大腸桿菌ClpYQ蛋白酶之ClpY I domain區域双環構造與孔洞區所扮演角色

國立臺灣大學生物資源暨農學院農業化學系 博士論文

Department of Agricultural Chemistry College of Bioresources and Agriculture

National Taiwan University Doctor Thesis

大腸桿菌ClpYQ蛋白酶之ClpY I domain區域双環構 造與孔洞區所扮演角色

The role of ClpY I domain double loops structure and pore site in Escherichia coli ClpYQ protease

謝汎擎

Fan-Ching Hsieh 學號：D95623002

指導教授：吳蕙芬 博士 Advisor：Whei-Fen Wu, Ph.D.

中華民國 101 年 7 月

July, 2012

i

謝誌

感謝吳蕙芬老師悉心指導與各位口試委員給予的寶貴 建議，才能將論文順利的完成。也謝謝家人在攻讀博士學位 期間對我的包容與支持。求學過程中師長與好朋友們所給予 的提點與建議使我受益良多。還有謝謝這六年來一起在實驗 室打拼互相扶持的夥伴們，以及中研院林宇慶博士、江秉諭 博士及林聖偉博士在實驗上給予的幫助與建議。對大家的幫 忙，盡在不言中，只有感謝、感謝再感謝

謝汎擎 101.7.27

iii

摘要

ATP依賴型蛋白酶對於控制關鍵調控蛋白表現量及降解異常蛋白質以維持 微生物體內正常生理活動扮演著重要的角色。ClpYQ蛋白酶為ATP依賴型蛋白酶 其中的一種由ClpY與ClpQ二種次單元體所組成。ClpY具有ATPase與chaperone 的功能而ClpQ為一胜肽酶。ClpY可以自身形成的六元環而與ClpQ十二元體上下 相接形成啞鈴狀的聚合分子。ClpY主要負責辨識、解構與運送基質SulA至ClpQ 十二元體的活性中心進行分解。ClpY單元體由N、 I 與C三個domain組成各有其 獨特的活性而I domain區域突出於N與C domain之外，其主要的功能尚未有清楚 的界定。本研究發現ClpYQ蛋白酶對基質MBP-SulA的辨識結合主要是由loop2結 構來進行。而I domain loop1(aa.137-150) 結構則是可能在ClpY在與MBP-SulA辨 識結合後，ClpYQ蛋白酶進行降解作用時，阻擋多餘的MBP-SulA與ClpY六元環 結合的功能。在pore I/loop2雙缺失突變蛋白ΔP1L2(aa 90-93；aa 175-209)在in vitro pull down實驗中有與MBP-SulA最低的相對活性，顯示基質的辨識結合由pore I 與loop2共同負責。另外ClpY可以在沒有ATP存在下與SulA進行辨識結合，而且 當ClpY形成六元環後只能與少量的MBP-SulA結合。綜合以上結果可推論出ClpY 與SulA進行辨識結合的步驟：即ClpY在沒有ATP存在下與SulA進行辨識結合後，

SulA-ClpY在ATP存在下與其他未結合的ClpY形成SulA-ClpY6或SulA-ClpY12的 聚合，再與ClpQ十二元體形成SulA-ClpY6Q12聚合體，再進行解構、傳送及降解 的步驟。而ClpYY408A突變蛋白無法形成穩定的六元環及ClpYQ聚合體，但仍 保有部分的ATPase活性及部分的降解活性，顯示了ClpYQ聚合的穩定度對酵素 的活性是重要的。

關鍵字： ClpYQ、MBP-SulA、pore I site、I domain、pull down、基質辨識

Abstract

ATP dependent proteases play important roles in controlling the levels of key regulatory protein and in the elimination of abnormal proteins to maintain normal physiological functions of microorgamisms. ClpYQ protease, one of ATP dependent proteases includes two subunits ClpY and ClpQ. ClpY acts as an ATPase and chaperone and ClpQ is a peptidase. ClpY is capble of forming a hexamer ring docked with ClpQ dodecamer to constitute a dumbbel-shaped complex. ClpY is responsible to recognize, unfold and traslocate substractes into the proteolytic site of ClpQ for degradation. Besides, ClpY is divided into three domains N, I and C domain. Each domain has it’s own distinct activity. I domain, a unique protruding domain of ClpY, is unclear for its function. In this study, our results demonstrated that ClpY I domain loop2 is responsible for the initial gripping of SulA and loop1 acts as a lid that is likely to prevent an excess of substracts binding for ClpY when ATP is present.

ΔP1L2(aa 90-93；aa 175-209) showed the lowest binding activity with MBP-SulA at in vitro pull-down assay and these results indicated that pore I and loop2 are most

responsiable for substrates binding. In addition, ClpY was capble of recognizing MBP-SulA wthout ATP to form SulA-ClpY complex and the ClpY hexamer can only bind a MBP-SulA molecule when ATP is present. These results also indicated that ClpY was capble to recognize SulA wthout ATP and formed SulA-ClpY complex for increasing its local surrounding substrate’s concentration and likely subsequently formed SulA-ClpY6 or SulA-ClpY12 complex docked with ClpQ for degradation when ATP is present. Y408A is not capble to form stable hexamer and ClpYQ oligomer maintains partial ATPase activity and degradation activity indicating that ClpYQ oligomerization is important for the enzyme activity.

keyword： ClpYQ、MBP-SulA、pore I site、I domain、pull down、substrate recognition

v

目錄

論文審定書………i

謝誌………ii

摘要………iii

Abstract………iv

目 錄 … … … v

表目錄………vii

圖 目 錄 … … … v i i i 附圖目錄………x

壹、 前言………1

一、 能量依賴蛋白酶………1

二、 ClpYQ 蛋白酶………2

三、 ClpQ 結構及功能………3

四、 ClpY 結構及功能………4

五、 ClpYQ 蛋白酶與 ATP 之間的交互作用………6

六、 ClpY 與 ClpQ 的交互作用………7

七、 ClpYQ 蛋白酶之基質………...9

八、 ClpYQ 蛋白酶對於 SulA 之辨識………10

九、 研究動機與目的………11

貳、 材料與方法………12

一、實驗材料……… 12

(一)菌株與質體………12

(二) 藥品與試劑………12

二、方法……… 14

(一) 目標基因選殖………14

(二) 蛋白質純化………17

(三) SDS 蛋白質膠體電泳………20

(四)西方墨點分析………22

(五) 蛋白質活性測試………26

(六) ATPase活性測定………27

(七)等溫滴定量熱法……… 28

(八) 蛋白質聯結測試………28

(九) Pull down assay………29

(十)表面電漿共振生物分子感測法………30

参、結果………31

一、ClpY與ClpQ及其突變蛋白純化………..31

二、ClpY及其突變蛋白對於ClpYQ分解MBP-SulA活性的影響………31

三

、

四、以蛋白質聯結測試觀察ClpY及ClpY與ClpQ的聚合………38

五、ClpY T87I ATPase突變蛋白的定性分析………40

六、C domain突變蛋白ClpY Y408A的定性分析………41

七、以表面電漿共振生物分子感測法進行即時偵測MBP-SulA與ClpY、pore I 缺失突變蛋白與雙缺失突變蛋白的親和力……… 43

肆、討論………44

伍、結論………49

陸、參考文獻………50

vii

表目錄

表一、本論文所使用的菌株………55

表二、本論文所使用的質體………56

表三、本論文所使用的引子………57

表四、ClpY及其缺失突變蛋白於胞外降解MBP-SulA的相對活性………58

表五、在不同核甘酸存在下ClpY與MBP-SulA在in vitro pulldown試驗中相對活 性………59

表六、以表面電漿共振生物分子感測法(Surface plasmon resonance assays)進行即 時偵測MBP-SulA與ClpY及其缺失突變蛋白之間的親和力………60

表七、以表面電漿共振生物分子感測法(Surface plasmon resonance assays)進行即 時偵測於有 ATP 下 MBP-SulA 與 ClpY 及其缺失突變蛋白之間的親和 力………61

圖目錄

圖一、突變蛋白及及其突變區域位置………62

圖二、帶有 His tag ClpY 與 ClpQ 的蛋白質純化………63

圖三、帶有 MBP tag SulA 蛋白質的純化………64

圖四、純化帶有 N 端 His tag 的 ClpYΔI domain 缺失突變蛋白質………65

圖五、純化帶有 N 端 His tag 的 ClpY ΔD-loop 缺失突變蛋白質………66

圖六、ClpYQ 蛋白酶於胞外對 MBP-SulA 降解實驗………67

圖七、ClpYQ 與 ClpY-ClpQE61C 對 MBP-SulA 的降解實驗………68

圖八、ClpY I domain 缺失突變蛋白對 MBP-SulA 的降解實驗………69

圖九、 ClpY ΔD-loop 缺失突變蛋白對 MBP-SulA 的降解實驗及其蛋白質穩度.70 圖十、ClpY I domain loop2 點突變蛋白對 MBP-SulA 的降解實驗…………71

圖十一、以不同核苷酸進行 ClpY 與 MBP-SulA 的 in vitro pulldown 實驗………72

圖十二、以 in vitro pulldown 分析 ClpQ 對 ClpY 與 MBP-SulA 的辨識結合的影 響………73

圖十三、在有或無 ATP 下以 in vitro pulldown 分析 ClpYΔI+7Gly 缺失突變蛋白 與 MBP-SulA 辨識結合………74

圖十四、在有或無 ATP 下以 in vitro pulldown 分析 ClpYΔL1 缺失突變蛋白與 MBP-SulA 辨識結合………75

圖十五、在有或無 ATP 下以 in vitro pulldown 分析 ClpYΔL2 缺失突變蛋白與 MBP-SulA 辨識結合………76

圖十六、在有或無 ATP 下以 in vitro pulldown 分析 ClpY ΔD-loop 缺失突變蛋白 與 MBP-SulA 辨識結合………77

圖十七、在有或無 ATP 下以 in vitro pulldown 分析 I domain loop2 點突變蛋白與 MBP-SulA 辨識結合………78

圖十八、在有或無 ATP 下以 in vitro pulldown 分析 pore I 缺失突變蛋白 ΔP1 與 MBP-SulA 辨識結合………79

圖十九、在有或無 ATP 下以 in vitro pulldown 分析雙缺失突變蛋白 ΔP1L1 與 MBP-SulA 辨識結合………80

圖二十、在有或無 ATP 下以 in vitro pulldown 分析雙缺失突變蛋白 ΔP1L2 與 MBP-SulA 辨識結合………81

圖二十一、ClpYΔL2 缺失突變蛋白與雙缺失突變蛋白 ClpYΔP1L2 in vitro pulldown 之結果………82

圖二十二、ClpY pore I 缺失突變蛋白及 pore I/I domain 雙缺失突變蛋白對 MBP-SulA 的降解實驗………83

圖二十三、以蛋白質聯結測試觀察 ClpY 自身聚合及 ClpY 與 ClpQ 的聚合……84

圖二十四、以蛋白質聯結測試觀察 ClpY 與 MBP-SulA 的結合………85 圖二十五、以蛋白質聯結測試觀察ClpYΔL1 缺失突變蛋白自身聚合及 ClpYΔL1

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缺失突變蛋白與 ClpQ 的聚合………86 圖二十六、以蛋白質聯結測試觀察ClpYΔL2 缺失突變蛋白自身聚合及 ClpYΔL2

缺失突變蛋白與 ClpQ 的聚合………87 圖二十七、ClpY T87I ATPase 突變蛋白對 MBP-SulA 的降解實驗………88 圖二十八、ClpY T87I ATPase 突變蛋白 ATPase 的相對活性………89 圖二十九、以等溫滴定量熱法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC) 進行 ClpY、

C l p Y T 8 7 I 與 AT P γ S 結 合 測 定 … … … 9 0 圖三十、以蛋白質聯結測試觀察 ClpY T87I ATPase 突變蛋白自身聚合及 ClpY T87I ATPase 突變蛋白與 ClpQ 的聚合………91 圖三十一、ADP 存在下以蛋白質聯結測試觀察 ClpY T87I ATPase 突變蛋白自身

聚合及 ClpY T87I ATPase 突變蛋白與 ClpQ 的聚合………92 圖三十二、ClpY Y408A 突變蛋白對 MBP-SulA 的降解實驗………93 圖三十三、ClpY Y408A 突變蛋白 ATPase 的相對活性………94 圖三十四、以蛋白質聯結測試觀察 ClpY Y408A 突變蛋白自身聚合及 ClpY Y408A

突變蛋白與 ClpQ 的聚合………95 圖三十五、在有或無 ATP 下以 in vitro pulldown 分析 ClpY Y408A 突變蛋白與

MBP-SulA 辨識結合………96 圖三十六、以表面電漿共振生物分子感測法(Surface plasmon resonance assays)進

行即時偵測 MBP-SulA 與 ClpY 之間的親和力………97 圖三十七、以表面電漿共振生物分子感測法(Surface plasmon resonance assays)進

行即時偵測 MBP-SulA 與 ClpYΔP1 之間的親和力………98 圖三十八、以表面電漿共振生物分子感測法(Surface plasmon resonance assays)進

行即時偵測 MBP-SulA 與 ClpYΔP1L1 之間的親和力 ………99 圖三十九、以表面電漿共振生物分子感測法(Surface plasmon resonance assays)進

行即時偵測 MBP-SulA 與 ClpYΔP1L2 之間的親和力………100 圖四十、以表面電漿共振生物分子感測法(Surface plasmon resonance assays)在

ATP 存在下進行即時偵測 MBP-SulA 與 ClpY 之間的親和力 ………101 圖四十一、以表面電漿共振生物分子感測法(Surface plasmon resonance assays)在

ATP 存在下進行即時偵測 MBP-SulA 與 ClpYΔP1 之間的親和力…102 圖四十二、以表面電漿共振生物分子感測法(Surface plasmon resonance assays)在

ATP 存在下進行即時偵測 MBP-SulA 與 ClpYΔP1L1 之間的親和力…103 圖四十三、以表面電漿共振生物分子感測法(Surface plasmon resonance assays) 在

ATP 存在下進行即時偵測 MBP-SulA 與 ClpYΔP1L2 之間的親和力…104 圖四十四、ClpY 與 MBP-SulA 辨識結合流程………105

附圖目錄

附圖一、大腸桿菌 ClpYQ 結構圖………106 附圖二、大腸桿菌 ClpY 六元環與單元體結構圖………107 附圖三、大腸桿菌 ClpY 與 ClpQ 在無 ATP 下以凝膠過濾法純化其分子大小之分

布………108 附圖四、大腸桿菌 ClpY pore I site 之結構………109 附圖五、基質促進 ClpYQ 聚合與降解流程………110

1

壹、前言

一、能量依賴蛋白酶(energy-dependent protease)

在細胞內為了維持正常的生理功能及新陳代謝活動，細胞內各種調節蛋白濃 度 高 低 及 蛋 白 質 品 質 均 須 調 控 與 平 衡 才 能 達 成 。 而 能量依 賴 蛋 白 酶 (energy-dependent protease)能夠藉由分解蛋白質來維持細胞中蛋白質濃度的恒定 及分解錯誤摺疊的蛋白質以維持蛋白質的品質，確保功能正常。在真核細胞中 26S proteasome 可辨識被加上 ubiquitin tag 的基質予以分解。然而在細菌中有數 種標記系統及能量依賴蛋白酶；這些能量依賴蛋白酶(energy-dependent protease)在 正常的生長狀況下細胞內有一定的表現量。當受到環境的壓力刺激下細菌會增加 此類蛋白質的合成，調節細胞生理功能抵抗環境壓力維持正常生理功能。而蛋白 質的分解作用，不管在動物細胞或細菌中均涉及在貧乏狀態下回收蛋白質，藉以 產生游離胺基酸進行回收再利用與能量生成的機制 (Wickner et al., 1999)。所以 這些能量依賴蛋白酶(energy-dependent protease)在調節細胞生理功能上扮演了重 要的角色。

在大腸桿菌中也具有此類能調節細胞生理功能的 energy-dependent protease，

如 Lon、HslUV(ClpYQ)、ClpAP、ClpXP、FtsH 等。以上這些蛋白酶均可藉由水解 ATP 將蛋白質水解成小片段，當細菌生長環境受到改變如：溫度上升或下降、營 養缺乏、添加抗生素或其他化學藥劑、滲透壓改變、UV 照射等，都會引發菌體 內不正常蛋白質生成累積，此時細菌會因所受到不同的壓力產生一些反應，如：

熱休克反應(Heat-shock response)或 SOS 反應，在這些反應中會引起以 ATP 作為 能量來源的蛋白酶提高生產，用以幫助細菌度過不利於生長的環境。

ATP 依賴蛋白酶（ATP-dependent protease）

ATP 依賴蛋白酶為廣泛存在於真核細胞、細菌及古細菌中。顧名思義 ATP 依賴蛋白酶能夠水解 ATP 作為能量來源，將基質結構打開並降解。ATP 依賴蛋

白酶通常為桶狀的複合體，而蛋白酶的活性部位則被包埋於桶狀複合體中。基質 必須穿越桶狀的複合體中央的孔洞才能抵達蛋白酶活性中心(Bochtler et al., 1997;

Wang et al., 1997)。孔洞直徑大小約為 10Å ，而蛋白質進入需經解構之後才能進 入蛋白酶活中心進行降解 (Bochtler et al., 2000; Guo et al., 2002)。而真核生物中 的 26S proteasomeATP 也是依賴蛋白酶的成員之一。由具有 ATPase 功能的 19S proteasome 及具有蛋白酶功能的 20S proteasome 所組成，19S proteasome 會辨識 基質並將基質解構送入 20S proteasome 中進行降解 (Voges et al., 1999)。

在大腸桿菌中 ATP-dependent protease，其中可依組成分為雙組合系統(two component system)，如 ClpYQ、ClpAP、ClpXP 等；單一胜肽鏈蛋白酶 (single-chain protease)，如 Lon 及 FtsH。雙組合系統是由兩各單元體組成，

分別為 ATPase 與 peptidase；單一胜肽鏈蛋白酶則是具有 ATP 水解酶(ATPase) 與胜肽分解酶(peptidase)活性的單元體。ATP-dependent proteases 在分類上根 據 AAA (ATPase associated with a variety of cellular activities)保守序列的個數，將 ATP-dependent protease 分為兩種類型的蛋白質:（1）Class I:如 ClpA、ClpB、

ClpC 及 ClpE，其均具有兩個具保守性的 AAA domain 或 Nucleotide binding domain (NBD) AAA-1(D1)，分別為 AAA-1(D1)及 AAA-2(D2)，兩者之間由一段 序列(linker sequence)隔開，此序列於各個菌種長度接不同；(2)Class II：如 ClpX 與 ClpY，其具有一個保守性的 AAA module，為 AAA-2(與 D2 具有同源性) (Schirmer et al., 1996)。

二、ClpYQ 蛋白酶 ClpQY operon

ClpQY operon是以clpQ在前clpY在後的順序存在於基因組上 (Chuang et al., 1993)，而ClpQY operon 能經由熱休克誘導生成及其上游啟動子(promoter)基 因序列與σ³² (熱休克基因啟動子)能辨識之保守序列相似，且其序列與groE及

3

dnaK等熱休克基因啟動子相符，因而clpQ⁺Y⁺ operon被推論為熱休克基因。所以 ClpQY也被稱為HslVU(Heat Shock Locus)。

在1996年，Rohrwild等人 (Rohrwild et al., 1996)，利用帶有lac promoter 及 ropH 基因( encodeσ³²)之質體，大量表現σ³² 時，ClpYQ 的表現量增加約 10 倍，且當有 ATP 存在時，ClpYQ水解短胜肽鏈 Z-Gly-Gly-Leu-AMC 之能力亦提 高約10倍，此研究確認了ClpYQ 屬於熱休克蛋白酶，並提及此 operon 受到σ³² 調控。

clpY 基因的突變會造成dnaA46突變株在較高溫環境生長時抑制DNA的

複製，Lon突變株的絲狀性狀及照射UV所造成的死亡可藉由clpQ⁺Y⁺ 的大量 表現獲得抑制 (Khattar, 1997)。 ClpYQ同時也能分解σ³² 在44℃下分解活性為 35℃的15倍 (Kanemori et al., 1997)。 在研究報告中 (Lien et al., 2009)利用在染色 體上clpQ⁺Y⁺ 啟動子序列與報告基因(lacZ) 融 合 ， 並 在 野 生 型 及 r p o H 缺 失 株 中 進 行 熱 休 克 的 誘 導 ， 在研究報告中融合基因在野生型菌株經熱休克誘導會表 現增加而在rpoH缺失株表現量減少且在啟動子與RpoH結合的-10區域帶有C→T 點突變，融合基因表現量會減少證明了RpoH是單獨調控clpQ⁺Y⁺ operon的表現。

作者更進一步的發現clpQ⁺Y⁺operon的五端上游帶有一段約 71bp 未轉譯序列 (5’untranslated region; 5’UTR)會形成stem-loop的結構針對此一結構經由缺失突 變分析結構的破壞會造成融合基因表現量的下降由此一結果得出5’UTR形成 stem-loop的結構與否會影響clpQ⁺Y⁺ operon表現，推論stem-loop的結構可增加 mRNA的穩定性 (Lien et al., 2009)。

三、ClpQ結構及功能

ClpQ單元體由176個胺基酸構成，基因片段長531個鹼基，分子量為19kDa。

ClpQ會聚合形成六元環單體，再由兩個六元環單體聚合形成十二元體。ClpQ具有

胜肽酶的功能，主要負責水解經由ClpY解開並運送來的胜肽鏈 ClpQ與真核生物 的 20S proteasome之β-type subunit 具有 18%之相似度且在蛋白酶的分類上與 20S proteasome同樣屬於threonine protease，與ClpP（屬於 serine protease）不同 (Missiakas et al., 1996, Bochtler et al., 1997)。

ClpQ在其單獨存在時，是一個活性不高的胜肽酶(peptidase)可緩慢的水解一 些斥水性的胜肽 (Rohrwild et al., 1996)，ClpQ 自身會形成六元環在兩個六元環 聚合成啞鈴狀的十二元體，而其活性中心位於十二元體內部 (Bochtler et al., 1997)。基質必須進入活性中心才能被分解。因此十二元體的聚合對於ClpQ的活 性有很大的影響。組成ClpQ的12元體每個單體皆具有單一活性部位，所以ClpQ 的12元體具有12個活性部位。在2009年的研究報告顯示，當ClpQ 12元體中具有 正常ClpQ次單元的個數達6個以上時，可以維持與野生型ClpQ 蛋白酶相同的 peptidase活性，若個數不達6個時，其peptidase活性有逐漸下降的趨勢 (Lee et al., 2009)。

四、ClpY結構及功能

ClpY由443個胺基酸構成，基因片段長1332個鹼基，分子量為49kDa，會 聚合形成六元環 (附圖一)。ClpY具有ATP水解酶與chaperone的功能 ClpY六元 環能與ClpQ聚合成的十二元體結合後進行蛋白質的水解。ClpY具有ATP水解 酶與chaperone的功能之外也負責基質的辨認與結合，並藉著水解 ATP消耗能 量，打開基質及將基質經由中心孔洞送往ClpQ中水解。ClpY單體具有三個區域 分別為N、C及 I domain；N domain約有197各胺基酸 (N, residuces 2-109 及244-332) 此區域為nucleotide binding site；C domain為111各胺基酸組 成,(333-443aa)形成一α-helix構造；而I domain介於N、C domain之間

（110-243 aa)而突出於N、C domain之外，其結構具有高度的彈性 (附圖二 B) (Bochtler et al., 2000)。

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ClpY N domain

ClpY具有二個N domain(aa 2-109及aa 224-332)中間以I domain相連之後接C domaim(N-I-N-C) ， 在 N domain 中 有 核 甘 酸 結 合 區 域 nucleotide binding pocket(aa17-19, aa57-66, aa80-89)、central pore(pore I aa89-94,poreII aa265-269) 。 前人研究中(Wang et al., 2001)指出在不同菌種間ATPase的同源性比較，在 pore I的GYVG motif的胺基酸序列保守性相當高，藉由ClpY結晶結構指出位於 pore I GYVG motif中Y91位置會隨著ClpY open state到close state的變化而遠離或 靠近ClpQ，因此認為水解ATP提供了將基質打開並轉送至蛋白酶活性區的能量，

Y91則可能扮演將基質解構及轉送至活性區的角色(Wang et al., 2001)。在Park等 人報告中更進一步推論位於ClpY中心孔洞周圍的G⁹⁰Y⁹¹V⁹²G⁹³ pore-motif(附圖 四)扮演打開及運送基質的角色 (Park et a1 2005)。Y91G、V92G、G93A、△88-92 突變蛋白無法分解MBP-SulA，但仍具有分解casein的能力。突變蛋白Y91F、V92I、

V92A、V92S具有分解MBP-SulA及casein能力，而其他突變蛋白Y91I、Y91C、

Y91A、Y91S、V92F、V92C無法分解MBP-SulA但仍具有分解casein的能力。結 果顯示在第91位置為芳香環系胺基酸對於分解SulA是無可取代的(Park et al., 2005)。且在2011年的研究，以酵母菌雙雜交系統與in-vitro pull down assay針對 位 於 ClpY 中 心 孔 洞 (central pore) 中 的 兩 個 pore site(pore I 90-93aa. ； poreII 265-269aa.)與基質MBP-SulA結合的關係研究中指出pore I突變蛋白Y91F、Y91S、

V92F在ClpQ存在下，不管是否具有分解基質MBP-SulA的能力(Y91F有；Y91S、

V92F則無)均可與基質MBP-SulA結合，證明了pore I參與基質的結合與負責運送；

而poreII不若pore I重要 (Hsieh et al., 2011)。

ClpY C domain

ATP與ClpY結合時ATP會同時與C domain與N domain接觸形成緊密的結合；反之，

C domain與N domain結構較鬆散。C domain也會與鄰近ClpY單元體的N domain 以逆時針的方向緊密的結合幫助ClpY形成六元環 (Bochtler et al., 2000)。的在前 人研究中，ClpY當與ATP結合時C domain末端會自結構內部伸出並插入ClpQ聚 合體活化ClpQ活性 (Wang et al., 2001)。ClpY C domain具有幫助ClpY形成六元環、

幫助ClpY與ClpQ結合與維持ATPase活性的功能。

ClpY I domain

缺失突變株無法與SulA有親和力，然而ClpYΔI+7Gly在MMS test與西方氏雜交 (western blot)的結果顯示除了野生型ClpY及ClpYΔL1(loop1；137-150aa)外其餘突 變株均無法生長在western blot的結果也測到了SulA的存在。以上結果顯示ClpY I domain可能參與降解作用之前期對基質辨識有關。

五、ClpYQ蛋白酶與ATP之間的交互作用

ClpYQ為ATP依賴蛋白酶 (ATP-dependent protease)，ATP存在與否與ClpYQ蛋

7

白酶的活性有密切的關聯。與ClpYQ蛋白酶需要藉由ClpY本身的ATPase水解ATP 將基質解構並傳送基質至ClpQ進行基質降解。在沒有ATP存在下經gel filtraction 所得到的聚合蛋白分子量則分布於50 kDa 、100kDa、282 kDa及346 kDa，約為 ClpY單體的1倍、2倍、6倍及7倍，而在ATP存在下經gel filtraction則大部分聚集 在單體的6倍及7倍(Kessel et al., 1996; Rohrwild et al., 1996;Yoo et al.,1996)。經 X-ray結晶繞射分析，確認ClpY是以六元環的形式存在(Rohrwild et al., 1997)顯示 ATP的存在會促進ClpY六元環的形成。而在2008年研究報告中發現，雖然ClpY 六元環具有6各ATP結合區，但其與ATP結合的狀態在3至4個結合狀態即達到飽 和並不會6個ATP結合區全數佔滿。而是當1個ATP與ClpY結合時會使得ClpY與 ClpQ結合隨著ATP與ClpY結合的量增加促使ClpY辨識基質，然後活化ATP的水 解作用進而提供能量使得基質被解構並運送至ClpQ進行降解。由此，完成酵素 聚合、基質辨識、基質打開折疊與運送及基質降解的循環，因此正在作用的ClpYQ 不會分離且維持其分解效率 (Yakamavich et al., 2008)。

六、ClpY與ClpQ的交互作用

Ishikawa 等人 (Ishikawa et al., 2000)於 Nature 發表以 cryo-EM 觀察大腸桿菌 ClpYQ 蛋白質的結構，發現 ClpY 的 I domain 是遠離 ClpQ 並非與 ClpQ 相接；此 外在 2001 年 Wang 等人 (Wang et al., 2001)及2002年Ramachandran 等(Ramachandran et al., 2002)亦有相同的結果，指出ClpY 的 I domain 是遠離 ClpQ 且 ClpYQ 的聚合是

由 ClpY 的 C domain 與 ClpQ 相接。ClpYQ 蛋白酶是由 Y₆Q6Q6Y6環狀結構所形 成的啞鈴狀聚合體，ClpYQ 聚合體中央通道是相通的而降解蛋白質的活性區域 包埋於 ClpQ 內(附圖一)。由於進入 ClpQ 十二元體入口僅 10Å ，基質無法直接 進入酵素活性中心進行分解。所以基質需要先經由 ClpYQ 蛋白酶外側的 ClpY 解 開摺疊，再將胜肽鏈送入 ClpQ 進行基質的降解 (Zolkiewski, 2006)。

Wang等人藉由重新分析已知的幾種ClpY結晶結構，得到 SO4、ATP、ADP 及

不外加的四種情況下ClpY之結晶結構分析 觀察到不同核苷酸對於ClpY之α–helical domain旋轉角度之影響，並認為不同核苷酸對於ClpY的α–helical domain旋轉角度 之即為ClpY由打開狀態（open state）至關閉狀態（close state）的構型變化。且 ClpY在與ATP結合時，其C端會從其結構內部向外伸出與ClpQ十二元體進行結合。

當ClpYQ聚合之後，ClpQ十二元體的中央孔洞由10Å 擴張至19.3Å 。相較於沒有 ClpY或是ClpY存在但無ATP時ClpQ十二元體的中央孔洞大小明顯增加近一倍 (Wang et al., 2001)。

2002年Ramachandran等人亦有合 成 ClpY C 端 最 後 8 個 胺 基 酸 EDLSRFIL

（octapeptides），發現僅此 octapeptides 便能將 ClpQ 的功能活化，進行分解 一些短胜肽鏈，此結果較野生型的ClpYQ功能效率相比為其之50%，而此實驗之 結果顯示，在加入octapeptides之後，ClpQ仍無法分解已摺疊之較大基質，但是 卻 明 顯 比 僅 ClpQ 存 在 時 在 分 解 短 胜 肽 的 能 力 上 有 明 顯 的 提 升 ， 同 樣 在 decapeptides (ADEDLSRFIL)及dodecapeptides (LVADEDLSRFIL)的實驗中也看到 相同的情形，甚至在使用12個胺基酸的胜肽鏈時，效率可以達到100％。從以上 證據可知 ClpY C 端最後10個 胺基酸 在活化 ClpQ的功能上扮演重要的角色 (Ramachandran et al., 2002)。在2004年的研究報告更進一步顯示ClpY C端之R440及 L443胺基酸為連結並活化ClpQ的重要位置 (張2004)。在ClpQ與ClpY C端的結合 部位，經結晶結構預測ClpQ E61及K28為ClpY R440及L443對應之位置 (黃2006) 以酵母菌雙雜交系統分析ClpQ蛋白分子在E61位置突變，除了E61D以外其餘其 他胺基酸均可以在E61位置上與ClpY產生數十至數百倍的交互作用力且可以恢 復ClpY R440突變株的酵素活性而K28位置則是不可替換的重要位置。

在研究報告中 (Azim et al., 2006)以SPR(surface plasmon resonance)技術測定 蛋白質的交互作用力，發現在基質(MBP-SulA)存在的情形下ClpYQ的親和力為 ClpYQ單獨存在下的5倍且ClpY對於MBP-SulA有極強的親和力；另外，也提供了 證據當ClpY與ClpQ的交互作用時，基質可參與其中。反之，ClpQ則無此作用。

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七、ClpYQ 蛋白酶之基質

大腸桿菌ClpYQ蛋白酶之基質，目前所知ClpYQ基質有四種：SulA、RcsA、

RpoH及TraJ。其中SulA與RcsA為Lon之基質 （Gottesman et al., 1993）。RpoH為 FtsH 之基質 (Herman et al., 1995)。ClpYQ 專屬之專一性基質直至目前仍未發 現。

SulA 為 突 變 株 中 篩 選 到 的 可 幫 助 細 菌 抗 拒 紫 外 線 傷 害 的 蛋 白 質 (Gottesman et al., 1985)是 sfiA 所轉譯出之產物 (Jones & Holland, 1985)，為 SOS 反應發生時會大量表現的蛋白質之一。目前已知：SulA為細胞分裂的抑制 物，能與FtsZ（能促進細胞分裂）形成複合物，以達到抑制細胞分裂的效果。當 細胞 DNA 受到嚴重損傷時，細胞會啟動 SOS 反應，此時 SulA 會大量表 現使細胞停止生長，直至細胞度過惡劣的環境。

RcsA 為一胞外莢膜（capsule）生成的正調控蛋白質，RcsA能夠使筴膜生成基 因cpsB的表現量增加，是一種轉錄活化物，其於1985年時首度由Gottesman等人 (Gottesman et al., 1985)提出，被認為可調控莢膜生成，於lon突變株更為明顯，而 細菌的莢膜被認為與致病力及細菌於宿主外存活有關 。

RpoH為一種σ factor（σ³²，其可開啟熱休克基因的表現，是一個與熱休克基 因轉錄有關之因子）。RpoH在平常溫度時，結構較不穩定易被分解，但當其存 在於高溫時結構較穩定，則可進一步啟動熱休克基因表現。在一些蛋白酶（Lon、

ClpXP）的突變株中，會看到σ³²的表現量增加，而當放入clpYQ 轉殖於拷貝（copy）

數高之質體時，σ³²的表現量並無增加，發現有抑制熱休克反應的現象發生

(Kanemori et al., 1997)，推測其為ClpYQ之基質。

TraJ為F-plasmid的transfer activator，對於細菌間的接合具正向調控，促使細 菌間基因的交換，在最近研究顯示，在細菌正常生長時TraJ對於ClpYQ具有抗性 而當有外在壓力的時候，ClpYQ可將TraJ分解 (Lau-Wong et al., 2008)。

八、ClpYQ蛋白酶對於SulA之辨識

SulA為ClpYQ天然的基質ClpYQ能將SulA分解成58條不同片段大小的碎片 (3-31residues)，ClpYQ對於SulA切割位置較偏好其蛋白質分子中央及C端區域 (Breyer & Matthews, 2001)而此區域正是SulA與FtsH進行交互作用必要的區域 (Higashitani et al., 1997)。在酵母菌雙雜交系統針對ClpYQ對於基質的辨識的研究 中發現在分子中央區段的SulA/M87I與SulA/L57F突變蛋白對於ClpY的親和力有 顯 著 的 不 同 (SulA/M87I 有 高 於 野 生 型 的 親 和 力 而 SulA/L57F 幾 乎 沒 有 ) ， 且 SulA/△ C40幾乎沒有ClpY的親和力 (Lee et al., 2003)。此結果與Lon辨識SulA分子 C端區域不同 (Ishii & Amano, 2001)。為確認ClpYQ蛋白酶辨認SulA的區域，進 行酵母菌雙雜交測試各突變蛋白與ClpY之間交互作用的情形，發現ClpY辨識的 區域可能落在SulA C端末20-30個胺基酸片段中。將C端末20-30個胺基酸序列進 行軟體分析，具有較高的疏水性。推測，ClpY可能是利用疏水性作用力對基質 SulA進行結合及辨識 (翁, 2009)。透過in vitro pull down及降解實驗分析，確認 SulA C端末20-30個胺基酸片段中GFIMRP序列對ClpY的辨識、傳送及SulA本身 的生理活性扮演重要的角色。同時也發現ClpY GYVG motif中Y91相對作用位置 會影響在GFIMRP序列的SulA F143上 (黃, 2011)。

在以Bacteriophage P22 Arc repressor蛋白當作ClpYQ基質的研究中Arc在ATP 存在下能夠被ClpYQ辨識然後分解，其辨識區域為Arc的N端序列。其N端序列片 段(1-12residuces)在有ATPγS及鎂離子的存在下與ClpY有很強的結合力，此結果 顯示了ClpYQ對於基質的辨識是需要ATP的存在且辨識區域隨著基質的不同而 有所不同 (Kwon et al., 2004)。

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九、研究動機與目的

ClpYQ蛋白酶的組成分別由ClpY與ClpQ組成，ClpYQ對於其基質的降解需 要兩者與ATP的共同參與才能完成。ClpYQ對於基質的降解則是牽涉到一連串的 辨識、結合、解構、運送及降解等步驟。ClpY與ClpQ聚合成ClpYQ蛋白酶；才 具有降解基質的能力，而ClpY與ClpQ結合力的大小對於ClpYQ蛋白酶降解效率 有何影響?是否ClpYQ之間聚合力越強降解效率越高?因此，以ClpQ與ClpY結合 力增強功能蛋白探討ClpYQ之間聚合力與蛋白酶活性的關係。

ClpYQ蛋白酶對於其基質SulA的辨識在SulA C端末20-30個胺基酸片段 (翁, 2009)，但是ClpY本身的辨識功能區段尚未有明確的界定。而ClpY I domain (110-243aa)介於N、C domain之間而突出於N、C domain之外，其結構具有高度的 彈性 (Bochtler et al., 2000)，而且ClpY的I domain位於ClpYQ聚合體的最外側 (Ishikawa et al., 2000)。 在Park等人報告中指出基質的打開及運送位於ClpY中心 孔洞的pore site (Park et al., 2005)，有此可知在基質進入ClpY中心的pore site之前 應有另一區域先與基質做辨識結合；因此，位於ClpQY最外側之 I domain可能與 基質辨識有關，並以ClpY的I domain缺失突變蛋白來探討I domain對於基質辨識 及分解的影響。

利用酵母菌雙雜交系統中測定ClpY與基質SulA的親和力並輔以MMS test與 細胞內降解測試(in vivo degardation)的西方氏雜交(Western blot)，進行ClpY及其 突變蛋白的分析研究；發現ClpY poreI及I domain上的double loops會影響基質辨 識、解構、運送，並且於ClpY與ClpQ結合及ClpQ的活化，使基質降解流程，亦 具有初步生化測試之結果。本篇研究，延續及拓展先前所參與之研究，藉由選 殖並純化出ClpY及具有影響ClpYQ蛋白酶降解流程的突變蛋白，進行一連串的 生化測試及分析；針對ClpY自身的聚合、ClpY的基質辨識區位、ClpYQ與ATP 的關係、ClpY各區域與ClpQ之間的交互作用、及ClpY不同區域(N、I 及C domain) 的突變在對基質降解過程所扮演的功能及重要性，提供直接有力的證據。

貳、材料與方法

一、實驗材料 (一)菌株與質體 1.菌株

(1) Escherichia coli BL21 DE3 (2) Escherichia coli XL1 Blue 菌株描述詳見表一

突變蛋白及突變區域詳見圖一

2.質體

(1) pET21a (novagen)

為表現載體通常用於大量表現所選殖在pET21a MCS(multiple cloning site)上 的基因產物其宿主為E. coli BL21 DE3，帶有T7 promotor當以IPTG進行誘導時宿 主產生T7 polymerase會使選殖在T7 promotor目標基因大量表現而大量產生目標 蛋白。帶有Amp抗性。

(2) pMAL(NEB)

為一表現載體，主要是能大量表現目標基因與 MBP(maltose binding protein) 融合蛋白藉由 MBP 與 amylose resin 的親和力提供一簡單方便的方式純化蛋白 質。

質體詳見表二

(二) 藥品與試劑

1.培養基

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Luria-Bertani (LB) Broth 液態培養基 BD Biosciences (U.S.A.)

Tryptone 10 g

Yeast extract 5 g

NaCl 10 g

每 25 g 溶於 1 L 蒸餾水中

LB Agar 固態培養基，每 1 L 液態培養基加入 15 g agar Agar 購於 BD Biosciences (U.S.A.)

Luria-Bertani (LB) Broth+glucose+ampicillin 抗生素使用濃度為 Ampicillin（100g/ml）

2.藥品、酵素及相關套組

(1)藥品購自 Sigma（St. Louis, U.S.A.）

J.T. Baker（Phillipsburg, U.S.A.）

和光純藥工業株式會社（Osaka, Japan）

及生工公司（台北，台灣）。

(2)限制酶、接合酶等酵素購自 TaKaRa（Kusarsu, Japan）

(3)Plasmid DNA 純化套組

Mini-M^TM Plasmid DNA Extraction kit（Viogene，富聯生物科技公司）

Gel-M^TM Gel Extraction kit（Viogene，富聯生物科技公司）

Gel/PCR DNA isolation kit（Viogene，富聯生物科技公司）

QIAGEN^R Plasmid Midi kit（Qiagene）

(4)蛋白質純化套組

TALON Metal Affinity Resin (Clontech)

pMAL™ Protein Fusion and Purification System (NEB) (5)親和力測試

Sensor Chip CM5(GE Healthcare Life Sciences)

3.核酸引子

ClpY 引子在 5 端帶有 NdeI 切位與加入 6 個 His 胺基酸以便於純化，而在 3 端帶有 HindIII 切位。ClpQ 引子在 5 端帶有 NdeI 切位，而在 3 端帶有 HindIII 切位與加入 6 個 His 胺基酸以便於純化。

核酸引子由基隆米克斯合成 詳見表三

二、方法

(一) 目標基因選殖 1.質體製備

Mini-preparation of plasmid DNA from bacteria(小量製備)

相關 Kits 購買自 Viogene 以及 Qiagene ，詳細實驗步驟參考套組之使用手冊。

2.勝任細胞 ( competent cell ) 製備

氯化鈣法於 37℃ 恆溫培養箱隔夜培養菌體 (12 - 16 小時)。以 1 mL 菌體 接種於 100 mL LB 培養基，重新震盪培養至 OD600 吸光值為 0.6 - 0.8。將菌液 平分至兩管，4000 rpm 4℃ 離心 10 分鐘，去除上清液。此後步驟均保持低溫 操作。以每管 1 - 2 mL 冰的 0.1 M CaCl₂ 懸浮菌體，再加入 3 - 5 mL 冰 0.1 M CaCl₂ 混勻，冰浴 30 分鐘。以 4000 rpm 4℃ 離心 10 分鐘，後倒掉上清液。

重複 3 及 4 步驟一次。每個離心管加入 2 mL 冰 0.1 M CaCl2 / 15% glycerol，

懸浮菌體。每 0.2 mL 菌液分裝至菌種保存管中，儲存於 -80℃。

3.轉形作用

(1) E. coli Heat shock transformation

取 50 μL competent cell 與 20 μL 質體接合產物 或 5 μL 小量製備的質體

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混合，冰浴 40 分鐘。於 42℃水浴，進行熱休克轉形作用 100 秒。加入 0.5 mL LB ，在 37℃ (AC3112 於 30℃) 培養箱中震盪培養 1 小時。以 4000 rpm 離心 五分鐘，去除上清液，留下約 50 μL 懸浮菌體，塗於具適當抗生素固態培養基 上，置於 37℃ (AC3112 於 30℃) 培養箱培養隔夜。以 4000 rpm 離心五分鐘，

去除上清液，留下約 50 μL 懸浮菌體，塗於具適當抗生素固態培養基上，置於 37℃ (AC3112 於 30℃) 培養箱培養隔夜。

(2) TSS-Transformation

取 30 μL 隔夜培養菌液加入 3 mL LB 培養液中，培養至 OD₆₀₀ 0.6~0.8。將 菌液以 3000 rpm，離心 5 分鐘，移除上清液。以 300 μL 2X TSS 溶液將菌體 懸浮，冰浴 10 分鐘。加入 5 μL 質體，混勻後，再置於冰上 30 分鐘。於 42℃

下，進行熱休克反應 (Heat shock) 120 秒。加入 0.5 mL LB 液態培養基，在 30℃

培養箱中震盪培養 1 小時。以 4000 rpm 離心五分鐘，去除上清液，留下約 50 μL 懸浮菌體，塗於適當抗生素之 LA plate，置於 30℃ 培養箱培養隔夜。

2X TSS (Transformation and storage solution)

PEG 8000 (Polyethylene glycol 8000) 20.0 g DMSO (Dimethyl sulfoxide) 10.0 ml 1 M MgSO4 4.0 ml 加入 LB 至 200 mL，以 0.22 μm 孔徑濾膜過濾達滅菌效果，保存於 4℃。

4. 基因選殖

(1)基因表現質體建構

pET21a 6x His clpY與pET21a 6x His clpQ及其他突變蛋白

設計帶有6x His tag及NdeI切位之5端引子（NdeI-His-ClpY-5’primer）及帶有 HindIII切位之3端引子（ClpY-HindIII-3’primer）以pBAD24-clpY及其突變基因 作為模板，透過PCR放大clpY及其突變基因片段後，將此片段及pET21a以NdeI 及HindIII截切後並進行接合反應，最後轉形至大腸桿菌中，利用含Ampicillin

抗 生 素 的 培 養 基 進 行 篩 選 。 而 clpQ 則 使 用 帶 有 NdeI 切 位 之 5 端 引 子

（ NdeI-ClpQ-5’primer ） 及 帶 有 6xHis-tag 及 HindIII 切 位 之 3 端 引 子 （ ClpQ- His-HindIII-3’primer）以pBAD33-clpQ作為模板，以相同的方式進行建構。

(2)聚合酵素鏈鎖反應(PCR) PCR反應條件

Template 2.0 μl

10X PCR buffer (with Mg²⁺) l

dNTP (10 mM) l

Forward primer 5 mM (5’) l Reversed primer 5 mM (3’) l

Taq DNA polymerase l

ddH₂O μl

Total μl

95℃： 10 分鐘，雙股 DNA 打開成單股 DNA。95℃： 90 秒。55℃： 60 秒，使引子 annealing 於模版。72℃： 90 秒，進行 DNA extension。重複步驟 2、

3、4 共 30 個循環。72℃，2 分鐘。4℃，中止反應。產物保存於 4℃。

(3)限制酶 (restriction enzyme) 反應

選用適當之限制酶與質體和 DNA 片段分別反應，反應溫度視限制酶種類 而定，一般來說反應溫度為 37℃，反應時間 60 – 70 分鐘。將反應溶液加入適 當之追蹤染劑，進行 DNA 瓊脂膠體電泳。

(4)DNA 瓊脂膠體 (agarose gel)電泳

以 1× TAE 緩衝液配製 0.8~1.0% 之瓊脂膠體，以 100 伏特之電壓進行電 泳，反應 25~35 分鐘。以 EtBr (ethidium bromide) 進行外染，退染後再以紫外

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光觀察 DNA 產物。

(5)DNA 瓊脂膠體 (agarose gel) 電泳回收 DNA

進行 DNA 瓊脂膠體電泳後，經 EtBr 染色，退染後，使用長波長之紫外光 源 ( 365 nm )，觀察並截取欲回收之 DNA 位置。使用 Gel Extraction Kit (購買 自 Viogene ，詳細實驗步驟參考套組之使用手冊。) 回收 DNA。

(6)接合反應 (DNA ligation)

經限制酶反應回收後之 DNA，依載體與欲插入之 DNA 片段濃度比約 3：

1 的比例加入：

質體(vector) .0μl

DNA 片段(insert) 12.0μl

T4 Ligase 1.0μl

10X ligation buffer 2.0μl

10 mM rATP 1.0μl

Total 20.0μl 以 16℃ 冰浴反應 16 - 20 小時。

(二) 蛋白質純化

1. His tag 蛋白之純化 metal affinity resin (Talon resin；Takara)

將轉殖帶目標蛋白 pET21a 質體的菌株(E.coli BL21)培養於 Luria-Bertani (LB) Broth+ampicillin 培養隔夜。將隔夜菌液以 100 比 1 的體積至培養基中震盪培養 至 OD600 吸光值 0.5，加入 IPTG 至濃度 0.3mM 振盪培養於 37℃ 4 小時離心 4000xg/15 分鐘/4℃去上清液收集菌體。以預冷之 native buffer 懸浮菌體(25ml 菌 液對應 2ml)。在冰上以 sonicator 將細胞壁打破(功率 10 瓦、震盪 1 秒停 1 秒、

總時間 2 分鐘) 。離心 10000-12000xg/15 分鐘/4℃取上清液。將上清液倒入裝置 好的 metal affinity resin 管柱(事先已用 5-10 倍體積之 wash buffer 洗過)，讓上清 液完全通過管柱收集滴下的上清液。以 5-10 倍體積 wash buffer 洗 metal affinity resin 管柱收集滴下的液體。以 3-5 倍體積 elution buffer 將帶有 His tag 之目標蛋 白溶出收集滴下的液體。

Native buffer pH 7.5 Na2HPO4 58 mM NaH₂PO₄ 17 mM NaCl 68 mM

Wash buffer pH 7

NaH2PO4 50 mM NaCl 300 mM

Elution buffer pH 7

NaH₂PO₄ 50 mM NaCl 300 mM Imidazo 150 mM

2. MBP 融合蛋白之純化 Amylose resin (NEB)

將轉殖帶有 pMAL-sulA 菌株培養於 Luria-Bertani(LB) broth+glucose +ampi -cillin 培養隔夜。將隔夜菌液以 100 比 1 的體積至培養基中震盪培養至 OD 600 吸光值 0.5 加入 IPTG 至濃度 0.3mM 振盪培養於 37℃ 2 小時。離心 4000xg /20 分鐘去上清液收集菌體加入預冷之 column buffer 懸浮菌體(1g 菌體重加 10ml column buffer) 。在冰上以 sonicator 將細胞壁打破(功率 10 瓦、震盪 1 秒停 1 秒、

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總時間 2 分鐘) 。將菌液離心 9000xg/30 分鐘取上清液，加入 column buffer 以 1:5 的體積稀釋上清液。將上清液倒入裝置好的 amylose resin 管柱(事先已用 8 倍體 積之 column buffer 洗過)，讓上清液完全通過管柱收及滴下的上清液。以 12 倍體 積之 column buffer 沖洗管柱。以 column buffer+10 mM maltose 進行溶出回收 MBP 融合蛋白。

Column buffer, pH = 7.4 Tris-HC l20 mM

NaCl 200 mM EDTA 1 mM

Elution buffer add 10 mM maltose in column buffer

3. 蛋白質濃縮

選定適合分子大小的蛋白質濃縮過濾器使用蛋白質濃縮過濾器 10k 及 30k (Millipore)以離心的方式進行蛋白質濃縮及緩衝液的取代。

4. 蛋白質定量

使用 Bradford 法蛋白質定量套組(BIONOVAS Co., Ltd)，將蛋白質標準液依 所需要之濃度稀釋(體積 20 ul)在 96 孔盤中加入 Bradford 試劑 200 ul 混合均勻在 室溫下放置 5 分鐘以分光光度計測吸光值 A595 繪製檢量線在將待測樣品值代入 公式計算濃度。

5. 蛋白質保存

蛋白質所存在之緩衝液置換成利於蛋白質保存之 storage buffer 濃縮管

（Milipore），來進行緩衝液置換。

Storage buffer

0.5M HEPES 5.0 ml 1.0M MgCl2 1.0 ml 1.0M DTT（Dithiothreitol） 25.0l 65% Glycerol 7.7 ml NaCl 0.88 g H2O 25 ml 先溶解後，調整 pH 至 7.4，再加水至總體積為 50 ml 50 ml

(三) SDS 蛋白質膠體電泳

測量菌液的 OD₆₀₀吸光值。取 2.0 mL 菌液於 6000 rpm 離心十分鐘，去除上 清液。以滅菌水清洗兩次，加入50 μL 的 2X SDS-PAGE 樣品溶液，於 95-100℃

下反應 10 分鐘，得到含粗萃蛋白的 SDS-PAGE 樣品溶液。取約含等量菌數 (由 OD600吸光值換算) 之含粗萃蛋白的 SDS-PAGE 樣品溶液於 12.5%的 SDS-PAGE 膠片中進行蛋白質電泳。先於 60 伏特電泳 40 分鐘，再於 100 伏特下電泳約 100 分鐘。

SDS-PAGE 電泳膠片（12.5%） Running gel Stacking gel

H₂O 3.3 ml 3.4 ml

30% Acrylamide 4.0 ml 0.83 ml

1.5M Tris（pH 8.8） 2.5 ml 0 ml

1.0M Tris（pH 6.8） 0 ml 0.63 ml

10% SDS 0.1 ml 0.05 ml

10% APS 0.1 ml 0.05 ml

TEMED 0.004 ml 0.005 ml

此份量約可配製 0.75mm 厚 10X7cm 的膠片兩片。

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30% 丙烯醯胺液 (Acrylamide)

40% Acrylamide/ Bisacrylamide 75 ml

H₂O 25 ml

加蒸餾水至 100 mL，保存於 4℃。

分離膠體緩衝液 (Running buffer)

Tris base 36.3 g TEMED 0.72 ml 以 150 ml 蒸餾水溶解並調整 pH 至 8.8，加水至總體積為 200 ml，保存 4℃。

焦集膠體緩衝液 (Stacking buffer)

Tris base 6.0 g TEMED 0.4 mL 調整 pH 至 6.8，加水至總體積為 100 mL，保存於 4℃。

5X 電泳槽緩衝液 (Chamber buffer)

Tris base 15.0 g Glycine 72.0 g SDS 5.0 g 先以 800 ml 蒸餾水溶解並調整 pH 至 8.3，加水至 1000 ml，保存於室溫。

使用時稀釋至 1X。

追蹤染劑 (Tracking dye)

Bromophenol blue 1.0 mg H2O 5.0 ml 87% Glycerol 5.0 ml

Bromophenol blue 先溶於蒸餾水後，再加入 glycerol，保存於室溫。

2X SDS-PAGE 樣品溶液

H2O 0.8 ml

0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 4.0 ml 10% SDS 6.4 ml

β-mercaptoethanol 1.6 ml Tracking dye 3.2 ml 總體積 16.0 ml，保存於室溫。

APS 溶液 (Ammonium persulfate)

APS 50.0 mg 加滅菌水0.5 ml溶解。每次使用前新鮮配置。

(四) 西方墨點分析（Western Blotting）

1.蛋白質粗萃樣品製備

(1) 測量菌液之 OD600 吸光值。

(2) 將 3ml 菌液以 3000 rpm，離心 10 分鐘，移除上清液。

(3) 以 1ml 無菌水清洗菌體，再次離心，移除上清液，收集菌體。

(4) 加入 200 l 的 2X SDS sample buffer 懸浮菌體，於 100℃下反應 10 分 鐘，得到含粗萃蛋白的 SDS-PAGE 樣品溶液。

(5) 取約含等量菌數（由 OD₆₀₀吸光值換算）之粗萃蛋白樣品溶液，於 12.5%

的 SDS-PAGE 膠片中進行蛋白質電泳。

2. 轉印（Transfer）

本實驗使用 Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell（Bio-Rad）將蛋白

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質由 SDS-PAGE 膠片轉印至 nitrocellulose membrane（Millipore）上固定。轉印 方法參考 Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell 所提供之使用說明書。

(1) 裁剪與 SDS-PAGE 膠片大小相似之 nitrocellulose membrane，使用前先於 100% methanol 中潤濕，再於無菌之二次水浸潤 2 分鐘，最後放入 transfer buffer 中平衡約 10 分鐘。

(2) 裁剪與 SDS-PAGE 膠片大小相似之 3 mm 濾紙六張，與二片海綿一同浸泡 於 transfer buffer 中平衡約 10 分鐘。

(3) 取出轉印用夾板，先將一片海綿置於黑色夾板上，再放上三張濾紙；接著將 電泳完畢之膠片小心取下，於 transfer buffer 中潤濕後，放置於濾紙上並以 玻棒小心趕出氣泡。

(4) 將 nitrocellulose membrane 完全覆蓋於膠片上，趕出氣泡後，再依次放上三 張濾紙及另一片海綿：最後闔上夾板卡緊，並將夾板放入轉印槽中。以上步 驟均戴手套操作。

(5) 以 400 mA 之電流轉印約 90 分鐘，轉印時蛋白質由負極向正極的

nitrocellulose membrane 移動。每 20 分鐘更換融化之冰塊，避免轉印溫度過 高而產生氣泡。

Transfer buffer

Methanol 200.0 ml 10% SDS 5.0 ml Tris base 3.03 g Glycine 14.4 g 加水至總體積為 1000 ml，保存於室溫 1000 ml

3. 雜合反應（Hybridization）

本實驗採用 Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP Substrate（Millipore）

操作手冊所提供之方法進行免疫雜交。

(1) 將轉印後的轉漬膜 nitrocellulose membrane 以 PBS 浸潤後，置入 blocking reagent 中，於室溫下搖洗反應 1 小時。

(2) 將轉漬膜於室溫下以 PBST 搖洗三次，第一次 15 分鐘，第二、三次 5 分鐘。

(3) 將轉漬膜置於含一次抗體的 blocking reagent 中，於室溫下搖洗反應 1 小時，或置於 4℃反應隔夜，進行雜交。

(4) 將轉漬膜於室溫下以 PBST 搖洗三次，第一次 15 分鐘，第二、三次 5 分鐘，以去除非專一性雜交訊號。

(5)將轉漬膜置於含二次抗體的 blocking reagent 中，於室溫下搖洗反應 1 小時，或置於 4℃反應隔夜，使二次抗體與一次抗體產生雜交反應。

(6) 將轉漬膜於室溫下以 PBST 搖洗三次，第一次 15 分鐘，第二、三次 5 分鐘，以去除非專一性雜交訊號

PBS

Na₂HPO₄ 11.45 g NaH2PO4．2H2O 2.96 g NaCl 5.84 g 加水至總體積為 1000 ml，保存於室溫 1000 ml

PBST（PBS-Tween）

於 PBS 中加入 0.1%的 Tween-20，保存於室溫。

Blocking reagent

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PBST 100 ml Skim milk 7.0 g 使用前配製，需充分溶解。

一次抗體 （適用於本實驗）

Polyclonal rabbit anti-MBP (NEB) 1:5000 稀釋 Polyclonal rabbit anti-ClpY 1:5000 稀釋

二次抗體 （適用於本實驗）

Goat anti-rabbit IgG-HRP 1:5000 稀釋 4. 訊號偵測（signal detection）

本實驗採用 Immobilon^TM Western Chemiluminescent HRP Substrate（Millipore）

套組進行雜交訊號的偵測。訊號產生的原理，是利用標示於二次抗體上的 p e r o x i d e 與 套 組 中 的 d e t e c t i o n s o l u t i o n 反 應 而 發 出 螢 光 ， 然 後 再 以 autoradiography film（Classic Blue, MIDSCI）於暗房中顯影，以偵測雜交訊號。

此套組中含有 Solution I ：HRP Substrate Peroxide Solution 及 Solution II：HRP Substrate Luminol Reagent。

(1) 取相同體積之 Solution I 及 Solution II 置於試管中（每片轉漬膜各需約 0.5 ml 的 Solution I 及 Solution II ），將 Solution I 及 Solution II 混合成 detection reagent ，靜置反應 5 分鐘。

(2) 取透明投影片置於壓片盒內，將轉漬膜上的 PBST 滴乾，平鋪於投影片 上；接著將 detection reagent 均勻滴灑於轉漬膜上，再覆蓋另一張投影 片，保持投影片表面乾燥。

(3) 以下步驟均於暗房中操作。將 autoradiography film 置於轉漬膜上壓片。

（壓片時間視訊號強弱而定， 10 秒至 30 分鐘均可）。

(4) 將壓後的底片（autoradiography film），放入顯影劑中顯影，顯影時間視 訊號強弱而定，約 30 秒至 5 分鐘。

(5) 以清水潤洗去除底片上的顯影劑，將水滴乾；再將底片放入定影劑中定 影，以清水潤洗去除底片上的定影劑，最後將底片晾乾保存。

5. Stripping

如欲以同一張轉漬膜再次進行免疫雜交反應，可使用 stripping buffer 洗去 轉漬膜上的抗體，以進行第二次免疫雜交反應。以 stripping buffer 處理過的轉漬 膜可能會導致蛋白質訊號稍微減弱。

(1) 將偵測過訊號之轉漬膜以蒸餾水潤洗五分鐘。

(2) 將轉漬膜置於 stripping buffer 中，於室溫下搖洗反應 30 分鐘。

(3) 將轉漬膜於室溫下以蒸餾水搖洗三次，每次 5 分鐘，以去除非專一性雜 交訊號。

(4) 轉漬膜以 PBS 潤洗後，即可進行第二次的免疫雜交反應。

Stripping buffer

Na₂HPO₄ 11.45 g

NaH2PO4．2H2O 2.96 g 以 HCl 調整 pH 至 2.5，加水至總體積為 200 ml 200 ml

(五) 蛋白酶活性測試 (

)

(1) 於 degradation buffer 中加入 ClpY、ClpQ 、MBP-SulA 及 5 mM ATP，

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置於 37℃下進行反應。

(2) 於反應開始 0 小時，取 20 l 之反應物加入 20 l 2X SDS sample buffer 終止反應，並於 100℃下反應 10 分鐘，得到 SDS-PAGE 樣品溶液。

(3) 於反應開始 2 小時及 4 小時，重複步驟 2，進行不同時間點取樣。

(4) 進行 SDS-PAGE 觀察結果。

(5) 利用 Imgae J 影像分析軟體將 SDS-PAGE 之結果進行定量分析。

Degradation buffer

HEPES 0.1M MgCl₂ 10mM DTT（Dithiothreitol） 1mM EDTA 1mM

4X Degradation buffer

0.5M HEPES 80.0 ml 1.0M MgCl₂ 4.0 ml 1.0M DTT（Dithiothreitol） 0.4ml 0.5M EDTA 0.8 ml H2O 50 ml 先溶解後，再加水至總體積為 100 ml，保存於 4℃ 100 ml

(六

(六) ATPase 活性測定

將待測蛋白質ClpY(6-mer；8μM)、ClpQ(12-mer；8μM)與MBP-SulA(4.9μM) 加入ATP mix反應溶液中，反應總體積200μl。以螢光分光光譜儀(激發340 nm；

發散460 nm)，在37℃下連續偵測NADH減少的量，NADH減少的量即為ATP消

耗的量。以野生型ClpYQ的ATP消耗量為100％得出突變株ATPase相對活性。

ATP mix反應溶液

degradation buffer中含有

ATP 2.5mM NADH 0.375mM Phosphoenopyruvate 1.0mM Pyruvate kinase 5 U/ml Lactate dehydrogenase 5 U/ml

(七) 等溫滴定量熱法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)

將待測蛋白質ClpY(ClpY6-mer 25μM；200μl)置於isothermal calorimetric cell 中以750mM之ATPγS (以degradation buffer配製)在25℃下對蛋白質ClpY進行滴定，

每間隔150秒注入1.9μl ATPγS，攪拌速率為1000rpm。以蛋白質ClpY注入只有 degradation buffer的isothermal calorimetric cell當作控制組。所用的機型為iTC 200 (MicroCal) 。 所 得 到 的 資 料 以 Origin version 7.0 data analysis software (MicroCal)進行分析。

(八) 蛋白質聯結測試(cross-linking analysis)

將 ClpY (ClpY6-mer 4μM) 、 ClpQ (ClpQ12-mer 4μM) 與 1mMATPγS 加 入 degradation buffer 中 ， 總 體 積 為 50l 於 37℃ 中培養 5 分 鐘 進 行 結 合 後 ， 加入 glutaraldehyde使反應液中glutaraldehyde濃度為0.4%於37℃中培養20分鐘進行連 結反應，加入30μl含有7.5% SDS及10% 2-mercaptoethanol之Tris.HCl (pH6.8)，進 行蛋白質電泳(4-12% gradient gel)。(Seong 2002)

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(九) Pull-down assay

(1) 於 degradation buffer 中加入 ClpY (ClpY6-mer 1.3μM)及 MBP-SulA (7.8μM)或其衍生物蛋白質及 5 mM ATP，總體積為 50l，置於 37℃下 反應 30 分鐘。

(2) 取 40 l 之 amylose resin 至乾淨離心管中，於 4℃下以 4000 rpm 離心 30 秒，移除上清液。

(3) 加入 200 l 之 1X wash buffer 懸浮 amylose resin，於 4℃下以 4000 rpm 離心 30 秒，移除上清液。

(4) 加入反應完成之反應液以懸浮 amylose resin，於 4℃下搖洗 6 小時以上。

(5) 將搖洗完畢之反應物，於 4℃下以 4000 rpm 離心 30 秒，移除上清液。

(6) 加入 200 l 之 1X wash buffer，激烈震盪 5 秒，於 4℃下以 4000 rpm 離 心 30 秒，移除上清液。

(7) 重複步驟 6 ，10 次。

(8) 加入 20 l 之 2X SDS sample buffer，於 100℃下反應 10 分鐘，得到 SDS-PAGE 樣品溶液。

(9) 以 SDS-PAGE 或 Western blotting 的方式進行結果分析。

5X wash buffer 4℃保存 0.5M HEPES 100.0 ml 3.0M NaCl 17.6 g Glycerol 50.0 ml Triton X-100 0.4 ml 1.0 M MgCl₂ 5.0 ml

Total 200 ml

( 十 ) 表 面 電 漿 共 振 生 物 分 子 感 測 法 (Surface plasmon resonance assays)

親和力測試採用表面電漿共振生物分子感測法(Surface plasmon resonance assays)，

所使用儀器為 BIAcore T200 instrumentation (GE Healthcare Life Sciences)，採 用 CM5 晶片(GE Healthcare Life Sciences)，所有實驗步驟均照原廠操作手冊。

將 MBP-SulA 固定於 CM5 晶片上達 9818 RU (resonance units) ，親和力測試以 degradation buffer(100 mM HEPES (pH 7.4), 10 mM MgCl₂, 1mM DTT and 1mM EDTA)進行，在添加 ATP 的實驗中則在 degradation buffer 中添加 5 mM ATP，系 統流速為30 μl/min。待分析蛋白質 ClpY 及其突變蛋白以不同濃度(0.1–6 μM)進 行測定。結合測試(Binding assays)進行 2 min 後，將分析物置換成 degradation buffer 進行 10 min 的分離測試(Dissociation)。結合測試後所得數據以 Biacore T200 Evaluation Software version 1.0.軟體進行分析。

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參、結果

一、ClpY 與 ClpQ 及其突變蛋白純化

將pET21a-6xHis-clpY及pET21a-6xHis-clpQ送入大腸桿菌菌株BL21clpY^-clpQ^- 中大量表現並經Metal affinity resin (Talon resin；Takara)加以純化。而ClpQ則是利 用設計好的引子將6xHis tag加在蛋白質的C端以免影響其酵素活性。以Metal affinity resin純化帶有His tag的ClpY (圖二A)與ClpQ (圖二B)及其突變蛋白，以獲 得純度較高的目標蛋白。而ClpYQ的基質MBP-SulA以Amylose resin進行親和性 純化，由於宿主沒有將MBP基因剔除故有少量的MBP蛋白 (圖三)。ClpY I domain 缺失突變蛋白與ClpYΔI+7Gly ClpYΔL1,L2 (loop1 137-150；loop2 175-209)以下以 ClpY ΔD-loop (Δdouble loops)稱之，無法得到純化蛋白，但是在破菌上清液中無 明顯出現目標蛋白，因此推測誘導出來的目標蛋白在包涵體 (inclusion body)中。

加入以含有5% sarklsoyl緩衝液進行破菌，離心取上清液然後加入binding buffer (2%triton X-100及20mM CHAPS) 稀釋破菌上清液。將破菌上清液中5% sarklsoyl 稀釋至1%以免妨礙後續純化。結果顯示，ClpYΔI+7Gly (圖四)與ClpY ΔD-loop (圖 五)雖能純化但產量效率偏低，以純化大量製備並濃縮至所適當的濃度與體積。

二、ClpY及其突變蛋白對於ClpYQ分解MBP-SulA活性的影響

將經純化的 ClpY、ClpQ 與 MBP-SulA 在含有 ATP 的緩衝液在 37℃下進行 in vitro degradation 經測試過後選用 0 hr、2 hr、4 hr 時間點進行取點後，進行 SDS-

PAGE 觀察結果 (表四；圖六)。利用 Image J 軟體將 SDS-PAGE 之結果進行定量 分析。以 ClpYQ 的實驗組所降解 MBP-SulA 的量為 100%，以計算出 ClpY 突變 蛋白相對於 ClpYQ 降解 MBP-SulA 的相對

(一) ClpQ 蛋白 E61 位置突變對 ClpYQ 聚合的影響及其酵素活性之探討

前人研究中 (Wang et al., 2001)提出當ATP與ClpY結合時，ClpY C端會自其 結構內部向外伸出並使得ClpQ中央通道直徑增加。而Ramachandran等人發現 ClpY C端扮演連結並活化ClpQ的角色，ClpY C端10各胺基酸能夠活化ClpQ使酵 素活性提高 (Ramachandran et al., 2002) 。 ClpQ E61C為一個與ClpY聚合能力強的功 能增強蛋白，將純化之ClpYQ E61C進行降解實驗與ClpYQ作比較，以釐清ClpYQ 之間聚合力的強弱對酵素活性的影響。結果顯示，ClpQ E61C與ClpY然雖然具有 較佳的聚合力，但ClpQ E61C-ClpY分解MBP-sulA的相對活性為89%±7.1%與 ClpQ-ClpY分解MBP-sulA的能力相去不遠 (表四；圖七)；可知於in vitro分解實 驗中，ClpY與ClpQ聚合力之大小並不能影響分解能力。

(二) ClpY I domain缺失突變蛋白ClpYΔI+7Gly對於ClpYQ酵素活性的影響 ClpY I domain (aa.110-aa.243)，ClpY I domain缺失突變蛋白為了維持構型完 整在N domain之間加了7個Glycin當作連接。在酵母菌雙雜交系統中ClpYΔI+7Gly 與基質MBP-SulA並無明顯的親和力，且ClpYΔI+7Gly在MMS test與 in vivo degardation的western blot的結果顯示突變株均無法生長；在western blot的結果也 測到了SulA的存在 (Lien et al., 2009)，顯示I domain缺失會影響ClpYQ酵素活性。

所以利用經純化ClpYΔI+7Gly缺失突變蛋白在in vitro下對MBP-SulA進行降解實 驗，與ClpY相比，ClpYΔI+7Gly缺失突變蛋白酵素活性僅為ClpY的59%±6.5%活 性下降了將近40%左右 (表四；圖八 A)，顯示ClpY I domain對於ClpY所負責的 基質辨識、解構或運送具有一定程度的影響。

(三) ClpY I domain loop構造對於酵素活性的影響

在對ClpY結晶結構分析研究中 (Wang et al., 2001)，ClpY I domain (aa.110- aa. 243)中有二個loop構造分別位於aa.137- aa.150 (loop1)與aa.175- aa.209 (loop2) 的位置。分別對於此二個loop構造分別進行缺失突變於in vivo下以MMS test與in

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vivo degardation western blot進行分析，ClpYΔL2 (loop2；175-209)、ClpYΔL1,L2

(loop1 137-150；loop2 175-209)失去活性無法分解SulA (Lien et al.2009)。以ClpY I domain缺失突變蛋白ClpYΔL1(loop1；137-150)進行對MBP-SulA降解實驗，ClpY ΔL1酵素活性為ClpY的1.38倍 (表四；圖八 B)。而ClpYΔL2 (loop2；175-209)對 MBP- SulA的降解，相對活性為49%±12% (表四；圖八 C)。由以上結果顯示ClpY I domain loop構造對於酵素活性有一定的影響，缺少loop2的ClpYΔL2缺失突變蛋 白相對活性大幅下降一半，ClpY I domain缺失與I domain loop2缺失均會導致對 基質的辨識結合力下降造成酵素活性降低 (表四；圖八 D)。ClpYΔL1缺失突變 蛋白，因為缺少loop1使得loop2更容易與基質的辨識結合導致相對活性高於ClpY，

則需要更一步的實驗證明。

以ClpY ΔD-loop (Δdouble loops)，進行降解實驗，發現ClpY ΔD-loop缺失突 變造成蛋白質本身不穩定，在降解實驗中第2小時起開始自行降解 (圖九 A)。因 此，無法測得其酵素的相對活性。對於ClpYΔD-loop蛋白進行穩定性實驗以0分 鐘開始取點，每30分鐘取一點連續取點至120分鐘進行SDS-PAGE觀察，結果顯 示在37℃下ClpY ΔD-loop蛋白於60分鐘開始有明顯自身降解(圖九 B)。

(四) ClpY I domain loop2點突變對於酵素活性的影響

ClpY I domain loop2 (175-209)的缺失會使相對活性大幅下降一半，ClpY I domain loop2可能對於基質的辨識結合扮演重要的角色。在ClpY aa.175- aa.209 區域中是否有某些胺基酸位置對酵素活性具有的影響，因此利用loop2點突變來 進行對MBP-SulA的降解，藉此縮小或確定ClpY對基質辨識結合的點位。在 in vivo實驗中 (Lien et al.,2009) ，M187I為親和力增強突變蛋白與SulA的親和力同

時保有酵素活性，在in vitro下降解活性為ClpY的87±5％ (表四；圖十 A)與ClpY 相去不大，並未由於與SulA的親和力大而使活性增加；ClpY loop2點突變ClpY L199Q功能缺失株均為非極性突變成極性造成在酵母菌雙雜交系統中與SulA幾 乎無親合力，同樣的在MMS test無法生長，為一個活性與親和力完全喪失的點突