合成路易士X二聚體與KH-1抗原分子

國立臺灣大學理學院化學研究所 碩士論文

Graduate of Chemistry College of Science National Taiwan University

Master Thesis

合成路易士 X 二聚體與 KH-1 醣抗原分子

Synthesis of Dimer Lewis X and KH-1 Antigens

蔡秉霖 Bin-Ling Tsai

指導教授：翁啟惠 博士 吳宗益 博士

Advisor: Chi-Huey Wong, Ph.D.

Chung-Yi Wu, Ph.D.

中華民國 九十八 年 一 月

January, 2009

謝誌

回首過去兩年半的碩班生活，心中的感觸五味雜陳。最初，找指導老師一直 很不順利，當我正要放棄台大到別的學校時 翁老師給了我一個機會，讓我在設備 一流的中研院基因體中心裡無後顧之憂地做研究，真的真的非常感謝 翁老師。另 外，也很幸運能由 吳老師來指導我實驗上的問題，由於我的任性與＂稍稍的＂叛 逆一般老師可能會把我趕出實驗室吧!?不過 吳老師的包容與信任讓我在實驗上 自由發揮，雖然過程中有時感到倦累不過玩得還滿開心的，也謝謝 任老師在實驗 技巧上的指導。感謝 林俊宏老師與 鄭偉杰老師撥空參與學生的口試，在論文方 面給予指教，也謝謝台大化學所的老師讓我獲得在化學上更深一層的知識。

今日，能順利畢業也謝謝六樓的青哥、鼎鈞學長、謝俊傑博士、駿儀學長與 昆賢學長；還有一同是吳老師實驗室的成員－哲雄學長、正琪學姐、陳怡佳博士、

韓政良博士、朱國慶博士、梁其輝博士、楊景順博士、孫宗賢博士、備椿、津瑋、

姮雁、尚軒、明秀、易嫻、郁翔、從安、彥霖、瑞祺、世皇和宏揚給我很多實驗 技巧與經驗上的建議；也謝謝師母 淑真姊幫忙處裡我們的帳務等事，還有充滿活 力的學弟妹－勃佑、侑蓁與新進來的俊瑋、大頭丁和阿信。感謝 郁郁和Lora 幫我 們處理實驗室和會議上的問題，在口試前給我鼓勵與幫忙邀請口試委員等事。

感謝耿淑怡 老師、劉河順 老師、吳雪莉 老師、吳森雄 老師與邱瀞慧 老師，

在我過去求學過程中在關鍵時刻拉了我ㄧ把，爾後才有機會一路順利唸完碩士學 位。

最後，特別要感謝的是我的家人！謝謝您們用無限的包容與諒解來慢慢改變 我過去的叛逆，在我疲憊或是失落時作為我最後的避風港，提供所需的資源來讓 我學習，謝謝您們。

這篇論文雖然不臻完善，但包含我過去的努力。最後，謹以此篇論文獻給我 最愛的家人與引發我對生命科學感到興趣的老師－吳森雄 老師。

中文摘要

醣類是組成細胞的四種基本成分之一，含量豐富且以多樣化形式存在於 生物高分子中。癌細胞與正常細胞相比較下，在某些醣分子上的結構或量的層級 上有不同表現。醣蛋白和醣脂質在醣化過程中，分子的不正常改變常會造成腫瘤 的惡化。

路易士 X 二聚體與 KH-1 為大腸癌的細胞膜上顯著表現的兩種抗原分子，

這兩種抗原分子大量的表現也與癌症的惡化前兆有關。所以路易士 X 二聚體與 KH-1 抗原分子可以用來發展疫苗或是用於醣晶片上作癌症的診斷。然而在鑑定和 純化腫瘤細胞上的醣類抗原分子是非常困難，因此有機合成在醣生物學的研究上 扮演重要的角色。在此篇論文中成功利用本實驗室所發展的一鍋化合成法來合成 出三醣的路易士Ｘ、六醣的路易士 X 二聚體與七醣KH-1 腫瘤抗原分子的類似物。

Abstract

Among four major classes of macro-biomolecules-nucleic acids, proteins, lipids, and carbohydrates-carbohydrates are the least studied and understood.

Carbohydrates and their conjugates are abundantly expressed on the out-surfaces of prokaryotic and eukaryotic cells and involved in various biological event. Especially, the surface of cancer cells frequently display glycans at different levels or with fundamentally different structures in comparison with that of normal cells, including the progression of tumor cell metastasis.

Dimeric Lewis X and KH-1 are two tumor-associated antigens. These antigens are considered as the marker for malignancy and pre-malignancies involving colonic adenocarcinoma. Lewis X dimmer and KH-1 tumor associated antigens can be used to develop carbohydrate-based anticancer vaccines and carbohydrate microarray in diagnosis. However, the structure identification and isolation of homogeneous carbohydrate-based tumor antigen is very difficult, organic synthesis play an

important role in glycobiology research. Finally, one-pot strategy was successfully developed to synthesis Lewis X monomer, Lewis X dimer hexasaccharide and KH-1 heptasaccharide analogues.

縮寫表

Ac acetyl aq aqueous Bn benzyl Bz benzoyl

Cp cyclopentadienyl CSA camphorsufonic acid

DDQ 2,3,-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone DMDO dimethyl dioxirane

DMF N,N-dimethylformamide

EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Et ethyl

Me methyl

NIS N-iodosuccinimide Ph phenyl

Phth phthaloyl Piv pivaloyl py pyridine

TBAI tetra-n-butylammonium iodide Tf trifluoromethanesulfonyl TFA trifluoroacetic acid TFAA trifluroracetic anhydride Tol p-tolyl

Troc 2,2,2-trichloroethoxylcarbonyl

目錄

謝誌……… i

中文摘要……… ii

英文摘要……… iii

縮寫表……… iv

目錄……… v

第一章 緒論………. 01

第一節 寡糖的化學合成……….……….. 04

第二節 一鍋化合成法………….……….. 07

第三節 腫瘤細胞表面醣分子抗原………. 13

第二章 路易士Ｘ二聚體與KH-1 寡醣分子之化學合成回顧………..… 17

第一節 路易士Ｘ二聚體寡糖合成回顧………. 17

第二節 KH-1 寡糖合成回顧………... 26

第三章 結果與討論……….. 32

第一節 路易士X 二聚體與 KH-1 之逆合成分析………. 32

第二節 路易士X 二聚體與 KH-1 之合成流程………. 34

參考文獻………. 47

附錄 材料與實驗步驟………. 50

第一章 绪論

存在於生物體中的四大分子分別為－核酸(nucleic acid)，蛋白質(protein)，

碳水化合物(carbohydrate)和脂類(lipid)。其中，碳水化合相對於核酸和蛋白質 這兩種生物分子有兩項重要的差異： (1)具有高度的支鏈性 與 (2)單體間有不 同連接方式¹ (圖一)。核酸(nucleic acid )與蛋白質(protein)都以線性連接的生物 聚合物，在單體間的鍵結上沒有立體化學的問題。由於碳水化合物的高支鏈 性與單體間鍵結的立體化學的不同，大大提升結構上的複雜度也增加研究上 的困難。

(圖一) (1)去氧核糖核酸(DNA)結構 (2)胜肽結構 (3)寡糖結構

分子生物學的核心是由 佛朗西斯．克里克(Francis Harry Compton Crick) 在1958 年提出的中心法則(Central dogma)² (圖二)，並在 1970 年發表於 Nature 期刊上的一文－分子生物學的中心法則(Central dogma of molecular biology)：

分子生物學的中心法則旨在詳述說明連串訊息的逐字傳送，它指出遺傳訊息 不能由蛋白質轉移到蛋白質或核酸之中。

( The central dogma of molecular biology deals with the detailed residue-by- residue transfer of sequential information. It states that such information cannot be transferred from protein to either protein or nucleic acid. ) [目前也發現一些 中心法則的例外]

建立於轉錄(transcription)、轉譯(translation)及 DNA 複製(replication)這套模版 (template)上的分子生物技術則提供了一套在研究核酸及蛋白質上強而有力的 技術。

隨著人類基因體序列的解碼完成，後基因體時代正式宣告來臨。醣類的 研究則在後基因體時代被視為重要的領域之ㄧ！醣類在生物體中的角色除了 提供能量來源之外，慢慢也被了解到涉及要重辨識(recognition)的功能(圖三) 例：抗原與抗體的辨認³、微生物與細胞表面的結合⁴；經後轉譯(post translation) 醣化修飾的蛋白質影響其結構上的摺疊(folding)與壽命(lifetime)⁵；發炎反應⁶ 以及細胞分化與增生⁷等等。

(圖二) 中心法則(central dogma) (a) DNA 複製成 DNA

(b) DNA 轉錄成 RNA (c) RNA 轉譯成蛋白質 (d) RNA 逆轉錄成 DNA

(e) 未成熟的 RNA 剪切後成為 成熟的 RNA

a b

c

d e

(圖三) 細胞表面上的醣分子涉及與細胞-細胞之間、細胞-微生物、與一些 生物分子等之間的辨識作用。

然而，在生物體中構築多醣體的過程中，似乎缺少了一套完整且有利於 了解最終生合成出多醣序列的相對密碼子。在研究具有高歧異度的醣類分子 其生物活性功能的過程中，如何快速得到足夠量的同質性(homogeneous)多醣 分子與醣分子解序技術是非常重要的問題！

第一節 寡糖的化學合成

醣類的合成相較於核酸或蛋白質的合成困難許多，原因在於 (1)醣類分子 常有支鏈結構，而非單純的線性結構，(2)單醣單元之間的連接方式有α或β 鍵結，(3)合成的過程中需要不同的選擇性上保護與去保護的步驟(圖四)。其中 值得注意的是，選擇不同種類的保護基對於醣化反應過程中的活性與立體選 擇性會有所差異，例：推電子基的保護基會增加醣供與者(glycosyl donor)的活 性，拉電子基的保護基則反之，二號碳上為酯類(ester group)或醯胺類(amide group)時，進行醣化反應時有鄰基參與效應(neighboring effect)⁸。

Hydroxy protection

Ether O

R

R= H (Pd/C or Pd nanoparticles) R= OMe (TFA or DDQ)

R= NHPiv (DDQ) R= OAc (NaOMe)

R= Halogen (Pd, 2^oamine, acid)

O CPh₃ (TsOH)

O (^tBuOK, Ir, Pd, or Rh)

O Si

tBu R R

R= CH₃ (Bu4NF or HF) R= C₆H₅ (Bu4NF or HF)

Acetal

O O

R¹ R²

or OO

OMe

OMe R¹=R²=CH₃

R¹=H, R²=C₆H₅ R¹=H, R²=CH₃OC₆H₄-

(TFA or AcOH)

Ester

R O

O

R= CH₃, CCl₃CH₂-, Ph, ClPh, (CH₃)₃C- (NaOMe) R= ClCH₂- (NaOMe or thiourea or NaHCO₃) R= CH₃CO(CH₂)₂- (NH₂NH₂)

Amine protection

O N₃

O N O

O

O NHR

(H₂/Pd)

(NH₂NH₂)

R= CH₃CO- (MsOH, MeOH) R= CCl3CH2OC(O)- (Zn-acetic acid)

R= ArSO2- (Na/NH₃or Ac₂O/DMAP)

(圖四) 醣類合成過程中常見的保護基與去保護的試劑⁸

隨著有機合成反應的開發，目前已有數種化學方式可以成功合成出寡糖 分子，其中大多數的方法是使用路易士酸(Lewis acid)去活化異位性(anomeric) 碳原子上的離去基(leaving group)，然後與另一種糖上的氫氧基(hydroxy group) 做置換反應(圖五)。在寡糖的合成中，醣苷鍵(glycoside bond)的立體位向控制 (stereo-control，α or β)可以說是最重要的，目前最常見的控制醣苷鍵立體 位向的方法的是： α-1,2-同向(cis)－動力向差異構物效應(kinetic anomeric effect) 與 β-1,2-反向(trans)－鄰基參與效應(neighboring effect)⁸ (圖五 A)。

最早配醣體(glycoside)的合成紀錄是由 Michael, A 在 1879 年發表在 Am.

Chem. J ⁹，不過後來第一個較被廣泛使用的方法是由W. Koenigs 與 E. Knorr 在1901 年發表在 Ber ¹⁰. 現在被稱為 Koenigs-Knorr 醣化反應－利用 Glycosyl halide 與醇類在重金屬或是路易士酸的幫助下進行醣化反應。後來也陸續發展 出一些醣化反應的方式，主要可以分成兩大類¹¹(圖五 B)：(1) 含 Koenigs-Knorr 醣化反應在內的異位交換反應(anomeric exchange reactions)，例：glycosyl halide、glycosyl sulfoxides 和 thioglycoside 等 與 (2)含氧異位反應(anomeric oxygen retaining reactions)，例：trichloroacetimidate、glycosyl phosphite、glycosyl phosphate 和 pentenyl glycoside 等。 在這兩大類之外還有由 Danishefsky 教授 開發出來的Glycal，經氧化試劑(例：DMDO)氧化得到 1,2 環氧化物(1,2-epoxy) 後藉由路易士酸(例：ZnCl2)催化下進行醣化反應。

O L Lewis acid

Activation -L^-

O O

H R¹

O OO

R`

O H R¹

Glycosylation O

OR¹

O OR¹ and

(participation of C-2 substituent) favor

favor (anomeric effect)

O X

O

O O

O

O O

O O P

OR² OR²

O NH

CCl₃

SR³ O P

O OR³

OR³ O

S O

Ph S

S OEt O

Glycosyl halides X=Cl, Br, (AgOTf)

or F (SnCl₂/AgClO₄) Glycosyl phosphite

(TMSOTf) Trichloroacetimidates (TMSOTf)

Thioglycosides (NIS/ThOH or DMTST)

Glycosyl phosphates (TMSOTf)

Pentenyl glycosides (NIS/Et₃SiOTf)

Glycosyl sulfoxides (Tf₂O)

Glycals

(1.DMDO 2.ZnCl2) Xanthates (DMTST, Cu(OTf)₂) A

B

(圖五) (A) 醣化作用的反應機構 (B)常見的醣化試劑和與其使用的活化劑⁸ α

β

第二節 一鍋化合成法 (One-Pot Synthesis)

目前已經有數個研究團隊利用各自開發的一鍋化合成法來合成寡糖。原 理上是在同一個反應瓶內，利用反應活性的不同或使用不同的活化劑來活化 醣授予體後，依序連接起來得到目標產物(圖六)¹²。

(圖六) 一鍋化合成寡醣的策略設計¹²

在70 年代，最早由 Paulsen 發現到 glycosyl halides 上 C2的氫氧基如果以 醚類的形式保護起來活性會比以酯類的保護基形式來得高¹³，後來，Frase-Reid 利用強勢-弱勢(armed-disarmed)形容在正戊烯醣授予體上 C2的氫氧基以醚類 (強勢)或酯類(弱勢)不同保護基造成活性上的差異¹⁴(圖七)。

(圖七) Fraser-Reid 在合成雙醣上的強勢-弱勢策略¹⁴

在Boons 的團隊發現，雖然醣授予者上 C2的氫氧基保護基相同，但利用 離去基立體障礙的不同使得活化劑要活化離去基時有不同的競爭關係，進而 造成活性上的差異¹⁵(圖八)。

O SEt BzO OBz

BzO O BnO O

BnO O BnO O

BnO BnO OBn

BnO

BzO O BzO

BzO O

S +

NIS/TMSOTf

O BzO BzO

BzO O BnO O

BnO O BnO O

BnO BnO OBn

BnO

BzO O BzO

BzO HO

S

BnO O BnO

HO

BnOOMe +

NIS/TMSOTf

BzO O BzO

BzO O O BzO BzO

BzO O BnO O

BnO O BnO O

BnO

BnO OBn

BnO

O O

BnO

BnO BnO OMe

(圖八) 離去基的立體障礙造成反應性的不同 (Boons 團隊)¹⁵

第一個真正利用一鍋化合成法進行醣化反應是在1993 年，由 Kahne 等人 利用苯基堸(phenyl sulfoxide)與硫苷糖(thioglycoside)授予體依序活化，進行一 鍋化合成ciclamycin 0 三醣分子¹⁶(圖九)。

O O

S O

O HOOBn

SPh

O TMSOOBn

S O

OMe

FAST, -78^oC CH₂Cl₂/ Et₂O TfOH

COOMe

O OOBn

SPh

O O O

OBn

O

(圖九) Kahne 一鍋化合成 Ciclamycin 0 三醣分子¹⁶

Takahashi 等人則是選擇不同種類的醣授予體，利用不同的活化劑來進行 選擇性的一鍋化醣化反應¹⁷(圖十)。

BnO O

O OBz

O O O

O BzMOBzMO

OMBz

BzMO BzMO MBzO

BzMO OMBz

NH CCl₃

O OAc AcO SPh

AcO OH

TMSOTf

BnO O O O

OMe OH

BzO OMBz BzMOBzMO

BzMO 1

2 NIS / TfOH

BnO O

O BzO

O O O BzMOBzMO

OMBz

BzMO BzMO MBzO

BzMO OMBz AcO O

AcO

AcO O BnO O

O

BzOOMe O

O

BzMO BzMO

BzMO OMBz

(圖十) Takahashi 的一鍋化合成法¹⁷

在Ley 的團隊，首先利用 NMR 的技術定出醣授予體的相對活性數值 (relative reactivity values，RRV)¹⁸。另外，也利用硒苷醣(selenoglycosides)與硫 苷醣(thioglycoside)在相同的活化劑中被活化的速度不同，進而利用在寡醣的 一鍋化合成法¹⁹(圖十一)。

(圖十一) Ley 的一鍋化合成法

在 1999 年，翁的實驗室利用HPLC 的方式定出硫苷糖(thioglycoside)的相 對活性值，並將這些基本單元(building block)的活性值寫入麥金塔電腦程式中 建立了一套資料庫。未來在著手合成寡醣時，將寡醣結構輸入電腦分析後依 輸出建議的理想基本單元進行一鍋化反應，即可有機會得到目標產物^12,20(圖 十三)。

(圖十三) 翁的程序性的一鍋化合成法²⁰

最後介紹的是反覆活化的一鍋化合成法(圖十四)，此法建立於 Danishesfky 開發的glycal 方法論²¹、Gin 的化學選擇性醣化反應²²與Yamago²³等人的方 法。最先作前活化(preactivation)硫苷糖的反應進行醣化反應的是 Crich²⁴進行 甘露糖的β-醣苷鍵生成反應(圖十五)。後來 Boom 和 Marel²⁵利用反覆活化的 方式進行一鍋化合成法(圖十六)。

(圖十四) 反覆活化一鍋化合成法²⁶

(圖十五) Crich 實驗室發展出合成甘露醣-β-醣苷鍵的方法

(圖十六) 反覆活化的一鍋化合成法

第三節 腫瘤細胞表面醣分子抗原

癌症(cancer)這令人聞風色變的疾病，已成為造成人類死亡的主要殺手之 ㄧ。根據世界衛生組織(World Health Organization)統計，2007 年因癌症所造成 死亡的人數有七百九十萬人，佔所有死亡人數的13%。另外也預估，如果沒 有出現有效的診斷和治療方法的話，到2030 年時這一年全世界死於癌症的人 數將會多達一千兩百萬人²⁷！

癌症(cancer)是由一些失去正常細胞增生(cell proliferation)和調節恆定狀 態(homeostasis)的癌細胞(cancer cell)所引起的疾病。惡性腫瘤與正常細胞 的生長表現上的差異，巨觀來看有六種基本細胞生理狀態上的不同²⁸(圖十 七)：(1)自足的生長訊息(self-sufficiency in growth signals )、(2)對抑制生長訊息 不敏感(insensitivity to antigrowth signals)、(3)避開細胞凋零(evasion of apotosis) 、(4)無限制的複製能力(limitless replicative potential)、(5)持續性的血管新生 (sustained angiogenesis)和(6)侵犯與轉移到其他組織的能力(tissue invasion and metastasis)。

(圖十七)²⁸癌症所需的六種基本能力 自足的生長訊息、對抑制生長訊息不 敏感、避開細胞凋零、無限的複製能 力、持續性的血管新生 與侵犯轉移的 能力，這些能力在癌症生成的不同時 期過程中扮演重要的角色。

在1696 年，Meezan 與其他科學家首次利用凝集素(lectin)觀察到正常與癌 化的纖維母細胞(fibroblasts)之間膜上的醣蛋白有些許的不同，也證實了在癌化 的過程中出現了不正常的醣化現象²⁹。這些不正常的醣化現象包括了大量或減 少表現在正常細胞上，或是表現出不存在於正常細胞上的醣結構(圖十八)。

(圖十八) 癌症相關的碳水化合物抗原分子結構

過去，在研究這些不正常的醣化現象常是利用不同的凝集素去尋找正常 與惡性組織上不同的醣結合物(glycoconjugate)。拜科技的進步，現今則是利用 單株抗體(monoclonal antibodies)、分子探針(probe)與質譜(Mass spectrometry)、

核磁共振(Nuclear magnetic resonance)光譜等技術來研究這些不正常的醣化現 象。表一為我們常見到的一些已知以醣脂質或醣蛋白表現在不同癌症上的腫 瘤相關的碳水化合物抗原(tumor associated carbohydrate antigens)^{30, 31}。

腫瘤 抗原 Melanoma GM2, GD2, GD3 Neuroblastoma GM2, GD2, GD3, PSA Skin GM2, GD2, GD3

Small cell Lung cancer GM2, FucGM1, Globo H, PSA, sLe^a, di-Le^x, KH-1 breast GM2, Globo H, TF, (s)Tn, PSA, sLe^a

Prostate GM2, (s)Tn, TF, Globo H, Le^y Ovary GM2, Globo H, sTn, TF, Le^y

Colon GM2, Globo H, (s)Tn, TF, Le^y, sLe^a, di-Le^x, KH-1 Stomach GM2, Le^y, (s)Le^a

Pancreas GM2, Globo H, sTn, Le^y, sLe^a, sLe^x, PSA 表一 一些癌症細胞表面大量表現的碳水化合物抗原分子^{30, 31}

在1986 年，由 Hakomori 教授等人利用抗體做免疫組織化學染色(immuno- histological Staining，IHC)發現大腸癌與胃癌細胞表面大量表現出路易士 X 二 聚體(di-Le^x)與 KH-1 的醣分子抗原³¹(圖十九)，因此許多科學家想利用此特徵 作為生物標誌分子(biomarker)，進一步設計出治療疾病的標靶藥物。

過去的一些研究發現，腫瘤相關的醣抗原分子在誘導免疫反應方面不如 脂多醣(lipopolysaccharide)強，因此如何搭配一些適當的佐劑來促進免疫反應 與讓醣抗原分子成為好的抗原決定位(epitope)³²也是許多科學家正在著手解決 的問題。此外，這些抗原分子在胚胎與正常細胞中少量表現，因此免疫細胞 也是有可能會認為這是自體抗原分子而不會進行攻擊，因此如何打破免疫系 統對於這些抗原分子的自體容忍性(self-tolerance)³³也需要進一步去思考。

在研究這些醣類的生物活性之前，重要的是如何得到足夠量的同質性 (homogeneous)抗原分子，因此有機合成扮演重要的角色。由於路易士 X 二聚 體與KH-1 分子可運用於醣晶片與發展醣分子疫苗，因此具有合成的價值。接 下來開介紹過去合成的相關文獻與本篇論文利用一鍋化合成法來同時合成直 鏈與支鏈型態的寡糖。

O O

O NHAc

O OH O

HO OH

OH O O

OH OO

NHAc

O O

HOOH OH

HOOH OH O

HO OH HO

O O HOOH

OH

O O

O NHAc

O OH O

HO OH

OH O O

OH OO

NHAc O

HO HO

OH OH

O O

HOOH OH

HOOH OH

O HO

OH OH

O O

HO OH

OH O O

HO

OH OH

O O

HO OH

OH

O C₁₃H₂₇

C₁₃H₂₇ HN

HN

OH

OH O

O

C₁₅H₃₁

C₁₅H₃₁ Dimeric Lewis X antigen

KH-1 antigen

(圖十九) 路易士 X 二聚體與 KH-1 抗原分子結構

第二章 路易士Ｘ二聚體與KH-1 寡醣分子之化學合成回顧

第一節 路易士Ｘ二聚體寡糖合成回顧

1988 年 Ogawa 教授首先完成路易士 X 二聚體全合成的工作，其採用的策 略乃是以imidates 的方式進行[3+2+3]逐步合成法來建構出八醣分子(圖二十)³⁴ 。在合成過程中，五醣化合物6 與三醣化合物 7 進行醣化反應的過程中會產 生副產物8(10%)，且繁複步驟也影響總產率的高低，反應過程中也使用到一 些重金屬其經濟效益似乎不高。

K. C. Nicolaou 團隊在 1990 年完成路易士 X 單體到三聚體系列的全合成 工作，圖二十二為簡示他們進行路易二聚體的合成策略³⁵。其乃是利用氟苷醣 (glycosyl fluoride)在路易士酸(Lewis acid)的活化下進行[3+2+3]的逐步醣化反 應。其中化合物4 與化合物 10 進行[3+2]醣化反應時，由於化合物 10 半乳糖 (galactose)上 C4的氫氧基立體障礙比C3的氫氧基大，因此會有特位選擇性 (regioselective)在 C3的氫氧基上進行反應。同理，在化合物19 經選擇性去保 護後得到化合物20 再與化合物 4 進行醣化反應時經特位選擇性(regioselective) 得到想要的1→3 醣苷鍵，得到八醣的化合物 21。

Schmidt 實驗室在 1994 年利用他們自行開發出來 imidate 的方法來合成路 易士X 系列的分子，包含了路易士 X 單體(monomer)到四聚體(tetramer)分子，

(圖二十一) ³⁶為路易士X 二聚體的合成步驟，他們使用的策略是[3+3+2]的逐 步合成方式，建立出三醣的授予體化合物8 與三醣的接受體化合物 6，接下來 進行醣化反應得到化合物9，然後將化合物 9 的還原端的矽保護機除去後轉變 成醣授予體imidate 的形式(化合物 10)，最後再與化合物 11 進行醣化反應得到 化合物12 的八醣分子。化合物 12 的還原端與非還原端可以藉由上保護與去 保護的等反應進行衍生化。

在1999 年 Sinaÿ 團隊合成路易士 X 二聚體的策略是利用硫苷醣(thio- glycoside)進行[3+2+3]逐步合成法(圖二十三) ³⁷。首先，利用已經構築好的化

合物2 與化合物 3 進行醣化反應，經特位選擇性(regioselective)生成所要的 1→3 醣苷鍵結，得到化合物 4。酯類經醇解後，在酸性條件下與二甲基苯縮 醛(benzaldehyde dimethyl acetal)反應，選擇性保護在最外端半乳糖上的 C4與 C6上的氫氧基，得到化合物5。在化合物 5 最外端的半乳糖上裸露出來的 C2

與C3上的氫氧基在反應活性上C3大於C2，因此化合物5 與化合物 2 進行醣 化反應時會選擇性與C3上的氫氧基反應，進而得到所要的八醣分子化合物6。

Boons 的團隊在 20000 年利用修飾過的環氧樹酯聚合物( Methoxypoly (ethylene glycol), MPEG )作類似固相醣化反應的支撐物。他們所採用的是[3+3]

逐步合成法的策略，先在可溶性的聚合支撐物上建構出三醣分子8³⁸ (圖二十 四)，接著從聚合物上切除下來，經一系列反應轉成三醣的醣授予體 (glycosyl donor) 化合物 12，再與在聚合物上的化合物 9 [3+3]的醣化反應，最後得到路 易士二聚體的六醣分子。

Takahashi 在 2005 年利用他們實驗室的正交性(orthogonal)一鍋化反應，配 合固相合成法進行自動化平行合成路易士X 二聚體(圖二十五) ³⁹。開始以化合 物3 與 6 進行選擇性活化與特位選擇性(regioselective)醣化反應得到化合物 8，

接下來進行兩次的正交性(orthogonal)醣化反應得到四醣的醣授予體(glycosyl donor)化合物 2。第二次一鍋化反應中，化合物 2 與 3 再次進行選擇性活化與 特位選擇性(regioselective)醣化反應得到化合物 10 後，最後再進行兩次正交性 (orthogonal)醣化反應得到所要的寡醣分子化合物 1。

最近，在2007 年由 黃與葉兩人的團隊利用反覆活化的方式進行一鍋化 醣化反應。他們採用的策略是[3+3+2]的策略來得到路易士 X 二聚體分子⁴⁰(圖 二十六)。他們也應用反覆性活化的一鍋化合成法和特位選擇性(regioselective) 的方式來建構兩種三醣分子的醣授予體(glycosyl donor)化合物 5 與 6。在第二 次的一鍋化合成反應裡再度使用特位選擇性的方式進行[3+3+2]直鏈的醣化反 應，建構出路易士X 二聚體分子。

O O O

O OBn

NPhth AcO OAc

AcO

OAc

O O

BnOOBn OBn

O O O

O OBn

NPhth AcO OBn

AcO

OBn

OR O

BnOOBn OBn

O O O BnO HO

OBn

BnO BnO OBn

OBn OBn 1

2 R=H 3 R=CNHCCl₃

O O O BnO OBn

BnO BnO OBn

OBn OBn O O

O O

OBn

NPhth RO OBn

RO

OBn O

O BnOOBn

OBn

4

5 R= Ac 6 R= H O

OBn OO

NPhth O

O

BnOOBn OBn AcO OAc

AcO

OAc

O OBn O

O O O

BnOOBn OBn AcO OAc

AcO

OAc

NPhth O

NH CCl₃

8 7

O O O BnO OBn

BnO BnO OBn

OBn OBn O O

O O

OBn

NPhth HO OBn

O

OBn O

O BnOOBn

OBn O

OBn OO

O O

BnOOBn OBn AcO OAc

AcO

OAc

NPhth

9

(圖二十) Ogawa 實驗室合成路易士二聚體的流程簡圖³⁴

HO O

OBn

NPhth

O SPh O

ClAcO ClAcO

OAc F OCO^tBu

O O

OBn

NPhth O SPh

O ClAcO OAc

ClAcO OCO^tBu

O O

OBn

NPhth HO SPh

O OAc ClAcO

ClAcO OCO^tBu O

BnOOBn OBn

F a

b

c O O

OBn

NPhth O SPh

O OAc ClAcO

ClAcO OCO^tBu

O BnOOBn

OBn

O O O Bu^tOCO HOOBz OBz HO

Bu^tOCO OCO^tBu OR

d

O O O Bu^tOCO HOOBz OBz O

Bu^tOCO OCO^tBu OR O O

OAc

PhthN O O OAc ClAcO

ClAcO OCO^tBu

O AcOOAc

OAc

O O O Bu^tOCO HOOBz OBz O

Bu^tOCO OCO^tBu OR O O

OAc

PhthN O O HO OAc

HO OCO^tBu

O AcOOAc

OAc

11 12 13

14

O O

OAc

NPhth O F

O OAc ClAcO

ClAcO OCO^tBu

O AcOOAc

OAc

+

+

O O O Bu^tOCO HOOBz OBz O

Bu^tOCO OCO^tBu OR O O

OAc

PhthN O O OAc HO OCO^tBu

O AcOOAc

OAc O O

OAc

NPhth O

O OAc ClAcO

ClAcO OCO^tBu

O AcOOAc

OAc O

15

16

4

19

20 10

21 +

O O

OAc

NPhth O F

O ClAcO OAc

ClAcO OCO^tBu

O AcOOAc

OAc

4

e

f

(圖二十二) K. C. Nicolaou 實驗室合成路易士 X 二聚體的流程簡圖³⁵

(a) AgClO4 (2.5eq), SnCl2 (2.5eq), 4-Å M.S., CH2Cl2, 0^oC (72%) (b) H2Ru(PPh3)4, EtOH, 95 ^oC, TsOH, MeOH (86%) (c) AgClO4 (2.5eq), SnCl2 (2.5eq), 4-Å M.S., Et2O, -30 ^oC (87%) (d) AgOTf (2eq), HfCp2Cl2 (2eq), 4-Å M.S.,CH2Cl2,-25 ^oC (91%) (e) thiourea (5eq), 2,6-lutidine (5eq), MeOH:CH2Cl2(1:1) (f) AgOTf (8eq), HfCp2Cl2 (8eq), 4-Å M.S., CH2Cl2, 0 ^oC (84%)

(圖二十一) Schmidt 實驗室合成路易士 X 二聚體的流程簡圖³⁶

(a) (i)TMSOTf (0.1eq), Et2O (85%) (ii)NaCNBH3, HCl (80%) (b) TMSOTf (0.1eq),Et2O (89%) (c) (i)TMSOTf (0.1eq), Et2O (85%) (ii)NaOMe, MeOH;

PhCH(OMe)2, p-TsOH (89%) (d) TBAF; CCl3CN, DBU (e) TMSOTf (0.2eq), CH3CN (80%) (f) TBAF; CCl3CN, DBU (g) TMSOTf (0.2eq), CH3CN (74%)

OO O O BzO BzO

OBz

OBz O BnOOBn

OBn

SPh OBn

NPhth

O OBn

OSE BnOO OBn

O HO HO

OBn

BnO +

OO O O BzO BzO

OBz

OBz O BnOOBn

OBn OBn

NPhth

O OBn

OSE BnOO OBn

O HO OBn

BnO O

OO O HO O

OH O BnOOBn

OBn OBn

NPhth

O OBn

OSE BnOO OBn

O HO OBn

BnO O

OO Ph

a

b

2 3

4

5

2 c

OO O O OH

O BnOOBn

OBn OBn

NPhth

O OBn

OSE BnOO OBn

O HO OBn

BnO O

OO Ph

OO O O BzO BzO

OBz

OBz O BnOOBn

OBn OBn

NPhth O

6

(圖二十三) Sinaÿ 團隊合成路易士 X 二聚體的流程簡圖³⁷

(a) NIS, TfOH, CH2Cl2, 4-Å M.S. (b) NaOMe, MeOH (c) NIS, TfOH, CH2Cl2, 4-Å M.S.

(圖二十四) Boon 團隊合成路易士 X 二聚體的流程簡圖³⁸

(a) NIS, TMSOTf, 4-Å M.S., 0 ^oC, DCM (b) Et3N, DCM (c) TBAF, AcOH, THF (d) H2O2, Et3N, THF (e) DDQ, DCM, H2O (f) CCl3CN, DBU, DCM

(g) TMSOTf, 3-Å M.S.

(圖二十五) Takahashi 團隊合成路易士 X 二聚體的流程簡圖³⁹

(a) 6.(1.2 eq.), AgOTf(1.5 eq.), CH2Cl2, 4-Å M.S., -40 ^oC, 92% ; (b) 7.(1.0 eq.), DMTST(1.5 eq.), CH2Cl2, 4-Å M.S., 0^oC, 85% ; (c) 5.(2.0 eq.), DMTST(2.5 eq.), CH2Cl2, 4-Å M.S., 0 ^oC, 96%

(a) 3.(1.0 eq.), HfCp2Cl2/2AgOTf (2.0 eq.), CH2Cl2, 4-Å M.S., -40^oC, 99% ; (b) 4.(1.2 eq.), NIS(1.5eq), TfOH(0.1 eq.), CH2Cl2, 4-Å M.S., -0^oC, 75% ; (c) 5.

(2.0 eq.), NIS(2.5 eq.), TfOH(0.1 eq.), CH2Cl2, 4-Å M.S., -0^oC, 87%

(圖二十六) 黃與葉團隊合成路易士 X 二聚體的流程簡圖⁴⁰

(a) AgOTf (4 eq.), p-TolSCl, -78 ^oC, 10 min; then B1, TTBP, 20 min; (b) B2, p-TolSCl, TTBP, -78 ^oC - 0 ^oC in45 min;

(1)compound 1 : 3 : 4 = 1.4 : 1.0 : 1.2 (eq.) compound 1 : 2 : 4 = 1.1 : 1.0 : 1.1 (eq.) (2)compound 5 : 7 : 8 = 1.1: 1.0 : 0.7 (eq.)

第二節 KH-1 寡糖合成回顧

KH-1 寡醣分子的合成，最早是在 1997 年由 Schmidt 與 Danishefsky 的團 隊各別發表於Tetrahedron Letters 與 Nature 期刊上。

Schnidt 團隊的合成方法是利用他們所研發的 imidates 來合成 KH-1 分子 (圖二十七)⁴¹，合成策略與前面敘述過的路易士X 二聚體一樣，然後再經去保 護與選擇性上保護的反應後，裸露出最外面非還原端半乳糖(galactose)上 C2

的氫氧基，然後在與岩藻醣(fucose)進行醣化反應得到 KH-1 的九醣分子。

Danishefsky 的團隊則是利用他們開發出來的 glycal 方式，來合成 KH-1 分子。他們有兩種合成途徑，第一種途徑是1997 年發表在 Nature 期刊上的方 法(圖二十八) ⁴²，先將直鏈的六糖分子建構好後最後再一次接上三個岩藻醣單 元(fucose unit)。第二種途徑是在 2005 年發表在 J. Org. Chem.的方法 (圖二十 九) ⁴³，採用的是[4+3]的合成策略，其利用此策略是因為可以另外合成出路易 士Y 四醣與六糖分子，進一步了解抗體對於 KH-1 中抗原結合決定位(epitope) 的最小結構。

利用固相合成法來合成寡糖的先驅者之ㄧ的Seeberger，在 2004 年也成功 利用他們實驗室開發的固相合成策略成功的合成出KH-1 分子(圖三十) ⁴⁴。雖 然在合成的過程中需要大量的單元分子(building blocks)和重複性的去保護，但 在反應的過程中是由機器控制且只需一天的時間。雖然無法大量化的生產，

但就實驗室應用在醣晶片上不同結構的寡糖資料庫所需的量而言是足夠的。

先前的研究發現，可以結合KH-1 抗原分子的抗體都可以與路易士 Y 結 構的四醣分子結合，因此利用目前已有的抗體無法有效的辨別KH-1 與路易士 Y 分子的差異。為此，Boons 團隊在 2005 年利用 imidates 的方式來合成 KH-1 七醣分子的衍生物(圖三十) ⁴⁵，進一步演化抗體的專一性，最後演化出的抗體 對於KH-1 抗原的結合力為路易士 Y 抗原分子的二十倍。

(圖二十七) Schmidt 實驗室合成 KH-1 分子的流程簡圖⁴¹

(h) (i) NaOAc, MeOH (qu) (ii) Acetone, p-TsOH (89%) (i) TMSOTf (94%)

(圖二十八) Danishefsky 實驗室合成 KH-1 分子的流程簡圖⁴²

(a) (i) DMDO, CH2Cl2, (ii) ZnCl2, THF (65%); (b) TESOTf, Et3N, CH2Cl2 (92%) (ii) I(coll)2ClO4, PhSO2NH2, 4-Å M.S. > 90% (iii) LHMDS, EtSH, DMF > 90%; (c) Ac2O, Et3N, DMAP, CH2Cl2 (95%); (ii) I(coll)2ClO4, PhSO2NH2, 4-Å M.S. > 90%

(iii) LHMDS, EtSH, DMF (iv) Ac2O, Et3N, DMAP, CH2Cl2 (85%); (d) K2CO3, MeOH (80%); (e) MeOTf, di-t-butylpyridine, Et2O : CH2Cl2(2:1), 4-Å M.S. (55%), (ii) K2CO3, MeOH (85%); (f) (i) MeOTf, di-t-butylpyridine, Et2O : CH2Cl2(2:1), 4-Å M.S. (60%) (ii) Ac2O, Py, DMAP, CH2Cl2 (95%) (iii) TBAF/AcOH (93%) (g) Sn(OTf)2, toluene:THF (10:1), 4-Å M.S. (60%).

(圖二十九) Danishefsky 實驗室利用[4+3]策略合成 KH-1 分子的流程簡圖⁴³

(圖三十) Seeberger 實驗室利用固相合成 KH-1 分子的流程簡圖⁴⁴

(a) 2. (5.0eq.), TMSOTf (5.0eq.), repeated 2 times for 15 min each; (b) 20%

piperidine in DMF (2.2 mL), repeated 3 times for 10 min each; (c) 3. (5.0eq.), TMSOTf (5.0eq.), repeated 3 times for 15 min each; (d) 4. (3.5 eq.), TMSOTf (3.5eq.), repeated 3 times for 15 min each; (e) 5. (5.0eq.), TMSOTf (5.0eq.), repeated 2 times for 15 min each; (f) 10% N2H4 in DMF (2.5 mL), repeated 5 times for 15 min each; (g) 6. (5.0eq.), TMSOTf (5.0eq.), repeated 2 times for 15 min each; (h) NaOMe (10 eq.) in MeOH/CH2Cl2, repeated 4 times for 90 min each.

HO O FmocO

OBn

NHTroc O

OBz O

BnO OBn DEIPSO

OBz SEt +

O O RO

OBn

TrocHN O

OBz O

BnO OBn DEIPSO

OBz

1 2

a

b 3 R= Fmoc 4 R= H

O AcOOAc OBnSEt

5

O O O

OBn

TrocHN O

OBz O

BnO OBn DEIPSO

OBz

O AcOOAc

OBn O O

O OBn

TrocHN O O

BnO OBn HO

OBz

O AcOOAc

OBn

NHCbz

7 6

HO O FmocO

OBn

NHTroc O

OBz +

2

d O

BnO OBn BnO

OLev SEt

8

c

O O R²O

OBn

TrocHN O

OBz O

BnO OBn BnO

OR¹

e 9 R¹= Lev, R²= Fmoc 10 R¹= Lev, R²= H

9

f 11R¹= H, R²= H

O AcOOAc OBnSEt

5 d

O O O

OBn

TrocHN O

OBz O

BnO OBn BnO

O

O O AcOOAc

OBn

AcOOAc OBn O O

O OBn

TrocHN O O

BnO OBn BnO

O

O O AcOOAc

OBn

AcOOAc OBn

NH CCl₃

13 12

O O O

OBn

TrocHN O O

BnO OBn BnO

O

O O AcOOAc

OBn

AcOOAc OBn

O O O

OBn

TrocHN O O

BnO OBn OBz

O AcOOAc

OBn

NHCbz

7 + 13 ^g

14

(圖三十一) Boons 實驗室合成 KH-1 分子的流程簡圖⁴⁵

(a) p-benzoyl-benzyl alcohol, NIS, TESOTf, CH2Cl2, 0 ^oC (86%);

(b) CH2Cl2/Et3N (5:1) (95%); (c) NIS, TESOTf, CH2Cl2, 0 ^oC (74%); (d) NIS, TESOTf, CH2Cl2, 0 ^oC; (e) CH2Cl2/Et3N (5:1) (95%); (f) N2H4-AcOH, MeOH, CH2Cl2 (87%); (g) NIS, TBSOTf, CH2Cl2, -30 ^oC (60%)

第三章 結果與討論

第一節 路易士X 二聚體與 KH-1 之逆合成分析

本篇論文的目標為利用一鍋化合成法的策略來合成路易士X 二聚體的六 醣分子與KH-1 的七醣分子，接下來先對此兩目標分子進行逆合成分析。

路易士Ｘ二聚體的六醣分子(圖三十二 A)，可分解成三個單元分子－岩藻 醣單元(fucose unit) (B)、N-醯胺乳醣單元(N-lactosamine unit) (C)與還原端的 三醣單元(reducing unit) (D)，利用此三個單元分子的反應活性差異，來進行一 鍋化合成法，且還原端的三醣單元亦可由一鍋化合成法獲得。

在結構上KH-1 與路易士Ｘ二聚體(圖三十三 H 與圖三十二 A)差別在於 KH-1 的非還原端上的半乳糖(galactose)C2上的氫氧基比路易士X 二聚體多一 個α,1→2 鍵結的岩藻醣(fucose)，因此只要將 N-醯胺乳醣單元(C)修改成(I) 則可以利用相同的合成方式合成出KH-1 的七醣分子。

在生成醣苷鍵(glycosidic bond)立體位向(configuration)上的控制，α位向 是利用動力向差異構物效應(kinetic anomeric effect)來控制，β位向則是利用鄰 基參與效應(neighboring group participation effect)。因此，在岩藻醣上 C2的氫 氧基利用醚類的保護基，其他的醣類上C2的氫氧基或氨基個別利用酯類(ester) 或胺酯(carbamate)的保護基來進行保護。在一些醣上不進行醣化反應的氫氧 基，則利用長久性的保護基 [在此是利用芐基醚(benzyl ether)與縮醛(acetal)]，

其他在不同反應階段會進行反應的氫氧基則選擇暫時性的保護基 [在此利用 苯甲酯(benzoyl-)與γ-酮戊酯(levulinoyl-)]，利用不同的去保護條件可以選擇性 裸露出將進行醣化反應的氫氧基。最後，將進行一鍋化的合成單元則可設計 成(E) (F) (G)與(J)。

(圖三十二) 路易士 X 二聚體的逆合成分析

(圖三十三) KH-1 的逆合成分析

第二節 路易士X 二聚體與 KH-1 之合成流程

O OH HOHO

NH₃

OH O

OH HOHO

NHTroc OH

O OAc AcOAcO

NHTroc OAc

O OAc AcOAcO

TrocHN Br Cl

TrocCl NaHCO₃ H₂O, 0^oC to r.t

Ac₂O

pyridine, 0^oC to r.t.

80.3% Two steps

HBr in AcOH (33%) CH₂Cl₂, -10^oC

I₂, DDQ CH₃CN, AW-300, r.t

71.2% Two steps

O OAc AcOAcO

TrocHN

O N₃

HO N₃

NaOMe MeOH, r.t

O OH HOHO

TrocHN

O N₃ O

HOTrocHN

O N₃

OO Ph benzaldehyde dimethyl acetal CSA, CH₃CN, 40^oC

91.3% two steps

Levulinic acid EDCI, DMAP CH₂Cl₂, r.t

87.8%

O LevOTrocHN

O N₃

O O

Ph Triethylsilane

TFA,TFAA CH₂Cl₂, 0^oC to r.t

88.6%

O LevOTrocHN

O N₃

BnO HO

1 2 3

4 5

6 7

8

9

Hydrazine/AcOH/pyridine (v/v 0.3:1.9:2.6)

pyridine, r.t 87.1%

O HOTrocHN

O N₃

HOBnO

10

(流程一) 葡萄糖醯胺單元分子的合成流程

首先，以葡萄糖胺鹽酸鹽類(glucosamine hydroxychloride) 1 作為反應的起 始物，經碳酸氫鈉水溶液進行中和反應，然後在冰浴下加入氯甲酸-2,2,2-酸氯 乙酯(2,2,2- trichloroethoxycarbonyl chloride) 劇烈攪拌反應後會有白色固體析 出，將析出的白色固體過濾後用冰水將鹽類洗去，然後將白色固體抽乾得到 化合物2⁴⁶。化合物3⁴⁶可由化合物2 在砒碇(pyridine)作為溶劑下與醋酸酐 (acetyl anhydride)進行乙醯化反應得到。化合物 3 在-10 ^oC 下與氫溴酸(hydro- bromic acid)進行溴化，反應得到白色固體的化合物 4⁴⁶。接下來化合物4 與 1- 疊氮正戊醇(1-azido-pentanol)進行醣化反應，依標準步驟⁴⁷是將活化過的分子 篩與化合物4 和 1-疊氮正戊醇溶於乙腈(acetonitrile)中，先在室溫下攪拌 1 小 時進行除水。不過發現化合物4 在除水的過程中會分解掉，因此稍作步驟的