應用神經工程發展可植入式神經元介面之研究-設計一可植入式之仿生性多點神經元微電極（子計畫二）（1/3）

行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告

子計畫二--設計一可植入式之仿生性多點神經元微電極(子

計畫二)(1/3)

計畫類別： 整合型計畫 計畫編號： NSC92-2218-E-006-025- 執行期間： 92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日 執行單位： 國立成功大學醫學工程研究所 計畫主持人： 陳家進 共同主持人： 林志勝，曾淑芬，朱銘祥，鍾卓良 計畫參與人員： 陳信壅、林淑萍、莊崇亮 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 93 年 5 月 31 日

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫

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成 果 報 告

■期中進度報告

應用神經工程發展可植入式神經元介面之研究-

設計一可植入式之仿生性多點神經元微電極（子計畫二）（1/3）

Design of Implantable Biomimetic Microelectrodes for Neuron Interface

計畫類別：□ 個別型計畫 ■ 整合型計畫

計畫編號：NSC 92－2218－E－006－025

執行期間： 92 年 8 月 1 日至 93 年 7 月 31 日

計畫主持人：陳家進

共同主持人：曾淑芬、朱銘祥、林志勝、鍾卓良

計畫參與人員： 陳信壅、林淑萍、莊崇亮

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列管

計畫及下列情形者外，得立即公開查詢

□涉及專利或其他智慧財產權，□一年■二年後可公開查詢

執行單位：

國立成功大學醫學工程所

中 華 民 國 九十三 年 五 月 三十一 日

行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

應用神經工程發展可植入式神經元介面之研究-

設計一可植入式之仿生性多點神經元微電極（子計畫二）

Design of Implantable Biomimetic Microelectrodes for Neuron Interface

計畫編號：NSC 92－2218－E－006－005

執行期間： 92 年 8 月 1 日至 93 年 7 月 31 日

計畫主持人：陳家進 執行單位：

國立成功大學醫學工程所

摘要

利用微機電製程的技術可以將電極進 一步微小化以製作出各式多點神經元介面 微電極，並可以在微電極陣列上同時刺激 及接收訊號。目前已經發展應用在許多體 外神經細胞生物學方面。本研究主要是在 探討利用微機電技術及細胞定位技術製成 的多點神經元介面，其對神經細胞生長的 可行性。應用微接觸式轉印技術於本研究 中，可以調整神經細胞生長排列及量測/ 刺激電極間的相關位置。我們的研究結果 中指出，可以藉由微機電技術成功地製成 具碗狀型態的多點神經元介面微電極。此 外，利用微接觸式轉印技術可以使神經細 胞在電極上定位並延著正確的電極位置方 向長，將有助於其他子計畫於設計各種電 生理神經科學的量測研究。 關鍵字：神經元介面、碗狀型態電極、細 胞定位圖、微接觸式轉印技術。

Abstract

New microfabricating and MEMS technologies have been developed for the fabrication of varied types of miniature

electrodes for sensation and stimulation of neurons. The microelectrode arrays have been developed for various in-vitro neuron cell culture applications. The aim of this research is to investigate the feasibility of neuron growth on a neuronal interface by using the microfabricating and cell patterning technologies. The aligned microcontact printing technique is adopted in this study to align between neurons and sensing/stimulation electrodes. Our results indicated that the microelectrode arrays designed in a specific bowel-shaped electrode could be successfully fabricated. In addition, the patterning stamp can align very well on the electrode which allows neurons to locate or grow right on electrode for experimenting various electrophysiological measurements designed in other sub-projects.

Keywords: neuronal interface,

bowel-shaped electrodes, cell patterning, microcontact printing.

前言

近年來由於微機電之體型微細加工、 面型微細加工和 LIGA 等製程的發展，已 可 以 利 用 矽 (silicon)[1] 或 高 分 子 (polymer)[2]基材製造各種新式微型電極， 隨著生物醫學及工程科技的日新月異，而 構 成 為 現 今 所 謂 的 神 經 介 面 (neural interface)研究，以電性傳導物質結合生物 性相容的材料及生物種類，有效地改善神 經介面的功能與表現。利用這些高科技技 術所製成的神經介面微電極來培養心肌細 胞或其他神經細胞，而此一電極-細胞所形 成的神經網狀系統，可以作為非侵入性的 細胞外紀錄[3]。 雖然微電極技術可以有效結合其他平 面微電極設備用於細胞外紀錄，但神經細 胞本體於微電極上任意分布、神經突觸往 各種方向生長以及神經細胞本身的遷移等 特性都會限制神經科學的觀察。為了解決 這個問題目前亦有許多學者針對於細胞於 微電極的固定方法作進一步相關的研究， 而目前的細胞定位技術發展有微接觸式轉 印（microcontact printing）技術[4]、應用 在微頻道（microchannels）的微流體圖案 （microfluidic patterning）[5]以及 Laminar flow patterning[6]等技術。 本研究的目的在於設計及建立一離體 的神經元介面，在此神經元介面可提供神 經細胞生長的環境，而且，此一神經元微 電極為多點式設計，可允許神經元細胞直 接於此一平台長成神經元網路。並進一步 利用微接觸式轉印技術，透過親細胞和次 細胞材料的處理，使在微電極上生長的神 經細胞可以形成想要的神經網路圖案。

研究方法

多點神經元微電極設計及製程 一般神經細胞的大小為 20µm 左右，設 計製作一 4×4 的多點神經元微電極。考慮電 極與細胞間接觸良好的問題，其與細胞接觸 的電極將進一步設計為一個碗型結構，以利 細胞於電極上可以有效定位，如圖一所示。 首先利用旋轉塗佈儀於 4 吋矽晶片上表面塗 佈上一層帶負電的光活性 polyimide(PI)層， 利用標準光照相平版印刷的技術來製造植 入結構的基底層(base)。PI 為一高分子且具 生物相容性的材質。接著利用電子蒸鍍儀於 此一 PI 基底層上鍍上 200µm 的金，以作為 電極及電極佈線。利用光微影蝕刻技術以做 出 4×4 的多點神經元微電極的電極及線 路。最後，利用旋轉塗佈儀塗佈 PI，經過曝 光顯影後使得金屬電極裸露並製作出具深 度似碗狀型的電極結構。利用表面輪廓儀來 量測所製作碗型電極的深度。 神經元細胞定位生長控制 利用旋轉塗佈儀於玻璃片旋鍍上PI， 經由曝光及光影製程技術做出想要的母模 圖案。用於細胞定位的PDMS聚合物是由 elastomer和harder以 9：1 比例配置而成。 將尚未乾化的PDMS滴入PI母模以製出所 需的PDMS印章。為了讓母模上的圖案能 對準壓印至基材上的電極，設計一能與顯 微鏡緊密接觸，而又能透過它來觀察母模 上的圖案印章的裝置，如圖二(a)所示，透 過顯微鏡外接微接觸式轉印對準系統，可 以 對 準 母 模 圖 案 和 基 材 上 的 電 極 。 以 poly-D-lysine (PDL) 溶 液 覆 蓋 所 製 程 的 PDMS印章圖案表面(3 ×3 ㎜2)。印章與所 欲壓印物質的相對位置可以藉由顯微鏡的 平台來調整印章X-Y平面。對微接觸式轉 印而言，軸向的控制可由顯微鏡的Z軸位置 調節鈕來作變動，如圖二(b)。最後，基材 用 2mg/ml 胎 牛 血 清 蛋 白 (bovine serum

albumin, BSA)浸泡一小時如圖二(c)。然後 用磷酸鹽緩衝液(phosphate buffer saline, PBS)沖洗掉基材上多餘的BSA。以微接觸 式轉印的技術完成定位細胞的步驟，其所 產生的細胞定位圖案示意圖如圖二(d)所 示。進一步以PC12 和 3T3 細胞培養於經由 微接觸式轉印技術所壓印的圖案的基材 上，觀察其細胞的黏著情形以進行微接觸 式轉印技術細胞定位的評估。使用 10ug/ml FITC-labeled PLL當作圖案的指示劑，以確 定在微陣列電極上的圖案。

結果與討論

圖三為利用微機電製程技術所製造出 來的電極外觀圖，進一步利用表面輪廓儀 來評估電極的構造，如圖四及圖五所示。 可以利用在最上層 PI 部分的開孔深度來製 作出多點神經元微電極中的碗型電極的構 造，而其深度乃是取決於旋轉塗佈儀的轉 速。塗佈厚度與旋轉速度的平方根成反 比，所以進一步控制塗佈速度，以製出所 需的碗型電極深度約為 20µm 左右。於圖 四為焊接點之開孔，可以看出焊接點的電 極邊長大小為 1.8mm×1.8mm，乃為配合標 準電子端子之規格。焊接點的電極之深度 約為 25µm 左右。圖五為碗型電極之開孔， 碗型電極大小為 40µm×40µm，電極與電極 的間距為 200µm，於圖中可以發現碗型電 極深度只有 2µm。由此可發現在相同的電 極製作過程中，焊接點的電極可以形成深 度 25µm 的凹槽，而碗型電極卻沒辦法， 可能要考慮延長碗型電極的蝕刻時間或微 影時間，才可以達到預期的目標。 圖六為 PI 所製成的母模的表面。左邊 比例刻度尺長度為 200 µm，右邊比例刻度 尺長度為 50µm。而在圖六中可以進一步發 現 在 每 一 方 格 的 四 個 頂 點 交 會 處 有 square-shaped node 的設計，此乃是為了能 夠增加細胞本體於電極上的附著面積。進 一步以 PI 母模為基板製出所需的 PDMS 印章，並取 PDL 溶液於 PDMS 印章上，利 用上述所設計的顯微鏡外接微接觸式轉印 對準系統，將印章上的 PDL 轉印至經過電 漿表面改質處理的基材表面，進一步利用 PC12 及 3T3 細胞來做細胞定位的評估，其 結果可印證於圖七：左圖為 PC12 細胞， 右圖為 3T3 細胞，利用數位相機(Olympus C5050)取得，其比例刻度尺長度分別為 100µm 及 50µm。PC12 與 3T3 細胞可以成 功地沿著所設計的圖案排列在經過電漿表 面改質處理的基材表面，而進一步於實驗 中發現經電漿處理後的基材表面，其 PDL 可以在基材上沾附較多的量，且經過細胞 培養後四天，仍可發現基材上有 PDL 的存 在。圖八乃是利用微接觸式轉印對準系統 於電極上做細胞定位圖案的轉印，並以 FITC-labeled PLL 當作細胞定位圖案的指 示劑，以確定在微陣列電極上的圖案。綠 色螢光為細胞定位圖案，黃色部分為電 極，可以清楚發現 square-shaped node 與電 極間的接觸非常相近。

計畫成果自評

本研究計畫中的主要成果可以分為兩 部分： 一、本研究完成以具生物相容性的 PI 為基材，設計一可供離體神經細胞培養之多 點神經元微電極介面。 二、本研究完成微接觸式轉印的母模已 能製造出有彈性的 PDMS 印章，並進一步有 效應用於細胞定位上。 利用微接觸式轉印技術將利用 PDL 以 幾何的排列方式轉印在基材表面上，使得神 經細胞可在上面生長，而常轉印的材質有氧 3

化矽，polyimide 等。其最大優點是成本比 其他設計路徑的方法來得便宜，且 stamp 可 重覆利用，增加了其再現性及實用性。結合 微接觸式轉印技術於自製之多點微電極陣 列上，可以增加並固定神經細胞本體在電極 面上的接觸，而且細胞間彼此相互連結的能 力也會增加，此一結果可以做為將來體外神 經網路系統的神經介面微電極。

參考文獻

[1]Q. Bai and K. D. Wise, “Single-unit neural recording with active microelectrode arrays,” IEEE Trans. Biomed. Eng., vol. 48, pp. 911-920, 2001.

[2]P. J. Rousche, D. S. Pellinen, D. P. Pivin, J. C. Williams, R. J. Vetter, and D. R. Kipke, “Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability,” IEEE Trans. Biomed. Eng., vol. 48, pp. 361-371, 2001.

[3] J. J. Pancrazio, J. P. Whelan, D. A. Borkholder, W. Ma, and D. A. Stenger, “Development and application of cell-based biosensors,” Ann. Biomed. Eng., vol.27, pp. 697-711, 1999.

[4]S. N. Bhatia, M. L. Yarmush, and M. Toner, “Controlling cell interactions by micropatterning in co-cultures: hepatocytes and 3T3 fibroblasts,” J. Biomed. Mater. Res., vol.34, pp. 189-199, 1997.

[5]A. Folch, A. A. Ayon, , O. Hurtado, M. A. Schmidt, and M. Toner, “Molding of deep poly(dimethylsiloxane) microstructures for microfluidics and biological applications,” J.

Biomech. Eng., vol.121, pp. 28-34, 1999.

[6]S. Takayama, E. Ostuni, X. P. Qian, J. C. McDonald, X. Y. Jiang, P. LeDuc, M. H. Wu,

D. E. Ingber, G. M. Whitesides, “Topographical micropatterning of poly(dimethylsiloxane) using Laminar flows of liquids in capillaries,” Adv. Mater., vol.13, pp. 570-574, 2001. 30-45 μm 25-35 μm Au 圖一 設計製作一 4×4 的多點神經元微電 極，其放大部分為多點神經元微電極中的 碗型電極。

(a) 圖二 (a)左圖為顯微鏡外接微接觸式轉印 對準系統裝置，在顯微鏡目鏡的連接裝置 下其印章支撐盤的縱切面；右圖為連接裝 置的外觀圖。(b)將印章裝到印章支撐盤管 子內並對準，調整旋轉盤和顯微鏡平台來 改變基材在 X-Y 平面的位置，而 Z 軸則由 顯微鏡調整扭來控制。(c)壓印完之後，將 基材放置 BSA 溶液一小時。(d)用 PBS 溶 液洗淨多餘 BSA，即可看見微米壓印的圖 案。 圖三 利用微機電製程技術所製造出來的 多點神經元微電極外觀圖。 Width (um) 0 1000 2000 3000 4000 5000 Dept h ( u m) 0 5 10 15 20 25 30 bonding pad 圖四 經表面輪廓儀量測多點神經元微電 極中的焊接點電極的構造，焊接點的電極 邊長大小為 1.8mm，深度約為 25µm 左右。 Width (um) 0 200 400 600 800 1000 De p th ( u m) -3 -2 -1 0 1 2 bowel electrode 圖五 經表面輪廓儀量測多點神經元微電 極中的碗型電極的構造，碗型的電極邊長 大小為 40µm，深度約為 2µm 左右。 物鏡鏡 連接環 軸承 旋扭 旋轉 (b) PDMS 印章 管子 基材 平台 x y z 目鏡 培養皿 BSA (c) (d) 1.8mm PDL _25µm BSA 5

圖六 PI 所製成的母模的表面。左邊比例刻 度尺長度為 200 µm，右邊比例刻度尺長度 為 50µm。 圖七 利用 PC12 及 3T3 細胞來做細胞定位 的評估。左圖為 PC12 細胞，右圖為 3T3 細胞，利用數位相機(Olympus C5050)取 得，其比例刻度尺長度分別為 100µm 及 50µm。 圖八 利用微接觸式轉印對準系統於電極 上 做 細 胞 定 位 圖 案 的 轉 印 ， 並 以 FITC-labeled PLL 當作細胞定位圖案的指 示劑，以確定在微陣列電極上的圖案。綠 色螢光為細胞定位圖案，黃色部分為電極。

附錄

1. S. P. Lin, T. L. Chuang, J. J. J. Chen, S. F. Tzeng, “Design of microscopy-based microcontact printing stamp and alignment device for patterned neuronal growth”,

Journal of Medical and Biological Engineering, vol.24, pp. 1-6, 2004.

2. S. P. Lin, J. D. Liao, J. J. J. Chen, “Immobilized chitosan on the polypropylene non-woven fabric surface for antibacterial and biomedical applications”, 6APCCS, 2004 (oral).