行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
轉殖海藻糖合成脢基因改善水稻對乾旱的適應力﹝2/3﹞
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2313-B-002-323- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學農藝學系暨研究所 計畫主持人： 劉麗飛 計畫參與人員： 趙雲洋 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 92 年 5 月 29 日
轉殖海藻糖合成? 基因改善水稻對乾旱的適應力
Enhancement of draught tolerant in transgenic rice
with a trehalose sythase gene
計畫編號：NSC 91 -2313-B-002-323-
執行期限：91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日
主 持 人： 劉麗飛 國立台灣大學農藝系
計畫參與人員：趙雲洋 國立台灣大學農藝系
中文摘要 本計畫是轉殖 TPS（海藻糖合成? ） 基 因 於 水 稻 優 良 品 種 台 農67 號 (TNG67)或台梗 9 號(TK9)，並在後代中 選育出對乾旱有較強忍受力的水稻。計 畫 執 行 至目 前 已獲 得 三種方 式調 控 的 轉殖水稻，這些轉殖水稻大部分為 1～ 2 個拷貝，並且可轉錄成 mRNA。TPS 蛋白可在體外大量表現，經純化後製成 抗體可進行西方墨點分析。轉殖水稻在 逆境下的表現，初步瞭解可耐鹽，目前 在進行乾旱測試，希望在利用已建立的 耐旱篩選方法中，能獲得耐性較強的植 株。 關鍵詞：海藻糖，海藻糖合成酵素， 基因轉殖，水稻 AbstractIn this project, the TPS gene will be transferred to rice (TNG 67 or TK 9) by Agro-infection methods. We will select the high tolerance of draught in
transgenic progeny.
Now we obtained transgenic plants that constitutive or stress-inducible promoters drove the TPS gene. The transgenic lines contained a low copy number of trans-
gene that achieved transcription by northern-bolt. The TPS protein was overexpressin in E.coli., therefore will proceed western blot after TPS protein being purified. Our data show the transgenic rice are salt tolerant. The draught tolerant plant will be found as soon as possible.
Keywords: Trehalose, TPS, gene , transfer, Rice. 二、緣由與目的 全球性氣候變遷，使作物生存環境 日漸惡化，在生長過程中必須遭遇更多 逆境與壓力。氣候變遷除了造成地球昇 溫以外，更造成水分供應失調，許多地 區沙漠化日益嚴重。Allen and Breshears (1998) 指出在未來十年間，缺水將使作 物無法生長，栽培面積減少，造成糧食 不足而無法因應眾多人口的需求。水稻 為重要的三大榖類糧食作物之一，在栽 培時需水量大，若能增加耐旱能力，則 可減少用水，一方面有環境保育的意 義，另一方面可擴展水稻的栽培地區。 植物耐旱的機制很多，例如改變植株形 態或結構，以減少水分散失; 或形成滲 透保護物質(osmoprotactant)，如:
mannitol 或 sorbitol 等糖醇類，betaine、 proline、trehalose、fructan 及多元胺等。 此外缺水逆境下亦會產生一些特殊 的蛋白質分子，例如 LEA 蛋白質(Late embryogenesis protein)等。這些物質的特徵 是具有高度的水溶性、不攜帶電價、可維 持生理作用時的 pH 值，並且大量累積時 對細胞不會造成毒害，其作用不但可以維 持細胞質內的滲透壓，亦可穩定細胞內蛋 白質與膜係的結構。在水稻方面陸續有相 關的報導，目前已經轉殖有 p5cs 基因(Δ'-pyrroline-5-barboxylate synthase)提高 proline 含量；轉殖 Adc 基因(arginine decarboxylase )提高二元胺 putrescine 含 量；及轉殖 HVA1 基因(第二群 LEA 蛋白 質基因)，結果均可促進水稻對缺水或鹽害 的耐性。本計畫即擬探討以基因轉殖方法 增加水稻中 trehalose 含量以提高水稻耐旱 能力。 Trehalose (α -D-glucopyranosyl α -glucopyanoside )為海藻糖，普遍存在動植 物體中，在體內代謝的方式與蔗糖相似， trehalose 是由 2 個葡萄糖經由海藻糖合成 ? trehalose-6- phosphate synthase (TPS)作 用形成 trehalose-6-phosphate 後，再經由海 藻 糖 磷 酸 激? trehalose 6- phosphate phosphatase (TPP) 催化後而合成，同時可 藉由 trehalase 水解成葡萄糖，因此 TPS、 TPP 和 trehalase 等酵素活性與 trehalose 的 含量有絕對的關係，大量表現 TPS 與 TPP 活性或抑制 trehalase 活性均可增加作物體 中 trehalose 含量。目前已從大腸桿菌、酵 母菌、阿拉伯芥和馬式捲柏選殖出 TPS 與 TPP 基因。 研究者進一步利用基因轉殖技術將大 腸桿菌中 ots A (為 TPS )和 otsB (為 TPP) 基因轉殖於菸草中，在 T0代分析
得知,ots A ots B 與 ots A 轉殖株中 tre- halose 含量相似，由此可知 TPS 是調控 trehalose 含量的主要酵素。在水稻方面 目前尚無相關之轉殖研究，但 Garcia .et al.(1999)在高鹽環境下比較水稻外加 trehalose 與 proline 的保護效果，發現施 用 trehalose 後水稻葉綠素含量及鹽分 排出體外的能力均比施用 proline 來的 高。顯示 trehalose 保護水稻細胞的效果 比 proline 佳。因此若能將合成 trehalose 的酵素基因轉殖到水稻中，直接提高 trehalose 含量，推測應可有助於水稻對 乾旱的耐性，甚至可能應用於耐鹽。 本計畫擬轉殖的 TPS 基因係來自 於美國華盛頓大學賀端華教授，沒有專 利的問題，基因的驅動採用大量表現與 可誘導式啟動子(inducible promoter )， 並比較二者之間的差異及影響，質體構 築完成後，用農桿菌轉殖法轉殖於水稻 優良品種台農 67 號(TNG67)或台梗 9 號(TK9)，藉由不同程度乾旱處理，希 求能培育出不影響正常生長且具耐旱 能力的水稻，以減少水稻栽培時的用水 量，未來並可提供其他學者做為耐鹽性 探討之材料。由於水稻方面目前尚無不 論國內、外均為創新性之研發。 三、結果與討論 本計畫執行至今，已完成轉殖質 體的構築，獲得 T0 轉殖植株及部分植 株鑑定。 在 質 體 構 築 方 面 已 完 成 三 個 轉 殖 質體。分別為：
1. 啟動子為 Ubiquitin，可廣泛性調節 基因表現， 稱 p1302UBIZ，全長 為 15700bp。（圖一） 2. 啟動子為 RD29A，可受乾旱誘導而 調節基因表現，稱 p1302RZN，全 長為 17200bp。（圖一） 3. 啟動子為 ABRC，可受 ABA 誘導 而調節基因表現，稱 p1302QSZ， 全長為 14767bp。（圖一） 利用農桿菌轉殖法，將已構築好的 質體轉殖於水稻中。目前已經進行多次 轉殖，其中二次轉殖比較成功，經培養 篩選及植物再生後，分別均得到 T0 轉 殖 植 株 ， 其 轉 殖 效 率達1.7％～5.2％ （表一）。 目前總計已得到 T0 轉殖水稻 50 株，其中 9 株為空白質體 p1302，42 株為含 TPS 基因之轉殖株，在人工氣 候室以盆栽方式栽培，目視觀察生長狀 況大致正常，株高、分蘗、株型、葉型 等均與未轉殖植株相似，但稔實率卻比 未轉殖植株低。 T0植株種植於人工氣候室中，取 葉片抽取 DNA，以南方氏墨點法進行 檢定，並判別 TPS 轉殖基因拷貝數， 目前已完成部分轉殖植株檢測，發現大 多數轉殖株含有 1～2 個拷貝 。 另外構築完成體外表現 TPS 蛋白 之質體 (pETRZ) ，並將含 pETRZ 質 體的大腸桿菌，經培養及誘導後可得到 109KD 的 TPS 蛋白質（圖二）。此蛋 白可純化後製成抗體，以利進行西方墨 點分析(western analysis)。 圖一、三種轉殖質體圖譜
表一 水稻轉殖TPS基因之篩選結果 質體名稱 感染癒合 組織數目 可抗 Hyg 的癒 合組織數目 轉殖系 的數目 轉殖植株 的數目 a轉殖效率（ %） 平均(%) p1302 (Vector) 188 98 9 9 4.7% （9 / 188） 4.7 % p1302 RZN (promter:RD29A) 364 208 10 17 2.7% （10 / 364） 2.7 % p1302 QSZ (promoter:ABRC) 524 421 9 10 1.7 % （9 / 524） 1.7 % 134 120 9 14 6.7 % （9 / 134） p1302 UBIZ (promoter:Ubiquitin) 214 102 8 8 3.7 % （8 / 214） 5.2 % M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 94KD 67KD 43KD 30KD I P T G — ┼ ┼ — ┼ — ┼ — Ho urs 0 1 3 3 5 5 7 7 轉殖植株T0 代種植於人工氣候室 中，取葉片抽取 DNA，進行檢定並判 別 TPS 轉殖基因拷貝數。目前已完成 轉殖植株中部分檢測，發現 RZN 1等 植株為2個拷貝，其他數轉殖珠均為1 個拷貝（圖三）。由北方式墨點式分析 TPS 轉殖植株得知，UBIZ 轉殖株在未 處理時RNA的表現比 RZN 轉殖株好 （圖四）。 圖三.南方式墨點分析含 TPS轉殖植株 圖四.北方式墨點分析 TPS轉殖植株 從轉殖植株耐鹽性測試得知，種子直 接浸150mM的鹽水3天後，再種於不含鹽 的固態洋菜膠上，經一星期後，轉殖株較 耐鹽，地上部與地下部的生長均 比對照組好 (圖五)。 表示 TPS 蛋白表現位置 圖二. TPS 蛋白質大量表現
水稻耐旱性測試
照光時間 （小時) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 葉 綠素 含 量 ( mg g -1 ) -0.005 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 風乾一時後有照光 風乾一時後無照光 圖六. 非轉殖水稻耐旱性之預備測試 而對照組植株耐旱性測試得知，在 風乾 1 小時後再照光 1 小時，葉綠素含 量則明顯減少，若持續照光 2 小時，葉 綠素含量則趨近餘零（圖六）。因此可 以依此條件當作篩選耐旱的方法。 四、計畫成果自評 本計畫依照進度進行，至目前獲得 可受不同方式調控的轉殖水稻，並證明 轉殖水稻大部分為 1～2 個拷貝，植株 內 轉 殖 基因 在 RNA 層次 亦 有表 現 。 TPS 蛋白順利在體外表現，將此蛋白純 化製成抗體後可進行西方式分析。轉殖 水稻初步瞭解可耐鹽，但仍可進一步由 分生層面，瞭解轉殖水稻在高鹽下的變 化。耐旱篩選方法已建立，希望亦可獲 得對乾旱耐性較強的植株。 圖五. 轉殖植株耐鹽性測試。TK9為對 照組，U2-11-14為轉殖水稻五、參考文獻
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