果顯示族群變動的時代距今相當久遠。各族群變動時間點如圖七顯示，族群縮小的時間點大約接近兩萬年。MSVAR 與 M ratio 的分析結果互相支持，顯示玉山杜鵑複合群於早期族群縮小的歷史。. 五、族群遷移 (一一) 長期遷移(long-term migration)分析分析長期遷移為了分析基因交流，使用 MIGRATE-N 的 maximum likelihood mode 分析長期(long-term)族群遷移率與長期有效族群數量。玉山杜鵑複合群內的遷移率介於 0.16 與 0.37 之間，森氏杜鵑大雪山遷移到玉山杜鵑鹿林山 0.161 最低，森氏杜鵑阿里山遷移到森氏杜鵑合歡山 0.368 最高。台灣杜鵑內族群遷移率介於 0.14 與 0.33 之間，台灣杜鵑棲蘭山族群遷移到台灣杜鵑里龍山族群 0.141 最低，台灣杜鵑棲蘭山族群遷移到台灣杜鵑杉林溪族群 0.321 最高。遷移率的分析顯示族群長期進行基因交流。為了觀察族群大小，θ 值經由 Ne=θ/4µ 換算有效族群數量(Ne) (表十四)。玉山杜鵑複合群的有效族群數量(分布當中機率為 0.5 的值)介於 2200 到 2700 之間，紅星杜鵑菜公坑族群 2273 最低，森氏杜鵑合歡山族群 2676 最高。台灣杜鵑有效族群數量(分布當中機. 39.

(47) 率為 0.5 的值)介於 2200 到 2500 之間，台灣杜鵑里龍山族群 2153 最低，台灣杜鵑思源族群 2473 最高。MIGRATE-N 分析顯示紅星杜鵑菜公坑族群與燦光寮族群有效族群數量低於玉山、森氏和南湖杜鵑， MSVAR 的分析顯示紅星杜鵑菜公坑族群與燦光寮族群當代有效族群數量低於玉山、森氏和南湖杜鵑，顯示複合群紅星杜鵑的族群數量少於其他物種。. (二二) 近期遷移(recent migration)分析分析近期遷移 BAYESASS 以 Bayesian 的方式估算近期族群遷移率。由遷移的程度來看玉山杜鵑複合群除了紅星杜鵑燦光寮族群與玉山杜鵑大雪山族群，其他族群由外遷移到族群內介於 21%與 29%之間，但是紅星杜鵑燦光寮族群與玉山杜鵑大雪山族群由外遷移到族群內的遷移率低 (M < 0.002)。遷移率 95%信賴區間介於 4.53E-10 與 0.126 之間，平均值 0.0207。由遷移的方向來看，紅星杜鵑燦光寮往菜公坑遷移，遷移率 26%。玉山杜鵑大雪山族群往玉山杜鵑、森氏杜鵑、南湖杜鵑遷移，遷移率介於 0.21 與 0.31 之間。分結果顯示紅星杜鵑菜公坑族群與紅星杜鵑燦光寮族群近期基因交流，玉山杜鵑大雪山族群與玉山、森氏、南湖杜鵑近期基因交流。. 六、適應性演化適應性演化 Arlequin 與 Fdist2 基於 FST 值檢測離群值的基因座(outlier loci)，. 40.

(48) lnθ 基於變異的程度分析離群值的基因座。適應性演化的分析對象為玉山杜鵑複合群(表十四)。一個檢測以上顯著的偏離中性演化基因座有 14 個(P < 0.025)，Arlequin 與 Fdist2 檢測顯著偏離中性演化基因座有 12 個，lnθ 檢測顯著偏離中性演化基因座有 3 個。兩個檢測以上顯著的基因座有 7 個，分別是 1655、1804、1812、1915、5362、5557、 5571，4 個檢測顯著的基因座有 1804、5362、5571。LnRV 的檢測發現紅星杜鵑燦光寮族群基因座 1723、6487，玉山杜鵑大雪山族群基因座 1804 為偏離中性演化基因座(P < 0.05)。DETSEL 與 lnθ 的檢測方式相似，以族群兩兩比較檢測偏離中性演化的基因座。表十五顯示紅星杜鵑菜公坑族群在所有的兩兩比較當中沒有檢測到偏離中性演化基因座，紅星杜鵑燦光寮族群則檢測基因座 1723、5571、6487 偏離中性演化。合併 DETSEL 與 lnθ 的檢測結果，顯示基因座 1723、 6487 皆偏離中性演化，顯示互相支持分析結果。 SAM 依據 likelihood ration G 和 Wald tests 估計對偶基因與環境氣候因子的相關性。顯著的基因座 14 個，對偶基因數量介於 1 到 3(表十六)。SAM 檢測的偏離中性演化基因座與其它檢測也顯著的有 11 個基因座(圖九)。檢測呈現 99.999% 相關並且同時在其他的檢測也顯著的基因座則有四個，分別是 1915、5362、5571、6615。. 41.

(49) 伍、討論一、遺傳歧異度維持族群的遺傳歧異度的重要性除了讓族群長久生存，更是族群面對新選汰壓力的適應能力(Hedrick 2004)。本研究使用 27 對 EST-SSR 引子檢驗玉山杜鵑複合群及台灣杜鵑遺傳多型性。紅星杜鵑歧異度(HE = 0.338)低於台灣杜鵑(HE = 0.395)；然而玉山杜鵑(HE = 0.406)、森氏杜鵑(HE = 0.406)與南湖杜鵑(HE = 0.426)的歧異度則略高於台灣杜鵑(HE = 0.395)。紅星杜鵑歧異度低於廣泛分布之台灣杜鵑，可能是受間冰期溫度上升影響族群縮小較明顯所致，如此之結果符合 Chung et al., (2007)玉山杜鵑複合群於間冰期族群退縮的結果，不過玉山杜鵑、森氏杜鵑與南湖杜鵑仍然存在過去冰河期族群擴張的註記。許多的植物研究發現 genomic SSR 的遺傳變異程度高於 EST-SSR，預期玉山杜鵑複合群 EST-SSR 歧異度也有相似的情況 (Peleg et al., 2008)。玉山杜鵑複合群 EST-SSR 歧異度(HE = 0.393)低於其他物種的 genomic SSR 歧異度，包括日本的 R. brachycarpum(HE = 0.815, 範圍 0.676-0.913; Hirao 2010)、日本的 R. ripense(HE =0.800, 範圍 0.794-0.809; Kondo 2009)、以及在中國的 R. simsii(HE =0.754, 範圍 0.278-0.944; Tan et al., 2009)。玉山杜鵑複合群遺傳歧異度低於其它杜鵑植物的 genomic SSR 歧異度平均值，包括整體平均值(0.61)、特. 42.

(50) 有種平均值(0.42)、廣泛分布種平均值(0.62)、異交物種平均值(0.65) 與多年生物種平均值(0.68)(Nybom 2004)。然而玉山杜鵑複合群 EST-SSR 遺傳歧異度高於其他物種以共顯性標誌 allozyme 檢驗的遺傳歧異度，包括整體平均值(0.149)、異交且為動物授粉物種的平均值 (0.124)、多年生木本植物平均值(0.149)、特有種平均值(0.063)與廣泛分布物種平均值(0.159)(Hamrick & Godt 1996)。雖然 Genomic SSR 的變異比較多，但是因為有較多的 stutter bands 與 null allele 致使基因型的估計產生偏差(Pashley et al., 2006)。此外，從 coding region 得到的 EST-SSR 更能有效提供族群的遺傳結構，並且也可用以檢測估計玉山杜鵑複合群有沒有適應性演化事件的發生。哈溫平衡的檢測顯示在玉山杜鵑複合群與台灣杜鵑的 EST-SSR 基因座均沒有嚴重偏離哈溫平衡(表四)。哈溫平衡與連鎖平衡的檢測結果顯示玉山杜鵑複合群與台灣杜鵑所估算的族群遺傳參數的可信度高。玉山杜鵑複合群各族群異質結合期望值與異質結合觀察值相似，其差異介於 0.01 與 0.03 之間，族群間共同的地方在於異質結合觀察值略高於異質結合期望值(表三)。紅星杜鵑菜公坑族群、玉山杜鵑大雪山族群、森氏杜鵑大雪山族群、森氏杜鵑合歡山族群自交系數 FIS 的檢測顯著異質結合個體多(heterozygote excess)而有異交傾向，台灣杜鵑的 FIS 檢測結果也是偏向異交。FIS 值的結果是負值，其原. 43.

(51) 因可能是杜鵑的繁殖性傾向異交。杜鵑植物異交的情形在 R. brachycarpum 有報導，其自交產生的後代對環境的適應力差，導致族群雖然可能有自交的情況，但是自交的後代無法生存，因此異交的後代保留在族群中(Hirao 2010)。. 二、玉山杜鵑複合群早期的有效族群數量大族群的遺傳結構反應過去族群變動的歷史。本研究使用 MIGRATE 檢測玉山杜鵑複合群的族群間基因交流程度，長期遷移率介於(long-term migration)介於 0.16 與 0.37 之間(表十三)，並且玉山杜鵑複合群的族群檢測到顯著的 isolation by distance(圖四)。Isolation by distance 形成的原因可能是鄰近族群高度的基因交流或是遠距離族群沒有基因交流，而且基因交流的量取決於有效族群數量的大小(Pope et al., 2006)。早期的基因交流量並不高，可能是因為早期的有效族群數量大，族群的遷移個體增加，因為玉山杜鵑複合群的族群間有相似的 θ 值，顯示在過去可能的族群數量大而使得族群間基因交流明顯，然而整體基因交流量介於 0.16 與 0.37 之間，代表族群退縮的過程部份 EST-SSR allele 喪失，如此之結果亦造成顯著的 isolation by distance 與顯著之遺傳分化(圖四，表七)。當兩兩比較鄰近的族群時，例如玉山杜鵑合歡山族群與森氏杜鵑合歡山族群、玉山杜鵑鹿林山族群與森氏杜鵑阿里山族群則發現分化的程度比較低(表七，表九)。玉山杜鵑、. 44.

(52) 森氏杜鵑與南湖杜鵑相鄰近族群之間較微弱的遺傳結構，可能是由於早期大的有效族群數量造成，而玉山杜鵑複合群強烈的 isolation by distance 則顯示目前有效族群數量下降而與族群破碎化有關(Chung et al., 2007)，因此距離較遠的族群因為基因交流不容易而分化比較大。 Log(r)與 Log(tf)的值為負，顯示玉山杜鵑複合群有效族群數量從早期開始劇烈的下降，也更支持早期的有效族群數量大。. 三、玉山杜鵑複合群族群退縮的歷史以不同的微衛星序列突變模式及其可能之比例檢測族群近期的縮小事件，顯示玉山杜鵑複合群近期並沒有族群縮小的痕跡(表十)。 MSVAR 的檢測發現玉山杜鵑複合群的當代有效族群數量(N0)遠低於早期有效族群數量(N1)，並且其比例 r 值介於 0.001 與 0.017 之間，顯示族群明顯退縮，而 M-ratio 檢測也支持在過去有瓶頸效應的發生 (圖六，表十二，表十三，)。玉山杜鵑複合群的 M-ratio 值顯示部份族群有效族群數量有縮小的痕跡，包括紅星杜鵑燦光寮族群、玉山杜鵑大雪山族群、玉山杜鵑合歡山族群與森氏杜鵑合歡山族群，台灣杜鵑則沒有發現有退縮(圖六)。玉山杜鵑複合群各族群的 M-ratio 值大部分皆低於 Garza & Williamson (2001)所提出的 0.68 門檻值。儘管玉山杜鵑複合群有五個族群的 M-ratio 值高於 MC 值，但是仍然有四個族群的 M-ratio 值低於於 MC 值，顯示玉山杜鵑複合群族群曾經縮小。. 45.

(53) 理論上 M-ratio 值的回復時間需要比較久，相較於 mode-shift 與 heterozygosity excess 的檢測，後兩者僅能檢測近期內發生的族群縮小 (Cornuet & Liukart 1996; Garza & Williamson 2001)。M-ratio 檢測所顯示的族群縮小事件，比起其他兩個檢測方法能顯現較久以前族群退縮的情形，因此玉山杜鵑複合群有四個族群 M-ratio 值低於 MC 值、 mode-shift 檢測與 heterozygosity excess 不顯著，其原因在於族群退縮事件發生於較久以前。另一方面若族群當代的有效族群數量少而遺傳多型性低時，族群縮小產生的 heterozygosity excess 不明顯而不容易檢測 (表十，Cornuet & Liukart 1996)。玉山杜鵑複合群雖然只有四個族群 M-ratio 值低於 MC 值，但是與 isolation by distance 的分析結果互相呼應玉山杜鵑複合群因族群縮小增加族群間基因交流難度，顯示族群的分化隨距離增加而上升。. 四、族群退縮後物種分歧杜鵑的繁殖是以蟲為媒介的異交為主，例如 R. ferrugineum (Escaravage & Wagner 2004)、R. ponticum (Stout 2007)、R. semibarbatum (Ono et al., 2008)、R. brachycarpum (Hirao 2010), 以及棲息於香港的六個杜鵑物種(Ng & Corlett 2000)的研究均顯示異交情形。因此預期可以發現有較多的遺傳變異存在於族群內。本研究以 EST-SSR 為工具檢測玉山杜鵑複合群分化的程度(φST = 0.185)與共顯. 46.