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國立臺灣大學生物資源暨農學院動物科學技術學系 碩士論文
Department of Animal Science and Technology College of Bioresources and Agriculture
National Taiwan University Master Thesis
蛋殼膜膠原蛋白水解液、蛋黃水解液及蛋殼粉對預 防骨質疏鬆機能性之評估
Evaluation of functional properties of egg-derived products on bone cell function
楊沛蓁 Pei-Chen Yang
指導教授：蘇和平 博士 Advisor: Hou-Pin Su, Ph.D.
中華民國 101 年 6 月 June, 2012
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致 謝
本論文承蒙恩師 蘇和平博士兩年來悉心指導與策勵，恩師於論文題目、試 驗設計、年會發表及論文之撰寫、修改，耐心指導並提供寶貴意見。也要感謝口 試委員 黃英豪博士、陳億乘博士與林詠凱博士詳細審閱與撥冗修正，特此敬致 謝忱。
在台北這兩年的就學期間，首先要感謝 蘇和平老師於論文研究上之指導與 做人做事觀念的指引，以及系上老師於學業與研究上所提供的意見與協助 ; 林 慶文老師及 陳明汝老師在學業及做人做事上的身教與言教 ; 感謝 陳億乘老師 大方的讓我去他們實驗室學習實驗技巧。
更感謝加工室這個大實驗室的小家長:阿伯學長，不只常常關心大夥的日常 生活，也常常在待人處事上教導與分析給我們聽，讓我了解到很多不同事情處理 的角度該如何去拿捏，除此之外也感謝學長在實驗上的幫助與指導 ; 另外也要 謝謝聖耀學長、偉盛學長、廷宇學長、月玲學姐以及之儀學姊，雖然跟妳們相處 的時間很短暫，但在懵懵懂懂的碩一小菜鳥階段，很謝謝你們願意跟剛進這個大 家庭的我分享所有點滴，以及許多做人處事之道理，甚至還策勵我。也很感謝馨 慧學姐、姿利學姐、雅婷學姐、昱婷學姐及庭羽學長，很謝謝你們在我手忙腳亂 面臨第一次的專討時，大家絞盡腦汁教我如何選擇paper 讓架構更完整，以及如 何讓自己的專討更有故事性。
還有加工室的戰友們:汪婷、賴床、英林、Pink ; 謝謝汪小婷陪我挑燈夜戰，
不只課業上的問題甚至在要結報時，還連續好幾天陪我練稿、改ppt，改到凌晨 3.4 點 ; 謝謝賴床在我剛來台北完全人生地不熟的時候，帶我融入這個大家庭，
甚至之後還一起加入壁球社，在實驗閒暇之餘一起去運動還有玩樂，除此之外，
常常在做實驗時也給我建議與幫忙 ; 更難忘大夥一起走跳校園、平溪放天燈祈 求實驗順利以及到處去吃美食，也要感謝偉大的助理 彥霖，謝謝你在我剛接觸 細胞實驗的時候，願意幫助協助我，有些東西雖然我們都不是很熟悉，可是我們
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兩個一起想辦法解決，真的是太感謝你了~同時也要感謝景銘、芳芳、吳婕、白 白還有BoA 要不是沒有你們的吱吱喳喳與打鬧，想必碩班生活必定相當枯燥乏 味，謝謝你們讓我擁有許多美好回憶。也要謝謝怡伶學姊、宜岑、奕賢與林真還 有大 A，謝謝你們大方教導與分享我許多實驗技巧。謝謝分生室的楊餔餔、大鳥、
小幼、乃霸與慧卉，陽明山採海芋、九份老街吃吃喝喝，互相抱怨、互相扶持，
許許多多歷歷在目，謝謝你們。
接著我要謝謝大葉大學生物產業科技學系的 吳建一老師以及陪我細數許多 日子的學長姐們還有夥伴們，帶我進入研究這個神聖的領域，我不會忘記實驗室 每年一定會有忘年會以及聖誕趴踢還有實驗室上山下海出征研討會，當然還有實 驗室一年一度的大夥集體出遊，每次出門總是很壯觀。謝謝在大學的這段期間，
大夥一起做實驗、翻paper over night，因為有你們，讓我更圓滿。在心情低落與 頹廢時，幸好有空空、哈哈、佳佳、阿曼、好兄弟毛毛、凱軍、秉洋及昱玲學姊 你們的加油打氣與鼓勵 ; 尤其感謝我大學的好室友兼第二個男友 空空，在我心 情難過時，都被我打電話煩 ; 在我煩悶時，要來接送我去他家大鬧 ; 也很謝謝 我的工工朋友們:老大、史瑞克、阿昌、小飛，謝謝你們的義氣相挺與義不容辭!!!
小女子真的超感動，一切盡在不言中。還有北科電機的朋友們，在台北的生活，
因為有你們的幫忙與參與，更增添在這邊的多彩多姿。
還有我的高中好姊妹們:佳凌、阿串、詩琦、阿嬤、昀紋、糖糖、彩虹及阿 丁，謝謝你們一路的互相扶持與陪伴，謝謝你們的兩肋插刀，每年的姊妹聚會是 一定不會忘的，因為我們說好，就算到了七老八十，還是要當一輩子隨 call 互 相扶持的好姊妹。還要謝謝另一重要的好兄弟兼好姊妹:飛機，謝謝你的關心與 陪伴，我想很多話你我不用多說都了解。
再來最感謝我親愛的家人、小阿姨一家人與我的女兒小胖子，謝謝你們在我 碩班這兩年台北的生活中，不論我遇到任何困難或挫折，都是最挺我的，謝謝爸 爸與媽咪的溫馨接送、糧食接濟以及無私的照顧與栽培 ; 謝謝小姨一家子的大 力相挺，你們就像我第二個家 ; 謝謝妹妹的貼心，雖然我們吵吵鬧鬧，但在我
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最需要的時候，你一定會第一個衝過來陪我。也謝謝我家女兒小胖子，在台北這 兩年也身兼我的室友，雖然不停地搞破壞，但不論在我高興難過還是沮喪，都是 這個小傢伙陪伴在我身旁，在我心中佔有非常重要的地位。也謝謝遠在北投上班 的大胖子，謝謝你在我碩班這兩年的陪伴與幫助，謝謝你在我生病時的細心照顧，
謝謝你照顧我生活上的點點滴滴，謝謝你就連我現在要畢業了，明明工作上已經 忙翻掉了，還幫我擔心工作的問題，不時的給我建議與經驗分享，謝謝你。
好快，碩士兩年一轉眼就過去了，還記得當初進來的青澀，還記得當初來到 台北的不安與恐懼，還記得不適應台北的快步調、擁擠的人潮與壞天氣，漸漸地 我已經要離開這裡了，謝謝在我生命中的每個人，不論是過客、恩人、啟蒙老師 甚至不時的在我最需要的時候拉我一把的朋友們，謝謝你們，因為你們我才能走 到這裡。
沛蓁 貳零壹貳 艷夏
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目 錄
口試委員會審定書 誌謝
目錄... I 表目錄... IV 圖目錄... V
中文摘要... i
英文摘要... iii
壹、緒論... 1
貳、文獻檢討... 3
一、蛋殼... 3
二、蛋殼膜... 7
三、蛋黃... 10
四、膠原蛋白簡介... 15
(一)、分布及來源 ... 21
(二)、應用 ... 21
(三)、對人體之功能 ... 22
五、骨質疏鬆... 24
(一)、骨質疏鬆症簡介 ... 24
(二)、骨質疏鬆症之成因 ... 28
六、目前臨床預防與治療骨質疏鬆之方法... 29
(一)、鈣劑 ... 29
(二)、賀爾蒙代替治療 (hormone replacement therapy ; HRT) ... 30
(三)、抑鈣素 ... 30
(四)、活性維生素 D ... 30
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(五)、雙磷酸鹽類藥物 (bisphosphate) ... 31
七、骨細胞... 31
(一)、骨細胞簡介 ... 31
(二)、骨母細胞 (Osteoblast) 簡介 ... 35
(三)、骨重塑作用 ... 36
(四)、MG-63 細胞及類骨母細胞 ... 39
(五)、研究細胞增生之方法 ... 39
(六)、研究骨細胞分化作用之方法 ... 43
參、材料與方法... 46
試驗設計... 47
實驗材料及細胞株... 47
實驗方法... 48
第一節 : 雞蛋殼膜之膠原蛋白萃取及分析 ... 48
(一)、實驗流程 ... 48
(二)、蛋殼膜之分離 ... 48
(三)、蛋殼膜膠原蛋白之萃取 ... 49
第二節 : 蛋殼膜膠原蛋白及蛋黃粉之水解 ... 50
(一)、蛋殼膜膠原蛋白之水解 ... 50
(二)、市售蛋黃粉之水解 ... 50
(三)、胜肽類濃度測定 ... 50
第三節 : 蛋殼膜膠原蛋白水解液、蛋黃水解液和蛋殼粉與 MG-63 類骨母細胞培 養之功能評估... 52
(一)、細胞培養 ... 53
(二)、繼代培養 ... 55
(三)、細胞計數 ... 57
(四)、細胞存活率測試 ... 57
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(五)、細胞型態之觀察 ... 58
(六)、鹼性磷酸酵素 (alkaline phosphatase ; ALP) 含量測定 ... 58
(七)、骨礦化節點分析 ... 59
(八)、茜素紅染色 ... 59
(九)、統計分析 ... 60
肆、結果與討論... 61
第一節 : 蛋殼膜膠原蛋白及蛋黃水解物之製備與分析 ... 61
(一)、蛋殼膜膠原蛋白之萃取及酵素水解過程之變化 ... 61
(二)、胜肽含量 ... 64
第二節 : 蛋殼膜膠原蛋白水解液、蛋黃水解液和蛋殼粉與 MG-63 類骨母細胞培 養之功能評估... 67
(一)、細胞存活率測試 ... 67
(二)、細胞型態之觀察 ... 75
(三)、鹼性磷酸酵素 (alkaline phosphatase ; ALP) 活性測定 ... 78
(四)、骨礦化節點分析 ... 84
(五)、茜素紅染色 ... 86
(六)、未來展望 ... 89
伍、結論... 90
陸、參考文獻... 91
柒、作者小傳... 98
IV
表目錄
表1-1 雞蛋蛋殼部之一般組成 ... 6
表1-2 雞蛋蛋殼各部分之有機物化學組成 ... 6
表1-3 深色及淺色卵黃之成分組成 ... 11
表1-4 蛋黃蛋白質之組成 ... 12
表1-5 蛋黃脂質之組成 ... 13
表1-6 膠原蛋白類型之組成及其在組織中之分佈 ... 20
表1-7 世界衛生組織 (WTO) 對於骨質疏鬆症的分級方式 ... 26
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圖目錄
圖1-1 雞蛋之構造 ... 4
圖1-2 蛋殼之構造 ... 5
圖1-3 內殼膜之電子顯微鏡圖 ... 9
圖1-4 蛋黃成分之概要圖 ... 14
圖1-5 膠原蛋白之參股螺旋結構 ... 16
圖1-6 膠原蛋白之特殊胺基酸序列示意圖 ... 17
圖1-7 膠原蛋白單體之產生與交互連結 ... 18
圖1-8 膠原蛋白型態分類 ... 19
圖1-9 骨母細胞表型之發展 ... 22
圖1-10 骨質轉換之機制 ... 34
圖1-11 MTT 之結構圖 ... 38
圖1-12 存活細胞代謝產生 formazan 之反應 ... 41
圖1-13 鹼性磷酸酶之反應圖 ... 42
圖2-1 實驗之研究架構 ... 44
圖2-2 實驗流程及酵素水解條件 ... 47
圖2-3 實驗流程及膠原蛋白之萃取條件 ... 48
圖2-4 MG-63 細胞生長情況 ... 52
圖2-5 MG-63 細胞生長情況 ... 54
圖3-1 酵素水解蛋殼膜膠原蛋白之水解液外觀 ... 56
圖3-2 胃蛋白酶及胰蛋白酶水解蛋黃之水解液外觀 ... 62
圖3-3 水解期間胃蛋白酶水解蛋殼膜膠原蛋白之胜肽含量變化 ... 65
圖3-4 水解期間胃蛋白酶及胰蛋白酶水解蛋黃粉之胜肽含量變化 ... 66 圖3-5 以細胞增生試驗觀察不同濃度經胃蛋白酶水解 6 小時及 8 小時之蛋殼膜膠
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原蛋白與MG-63 細胞反應 24 小時對細胞增生之影響 ... 68 圖3-6 以細胞增生試驗觀察不同濃度經胃蛋白酶水解 6 小時及 8 小時之蛋黃粉與 MG-63 細胞反應 24 小時對細胞增生之影響 ... 69 圖3-7 以細胞增生試驗觀察不同濃度經胰蛋白酶水解 6 小時及 8 小時之蛋黃粉與 MG-63 細胞反應 24 小時對細胞增生之影響 ... 70 圖3-8 以細胞增生試驗觀察不同濃度經胃蛋酶水解 6 小時及 8 小時之蛋殼膜膠原 蛋白與MG-63 細胞反應 48 小時對細胞增生之影響 ... 72 圖 3-9 以細胞增生試驗觀察不同濃度經胃蛋酶水解 6 小時及 8 小時之蛋黃粉與 MG-63 細胞反應 48 小時對細胞增生之影響 ... 73 圖3-10 以細胞增生試驗觀察不同濃度經胰蛋酶水解 6 小時及 8 小時之蛋黃粉與 MG-63 細胞反應 48 小時對細胞增生之影響 ... 74 圖 3-11 以染色方式觀察添加不同處理組水解液反應 24 小時候對 MG-63 細胞生 長之影響 ... 76 圖3-12 以染色方式觀察添加不同處理組水解液反應 48 小時候對 MG-63 細胞生 長之影響 ... 77 圖3-13 鹼性磷酸酶活性觀察低濃度時之經胃蛋白酶水解 6 小時及 8 小時之蛋殼 膜膠原蛋白對MG-63 細胞分化之影響 ... 80 圖3-14 鹼性磷酸酶活性觀察低濃度時之經胃蛋白酶水解 6 小時及 8 小時之蛋殼 膜膠原蛋白添加0.1% 蛋殼粉之處理組對 MG-63 細胞分化之影響 ... 81 圖3-15 鹼性磷酸酶活性觀察低濃度時之經胰蛋白酶水解 6 小時及 8 小時之蛋黃 粉對MG-63 細胞分化之影響 ... 82 圖3-16 鹼性磷酸酶活性觀察低濃度時之經胰蛋白酶水解 6 小時及 8 小時之蛋黃 粉添加0.1% 蛋殼粉之處理組對 MG-63 細胞分化之影響 ... 83 圖3-17 添加不同處理組之蛋殼粉與 MG-63 共培養觀察其骨礦化結點之影響 . 85 圖3-18 不同劑量之水解液及蛋殼粉與 MG-63 類骨母細胞共培養觀察其茜素紅染 色之影響 ... 87
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圖3-19 不同劑量之水解液及蛋殼粉與 MG-63 類骨母細胞共培養，於茜素紅染色 下觀察骨礦化結節之形成 ... 88
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中文摘要
全世界之液蛋廠、餐廳及蛋品加工廠，每年會產生六百五十五萬噸之廢棄蛋 殼，目前廢棄蛋殼之應用，主要以作為廢棄垃圾丟棄或加入鳥禽類飼料中，添加 其鈣質營養量，其利用性值得深入探討 (Suguro et al., 2000)。最早於 1962，Baker 及Balch 發現將蛋殼溶於酸性溶液中，其粗萃取物中發現含有大量羥脯胺酸，最 後鑑定確定為第I 及 V 型膠原蛋白。而目前已有相關研究指出利用不同來源之膠 原蛋白 (牛皮、雞、魚與豬) 進行水解後，進行骨質疏鬆相關之細胞與動物實驗，
結果發現不論在細胞或動物實驗方面，與控制組相比皆有正面之效果。
骨質疏鬆症 (Osteoporosis) 為一種常見的全身性骨骼代謝異常的疾病，主要 是因為在骨骼的代謝過程中骨形成作用與骨吸收作用之間不平衡所導致，使骨密 度減少進而造成骨質中鈣質的流失，導致骨骼支撐力降低，所以骨骼容易碎裂 (Fanny et al., 2010)。
本篇研究主要探討蛋殼粉、蛋殼膜膠原蛋白水解液以及蛋黃水解液在骨母細
胞上之影響，實驗材料主要利用蛋殼膜萃取膠原蛋白，而後利用1%之胃蛋白酶
進行酵素水解 ; 蛋黃粉部分則利用胃蛋白酶及胰蛋白酶兩種酵素進行水解試驗，
兩者試驗皆於37℃下，水解時間 0-10 小時。再將此三種不同水解液進行胜肽含 量測試。選出最佳胜肽含量後，額外添加類骨母細胞 (MG-63) 中進行共培養。
而後進行細胞增生試驗、鹼性磷酸酶活性測試、骨礦化節點分析等功能評估。
實驗結果顯示，添加於 MG-63 類骨母細胞進行培養後，其中以經胰蛋白酶 水解6 小時之蛋黃水解液以及經胃蛋白酶水解 8 小時之蛋殼膜膠原蛋白水解液不 論在細胞增生與鹼性磷酸酶活性都有顯著差異。而在細胞增生之結果顯示，當水 解液濃度高於200 μg/mL 時，對於 MG-63 之增生有抑制之效果。因此，不論蛋 殼膜膠原蛋白水解液或蛋黃水解液與 MG-63 細胞進行培養時，若要有效刺激類 骨母細胞生長，其濃度在0-100 μg/mL 與控制組相比有顯著之效果。本實驗結果 也證實經胃蛋白酶水解8 小時之蛋殼膜膠原蛋白水解液與經胰蛋白酶水解 6 小時
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之蛋黃水解液在鹼性磷酸酶試驗與控制組相比有顯著之效果，其又以額外添加 0.1%蛋殼粉效果更為顯著。而在茜紅素染色試驗方面，同時添加經胃蛋白酶水解 8 小時之蛋殼膜膠原蛋白水解液與經胰蛋白酶水解 6 小時與 0.1%蛋殼粉之處理組 時，與控制組相比其礦化效果更為顯著。因此我們可以知道就述實驗條件下，會 增加骨細胞中之鹼性磷酸酶活性與骨礦化效果，進而促進類骨母細胞之生長。
綜合上述，膠原蛋白水解液對刺激類骨母細胞其生長確實有一定的效果，未 來在骨骼發展及預防骨質疏鬆上深具潛力。
iii
Abstract
Eggshell is a major byproduct of liquid egg industry and consists of collagen I, V and X in its membrane. Some studies suggest that hydrolyzed collagen-enriched diet improves bone collagen metabolism and BMD (bone mineral density). Using osteoblast-like MG-63 cells as a model system capable of partial osteoblastic differentiation, the effect of purified collagen on growth and morphological change were examined. The objective of this study was to investigate the effect of eggshell powder, collagen hydrolysate and egg yolk hydrolysate on bone cell function. The samples were prepared by hydrolyzing eggshell membrane collagen and egg yolk using pepsin and trypsin, at 37℃ for 1 to 10 hours. The hydrolysates of eggshell membrane collagen, egg yolk and eggshell powder were co-incubated with MG-63 cells then evaluated by the assays of proliferation, osteoblast differentiation and matrix mineralization using MTT (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide), alkaline phosphatase (ALP) activity and alizarin red staining, respectively. The results obtained from MG-63 cells in vitro test demonstrated that the egg yolk hydrolyzed by trypsin for 6 hours (ET6) and the collagen hydrolyzed by pepsin for 8 hours (CP8) were able to stimulate cell growth and ALP activity. The results of MTT assay indicated that the growth of MG-63 was inhibited by the samples at concentration higher than 200 μg/ml. In contrast, the proliferation of MG-63 was only stimulated at low concentration (0-100 μg/ ml) of hydrolyzed egg yolk and collagen. The result also demonstrated that the CP8 and ET6 revealed a highest ALP activity, especially the hydrolysates of collagen and egg yolk to added 0.1% eggshell powder. Furthermore, the alizarin red staining indicated that the mineralization was slightly enhanced when stimulated by the sample prepared by incorporating ET6 within CP8 and eggshell powder. It is concluded that the ET6、CP8
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and 0.1% of eggshell powder can increase significantly osteoblast activity, which acts on bone remodeling.
Key Words: Osteoblast, Eggshell Membranes, Collagen Hydrolysate, Egg Yolk Hydrolysate, Eggshell Powder
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壹、緒論
就台灣而言，每年約有兩億六千萬的雞隻生產約一億六千萬顆雞蛋 ; 由於 餐廳、液蛋工廠與滷蛋加工廠之關係，全世界每年則會產生六百五十五萬噸之廢 棄蛋殼，就目前此大量廢棄蛋殼之處理，除了丟棄外，還會把廢棄蛋殼加入鳥禽 類飼料中，增加其鈣質攝取量 ; 或者做為樹植物之堆肥，增加其營養。但大量 之廢棄蛋殼普遍餐廳與工廠其處理，主要以花錢處理丟棄。因此此些大量廢棄蛋 殼不只會造成環境之汙染，因蛋殼容易腐敗與腐壞，造成異味、蟲害孳生及垃圾 問題。此外也會造成餐廳及工廠之成本增加，因此希望能有效之利用此廢棄蛋殼，
增加其經濟效益成本，其利用性很值得深入探討。骨質疏鬆 (osteoporosis) 是一 種因骨質量減少或骨密度降低而使骨骼微細結構發生破壞的疾病，導致骨骼脆弱，
使骨折的危險性明顯增高。根據台灣地區流行病統計調查結果發現：65 歲以上 之台灣城市婦女，19.8％以上之脊椎體壓迫性骨折；男性則為 12.5％。而停經後
婦女骨質疏鬆症的盛行率更高達 30％。由以上數據得知骨質疏鬆對台灣國民健
康之危害。有關骨質疏鬆症與膠原蛋白間之關聯性始終具爭議性，但 Shuster (2005) 提出女性老化過程中，皮膚與骨骼之膠原蛋白每年約流失 1％，並造成骨 密度降低，且可能是骨質疏鬆症之直接原因。
由於目前醫學界還未有安全而有效方法來治療骨質疏鬆，因此，預防保健非 常重要 (Wade et al., 2001)。目前，在臨床治療骨質疏鬆上仍以藥物治療為主。
如雙磷酸鹽類 (Bisphosphonates)、抑鈣素 (Calcitonin ; CT)、副甲狀腺激素 (Parathyroid hormone ; PTH)、雌激素 (Estrogen)、活性型維生素 D (1α,25(OH)2D3)、
維生素K (Vitamin K)、氟化鈉 (Sodium fluoride ; NaF)等，皆是臨床上用來治療 骨質流失及骨質疏鬆之藥物 (Stuart et al., 1997)。然而藥物治療無可避免會產生 副作用。例如 : 投與抑鈣素後，注射部位會有疼痛感及噁心、心悸等症狀，而 雌激素除了對骨骼作用外會造成不正常性出血、噁心、嘔吐，甚至併發子宮內膜 癌及乳癌等副作用(Barrett et al., 1996 ; Birt et al., 2001)，卻可減少心血管疾病之
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死亡率及改善更年期症狀 (Potter et al., 1998) ; 雙磷酸鹽類則具有很強之骨吸收 抑制作用但仍會有噁心、嘔吐及下痢等副作用 (Stuart et al., 1997)。
因此本實驗主要探討自蛋殼膜中製備膠原蛋白，並將不同濃度之蛋殼膠原蛋 白水解液、蛋黃水解液及蛋殼粉水解液培養於類骨母細胞 (osteoblast)，並觀察 其對類骨母細胞 (MG-63) 之增生曲線、鹼性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 活性與礦物化反應 (minerialization) 等成骨作用參數之影響。藉此實驗之結果將 可充分利用廢棄蛋殼，並瞭解蛋殼鈣粉及蛋殼膜膠原蛋白水解物是否能刺激體外 成骨作用，開發減緩骨質流失並預防骨質疏鬆症之食品。
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貳、文獻檢討 一、蛋殼
通常禽蛋可大略分為蛋殼、蛋白及蛋黃等三部分，而所占比例以雞蛋為例蛋 殼約為10-12%、蛋白 55-63%以及蛋黃 26-33% (George, J. M. and R. P. Carmen, 1984)。雞蛋之構造如圖 1-1 所示，從蛋的外殼來看，由外而內，為蛋殼、外及內 蛋殼膜、蛋白、中央則為蛋黃。蛋殼上有許多細孔，一般稱之為氣孔或呼吸孔 (pore)。
且蛋之胚經由此細孔來呼吸，而蛋內產生之二氧化碳亦由此排出 (張，1999)。通 常蛋殼部的厚度為 250-370 µm，且蛋殼的厚度會隨著季節及雞隻營養而異 (張，
1999)。
如圖1-2 所示為蛋殼之構造，由海綿狀層 (spongy layer) (有機物的海綿狀間質 (matrix) 中為無機物) 以及乳頭層 (mammillary layer) (其由乳頭節 (mammillary knob) 及乳頭核 (mammillary core) 所構成) (張，1999)。而蛋殼主要成分為無機物 (inorganic matter) 約 95%，而其他組成成分，如碳酸鈣約 98.4%、碳酸鎂 0.8%、
磷酸鈣 0.7%，如表 1-1 所示。蛋殼除無機物外，含 2-3%蛋白質，其他則為水分 ; 然而蛋殼之有機物除了蛋白質以外還有多醣類 (張，1999)。
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圖1-1 雞蛋之構造。 (張，1999) Figure 1-1 The structure of hen egg.
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(張，1999) 圖1-2 蛋殼之構造。
Figure 1-2 The structure of eggshell.
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表1-1 雞蛋蛋殼之一般組成
Table 1-1 The general composition of eggshell.
成分 組成 (%)
水分 1.6
有機物 3.3
蛋白質 3.3
脂質 0.03
無機物 95.1 (張，1999)
表 1-2 雞蛋蛋殼各部分之有機物組成
Table 1-2 Organic chemical composition of each constituent layer of the eggshells hen.
成分 全有機物中之百分率 (%)
蛋殼 蛋殼膜 角皮層
全氮 15.01 15.54 15.94
己醣胺 (hexosamine) 態氮 0.46 0.11 0.24
其他氮 14.55 15.43 15.7
中性醣 (以半乳糖計) 3.57 1.97 2.87
醣醛酸 1.45 0 0
酯類 1.1 微量 0
己醣胺 5.83 1.45 3.06
(張，1999)
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二、蛋殼膜
蛋殼膜分為兩層:蛋殼內膜與蛋殼外膜二層，即外殼膜 (outer shell membrane) 與內殼膜 (inner shell membrane)，內殼膜包圍蛋白，而外殼膜與蛋殼密黏合著。蛋 殼內外膜合起來之厚度一般為50-70 µm。通常蛋殼薄者其蛋殼膜較厚，以保護蛋 白內容物。內外蛋殼膜皆在峽部形成。當卵進入峽部內，蛋殼膜即形成。而外蛋 殼膜之形成則是因卵在峽部停留期間會復於內蛋殼膜上。且內外蛋殼膜皆由峽部 所分泌之網狀角質蛋白質 (keratin) 組成 (林，2000)。
外蛋殼膜係由蛋殼之乳頭節崁入且與乳頭核相接，其外殼膜厚度約50 µm，內 殼膜則約為 20-22µm。而內殼膜構成纖維與外殼膜相似，係由三層重疊而成。且 纖維間隙存在著薄葉層 (lammeller) ，使其具有彈性且相互以纖維連接。其由蛋殼 之乳頭節崁入而與乳頭核相接。而內殼膜厚度則約為20-22 µm，其構成纖維與外 殼膜相似，皆由三層重疊而成，且纖維間隙存在薄葉層 (lammeller)，以使纖維相 互連接以呈具有彈性之構造，內殼膜之電子顯微鏡像如圖1-3 所示。蛋殼膜主要成 分為蛋白質，約含 20%水分，70%蛋白質以及 10%灰分，而蛋殼膜之蛋白質主要 成分又為角質素 (keratin) 。蛋殼膜、角皮層以及蛋殼其三者之蛋白質，又以蛋殼 膜中所含胺基酸較多，其為組胺酸 (histidine)、胱胺酸 (cystine)、脯胺酸 (proline) 等。
最早由Baker and Balch (1962) 於實驗中發現，將雞蛋殼膜利用酸性溶液進行 萃 取 ， 其 粗 萃 取 物 中 發 現 含 有 大 量 羥 脯 胺 酸 (hydroxylysine) 、 羥 基 離 胺 酸 (hydroxylysine) 以及鎖鏈素 (desmosine)，其中鎖鏈素是一種特殊之胺基酸，為離 胺酸之衍生物，只存在於纖維蛋白質-彈性蛋白質 (elastin)中。因此 Baker and Balch (1962) 推測其蛋殼膜中之蛋白質可能含有類膠原蛋白 (collagen-like) 或類彈力蛋 白 (elastin-like) 之存在。而 Haris 等人, (1980) 亦以酸性溶液萃取蛋殼膜，同樣在 萃取物中含有大量羥基脯胺酸、羥基離胺酸、鎖鏈素及一些離胺酸之殘基。
Wong 等人於 1984 年，利用醋酸溶液溶解蛋殼膜，並額外添加胃蛋白酶
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(pepsin) 切斷膠原蛋白之間之交叉鍵結，藉此提高萃取出膠原蛋白之溶解度且經電 泳分析後，於萃取物中發現第一型及第五型膠原蛋白之存在。
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(Nesheim et al., 1979) 圖1-3 內殼膜之電子顯微鏡圖。
Figure 1-3 The electron microscopy of eggshell membrane.
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三、蛋黃
卵黃可區別為深色卵黃、淺色卵黃，如表 1- 3 所示。但於加工時並不將此二 者分開處理。又欲檢討卵黃組成或其性狀時，往往以此兩者混合物為實驗。蛋黃 約含有50%固形物，而蛋白質、 脂質、無機成分、碳水化合物各為 16、32、2 及 1% ; 其主要又為脂質與蛋白質，卵黃中蛋白質之大部分為磷蛋白質，其組成概括 於表 1-4。其脂質與蛋白質之比例約為 2:1。脂質主要為三酸甘油酯、磷脂質以及 膽固醇，其比例如表1-5。新鮮蛋黃之 pH 約為 6.0，蛋黃有較多之蛋白質、灰分，
而尤以脂肪含量特別多。蛋黃含有約50%之固形物，其組成如圖 1-4。卵黃之成分 組成，亦如前述，依種種條件而變化。一般而言，卵黃之成分組成變異較卵白為 小。但卵黃一般比卵白容易腐敗、變質，此乃成分中含有不安定之脂質及脂蛋白 質之緣故 (林，2000)。
Kim 等人則於 2011 年，將蛋黃進行水解成可溶性蛋黃胜肽 (egg yolk water-soluble peptide) ，簡稱 YPEP。而後將可溶性蛋黃胜肽稀釋成 250-1000 µg/mL 與MC3T3-E1 細胞進行培養，觀察對細胞生長之影響 ; 實驗以測定細胞增殖以及 鹼性磷酸酶活性試驗來進行觀察。當骨母細胞逐漸成熟分化時，則會分泌鹼性磷 酸酶，因此可利用其活性高低來判定其骨母細胞之生長。
結果發現在細胞增殖及鹼性磷酸酶活性實驗方面，濃度250-1000 µg/mL 與對照組
相比，皆隨著濃度的增加而有更佳的效果。其中就細胞增殖實驗，又以濃度 500
及1000 µg/mL 與對照組相比，有顯著之差異 ; 而在鹼性磷酸酶活性試驗部分，則 以濃度1000 µg/mL 與對照組相比較有顯著之差異。因此我們可以知道，蛋黃經由 水解後，在適當的濃度下與類骨母型細胞進行培養，會刺激其細胞之增殖及生長。
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表1-3 深色及淺色卵黃之成分組成
Table 1-3 The composition of light and dark egg yolk
種類
淺色卵黃 深色卵黃
水分 (%) 86.0 45.4 粗蛋白質 (%) 4.6 15.0 脂質 (%) 3.50 36.40
(林，2000)
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表1-4 卵黃蛋白質之組成
Table 1-4 The composition of egg yolk protein
項目 組成 (%) 分子量
(1,000)
lipovitellenin 30-31 340 lipovitellin 43-44 320
livetin 10
α : 42 β : 80 γ : 15-22
phosvitin 14-15 21-33
(林，2000)
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表1-5 蛋黃脂質之組成
Table1-5 The compositions of yolk lipid
脂質 (%) 磷脂質 (%)
膽固醇酯 6 磷醯膽鹼 69
三酸甘油酯 71 神經磷脂 3
磷脂質 23 磷醯乙醇胺 24
(張，1999)
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(林，2000) 圖1-4 蛋黃成分之概要圖。
Figure 1-4 The schematic diagram of egg yolk composition.
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四、膠原蛋白簡介
膠原蛋白之簡介膠原蛋白在人體與脊椎動物中，扮演重要角色亦是不可或缺 的蛋白質，其分布於肌膚、肌肉及各類器官中。約佔人體總蛋白質含量的 25~33
％，相當於人體重量的 6%。其為結締組織重要的蛋白質外，在動物結締組織
(Connective Tissue) 中亦為最主要之構造性纖維蛋白質。就人體及脊椎動物方面，
主要功能為維持皮膚和組織器官的型態及結構，扮演整體支架的功能，用來提供 組織張力藉以保護並連結各種組織，也是修復各種損傷組織的重要原料物質 (Angele et al., 2004)。
此 外 ， 膠 原 蛋 白 屬 於 蛋 白 質 類 的 生 物 性 高 分 子 聚 合 物 ， 又 稱 作 膠 原 質 (Collagen)，主要以不溶性纖維蛋白存在，由於此種特殊特性因此有許多生化功能，
包括參與凝血反應、促進傷口癒合和組織修復、調控細胞與組織的生理功能(Lee, Singla and Lee, 2001)。
膠原蛋白種類至少有27 種，如表 1-6 所示。其結構由許多膠原纖維糾結纏繞 而成，分子量為283 kDa (283,000 daltons)。其最基本的單位為膠原分子，是由三 條多胜肽鏈 (polypeptides) 所組成 (圖 1-5)，此三條多胜肽鏈彼此平行，並且鏈與 鏈 之 間 以 氫 鏈 緊 密 的 結 合 在 一 起 ， 形 成 穩 定 的 三 股 螺 旋 結 構 (triple-helical structure)。由多個三股螺旋形成膠原蛋白分子，膠原蛋白分子在形成束形的膠原蛋 白微纖維，在形成纖維束 (Werkmeister and Ramshaw, 2000)。並藉由分子內氫鏈形 成左旋的α-螺旋 (α-helix)，又稱為 α 鏈 (α-chains)。而每條 α 鏈又由重複的胺基酸 單元 (Glycine-X-Y) 所構成，其中 X、Y 代表任何的胺基酸，但 X 通常代表脯胺 酸 (proline)，Y 通常代表羥脯胺酸 (hydroxyproline) 如圖 1-6 所示。第 I、II、III、
V 以及 IX 型膠原蛋白，會自我排組 (selfassemble) 成有週期性 (periodic) 的交纏 纖維 (cross-striated fibrils)。
不同種類型的膠原蛋白來源與強度皆有差異。第一型之膠原蛋白含量最豐富，
存在於多種結締組織中，其他膠原蛋白則呈組織特異性分佈 (圖 1-8)。
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(Karl et al., 1996) 圖 1-5 膠原蛋白之參股螺旋結構。
Figure 1-5 The triple helix structure of collagen.
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(Karl et al., 1996) 圖 1-6 膠原蛋白之特殊胺基酸序列示意圖。
Figure 1-6 The amino acid sequence of collagen.
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(Karl et al., 1996) 圖1-7 膠原蛋白單體之產生與交互連結。
Figure 1-7 Product of monomer and cross-link of collagen.
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(Deyl and Mikšík, 2000) 圖1-8 膠原蛋白型態分類。
Figure 1-8 The pattern classification of collagen.
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表1-6 膠原蛋白類型之組成及其在組織中之分佈
Table 1-6 The composition and distribution of collagen type in the organization
形式 各單鍵分子量 組織分布
I ≒100 kDa 皮膚、骨骼、血管等多數結締組織
H-trimer ≒100 kDa 細胞培養、腫瘤
III ≒100 kDa 軟骨
IV ≒100 kDa 血管、皮膚、肉芽組織
V ≒175、185 kDa 細胞基底膜
VI 透明軟骨外之大部分細胞周圍組織
VII 子宮、胎盤與皮膚
VIII 表皮細胞基底膜
IX ≒180 kDa 主動脈血管細胞、角膜內細胞
X ≒69、85 kDa 軟骨、眼後房水
XI ≒59 kDa 肥厚組織、軟骨
XII 皮膚、筋、軟骨
XIII 表面組織、小腸黏膜
XIV 軟骨、皮膚、筋、胎盤
XV 纖維母細胞
XVI 立方羊膜表皮之下
XVII 大水疱性類疱瘡
(洪，2004)
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(一)、 分布及來源
膠原蛋白主要是提供組織張力，連結以及保護各種組織，支撐人體的結構 (Guillerminet et al., 2010)，存在於動物細胞以及各類組織中。同時，膠原蛋白是細 胞外基質最重要的成分。人體膠原蛋白和動物膠原蛋白結構類似，因此可藉由生 化科技的處理，可從牛、豬、魚等取得膠原蛋白。膠原蛋白依照溶解性又可分為 原肽膠原蛋白 (procollagen) 、酸溶性膠原蛋白 (ASC) 、水溶性膠原蛋白 (PSC) 與變性後之膠原蛋白 (亦稱明膠)。原肽膠原蛋白、酸溶性膠原蛋白與水溶性膠原 蛋白主要應用在醫療用生醫材料方面，如人工皮膚、止血劑、人工血管、以及護 膚化妝品等，因此價位較高。而明膠不具三股螺旋結構，製造較為簡易，是一種 由真皮或其他組織以酸、鹼、熱或酵素水解後的產物，分子量小，價位較低。
(二)、 應用
膠原蛋白具有非抗原性、生物降解性、生物相容性、生物吸收性、不具毒性、
與生物活性物質協同作用、止血、可轉化成不同形式、生物降解的可調性等優異 的特性，使其在醫學上可廣為應用，且效果非常好，其中最主要的應用領域是生 醫材料。以膠原蛋白作為傷口的敷料，可使血液凝固，具有止血功能，未來在此 一方面的開發潛力無限。
這種傷口敷料，主要是基於膠原蛋白能夠與傷口緊密結合，併入新生組織當 中，並作為細胞生長時的基質。研究顯示，膠原蛋白創傷覆蓋材，對傷口的治療 具有下列優點:傷口較清潔、減緩細菌感染現象、減少傷口流膿、增加肉芽組織的 形成、癒合的傷口不會產生收縮、協助壓力褥瘡傷口的癒合，不致產生免疫反應 (洪，
2004)。
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(三)、 對人體之功能
1. 使皮膚具保護、適當彈性
表皮的基底膜與真皮中的膠原蛋白緊密結合，而膠原蛋白在真皮中緊緊包住 毛根皮脂腺及細胞，使基底膜得以與真皮緊密結合。皮膚老化後會失去彈性，主 要也與膠原蛋白有關，隨年紀增加，膠原蛋白纖維開始變得細小，伴隨膠原蛋白 存在的彈性蛋白之彈性也會減低，使原先真皮中膠原蛋白與彈性蛋白交互構成有 規則的網目結構逐漸崩解，導致含水量減少及皺紋生成。坊間含膠原蛋白之保養 品宣稱補充膠原蛋白能使皮膚保持年輕，道理即在於此。
2. 骨骼堅硬具彈性，不致疏鬆脆弱
膠原蛋白能使鈣質與骨細胞結合不致流失，所以骨骼中膠原蛋白流失時會使
骨中含鈣量降低。骨骼中膠原蛋白含量約占 20%，因為含有膠原蛋白，所以骨骼
與牙齒在堅硬中同時還帶有彈性。
骨骼與肌肉能夠互相連接也是靠膠原蛋白，而此處的膠原蛋白特稱之為肌腱。
骨與骨相連接部分，如膝蓋、關節等軟骨組織主要成分也是膠原蛋白，使得運動 時筋骨可保持柔軟而具彈性。
3. 使眼睛透光，眼角膜保持透明
眼角膜是眼睛重要結構之一，其中所含膠原蛋白纖維呈現規則排列，此種結 構不但可讓光線透過，也因為此種膠原蛋白纖維特殊的排列方式，眼角膜呈現透 明。
4. 於肌肉細胞連結並具彈性與光澤
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肌肉主要使由肌凝蛋白與肌動蛋白所構成，而細胞與細胞之間是利用膠原蛋 白進行黏合。膠原蛋白分子所形成的立體骨架可使身體保持良好姿勢，並呈現適 當柔軟度。
5. 保護及強化內臟功能
人體主要的內臟器官及組織都含有膠原蛋白，在這些臟器表皮結構下方即是 膠原蛋白，最大功能在於保護及強化臟器，例如胃或腸。
6. 生物科技上應用與潛力
由於膠原蛋白具有下列特殊性質，因此能發揮多種生物功能，包括：
(1) 組織與架構 (2) 支持與保護
(3) 生物力學特性-強韌性及延展性 (4) 控制分子通透性
(5) 促進傷口癒合與組織修復 (6) 調節細胞與組織的生物功能
膠原蛋白生物高分子化合物目前用途很廣泛，遍及醫藥、化工、食品等相關 領域。產品有各種不同形狀及用途，並依其形狀配合各項用途。其中生醫材料與 藥品方面的應用則是近年來熱門研究的課題。
生醫材料廣泛的應用於所有醫療器材中，像注射針筒、血袋、引流插管及植 入體 (implant)、人工臟器等。生醫材料必備的特性有:
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(1) 具生體機能 (2) 無毒性
(3) 可殺菌消毒性 (4) 機械學性質 (5) 生體不排斥性
但依使用目的，各種特性的重要性有很大的不同。其中膠原蛋白由於具有下 列作為生醫材料之優點，所以成為研究與關注的焦點：
(1) 止血 (2) 低免疫性
(3) 優良生體適合性 (4) 適度分解速率 (5) 供給修復原料
(6) 調控生長因子與藥物釋放
膠原蛋白產品除了生醫相關之產品，也可作為化工材料、化妝品用途、食品工業 及研究用途等。
五、骨質疏鬆症
(一)、 骨質疏鬆症簡介
骨質疏鬆症 (osteoporosis) 為一種常見的全身性骨骼代謝異常的疾病，主要是 因為在骨骼的代謝過程中骨形成作用與骨吸收作用之間不平衡所導致，使得骨質 密度減少，組織型態參數降低，骨組織惡化和骨質中鈣質的流失 (姚跟吳，1994)，
骨質結構因而佈滿了孔隙，骨小樑變單薄，呈現中空疏鬆的現象。若嚴重至某種 程度時，骨小樑縮小且骨板變薄，骨骼的支撐力降低，所以骨骼容易碎裂，因此
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很容易發生骨折 (張，1998)，且未來屢換碎裂性骨折的機會將大大地增加。所以，
罹患骨質疏鬆症不但容易造成骨折，更會引起各種併發症，危害人類的生命健康，
且目前無法經由 X 光來做早期診斷以即早治療。隨著世界人口老化的增加，未來
骨質疏鬆症將更為普遍，骨質疏鬆症所導致的骨折最常見的部位是肩部、脊椎、
髖部及腕部，其中約有1/5 的患者會在一年內死亡，而存活者其骨折後恢復情形往 往不良，造成需長期臥床調養，形成病人與家人的沈重負擔 (林，1995 ; 林，1994 ; 林，1993)。
骨骼是一種活組織，會持續不斷的改變，主要是透過造骨細胞之骨質生 成作用與蝕骨細胞之骨質再吸收作用的骨質再塑 (bone remodeling) 機制以維持骨 質代謝之恆定。骨骼中由膠質所構成的網狀組織，以及分佈其中的骨隨、血管與 細胞，也會不斷地更新。人體在二十至三十歲時，骨質密度會達到高峰，但之後 會卻逐漸流失 (Tortora, 1999)。而且隨著年齡的增長，骨質流失的速度也越來越快。
骨骼的空隙越來越大，因此骨骼也會越來越脆弱 (Mundy, 1999)。
骨基質 (bone matrix) 與骨鹽 (bone mineral) 是骨最主要的兩種構成成分，兩 者在骨中具有一定的比例。當兩者之比例不變但量同時減少時，即為廣義之骨質 疏鬆症 (osteoporosis) 或骨質流失 (osteopenia) (Mundy, 1999)。
1993 年 Osteoporosis Consensus Development Conference 研討會將骨質疏鬆症 定義為一系統性之骨骼疾病，其特徵為骨密度降低及骨組織之顯微退化，增加了 骨質脆弱性及骨折之機會。1994 年世界衛生組織 (WTO) 的學者專家依骨密度及 骨折情形，對於骨質粗鬆症診斷標準訂定為：體內任何一處骨骼之骨密度 (bone mineral density, BMD) 與正常年輕婦女之骨密度 (即顛峰骨質密度) 參考值相比。
女性在30-35 歲時其骨量會達到峰值，此後每年以 0.2-0.5％的速度流失。停經 後骨量更加速地流失，每年約2%-3%，持續 10-15 年。世界衛生組織 (WTO)對於 骨質疏鬆症的分級方式 (Cameron et al., 1963 ; Takahashi et al., 1993 ; Huiying et al., 1998) 如表 1-7：
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1. 正常骨密度 (normal)：與正常年輕人平均值相比在 1 個標準差 (Standard Deviation, SD) 之內。
2. 骨質減少症 (low bone mass or osteopenia)：低於正常年輕人平均值 1 個標準差，
但不超過2.5 個標準差，即骨量不足 (osteopenia)。
3. 骨質疏鬆症 (osteoporosis)：低於正常年輕人平均值 2.5 個標準差，但不一定發 生過骨折。
4. 嚴重骨質疏鬆症：有過骨質疏鬆症且合併一個部位以上之骨折，或稱為確定性 骨質疏鬆症 (established osteoporosis)。
表1-7 世界衛生組織 (WTO)對於骨質疏鬆症的分級方式
Table 1-7 World Health Organization (WTO) for the classification of osteoporosis Definition Category QUI/ Stiffness
T-score Within ISD of the young adult
reference mean
Normal T >-1.0
More than ISD below young adult mean, but less than 2.5
SD below this value
Low Bone Mass (Osteopenia)
-1.0 > T > -2.5
2.5 SD or more below the young adult mean
Osteoporosis T < -2.5
More than 2.5 SD below young adult mean in the presence of one or more
fragility fractures
Severe Osteoporosis
(established osteoporosis)
T < -2.5
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骨折在骨質減少 (steopenia, low bone desity) 之臨床上為常見而嚴重之併發症，
相似於高血壓與中風，高血脂症與心肌梗塞。骨質疏鬆本身雖非引起骨折唯一及 必須因子，但無可否認扮演著十分重要之角色，而且其可以預防及治療的。臨床 上引起骨折之原因，除了骨質低以外，尚加上創傷 (trauma) 才行。創傷之力量必 須大於骨質之強度才會引起骨折，而骨骼之強度又與骨質密度有關。因此，較低 之骨質密度在正常骨骼壓力下也可能出現骨折。但人體對跌倒創傷之保護作用也 扮演相當重要之角色，例如老人家反應差，加上因老化導致男性激素之減少而使 肌肉萎縮及失去協調力，加上視力不良及可能服用影響判斷及反應力之藥物，一 旦跌倒，骨骼所受之壓力極大，因此，老年人較易發生骨折。骨質之密度高低，
也是造成骨折之重要因素。
1987 年，Nordin 提出「骨折閥值」(Fracture threshold) 之觀念：骨質如果在正 常年輕成人之平均值兩個標準差以下，則甚易產生骨折。1982 年 Riggs 亦發現如 果骨質在閥值以上，骨質不易發生，1989 年 Huiying 提出如果骨質下降一個標準
差，則其骨折之危險度上升 2 倍，由此可見骨質密度對骨折之影響甚鉅。而骨質
密度是由兩個因素來決定：第一個為尖峰骨質 (peak bone mass) 之高低，另一個 則是其骨質流失速度之快慢。人類骨骼密度隨著生長發育而增加，其尖峰約在 20-35 歲間並且受到遺傳基因之控制，因此有骨質疏鬆症之家族史者，也比正常人 較易罹患骨質疏鬆症。此外如前所述，適度之負重運動，在骨骼之生長期是骨質 增加之重要因素。其他如營養狀況，包括足夠之鈣質及養份，在骨骼之成長期中 也扮演重要之角色，在骨骼重塑作用 (bone remodeling) 中之任何過程中如果受到 干擾，將使骨吸收作用 (bone resorption) 大於骨形成作用 (bone formation) 而產生 骨質流失。骨質流失之速率男女有異。由於老化使造骨細胞之功能下降，故骨質 將因老化而每年下降0.75%。這在男女並無差別，此種因老化而減少之骨質速度慢，
稱為slow loss ; 但在女性方面，一旦缺乏女性雌激素 (例如自然停經、早發性停經、
手術切除卵巢、過量運動或嚴重壓力下所致之無月經症、神經性厭食症及高泌乳
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激素症等) 均會使蝕骨細胞 (osteoclasts) 之活性大增進而增加骨吸收作用之深度，
使骨小樑加速破孔並斷裂，斷裂後骨小樑更不易產生新生骨，故小樑之間分隔越 遠，連結力越差，更不易承受壓力而產生骨折。這種缺乏雌激素所導致的骨質流 失，速率甚快，每年約3-6%甚至更高，稱為 rapid bone loss。近年來發現蝕骨細胞 與造骨細胞 (osteoblasts) 均含有雌激素之接受器 E2，除了促進蝕骨細胞之活性外，
尚可影響造骨細胞或其他單核細胞內細胞激素 (cytokines) 之分泌，例如使 TGF-β 上升，IL-1、IL-6 及 PGE2下降。TGF-β 可抑制蝕骨細胞之召集及分化，而 IL-1、
IL-6 及 PGE2則促進其作用活性。此外，E2尚能促進副甲狀腺素 (PTH) 及骨鈣蛋 白質 (osteocalcin) 之活性，故其對骨質密度之影響是相當複雜的，而其機制是為 防止骨質之快速流失。
(二)、 骨質疏鬆症之成因
目前骨質疏鬆症之病因尚未確立，推測與下列幾點有關:
1. 骨母細胞其功能減退
一旦骨骼中之舊組織代謝掉，就會長出新的，如此反覆的新陳代謝。隨著年 齡之增加，約在二十五歲，其骨頭之代謝開始產生變化，此時骨母細胞之活動降 低，而蝕骨細胞之活動增加，導致舊骨質依舊代謝，然而新骨質之生長機能卻開 始降低，於是兩者間無法平衡，骨骼質量降低因而造成骨質疏鬆。
2. 鈣吸收不良
維生素 D 為人體吸收鈣質之重要媒介，控制消化道對鈣之吸收，隨著年紀增
長，腎機能逐漸衰退，使維生素D 活化能力變差，進而降低小腸對鈣之吸收 (Henry, 1995)。
3. 賀爾蒙之變化
因生理代償現象如維生素 D 代謝不良，而使鈣易吸收不良，進而造成副甲狀
腺機能亢進欲增加消化道對鈣之吸收，但副甲狀腺素 (PTH) 亦可增加蝕骨細胞的
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數目及活性，反而加速骨骼之分解，因而增高血鈣濃度，而引起骨骼代謝增加，
造成骨質流失 (Henry, 1995)。
4. 停經
因停經後，卵巢功能會明顯降低，使得雌激素亦明顯下降，而雌激素減少會 使得副甲狀腺素敏感性增加，因而引起骨骼代謝增加，造成骨質流失。
5. 運動
骨 骼 承 受 較 大 壓 力 如 肌 肉 之 拉 力 與 重 力 如 負 重 運 動 ， 會 刺 激 骨 母 細 胞 (osteoblast) 之活性增加造骨效率，故骨骼會較為堅硬。所以沒有適度的運動，骨 質也會流失。
六、目前臨床預防與治療骨質疏鬆之方法
世界衛生組織曾宣稱骨質疏鬆症為僅次於心臟血管疾病之第二大難題。台灣 目前老年人口之增加，骨質疏鬆症之預防與治療亦將成為一個重要之課題。目前 臨床上預防與治療骨質疏鬆症有下列幾種方法:
(一) 鈣劑
鈣質之補充和攝取與骨質疏鬆有很大之關聯。過去一些研究顯示鈣質之補充 與骨質密度之相關性。只單純使用鈣質，有些臨床試驗之研究發現，可預防停經 後婦女之骨質流失，尤其對於日常生活鈣質攝取量低於 400 毫克的人。也有研究 發現鈣質對皮質骨 (cortial bone) 之流失有減緩的作用，但對於骨小樑 (trabecular bone) 沒有效果。其副作用包括胃腸道的症狀 ; 有的人會有高血鈣、高尿鈣之情 形。對低鈣飲食者有效，若與動情素合併使用效果更好。通常一次補充鈣不宜超 過600 毫克，每日不超過 1.5 克，而且服用時不宜與含有植物酸之食物、可樂、菠 菜、麥片與麵包等食用。不是每個人都適宜服用鈣劑，在使用前應先與醫生討論 後再服用 (Weaver, 1998)。
(二) 賀爾蒙代替治療 (hormone replacement therapy ; HRT)
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此為目前最常用之治療方式，對女性來說，在停經後由於動情激素之缺乏，
導致骨質流失快速，賀爾蒙之補充可阻止骨質繼續流失。由於口服劑型會由肝臟 代謝，有活動性肝臟疾病的人要小心 ; 對於之前有子宮肌瘤、子宮內膜異位者，
動情激素會刺激其復發 ; 高血壓患者或吸菸者也有特別注意。服用後，短期副作 用包括頭痛、煩悶、憂慮的情況 (因為黃體素之因素) ，此外仍有子宮之婦女會有 像月經週期般的出血。若長期服用，則會增加子宮內膜癌發生之危險性，不過配 合黃體素的使用則可避免所增加之危險性。更年期之女性及卵巢切除之婦女，適 當的補充雌激素，能有效地防治骨質疏鬆症，並可減少心血管疾病之發生。然而 以肝疾、高血壓、高血脂、乳癌、子宮肌瘤、中風等患者，則不宜採用。一般之
副作用包括噁心、嘔吐、腹脹、乳房腫痛、頭痛、頭暈與陰道出血等。使用 HRT
療法需按醫師指示服藥，定期回診追蹤，才能使醫師根據個人之需要及症狀，調 整給藥方式與劑量，並對一些副作用與警訊做適切之處理 (Gallagher, 1999)。
(三) 抑鈣素
抑鈣素可防止骨組織的吸收進而避免骨質流失，然而由於無法經由口服方式 吸收，必須經由注射或鼻內噴劑之方式給予。現在的抑鈣素多由鮭魚提煉，其缺 點是使用一段時間後人體內會產生抗體，而減低其效果。即使使用人類的抑鈣素，
也會因受體的down-regulation 而失去效用。或許給予抑鈣素必須嘗試間歇性給予，
有關這方面仍需進一步之研究來證明其效果。其副作用為頭痛、頭暈、噁心及便 秘等 ; 若以鼻內方式給予則可能刺激鼻黏膜分泌、打噴嚏，此外並無其他嚴重之 副作用。可於無法補充女性荷爾蒙者使用。其能抑制骨質之分解，並能達到止痛，
目前有鮭魚和鰻魚抑鈣劑，由於價格昂貴，所以無法廣泛運用 (Louis, 1997)。
(四) 活性維生素 D
維生素 D 實際上是一種賀爾蒙。可在接受充分的日曬後，為人體自行合成。
人體內有去氫膽固醇（dehydroxycholesterol），其同時也是膽固醇的前驅物質。當 皮膚受到紫外線照射，去氫膽固醇會轉換成前趨維生素 D3 (previtamin D3) ，此
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物質對溫度很敏感，很快就會成維他命D3 (Vitamine D3) ，又稱為 cholecalciferol。
接 下 來 經 過 循 環 進 入 肝 臟 和 腎 臟 ， 代 謝 成 具 有 活 性 維 生 素 D (1α,25-dihydroxyvitamin D3 ; 1α,25[OH2]D3)，或稱為 calcitriol。由食物或健康食品
所補充維生素D，從小腸吸收後，也會進入肝臟，走同樣的代謝路徑。一般而言，
維生素 D 之天然食物來源不多，包含有某些魚類肝臟油脂及脂肪多之魚肉，以及
雞蛋 (尤以維生素 D 強化之飼料餵飼之)，這也是大多數民眾缺乏維生素 D 原因之 一 ; 一些歐美國家也會採取食品中添加鈣或維生素 D 之方式，如營養穀片中添加 400 毫克鈣和 50 I.U.之維生素 D，以補充一般民眾之攝取不足 (Harold et al., 2004)。
Calcitriol 是目前功能最受了解之活化行維他命 D3，其功能主要是維持血中鈣質之 穩定:有助於小腸吸收鈣質。一些疾病像肝病、腎臟病或藥物像類固醇都會影響其
合成作用。一般促進維生素 D 之吸收、調節鈣磷平衡，可達到防治骨質疏鬆的效
果 (Michael, 2004)。
(五) 雙磷酸鹽類藥物 (bisphosphate)
如 Etidronate 與 Alendronate 等，可抑制蝕骨細胞之活性，但對更年期之其他 症狀並無改善之效果。由於 bisphosphate 同時具有抗骨質吸收及抗骨質礦化 (mineralization)的作用，所以須要間歇性的方式給予已獲得抗骨質吸收而避免抗骨 質礦化的效果 (Angel et al., 1997)。目前第二代的雙磷酸鹽類治療骨質疏鬆症藥物 : 福善美FOSAMAX® (Alendronate sodium, MSD) 則可以持續給予，在日前已經由美 國FDA 核准上市 (Im et al., 2004)。
七、骨細胞 (一) 骨細胞簡介
骨細胞在醫學上的研究以骨母細胞與蝕骨細胞居多，此二細胞在生理上的作 用，與許多生長因子或賀爾蒙息息相關。目前已知雌激素 (estrogen) 與 Vitamin D3
會促進骨母細胞的分化，使鈣質由血液轉移到骨頭的建構上，而副甲狀腺素
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(Parathyroid hormone, PTH) 則是促進蝕骨細胞將鈣質由骨頭在吸收釋放回血液中，
以維持血鈣平衡。而這些生長因子或賀爾蒙的接受器 (receptor) 分布在哪些細胞 上，研究發現骨母細胞的細胞膜上有 estrogen receptor (ER) 及 Vitamin D3 receptor (VDR) 會接收 estrogen 與 Vitamin D3的刺激，將訊息傳導至細胞內，使細胞執行 骨頭形成的相關步驟 (Gennari L et al., 2002)。骨骼是一種特殊的結締組織，它以 鈣化的網狀膠質作為人體的骨架。其中礦物質 (mineral) / 有機物 (organic) = 3/1，
而礦物質的主要成份是磷酸鈣化合物 (hydroxyapatite ; HAP ; (Ca10(PO4)6(OH)2)，
有機物則為膠原蛋白 (collagen)。骨骼中含有三種形式的細
胞：骨母細胞 (osteoblast, O.B.)、蝕骨細胞 (osteoclast, O.C.)和成骨細胞 (osteocyte) (Huether and McCance., 2000 ; Sikavitsas et al., 2001)。
O.B.是由骨生成 (osteogenic) 的間葉 (mesenchymal) 基 (stromal) 細胞演變 而來 (Aubin et al., 1995)，其主要的功能是形成骨骼和第 I 型膠原蛋白 (type I collagen)。O.B.能對 PTH 產生反應且在 1,25-dihydroxyvitamin D 的刺激下能產生骨 鈣蛋白質 (osteocalcin)。
骨細胞具有調節骨質密度的作用，其中又以造骨細胞主宰骨質生成的調控最 為重要。造骨細胞的分化及不受氧化傷害是骨質生成中很重要的步驟，一旦分化 不足或受到傷害的細胞數目過多，骨質的生成與骨質密度 (bone mineral density)將 會降低，對骨折後骨骼的再生重建或骨質疏鬆的病患是最不希望發生的事情。
在骨微環境中 (bone microenvironment)中，IL-1 可促進前驅蝕骨細胞分化，並 活化成熟的蝕骨細胞，誘導造骨細胞分泌其他促進骨蝕作用的細胞激素，如IL-6、
IL-11、M-CSF 等等。IL-6 則為蝕骨作用調節因子，是與骨吸收作用相關之細胞激 素。由巨噬細胞或單核細胞在 IL-1、TNF-α 等誘導下產生的一種細胞激素，可促 進蝕骨細胞成熟。有學者在停經期骨質疏鬆症婦女的細胞培養中，發現 IL-6 的含 量比正常停經婦女多，認為可能是雌激素下降之關係，而造成 IL-6 含量增加，進
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而促進骨蝕作用引起骨質疏鬆症 (Dai, 2000 ; Kimble et al., 1995)。
骨骼是脊椎動物體的重要器官，它可以支持軟組織以使身體維持外型及直立，
且藉由骨骼與肌肉相互間的合作得以執行運動，此外骨骼還有保護重要器官、儲 存礦物質以及骨髓更可製造血液細胞等重要功能。骨骼組織不同於大多數的組織 由緻密的細胞構成，而是由較大量的骨基質及較少數的骨細胞 (osteocyte)構成，
循一定的規則排列，細胞外包圍著骨基質，骨基質由有機基質 (organic matrix)，
其礦物質構成。有機基質又分膠原蛋白 (collagen) 及非膠原蛋白 (non-collagen)，
其中膠原蛋白佔有有機基質之90%，膠原蛋白至目前所知大約有 27 種 (Liu et al., 1995)。在骨組織中最主要的為第一型膠原蛋白 (type I collagen)，是由三條多胜肽 鏈 (polypeptide) 緊緊繫結著而形成三股螺旋之立體結構。這是骨骼用來抵抗張力 (tensile force) 的主要成份，非膠原蛋白包括骨鈣蛋白質 (osteocalcin)、骨橋蛋白 (osteonectin)、骨鈣素 (osteopontin) 等其功能可能與骨質礦化 (mineralization)有極 大關係，目前有很多學者正努力在研究其功能 (Skjodt, 1992)。
骨骼中礦物質主要由鈣質和磷酸根離予以一定的比例形成氫氧基磷灰石 (hydroxyappatite)，其化學式為 Ca10(PO4)6(OH)2 (Posner, 1987) 。加上少量的鈉、
鉀、鎂、碳酸根離子及微量金屬離子所形成。這些骨礦物質為存積在有機基質中，
為骨骼抵抗壓縮力 (compressional force) 及剪力 (shear force) 的主要成份。
造骨細胞乃由間質幹細胞 (multipotent stromal stem cells) 或骨髓中間質細胞 前驅物 (stromal cell precursors) 分化而成之細胞，這些細胞可分化為軟骨、脂肪、
肌肉。造骨細胞之形成過程，如圖1-9。
造骨細胞之特色為可分泌鹼性磷酸酵素 (alkaline phosphatase ; ALP)，bone Gla protein (BGP) ，大量的第一型膠原蛋白 (type I collagen) ，及其他基質蛋白 (matrix proteins) (如 osteonectin，osteopontin) (張，1998 ; 林，1995 ; 林，1994 ; 林，1993 ; Yao, 1999)。
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(Stein et al., 1996) 圖 1-9 骨母細胞表型之發展 (in vitro development of osteblast phenotype)。
Pre-osteoblast 為骨母細胞之前驅細胞，其主要負責細胞增生且會分泌膠原蛋白質，
當前驅細胞逐漸成熟分化，生長速率逐漸下降便進入第二個時期骨髓成熟期，此 時骨母細胞主要分泌鹼性磷酸酶與膠原蛋白 ; 細胞分化之末期為礦化時期，骨母 細胞開始逐漸礦化成為成骨細胞 (osteocyte)，分泌 osteocalcin 及 osteopontin 等髓 質蛋白質，最後細胞老化，步入死亡 (apotosis)。
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(二)、 骨母細胞 (osteoblast) 簡介
骨的細胞成分包括骨母細胞 (osteoblast)、骨細胞 (osteocyte)、破骨細胞 (osteoclast)。骨母細胞的來源為骨髓中基質細胞的前趨 (stromal cell precursors)，它 在形在骨的早期，含有豐富的鹼性磷酸酶 (alkaline phosphatase)。在骨母細胞分泌 骨基質 (Bone matrix)的過程中，自身被包埋在其陷窩 (lacunar) 之中而成為骨細胞。
骨細胞除了參與骨合成外，也可能參與骨的吸收。破骨細胞來自單核巨噬細胞 (macrophage)，為一種多核巨細胞，含有豐富的酸性磷酸酶 (acid phosphatase ; ACP)、
膠原蛋白酶 (collagenase) 和蛋白多醣酶 (proteoglycanase)等，具有吸收和鈣化軟 骨的功能 (Zheng et al., 1992)。
骨母細胞的特色是分泌鹼性磷酸酶、骨鈣蛋白質 (Osteocalcin)、大量的第 I 型 膠原蛋白 (type I collagen) 及其他的基質蛋白 (matrix proteins)，如骨聯蛋白 (osteonectin)和骨橋蛋白 (osteopontin)。並且會受許多激素、生長因子的影響，如 骨 母細胞會受甲狀腺激素 (Parathyroid Hormone ; PTH)，像三碘甲狀腺原氨酸 (triodothyronine ; T3)、甲狀腺素 (thyroxin ; T4)，前列腺素 E2 (ProstaglandinE2 ; PGE2) ， 轉 化 生 長 因 子 (transforming growth factor-β; TGF-β) 及 骨 化 三 醇 (1,25-dihydroxyvitamin D3 ; 1,25(OH)2D3) 等刺激 (Viguet-Carrin et al., 2006)，例如 當低劑量之甲狀腺激素時，會有效的促進骨母細胞活性，增加骨質，並可顯著增 加骨質密度; 而 1,25(OH)2D3會刺激骨頭吸收 (bone resorption)、抑制骨膠原蛋白合 成和增進骨的形成 (bone formation) (Young, 2003)。
骨 母 細 胞 的 胞 漿 (cytoplasm) 內 ， 有 豐 富 粗 面 內 質 網 (rough endoplasmic reticulum)和核糖體 (ribosomal)，前膠原蛋白 (procollagen)經高基氏體 (Golgi apparatus)加工後，釋出細胞外，進一步形成膠原纖維 (collagen fiber)，並且合成與 分泌出蛋白多醣 (proteoglycans)。一旦有機骨基質形成，鈣化即開始，骨母細胞中 有大量粒腺體 (mitochondrion)，其基質中含有豐富的鈣磷顆粒。骨母細胞富鹼性 磷 酸 酶 ， 具 有 焦 磷 酸 酶 (pyrophosphatase) 的 活 性 ， 可 以 水 解 焦 磷 酸 鹽
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(pyrophosphate)，還可以水解磷酸酯，提高局部鈣和磷酸鹽的濃度，形成過飽和狀 態，而促進鈣化過程。骨母細胞的大小、型態與其功能有關，在造骨細胞活躍時，
骨母細胞成肥碩、呈立方或柱狀; 當骨造骨時期停止時，則變為扁平或梭形
(Linkhant et al., 1996) 。 在 骨 母 細 胞 分 化 的 晚 期 ， 培 養 細 胞 進 入 礦 化 期 (mineralization)，細胞內的鹼性磷酸酶活性會下降，而與細胞外基質中羥基磷灰石 (calcium hydroxyapatite ; HA)沈積，並且相關的基因表現量達到高峰，如骨鈣蛋白 質 (osteopontin)、骨鈣蛋白質 (osteocalcin) 及骨涎蛋白 (bone sialoprotein)等基因。
(McCabe et al., 1996)。
(三)、 骨重塑作用
人體之骨骼在形成後，骨骼仍會繼續進行吸收與生成作用，不斷更新、調整 本身之需要，來應付環境之變化。所以正常人之骨骼會不斷地進行增生與修復，
使成熟之骨骼維持在一動態之平衡下，由蝕骨與與造骨細胞在骨小樑之表面與哈 維氏系統內不斷地進行破壞與修復的功能。因此，骨重塑之機制 (Bone remodeling) 即一連串由蝕骨與造骨細胞不斷地重複進行骨吸收與骨形成作用，骨重塑主要可 分為五階段: 活化、吸收、逆轉、形成與休止期，如圖 1-10。
1. 活化期 (activation phase) : 在持續進行之骨重塑作用中第一個步驟即是蝕骨 細胞之活化。在休止期之骨表面上，造骨細胞以扁平狀並排，當接受刺激後，
造骨細胞便變形為立方體狀，細胞間即出現空隙，此時由骨隨中之血液幹細 胞而來之前蝕骨細胞 (preosteoclast) 便分化而遊走至骨表面之空隙(Baylink and Wergedal, 1971)。
2. 吸收期 (resorption phase) : 蝕骨細胞活化後即會開始持續約 10 天之骨吸收作 用。骨表面亦同時變形為刷狀緣 (ruffled border)，使前蝕骨在骨表面附著以後，
前蝕骨細胞便分化成多核之蝕骨細胞 (osteoclast)。活化後之蝕骨細胞便開始 在骨表面進行溶解、消化與吸收。
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3. 逆轉期 (reversal phase) : 當蝕骨細胞吸收至一定量後便開始分裂，有可能分裂 而形成單核蝕細胞 (MNP)，單核蝕細胞便會在骨之吸收表面清除骨破壞後之 殘骸，同時骨吸收面會合成一種膠著性填充劑之成分。
4. 形成期 (formation phase) : 當骨吸收面被膠著性填充劑補填後，單核蝕細胞便 從骨表面離開，之後造骨細胞會聚集在進行骨吸收作用之骨缺損並開始製造
新生骨。此過程會持續約 3 個月之時間。在形成期之初期，造骨細胞之前驅
細胞藉由單向之遷移至骨缺損處，開始進行細胞之增生，並分化為成熟之造 骨細胞 (Eriksen and Kassem, 1992)。
5. 休止期 (resting phase) : 新生骨質內補充被吸收掉之骨量後，骨表面便回到從 前之休止狀態。造骨細胞一部分被埋進骨內，成為骨細胞 (osteocyte)，其他 之造骨細胞便扁平化成為襯裡細胞 (lining cells) (Lee, 1997 ; Ganong, 1997 ; Christenson, 1997)。
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(Lee, 1997) 圖1-10 骨質轉換之機制。
Fig 1-10 The sequence of bone remodeling in healthy individuals. Remodeling is initiated when osteoclasts are activated, resorb bone and create resorption cavities.
Resorption is followed by osteoblast activation and formation of osteoid, which then fills in the resorption cavity. The active process is the target of pharmaceutical agents that affect bone resorption and formation. Abbreviations: BRU, bone remodeling unit ; CL, cement line ; LC, lining cells ; OB, osteoblast ; OC, osteoclast ; OS, osteoid.
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(四)、 MG-63 細胞及類骨母細胞
當無法使用人體或動物進行試驗時，可另外選擇使用骨母細胞的培養來做骨 質相關之研究。然而在 in vitro 的研究上，細胞要由活體組織取出做初代培養 (primary culture) 所需處理的步驟複雜，在培養上也不易生長，且如果未經轉型 (transformation) 為細胞株 (cell line)，也會在數次分裂後走向死亡，因此在此細胞 培養部分，就以往的文獻中 (Manolagas et al., 1981 ; Majeska and Rodan, 1982)大多 利用骨母型細胞 (osteoblast-like cells) 來做研究。骨母型細胞在過去的研究中發現，
其相同外來刺激的表現，能和骨母細胞相同或相似之反應，且經轉型可以做續代 培養，目前已有數株細胞用於取代骨母細胞來做實驗，如本實驗所用之MG-63 cells，
是由人類骨癌細胞 ( osteosarcoma ) 衍生出的一種細胞 (Heremans et al., 1978)，在 前人研究中 (Franceschi et al., 1985) 發現 MG-63 和骨母細胞一樣對 1,25-(OH)2D3
有高度的反應性。另外像老鼠的骨細胞MC3T3-E1 及 ROS 17/2，也都是常用於實 驗的骨母型 (Shing et al., 2002)。在 Coelho 等人研究中發現細胞培養所用之培養基 或其他培養基其組成份不同，對骨母型細胞之增生或分化具影響。在Boyan 等人 於研究中則發現，1,25-(OH)2D3會提高MG-63、MC3T3-E1 及 ROS 17/2 鹼性磷酸 酶酵素活性 ( alkaline phosphatase, ALP ) 之表現，亦促進此三種細胞之分化。
(五)、 研究細胞增生之方法 1. 細胞計數
計算細胞為測量細胞生長最直接之方法，以細胞計數器 (Nucleo Counter) (Marienfeld, Germany) 來計算細胞數，方法為將細胞稀釋成 2X104，取30 µL 之細 胞與曲利苯蘭 (trypan-blue, Sigma) 以 1:1 比例混合，注入細胞計數器中，且在顯 微鏡下觀察應紀錄細胞個數。由於死細胞會被曲利苯蘭染色成暗藍色，而活細胞 則顯示亮圈狀，藉由觀察紀錄細胞計數器上之亮圈數目後，可換算以求得細胞之 數目。此方法雖最直接，但費時費力，不適於用在大量實驗及快速檢測。
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2. [3H] thymidine incorporation
DNA 主司細胞細胞生理，是活細胞中必存在之物質，因此藉由計算 DNA 之 數量亦可作為表示活細胞數的方法。由於DNA 之結構中包含 adenosine、guanosine、
thymidine 及 cytosine 四種 nucleoside，將以放射線 [3H] 標記之 thymidine 和細胞 一起反應一段時間後，藉由測量細胞中 [3H] 的放射線量可間接推算出細胞之數目。
雖 [3H] 具放射線且較昂貴，但此方法適用於大量實驗分析使用。
3. MTT assay
MTT ( 3-4,5-dimethlthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide )是一種黃色 水溶性染劑 (dye)，其結構如圖 1-11 所示，其會被活細胞中之粒腺體還原成藍色 的 formazan (Berridge and Tan, 1993) 。 原 理 為 利 用 3-4,5-dimethlthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide 黃色水溶性固體，可被細 胞內粒腺體 (mitochondria) 中之去氫酶 (dehydrogenase) 代謝將 tetrazolium切斷，
還 原 產 生 紫 色 不 溶 性 之 沉 澱 物 formazan
(2-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-fromazan) 堆積在細胞中，如圖 1-12。再 以DMSO 溶解此結晶物質，以波長 570-620nm 之濾鏡偵測其吸光值。而 MTT 添 加於細胞使其被粒腺體還原，因此藉由還原的 formazan 量可間接推算細胞數目，
此方法可利用於細胞增生或細胞毒性之試驗來定量細胞數目，和用[3H] thymidine incorporation 所作出結果相似，且無放射性之危險，因方便、快速又安全，因此為 目前普遍用於測量細胞增生或毒殺試驗之方法。
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圖 1-11 MTT 之結構圖。
Figure 1-11 The structure of MTT.
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圖 1-12 存活細胞代謝產生 formazan 之反應。
Figure 1-12 The formazan reaction of surviving cells metabolized.
