科技部補助專題研究計畫成果報告 期末報告

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質譜法發展新穎的基因鍵結體學(DNA Adductomics)：全面評估 檳榔及香菸所造成的DNA鹼基修飾(第4年)

計 畫 類 別 ： 個別型計畫

計 畫 編 號 ： NSC 100-2628-B-040-001-MY4 執 行 期 間 ： 103年08月01日至104年07月31日

執 行 單 位 ： 中山醫學大學職業安全衛生學系暨碩士班

計 畫 主 持 人 ： 趙木榮

共 同 主 持 人 ： 巖正傑、張耀仁

計畫參與人員： 碩士級-專任助理人員：蔡依虹 學士級-專任助理人員：謝明宴 博士後研究：許又文

報 告 附 件 ： 出席國際會議研究心得報告及發表論文 處 理 方 式 ：

1.公開資訊：本計畫涉及專利或其他智慧財產權，2年後可公開查詢 2.「本研究」是否已有嚴重損及公共利益之發現：否

3.「本報告」是否建議提供政府單位施政參考：否

中　華　民　國　104　年　10　月　31　日

中 文 摘 要 ： 本研究運用LC-MS/MS搭配連線固相萃取(on-line solid phase extraction, SPE)建立新穎的DNA adductomics研究方法，並克服 DNA adductomics目前的分析難題，接著運用於探討檳榔及香菸暴露 所造成的DNA鹼基修飾。以adductome map的疊圖比對探究檳榔及香 菸暴露造成DNA鹼基修飾特徵，並試圖以修飾鹼基的結構鑑定，追朔 人類尚未發現的重要致癌成分。

中 文 關 鍵 詞 ： 基因鍵結體學、DNA鹼基修飾、液相層析串聯質譜儀、檳榔、香菸 英 文 摘 要 ： Cellular DNA is highly vulnerable to modification by

exposure to electrophilic molecules that originate from both exogenous and endogenous sources, either directly or following metabolic activation. These modifications result in the formation of DNA adducts. If DNA adducts are not repaired properly, they can lead to mutations in critical genes such as those involved in the regulation of cellular growth and subsequent development of cancer.

The strategy, named the DNA adductome approach, is based on chromatographic separation of a nucleoside mixture combined with the detection of the constant neutral loss (CNL) of 2’-deoxyribose from positively ionized 2’-deoxynucleoside adducts over a certain range of transitions. This has led to the concept of producing an adductome map of all DNA adducts in a sample. This approach holds great potential for gaining further insight into DNA adduct profile

differences between human populations exposed to mixtures of environmental genotoxins, but until now has been

constrained by a variety of factors such as lower

sensitivity, limited structural information and regional differences in matrix effects along the chromatogram. In this study, we developed a novel DNA adductomics method, which overcome the drawbacks of previous works, for assessing external exposure to areca nuts and cigarette smoke.

英 文 關 鍵 詞 ： DNA adducts, DNA damage, adductomics, LC-MS/MS, areca nuts, cigarette smoke

一、前言

(1) 基因鍵結物的量測

細胞內正常的鹼基負責了多種生命現象，但在各種化學反應下，正常鹼基結 構可能被某些官能基團取代，進而產生共價鍵結，這些被修飾過的鹼基都可稱為 DNA 鍵結物 (DNA adducts) (陳皓君&洪嘉良，2001)。DNA adducts 的形成是基 因毒物致癌的關鍵起始步驟，當致癌物進入體內後大多可藉由代謝方式去毒排出 體外，而代謝過程也有機會將致癌物活化進而與 DNA 產生共價鍵結。如果細 胞內的 DNA 受到嚴重損傷，有可能造成細胞凋亡或停止分裂；但若細胞依然 存活，DNA adducts 未經修復，在細胞複製後將容易產生誤鑄代碼 (miscoding) 而造成突變，經年累月的突變基因累積是後續癌化的重要原因。

DNA adducts 的量測分析一直是項重要議題。然而生物樣本中的 DNA adducts 通常非常微量，且分析時遭遇的基質干擾極為嚴重，因此要精確且快速 地分析 DNA adducts 則備受挑戰。目前 DNA adducts 的量測分析法眾多，如免 疫組織化學 (immunohistochemistry) 方法直接在組織上染色標定 adducts，但其 特異性不足，屬半定量方法；彗星試驗 (comet assay) 方法於單顆細胞上量測 DNA 損傷概況，但缺乏檢量線可以量化，也無法得知特定 adduct 所造成損傷。

因此將細胞中的 DNA 萃取出後再執行分析是量化 adducts 較佳的方式。從 1980 年代開始，³² 磷 後 標 定 法 (³²P-postlabeling) 便是普遍用來量測 DNA adducts 的技術且沿用至今 (Beach and Gupta 1992)，其方法雖然敏感度佳，但過 程中需操作放射性物質危險且特異性差。免疫分析法 (immunoassay) 由於被開 發出的抗體種類有限，只能運用於特定 DNA adducts，同時也因會與其他 adducts 交叉反應也遭遇特異性差的問題 (Evans et al. 2010)。

層析法搭配不同偵測器進行分析是公認較準確的量測方法，係萃取出樣本中 的 DNA 並 進 行 水 解 ， 再 以 高 效 能 液 相 層 析 儀 (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 或氣相層析儀 (Gas Chromatography, GC) 搭配各式偵 測器 (如： HPLC 搭配螢光偵測器或電化學偵測器； GC 搭配質譜儀) 分析 (Klaene et al. 2013)。其中以 GC 的量測方法較為繁瑣，因大部份的 adducts 待測 物皆溶於水相中且揮發度低，因此必須事先將待測物進行化學衍生化，改變其化 學結構性質，降低沸點與增加揮發性，使其易於後續 GC 的分析。通常衍生化 步驟流程短則 30 分鐘，長可到 1-2 個小時，因此前處理步驟流程較為冗長；若 採用 HPLC 則能直接分析水相基質中的待測物。其中尤以 HPLC 搭配串聯質 譜儀 (Tandem Mass Spectrometry, MS/MS) 最適合分析 DNA adducts，準確且高 敏感度，同時可提供分子結構訊息。

然而 DNA adducts 種類眾多，上述的方法都無法完整且於同一時間描述外 來毒物暴露或疾病所造成的基因損傷全貌。因此類似蛋白體學與代謝體學的研究

概念，於 2006 年首先被提出應用於 DNA adducts 的研究，亦即同一時間分析 基因組上所有的 DNA adducts (Kanaly et al. 2006)；最近學者們開始將這樣的概 念統稱為基因鍵結體學 (DNA adductomics) (Balbo et al. 2014)。而目前 DNA adductomics 的全面分析技術開發及運用仍處於萌芽階段，近幾年來文獻發表還 不多，且此項分析任務只能藉由高選擇性及高靈敏度的 LC-MS/MS 才有機會能 達成。

(2) 基因鍵結體學

當 以 液 相 層 析 串 聯 質 譜 儀 (LC-MS/MS) 於 正 電 荷 電 噴 灑 離 子 化 (electrospray ionization, ESI)進入 MS/MS 分析時，正常的與被修飾鍵結的去氧核 苷 (2’-deoxynucleosides)，皆有碎裂丟失結構斷片 2’-去氧核糖 (2’-deoxyribose) 的共同特徵。因此 Kanaly (2006) 首先提出可將去氧核苷分子碎裂後丟失 2’-deoxyribose 的特性，作為 adducted 2’-deoxynucleosides 的分析策略，便能運 用 質 譜 進 行 大 範 圍 的 質 量 篩 選 ， 以 達 同 時 間 能 偵 測 所 有 可 能 的 adducted 2’-deoxynucleosides。

如 下 圖 一 所 示 為 運 用 質 譜 進 行 DNA adductomics 的 分 析 概 念 。 由 於 adducted 2’-deoxynucleosides 經由碰撞皆容易掉下 2’-deoxyribose (分子量 116 Da)，此掉下的去氧核糖結構屬於不帶電的中性分子，因此非常適合使用液相層 析串聯質譜儀特有的中性丟失掃瞄模式 (constant neutral loss, CNL)。利用將母離 子經碎裂後質荷比 (m/z) 能減少 116 者 ([M+H] ⁺  [M+H - 116]⁺) 作為特 徵。利用大範圍的質荷比掃描可得到每一層析時間下進入 ESI-MS/MS 所有可能 的 DNA adduct 訊號。最後將中性丟失質量 116 Da 質譜掃描的結果，透過軟體 將原始數據轉換輸出成三維圖像以顯示層析時間、母離子質荷比與波峰面積強度 的鍵結體地圖 (adductome map)，藉由鍵結體地圖比對便能呈現所有可能基因損 傷的全貌。

圖一、運用質譜進行 DNA adductomics 分析概念

二、研究目的

本研究的目的在於運用 LC-MS/MS 開發新穎且能廣泛量測 DNA 鍵結物 的 DNA adductomics 研究方法，克服 DNA adductomics 目前的分析難題，進而 運用於探討各種毒物 (如甲基化劑) 及混合物 (如檳榔萃取液) 於體外及動物試 驗所造成的 DNA adduct 全貌。利用 adductome map 的疊圖比對探究造成 DNA 鹼基修飾的重要特徵。

本研究順利完成：

(1) 建立能同時偵測 2’-deoxynucleosides 的 CNL 掃描模式。

(2) CNL 掃描模式下將偵測 2’-deoxynucleosides 的質譜參數進行最佳化。

(3) 針對 DNA adductomics 分析法建立 on-line SPE (solid phase extraction) 系 統，其可將所有 2’-deoxynucleoside adducts 自動萃取淨化，以減低分析時生 物基質所造成的基質效應或干擾，線上送入 LC-MS/MS 進行分析。

(4) 挑選出代表性內標，使其能在不同層析時段出現，當作分析時的區段校正內 標，修正各層析區段滯留時間 (retention time) 及基質效應 (matrix effects)。

(5) 成功建立資訊轉換輸出系統，將分析結果質譜訊號快速轉換成含有層析時 間、掃描質荷比與離子強度三維資訊的 adductome map。

(6) 將小牛胸腺 DNA (calf thymus DNA)處理直接甲基化劑 (methylmethane sulfonat, MMS)，驗證本研究開發的 DNA adductomics 方法可行性。

(7) 將檳榔萃取液直接與 calf thymus DNA 混合反應，以 DNA adductomics 技 術首先發現並證實檳榔中存有直接造成DNA 烷基化物質 (direct-acting DNA alkylating agent)。

(8) DNA adductomics 拓展到動物實驗上，小鼠分別餵食致癌物質二甲基亞硝胺 (N-nitrosodimethylamine, NDMA) 與 氘 化 二 甲 基 胺 (deuterium labeled dimethylamine, d6-DMA) 與亞硝酸鹽 (nitrite, NO2-)，犧牲後分析肝臟檢體。

(9) CNL 掃描搭配資料依靠收集模式 (information dependent acquisition, IDA) 以針對特定DNA adducts 進行 (enhanced product ion, EPI) 掃描，獲取離子斷 片訊息，藉此運用 CNL-IDA-EPI 模式進行結構定性分析。

三、研究方法

(1) 材料

本 研 究 所 使 用 的 化 學 藥 劑 均 為 分 析 級 ， 所 採 用 的 去 氧 核 苷 (2’-deoxynucleosides)測試標準品及同位素標準品共 18 種 (下表一)。各種標準品 的結構列於圖二。

表一、18 種標準品與內標準品名稱與購買來源

Standard Source

 2'-deoxyguanosine (dG)

 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dG)

 ¹⁵N5-2'-deoxyguanosine (¹⁵N5-dG)

 5-hydroxymethyl-2′-deoxyuridine (5-hmdU)

Sigma-Aldrich

 2'-deoxycytidine (dC) MP Biomedicals

 5-Methyl-2'-deoxycytidine (5-mdC) Tokyo Chemical Industry

 2'-deoxyadenosine (dA)

 thymidine (dT) Alfa Aesar

 2'-deoxy-5-propynyluridine (5-ppn-dU)

 2'-deoxy-5-propargyloxyuridine (5-ppg-dU)

 N6-benzoyl-2'-deoxy-8-oxoadenosine (N6-bz-8-oxodA)

Carbosynth

 ¹⁵N3-2'-deoxycytidine (¹⁵N3-dC)

 ¹⁵N5-8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (¹⁵N5-8-oxo-dG)

 5-Hydroxyethyl-2'-deoxycytidine (5-hmdC)

 5-Methyl-d3-2'-deoxycytidine (d3-5-mdC)

 5-Hydroxymethyl-2'-deoxycytidine-d3

(d3-5-hmdC)

 deoxythymidine-d3 (d3-dT)

 N6-(2-hydroxyethyl-d4)-2'-deoxyadenosine (d4-N6-2HE-dA)

Toronto Research Chemicals

1

OH HO

O N N

NH₂

O

2

OH HO

O

15N

15N

O

15NH₂

3

OH HO

O N N

NH₂

O

OH

4

OH HO

O N N

NH₂

O ^D

OH D D

5

OH HO

O N N

NH2

O

CH₃ 6

OH HO

O N N

NH₂

O

CD₃

7

OH HO

O N HN O

O OH

8

OH HO

O N N

N N NH2

9

OH HO

O N N

N NH O

NH2

10

OH HO

O 15N 15N

15N 15NH O

15NH₂

11

OH HO

O N HN O

CH ₃ O

12

OH HO

O N HN O

O

CD ₃

13

OH HO

O N N

N N NH

D D

D D OH

14

OH HO

O N N

N NH O

NH₂ H

15

OH HO

O

15N

15N

15N

15NH O

15NH₂ H

16

OH HO

O N

NH

O O O

17

OH HO

O N

NH O O

 

18

OH HO

O N N

N N NH

OH O

圖二、本研究所使用的 18 個 2’-deoxynucleosides 標準品及同位素標準品

1、2’-deoxycytidine；2、¹⁵N3-2’-deoxycytidine；3、5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine；

4、5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine-d3；5、5-methyl-2’-deoxycytidine；

6、5-methyl-2’-deoxycytidine-d3；7、5-hydroxymethyl-2’-deoxyuridine；8、2'-deoxyadenosine 9、2’-deoxyguanosine；10、¹⁵N5-2’-deoxyguanosine；11、thymidine；12、deoxythymidine-d3

13、N6-(2-hydroxyethyl-d4)-2'-deoxyadenosine；14、8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine 15、¹⁵N5-8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine；16、2'-deoxy-5-propargyloxyuridine 17、2'-deoxy-5-propynyluridine；18、N6-benzoyl-2'-deoxy-8-oxoadenosine

(2) 自動化連線固相萃取連接液相層析串聯質譜儀 (Automated On-line SPE LC-MS/MS)

本研究所採用的 on-line SPE LC-MS/MS 由 Agilent 1100 series 自動注射 器、二雙幫浦送液系統 (binary pump, Agilent 1100 series) 並搭配 API 4000 Q-trap 三級式四極柱混合離子阱質譜儀 (triple-quadrupole mass spectrometer, Applied Biosystems) 所組成。SPE trap column 為 Inertsil ODS-3 管柱 (75 mm × 2.1 mm, 5 μm particle size) 而 analytical column 亦為 Inertsil ODS-3 管柱 (150

× 2.1 mm i.d., 5 μm particle size)，如下圖三所示。

圖三、On-line SPE LC/MS/MS 之自動系統架構圖： (A) 樣本濃縮與淨化；(B) 待 測物沖提進入 HPLC 管柱以 MS/MS 進行分析。 (Hu et al. 2010)

四、結果與討論

(1) 利用 CNL 模式建立能同時掃描偵測 2’-deoxynucleosides 的分析方法

在CNL 模式下，我們初步設定 2’-deoxynucleosides 母離子經碎裂後質荷比 (m/z) 減少 116 Da (亦即會丟失 2’-deoxyribose：[M+H] ⁺  [M+H116]⁺) 作為 特徵。我們先將 8 種濃度皆為 250 ng/mL 的 2’-deoxynucleosides 標準品及其 對應的同位素內標，以 20 µL 的體積注射進行分析，質荷比 (m/z) 的掃描範圍 為 220-620。下圖四為 CNL 模式下的層析圖譜，4 種標準品及其同位素 (共 8 種) 因層析而順利分離，且 CNL 皆能準確地找出每個母離子的質荷比 (m/z)。

各標準品及其對應同位素的層析時間雖極為相同，但在 CNL 模式下仍可被分開 偵測出，因此 CNL 模式對於不同 2’-deoxynucleosides 具很好的辨識效果。

圖四、利用 CNL 模式建立同時掃描偵測 2’-deoxynucleosides 的層析範例

(2) CNL 模式下偵測 2’-deoxynucleosides 參數最佳化

為使 CNL 模式達到最佳的靈敏度，我們進一步將 2’-deoxynucleosides 的 掃描條件進行最佳化。由於去氧核糖是一個極不穩定的鍵結基團，容易受到高溫 度與電壓的影響而丟失，因此本實驗分析敏感度的最佳化將焦點置於電噴灑離子 化的溫度 (turbogas temperature)、去簇電壓 (declustering potential, DP)、碰撞能 量 (collision energy, CE) 與掃描時間 (scan time) 此四個重要參數。首先，將以 下參數設定於常設經驗值：curtain gas flow = 10；nebulizer gas (Gas 1) flow = 50；

turbo gas (Gas 2) flow = 50；collision-activation dissociation (CAD) gas flow = medium；entrance potential (EP) voltage = 10 V；collision cell exit potential (CXP) = 15V。接著，我們在正離子模式 (positive ion) 下評估電噴灑離子化的溫度、DP、

CE 與掃描時間對 CNL 分析敏感度的影響。

針對 18 種的 2’-deoxynucleosides 標準品或同位素標準品進行參數的最佳 化。如表二所示，ESI 加熱溫度經不同條件測試 (350°C、400°C、450°C)，發現 18 個待測物中有 15 個在 400°C 的加熱溫度下，有較好的分析強度；而表三為 去簇電壓 (DP) 經不同條件測試 (10、20、30、40、10-30、20-40)，發現 18 個 待測物普遍在 30 V 的 DP 電壓下，有較好的分析強度；而表四為碰撞能量 (CE) 經不同條件測試 (10、15、20、25、30、35、40、45、10-30、20-40)，發現以 10-30 V 區間範圍的碰撞能量較能涵蓋所有化合物的中性丟失需求。掃描時間越長則 訊號強度越佳(data not shown)，但過長的掃描時間會造成各層析時間的資訊擷取 過少。表五為最佳化結果的總結，ESI 加熱溫度為 400°C、DP 為 30 V、CE 為 10-30 V 及掃描時間為 1 秒，可讓 18 個 2’-deoxynucleosides 待測物，於 CNL 模式下分析有均衡的最佳靈敏度。

ESI 的溫度越高，雖有利於離子化後形成帶電液滴的揮散效率，增加帶電離 子進入質譜的機會，但在先前我們的研究發現 ESI 的溫度越高，也越容易使得 2’-deoxynucleosides 上的去氧核糖在進入 Q0 前就掉落，亦即在源內產生熱裂解 (in-source thermolysis) 反應。此外，過大的 DP 也 會 因 源 內 碰 撞 誘 導 解 離 (collisionally induced dissociation) 讓 2’-deoxynucleosides 上的去氧核糖在進 入 Q0 前就丟失 (Hu et al. 2010)。適當溫和的 CE 能量可讓 2’-deoxyribose 在 Q2 碰撞室順利碎裂丟失，過大的 CE 能量則會讓母離子在 Q2 時過度碎裂，

造成 2’-deoxynucleosides 的鹼基也被碎裂，因此減少了鹼基的子離子進入 Q3 的量。表六為經最佳化後的 CNL 掃描方法的條件，後續實驗皆採用此方法分析。

表二、電噴灑 (ESI) 溫度的最佳化

Relative intensity(%)

Nucleosides

Temperature

350℃

400℃

450℃

dC 84 100 60

15N3-dC 100 40 44

5hmdC 100 45 49

d3-5hmdC 81 85 100

5mdC 58 100 88

d3-5mdC 82 100 86

5hmdU 48 100 78

dA 99 100 61

dG 96 100 75

15N5-dG 100 64 71

dT 100 64 80

d3-dT 99 100 83

d4-N6-2HE-dA 95 100 77

8-oxodG 44 43 100

15N5-8-oxodG 47 86 100

5-ppg-dU 78 100 75

5-ppn-dU 99 100 93

N6-bz-8-oxodA 53 100 31

表三、去簇電壓 (DP) 的最佳化

Relative intensity(%)

Nucleosides

Declustering potential (DP), V

10 20

30

40 10-30 20-40

dC 39 15 76 100 72 65

15N3-dC 50 43 100 38 42 73 5hmdC 49 72 90 37 38 100

d3-5hmdC 50 46 100 76 58 43

5mdC 49 60 83 53 50 100 d3-5mdC 48 100 94 67 55 54

5hmdU 42 100 40 31 69 36

dA 57 79 100 95 59 62

dG 42 52 100 65 56 82

15N5-dG 67 55 67 54 50 100

dT 100 69 59 60 146 64

d3-dT 71 100 51 77 49 75 d4-N6-2HE-dA 51 72 65 44 73 100

8-oxodG 70 100 69 77 69 89

15N5-8-oxodG 85 48 100 68 58 55 5-ppg-dU 100 89 64 70 83 67 5-ppn-dU 100 42 78 35 83 40 N6-bz-8-oxodA 46 56 58 100 42 93

表四、碰撞能量 (CE) 的最佳化

Relative intensity(%)

Nucleosides

Collision energy (CE), V

10 15 20 25 30 35 40 45

10-30

20-40 dC 49 51 56 57 38 38 44 27 100 46

15N3-dC 49 40 100 37 34 38 36 24 37 18 5hmdC 95 85 60 48 27 28 8 2 100 8 d3-5hmdC 100 76 84 42 25 13 6 3 80 51

5mdC 100 77 99 77 91 52 60 69 86 41 d3-5mdC 49 100 71 61 73 90 43 68 74 87 5hmdU 68 29 9 4 2 0 0 0 100 4

dA 24 54 58 55 100 35 60 29 32 41 dG 26 17 16 39 31 44 33 27 100 20

15N5-dG 46 64 39 75 73 65 56 21 100 19 dT 88 73 52 41 42 35 23 23 100 21 d3-dT 77 71 71 53 62 33 30 28 100 23 d4-N6-2HE-dA 15 27 51 100 67 83 73 24 23 25 8-oxodG 58 68 81 87 85 70 100 40 80 26

15N5-8-oxodG 71 80 100 94 56 61 82 30 79 22 5-ppg-dU 83 60 20 21 7 6 0 0 100 11 5-ppn-dU 92 76 66 29 10 6 4 8 100 35 N6-bz-8-oxodA 41 63 66 100 55 56 49 19 93 33

表五、各種 2’-deoxynucleosides 的最佳化條件

Nucleosides

ESI temperature

(℃)

DP (V)

CE (V)

2'-deoxycytidine 400 40 10-30

15N3-2'-deoxycytidine 350 30 20

5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine 350 20-40 10-30 5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine-d3 450 30 10

5-methyl-2'-deoxycytidine 400 20-40 10 5-methyl-2'-deoxycytidine-d3 400 20 15 5-hydroxymethyl-2'-deoxyuridine 400 20 10-30

2'-deoxyadenosine 400 30 30

2'-deoxyguanosine 400 30 10-30

15N5-2'-deoxyguanosine 350 20-40 10-30

thymidine 350 10 10-30

deoxythymidine-d3 400 20 10-30

N6-(2-hydroxyethyl-d4)-2'-deoxyadenosine 400 20-40 25 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine 450 20 40

15N5-8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine 450 30 20

2'-deoxy-5-propargyloxyuridine 400 10 10-30 2'-deoxy-5-propynyluridine 400 10 10-30 N6-benzoyl-2'-deoxy-8-oxoadenosine 400 40 25

表六、經最佳化後 CNL 的分析方法參數

CNL

Start (amu) ~ stop (amu) 220-600

Loss of (amu) 116

Declustering potential, V 30 Entrance potential voltage, V 10

Scan time (s) 1.0

Collision-induced dissociation gas flow Medium Collision energy, V 10-30 Collision cell exit potential, V 15

(3) On-line SPE LC-MS/MS 分析法建立

由於 DNA adducts 的 LC-ESI-MS/MS 分析，常受到樣本基質的抑制干擾，

如鹽類、蛋白質或未經修飾的核酸，加上待測物又極為微量，造成分析困難。因 此，前處理流程中需要進行樣品的萃取淨化，將可能的基質干擾去除。但前處理 步驟可能造成樣品中待側物的損失，且通常冗長又耗時。所以發展成熟的自動化 連線固相萃取 (on-line SPE) 方式，應用在 adductomic 分析是非常好的解決方 案；自動化的完成樣品淨化並直接輸送至後端質譜分析，不僅減少樣品損失的機 會，也大大增加樣品的分析通量 (Tretyakova et al. 2013)。

本研究中建立 on-line SPE 連結 LC-MS/MS 分析方法，自動連線式固相萃 取裝置包含一六向閥 (valco) 與一 trap column 組成 (下圖 3)，六向閥的控制系 統採用 PE-SCIEX 控制軟體 (Analyst^TM, Applied Biosystems)。

表七詳列分析樣本時自動連線式固相萃取裝置的運作程序。當六向閥開關位 於 A (Load) 時，20 μL 的樣本藉由自動進樣裝置及一台流速設定為 0.2 mL/min 的幫浦輸送100% solvent Ia，將樣本連同溶液送至接有保護管柱 (guard column) 的固相萃取管柱，同時利用溶液沖洗將雜質與待測物分離。當 solvent Ia 將內含 待測物的萃取管柱沖洗 2.5 分鐘後，六向閥轉向位置 B，此時注入液相層析系 統的移動相溶液 eluent II 進行梯度沖提 (100% solvent IIa 到 100% IIb)，將 trap column 中的待測物輸送至 LC-MS/MS。經過 72.6 分鐘的沖提後，六向閥再度轉 回位置 A，此時注入 elute I (100% Ib) 清洗固相萃取管柱。最後以 100% Ia 的 溶液使管柱平衡，等待下一次分析。總分析時間為90 分鐘。

圖五為本研究開發之 On-line SPE LC-MS/MS 方法針對 18 種待側物標準 品之 CNL 掃描層析圖。

表七、2’-deoxynucleosides 分析所採用的閥件切換時程與層析梯度

Time (min)

Eluent I (trap column) Eluent II (analytical column) Valve position

Flow rate (μL/min)

Remarks Solvent Ia^a(%) Solvent Ib^b(%) Solvent IIa^c(%) Solvent IIb^d(%)

0.0 100 0 100 0 A 200 Injection and washing of sample.

2.5 100 0 100 0 B 200 Start of elution of the sample to the analytical column.

2.6 100 0 100 0 B 200

5.0 100 0 100 0 B 200

70.0 100 0 0 100 B 200 71.9 100 0 0 100 B 200

72.0 0 100 0 100 B 200

75.0 0 100 0 100 B 200

75.1 0 100 100 0 A 200 End of elution; trap column cleanup and reconditioning.

80.0 0 100 100 0 A 200

80.1 100 0 100 0 A 200 90.0 100 0 100 0 A 200

a3% (v/v) MeOH containing 1 mM ammonium acetate (AA).

b95% (v/v) MeOH containing 1 mM ammonium acetate (AA).

c2% (v/v) MeOH containing 0.1% Formic acid (FA).

d95% (v/v)MeOH containing 0.1% Formic acid (FA).

圖五、利用 on-line SPE LC-MS/MS 分析 18 個 2’-deoxynucleosides

(4) 利用不同層析時間內標準品進行區段訊號校正

當運用 LC-ESI-MS/MS 分析時，DNA 樣本中含有的基質可在不同層析時間 析出而干擾 (離子抑制或增強) adducts 的電灑離子化效率，進而影響每一層析區 段中 adducts 的訊號強度。甚或幫浦及基質也可能影響 adducts 的滯留時間，皆 不利於後續運用 adductome map 進行生物樣本間疊圖的量化比對。本研究採用 連線固相萃取 (on-line SPE) 系統雖能大幅減低基質效應，亦即將 DNA 樣本在 線上萃取純化後再進入 LC-MS/MS 分析，但依然無法完全免除基質效應。

理想上，分析時若能針對每一種待測的 DNA adducts 添加穩定同位素內標 (stable isotope internal standards)，可幫助修正基質效應及滯留時間的影響。然而 面對眾多或未知的 adducts 去合成穩定同位素內標於實務上是不可行的。此外，

液 相 層 析 常 因 固 定 相 及 流 動 相 間 的 些 微 變 化 ， 造 成 滯 留 時 間 的 飄 移 。 由 adductome map 的定性觀點，母離子相同但滯留時間不同，將被視為特徵不同的 adducts。因此，添加數種可在不同層析時間區段出現的代表性內標準品來作為校 正內標，是修正各區段基質效應及滯留時間的重要策略。

本研究以層析時間挑選出 6 種標準品 (含 4 種同位素與 2 種非同位素修 飾核酸)，作為各層析區段滯留時間及基質效應的內標。如下圖六及圖七所示。

0.1~8.0、8.1~15.0、15.1~21.0、21.1~26.0、26.1~35.0 及 35.1~90.0 分鐘分別由

15N3-dC、 d3-5-mdC、¹⁵N5-dG、¹⁵N5-8-oxodG、5-ppn-dU 及 N6-bz-8-oxodA 作

為校正內標。

圖六、6 種不同層析時間出現的校正內標

圖七、利用 6 種不同層析時間出現內標作為各區段待測 adducts 校正示意

(5) 質譜分析數據轉換輸出成 Adductome map

由於 adductomic 分析後，其數據量極為龐大且複雜，因此得透過軟體進行 轉換輸出成易判讀辨識的圖像。先前大多研究的 adductome map 皆使用圓泡圖 來呈現含母離子m/z、滯留時間與訊號強度(Kanaly et al. 2006; Singh et al. 2010;

Carlsson et al. 2014; Kanaly al. 2015)。

本研究試圖利用各式軟體將數據轉換成不同呈現方式的 adductome map 來 比較優略。DNA 樣本利用 on-line SPE LC-MS/MS 分析後，先從原廠軟體 Analyst 輸出原始數據，初步經由 msInspect (mass spectrometry In silico peptide characterization tool) (http://proteomics.fhcrc.org/CPL/home.html) 網站所提供的免 費轉檔軟體，轉以帶狀圖呈現 adductome map (圖八)，X 軸代表的是時間，Y 軸 代表掃描離子質荷比 (m/z)。經由此軟體轉換後，其呈現格式 (X 軸與 Y 軸) 皆 無法調整與修正，也無法提供量化的訊號強度資訊，只能作為初篩比對工具。此 adductome map 雖 能 提 供 訊 號 量 化 的 數 據 ， 但 可 能 因 為 DNA 中 正 常 的 nucleoside (如 dA、dT、dC 與 dG 等) 強度太高而無法辨識微量的 DNA 鍵結物。

圖八、運用msInspect 軟體將 CNL 訊號轉換成 adductome map 帶狀圖範例

接著我們也嘗試將 Analyst 輸出的原始數據，導入到 Microsoft Excel 中對 層析訊號一一積分，便可以將 CNL 分析得到的層析面積訊號轉換成 adductome

map 圓泡圖 (圖九)，圓圈的中心點 X 軸為層析時間，Y 軸為掃描離子質荷比 (m/z)，圓圈的大小代表訊號強度 (積分面積)。

圖九、運用 excel 將 CNL 訊號轉換成 adductome map 圓泡圖範例

另 外 ， 利 用 本 計 畫 購 置 的 Originlab 軟 體 (http://www.originlab.com/) 將 Analyst 輸出的原始數據轉換繪製成 adductome map 強度色帶圖，也能產生易於 判讀比對的圖像(見下圖十)。X 軸為層析時間，Y 軸為母離子 (Q1) 質荷比，顏 色代表訊號的強度；圖中色帶的窄跟寬表示層析訊號的範圍。

圖十、Adductome map 強度色帶圖

上述的原始數據，可進一步運用 AB Sciex 所提供 MarkerView^TM 軟體 (http://sciex.com/products/software/markerview-software)，以上述 6 種內標校正滯 留時間為基準，在不同層析時間區段中修正滯留時間，並扣除正常 nucleosides

及內標訊號後將訊號積分輸出。下圖十一為經扣除背景訊號並區段修正滯留時 間、離子抑制及 DNA 含量後，以 Originlab 繪製的 adductome map 強度點狀 圖。此種呈現方式較不易受圖譜中波峰拖尾干擾，能幫助快速辨別找出 DNA 鍵 結物。

對於特徵母離子的圖間比對，可利用 AB Sciex 所出版軟體 Metabolite ID for Analyst (Version 1.4 Prototype 2)，直接找出控制組與處理組的特徵母離子 (範例 詳見圖十八)。

圖十一、Adductome map 強度點狀圖 (扣除正常 nucleosides 及內標訊號)

(6) DNA adductomics 運用於 calf thymus DNA 暴露直接甲基化試劑

Methylmethane sulfonat (MMS) 係反應性強的直接甲基化劑 (direct-acting methylating agent)，可直接作用 DNA 屬於 SN2 (雙分子親和性取代機制) 的作用 試劑 (Beranek 1990)。下圖十二為 calf thymus DNA 與 MMS 反應後，水解添 加 校正內標，在 CNL 模式下掃描偵測 2’-deoxynucleosides 的全離子掃描累加 (total ion chromatography, TIC) 質譜圖。由 TIC 圖可初步比對總離子掃描訊號特 徵， 暴露 MMS (b) 相較於 DNA 控制組 (a) 在總層析時間 5 及 32 分鐘附近 有新的質譜訊號產生。

圖十二、DNA 經 CNL 掃描 (丟失質量:116 Da) 的 TIC 圖譜

上述的 TIC 圖譜資訊可進一步提取轉換為 adductome map 強度色帶圖 (未扣除 normal nucleosides：dA、dT、dC 與 dG 及內標訊號)；X 軸為層析時 間，Y 軸為母離子 (Q1) 質荷比，顏色代表訊號強度，如圖十三所示。相較於控 制組，MMS 處理組在層析時間 5 分鐘附近產生新訊號 A、B 與 C，其 m/z 分 別為 282、266 及 242，亦即原本分子量為 281、265 及 241；32 分鐘產生新 訊號 D 其 m/z 為 282，亦即分子量為 281。

圖十三、DNA adductome map 強度色帶圖

上述 adductome map 強度色帶圖可進一步透過 MarkerView^TM 軟體轉換，

利用 6 種校正內標進行在不同層析時間區段的滯留時間校正；將訊號積分並扣 除 normal nucleosides (dA、dT、dC 與 dG) 及內標訊號後並修正滯留時間、離 子抑制及 DNA 含量後的 adductome map。DNA 經 MMS 暴露後，大部分的特 徵訊號與控制組相似，但經由 adductome map 的疊圖比對後，找出 A、B、C 與 D 四 個 重 要 特 徵 的 DNA adduct 。 推 測 A 、 B 、 C 與 D 可 能 分 別 是 N7-methyl-2'-deoxyguanosine 、 N3-methyl-2'-deoxyadenosine 、 N3-methyl-2'-de- oxycytidine 及 O⁶-methyl-2'-deoxyguanosine 四個甲基化鍵結的 DNA adducts，

也證實本研究所開發的 DNA adductomics 方法可行性。

圖十四、DNA adductome map 訊號強度點狀圖

(7) DNA adductomics 運用於 calf thymus DNA 直接暴露檳榔萃取液分析

檳榔嚼食在亞洲地區 (南方) 極為盛行，主要是因為檳榔被廣用為來提振精 神，因此是繼吸菸、酒精及咖啡因後的第四大生活習性 (Winstock 2002)。檳榔 嚼塊組成為檳榔子 (areca nut)，其主成份為檳榔鹼 (areca nut alkaloids) 及多酚類 化合物被認為跟口腔癌最有關聯 (Nair et al. 2004)。此外，檳榔成分中也可能含 能與DNA 反應生成 adducts 的毒物，運用 DNA adductomic 方法可試圖找出未 知的致癌物。

本研究中我們利用 calf thymus DNA 直接與未成熟檳榔水萃液進行混合。下 圖十五為 DNA 經檳榔水萃液直接暴露後，利用 on-line SPE LC-MSMS 進行 CNL 分 析 ， 再 提 取 轉 換 為 adductome map 強 度 色 帶 圖 ( 未 扣 除 normal nucleosides 及內標訊號) 來檢視。將控制組 (a) 與檳榔水萃液處理後 (b) 做一 比較，可發現在層析時間約10 分鐘附近產生新訊號，其 m/z 為 282，亦即原本 分子量為 281。推測可能是檳榔水萃液可能存有甲基化劑， 而 dG 的 N7 位置最 易與甲基化劑鍵結。因此我們推測此adduct 為 N7-methyl-2'-deoxyguanosine，但 N7-methyl-2'-deoxyguanosine 在 常 溫 下 並 不 穩 定 ， 極 易 去 嘌 呤 為 N7-methylguanine。因此如果詳細確認檳榔水萃液中有未知甲基化劑存在，分析 經 檳 榔 水 萃 液 的 DNA 中 N7-methylguanine (N7-MeG) 及 N3-methyladenine (N3-MeA) 是更準確的方法，同時本實驗室先前針對這兩個 adducts 已有準確的 LC-MS/MS 測定法 (Chao et al. 2007; Hu et al. 2011)。

 

 

圖十五、檳榔萃取液直接與 DNA 混合反應後的 adductome map (a) DNA 控制組

(b) DNA 暴露檳榔水萃液

m/z 282

為了進一步確認檳榔水萃液中確實存有未知的甲基化劑，我們大量製造檳榔 水萃液並將其濃縮，與 DNA 反應後添加同位素內標並以 LC-MS/MS (multiple reaction monitoring mode, MRM) 測 定 是 否 會 生 成 N7-methylguanine 及 N3-methyladenine。令人驚訝地，不管是未成熟的檳榔(菁仔)、成熟的檳榔種子、

印度檳榔種子商業性小巧包零食 (pan masala) 及加入菸草的印度檳榔種子商業 性 小 巧 包 零 食 (gutkha) 皆 能 使 DNA 產 生 顯 著 地 N7-methylguanine 及 N3-methyladenine；下圖十六為以 LC-MS/MS 證實未成熟的檳榔水萃液能使 DNA 生成N7-methylguanine 及 N3-methyladenine (Hu and Chao 2012)。

全球約有6 億人口嚼食檳榔，檳榔早被證實會引起口腔癌，先前的研究皆推 測可能是檳榔中的物質經人體轉化代謝為致癌物。本研究領先發現檳榔的水萃物 不須經由代謝就能直接造成DNA 烷基化損傷，且此致癌物濃度不容忽視。此物 質對人體健康產生潛在的致癌因子，讓檳榔食用者容易罹患口腔癌。

圖十六、未成熟的檳榔水萃液直接與 DNA 混合反應後生成 N7-methylguanine 及N3-methyladenine (Hu and Chao 2012)

(8) DNA adductomics 運用於餵食二甲基亞硝胺的小鼠肝臟研究

亞硝胺是一種普遍存於香菸煙霧且毒性強烈的致癌物質，其中又以二甲基亞 硝胺 (N-nitrosodimethylamine, NDMA) 被廣泛研究，每支香菸的主煙流約有 6.3~76 ng 的 NDMA (Tricker et al. 1991)。國際癌症中心 (IARC) 將 NDMA 歸類 為 Group 2A，NDMA 經體內代謝後可造成 DNA 的烷基化傷害，可產生造成 鹼基結構上的甲基化修飾鍵結。因 NDMA 需經由代謝才具反應性，本研究將 NDMA 管餵小鼠 (10 mg/kg)，24 小時後犧牲後取其肝臟進行 DNA adductomic 分析，希望能進一步驗證本方法的廣用度且找出所有可能的 DNA adducts。下圖 十七為控制組與餵食 NDMA 後小鼠肝臟的分析結果，發現從 TIC 圖中無法立 即找出明顯差異。

圖十七、控制組與經NDMA 處理後小鼠肝臟的 CNL 分析結果

根據先前的分析經驗，發現 CNL 模式下質譜分析的 TIC 圖中訊號雜亂，

往往無法有效快速地找出差異性，導致於 TIC 比對效果不好。因此在本實驗在 取得質譜分析結果後，進一步利用軟體 Metabolite ID for Analyst (Version 1.4 Prototype 2) 直接進行特徵圖譜比對。

下圖十八為控制組與處理 NDMA 組的比對結果，軟體快速地找出有差異的 波峰訊號。以最顯著的訊號為例，相對於控制組在層析時間10.70 分鐘，NDMA 組出現一個非常強的特徵訊號。此訊號主要來自 m/z 282.0 ([M+H]⁺)，推斷可能 為 N7-methyl-2’-deoxyguanosine (N7-MedG) 或 O⁶-methyl-2’-deoxyguanosine (O⁶-MedG)。因 NDMA 經代謝後可生成反應性強的甲基偶氮離子，DNA 中的 2’-deoxyguanosine (dG) 含氮鹽基上 N7 及 O⁶ 位置最易與甲基偶氮離子形成共 價鍵結，其分子量會由 dG 的 267 變為 N7-MedG 或 O⁶-MedG 的 281，經 ESI 帶電後 m/z 為 282。

圖十八、控制組與經 NDMA 處理後的小鼠肝臟比對結果

為了驗證小鼠肝臟中所測得的甲基化鍵結物，本研究進一步提供小鼠 NDMA 的前驅合成物質，餵食小鼠二甲基胺的氘化內標 (deuterium labeled dimethylamine, d6-DMA) 與亞硝酸鹽 (Nitrite, NO2-)，劑量濃度為 200 mg/kg (d6-DMA) 與 100 mg/kg (NO2-)，使其在小鼠體內反應形成 d6-NDMA ，24 小時 後犧牲後取其肝臟進行 DNA adductomic 分析，下圖十九為控制組及同時給予 d6-DMA 與 NO2- 後的差異比對結果。

圖十九、控制組與經 d6-DMA+NO2- 處理後的小鼠肝臟比對結果

由於本研究使用的是二甲基胺的氘化內標 (d6-DMA)，結構上原本的氫被取 代成氘，因此與亞硝酸鹽反應後，會形成 d6-NDMA，再經由體內代謝後形成接 上氘化甲基 (CD3) 的 DNA 鍵結物，因此若在相同層析時間能看到 m/z 285 的 CNL 離 子 訊 號 (m/z 282+3 ， 源 自 d3) ， 便 能 更 加 證 實 是 d3-N7-MedG 或 d3-O⁶-MedG 的存在。圖十九中我們也發現與控制組比對之下 d6-DMA 加 NO2-

組，m/z 285 的離子訊號有非常顯著的差異性。我們的動物實驗(圖十八及十九) 皆驗證可能的 N7-MedG 或 O⁶-MedG 確實來自亞硝胺暴露代謝後體內形成的 鍵結物，也驗證此分析方法在動物實驗上的可行性。

(9) 利用 CNL-IDA-EPI 模式分析進行定性分析

CNL 模式分析所得到的 adductome map，展現所有可能 DNA adducts 的層 析時間、離子強度與母離子質荷比 (m/z)。若母離子帶電方式為普遍的 [M+H]⁺， 則可推測此 2’-deoxynucleosides 的分子量為 [M+H]⁺  1；但無法提供足夠的資 訊來確認修飾鹼基的分子結構。因此只能在有限的資訊下猜測可能的修飾鹼基，

進而購買已知的標準品或同位素內標，在 LC-MS/MS 的 MRM 模式下執行比 對確認。然而，若此修飾鹼基是未知的分子，則不可能有標準品或同位素內標可 進行比對。先前的幾個研究在 adductome map 上雖可找出具特殊意義的 DNA adducts，但有些修飾鹼基在缺乏標準品的情況下依然無法進一步確認結構，只能 由毒物代謝活化途徑猜測其可能的鍵結物 (Kanaly et al. 2006)。

本研究引入質譜分析特有的掃描模式：資料依靠收集模式 (information

dependent acquisition, IDA) 於 DNA adductomics 分析系統。所謂 IDA 模式，指 當 LC-MS/MS 進行 CNL 分析時，同時會根據 CNL 掃瞄到的瞬間訊號強度、

質荷比或帶電荷數，將符合設定篩選條件的母離子提取以進行碰撞裂解並量測其 裂解後片段質量分布。因此當執行 CNL 模式時可經 IDA (預設篩選條件)自動 提列出符合條件的母離子，並執行子離子掃描 (enhance product ion scan, EPI)，

如下圖二十所示。如此，便可在一次注射分析中同時獲得 adductome map 及每 一可能 DNA adducts 的離子斷片資訊，這將十分有助於修飾鹼基分子結構的推 定。

圖二十、運用資料依靠收集模式 (IDA) 於 DNA adductomics 分析

本研究利用 CNL-IDA-EPI 模式針對小鼠暴露 NDMA 後的肝臟進行分析量 測，IDA 設定的篩選條件門檻為訊號高度大於 2000 cps，且在一次 CNL 掃描裡 的前三名最大的訊號，皆會被挑選出來在 Q2 碰撞並收集 EPI 的碎片分析。設 定條件參數於表八。例如，經 NDMA 暴露 (圖二十一) 或給予 d6-DMA+NO2- (圖二十二) 後的小鼠肝臟 DNA 經 CNL-IDA-EPI 分析， m/z 282 被 IDA 系統 挑選出並進行 EPI 斷片掃描。從結果中可發現，m/z 282 經碰撞後的斷片指紋 與先前本實驗室分析N7-methylguanine 的斷片文獻相符合 (Chao et al. 2007)；皆 會產生 m/z 149 與 m/z 124 等主要斷片。經由所得到的結構斷片訊息，我們進 而推定 m/z 282 (RT=10.70 min) 的訊號應為 N7-methyl-2'-deoxyguanosine。而給 予d6-DMA+NO2- 後，雖然 m/z 285 母離子強度較低，導致碰撞後的碎片訊息較 少，但依然有看到 m/z 152 (m/z 149+3) 的訊號。

表八、CNL-IDA-EPI 分析參數表

CNL

Start (amu) ~ stop (amu) 220-600

Loss of (amu) 116

Declustering potential, V 30 Entrance potential voltage, V 10

Scan time (s) 1.0

Collision-induced dissociation gas flow Medium Collision energy, V 10-30 Collision cell exit potential, V 15

IDA

Abundance above (cps) 2000 Most of intense peak 3

Exclusion for (s) 20

EPI

Collision energy CE spread (35 ± 10V) Start (amu) ~ stop (amu) 50-600

Declustering potential, V 30 Entrance potential voltage, V 10 Collision-induced dissociation gas flow High Collision cell exit potential, V 15

圖二十一、CNL-IDA-EPI 分析 NDMA 暴露後的小鼠肝臟

圖二十二、CNL-IDA-EPI 分析 d6-DMA+NO2- 暴露後的小鼠肝臟

本研究進一步利用資料庫進行比對，此資料庫係先前實驗DNA 直接與強甲 基化劑 MMS 直接反應後分析建立。我們將小鼠肝臟以 CNL-IDA-EPI 分析得到 N7-MedG 斷片訊息放到資料庫中進行比對，如圖二十三顯示 NDMA 暴露組 m/z 282 的斷片指紋與資料庫內的 N7-MedG 比對是一致的，特徵吻合 (Fit) 高 達 97.289%，且反向搜尋 (RevFit) (用資料庫圖譜與該數據反向比對) 的特徵吻 合也有 99.784%。未來將持續建置更多的 DNA 鍵結物結構斷片訊息進入資料 庫，相信將極有助於 DNA adductomic 在生物醫學領域的定性研究應用。

圖二十三、CNL-IDA-EPI 斷片訊息與資料庫進行特徵比對

五、成果自評

本研究四年來成功發展DNA adductomics 分析法，所開發 DNA adductomics 質譜研究法，將可提供生物醫學領域嶄新的技術平台，以作為臨床(如化療)、化 學預防或毒物暴露評估的重要研究工具。

本研究計劃經費支持下共發表SCI 期刊論文 9 篇，成果豐碩：

1. Chiung-Wen Hu, Marcus S. Cooke, Yi-Hung Tsai and Mu-Rong Chao*

(Corresponding Author). 8-Oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2-

-deoxyguanosine concentrations in various human body fluids: implications for their measurement and interpretation. Archives of Toxicology, 2015, 89:201-210.

(SCI; Impact factor = 5.980, Ranking in Toxicology = 6/87 = 6.9%).

2. Chiung-Wen Hu, Jian-Lian Chen, Yu-Wen Hsu, Cheng-Chieh Yen and Mu-Rong

Chao* (Corresponding Author). Trace analysis of methylated and

hydroxymethylated cytosines in DNA by isotope-dilution LC-MS/MS: first evidence of DNA methylation in Caenorhabditis elegans. Biochemical Journal, 2015, 465:39-47. (SCI; Impact factor = 4.396, Ranking in Biochemistry &

Molecular Biology = 67/289 = 23.2%).

3. Mu-Rong Chao, Domniki Fragou, Panos Zanos, Chiung-Wen Hu, Alexis Bailey, Sofia Kouidou and Leda Kovatsi. Epigenetically modified nucleotides in chronic heroin and cocaine treated mice. Toxicology Letters, 2014, 229:451-457. (SCI;

Impact factor = 3.262, Ranking in Toxicology = 21/87 = 24.1%).

4. Chiung-Wen Hu, Yu-Wen Hsu, Jian-Lian Chen, Lai-Man Tam and Mu-Rong

Chao* (Corresponding Author). Direct analysis of tobacco-specific nitrosamine

NNK and its metabolite NNAL in human urine by LC-MS/MS: evidence of linkage to methylated DNA lesions. Archives of Toxicology, 2014, 88:291-299.

(SCI; Impact factor = 5.980, Ranking in Toxicology = 6/87 = 6.9%).

5. Mu-Rong Chao* (Corresponding Author), Pavel Rossner Jr., Siamak Haghdoost, Hueiwang Anna Jeng and Chiung-Wen Hu. Nucleic acid oxidation in human health and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2013, 2013:368651. (SCI; Impact factor = 3.516, Ranking in Cell Biology = 82/184 = 44.6%)

6. Chiung-Wen Hu, Huei Lee, Jian-Lian Chen, Yi-Jie Li and Mu-Rong Chao*

(Corresponding Author). Optimization of global DNA methylation

measurement by LC-MS/MS and its application in lung cancer patient. Analytical

and Bioanalytical Chemistry, 2013, 405, 8859-8869. (SCI; Impact factor = 3.436,

Ranking in Chemistry, analytical = 13/74 = 17.6%)

7. Chiung-Wen Hu and Mu-Rong Chao* (Corresponding Author). Direct-acting DNA alkylating agents present in aqueous extracts of areca nut and its products.

Chemical Research in Toxicology, 2012, 25, 2386-2392. (SCI; Impact factor = 3.529, Ranking in Chemistry, medicinal = 10/59 = 16.9%).

8. Chiung-Wen Hu, Hung-Hsin Liu, Yi-Jie Li and Mu-Rong Chao*

(Corresponding Author). Direct analysis of 5-methylcytosine and

5-methyl-2'-deoxycytidine in human urine by isotope dilution LC-MS/MS:

correlations with N-methylated purines and oxidized DNA lesions. Chemical

Research in Toxicology, 2012, 25, 462-470. (SCI; Impact factor = 3.529, Ranking

in Chemistry, medicinal = 10/59 = 16.9%).

9. Chiung-Wen Hu, Chih-Ming Chen, Hsin Hui Ho and Mu-Rong Chao*

(Corresponding Author). Simultaneous quantification of methylated purines in

DNA by isotope dilution LC-MS/MS coupled with automated solid-phase extraction. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 402, 1199-1208. (SCI;

Impact factor = 3.436, Ranking in Chemistry, analytical = 13/74 = 17.6%).

其中論文 ”Chiung-Wen Hu and Mu-Rong Chao*. Chemical Research in T

oxicology, 2012, 25, 2386-2392.” 領先證實檳榔水萃物不須經由代謝能直接造 成DNA 烷基化損傷。榮獲美國化學會(ACS)以新聞特稿發佈"Chewing betel qui d exposes half a billion people to direct carcinogens" http://portal.acs.org/portal /PublicWebSite/pressroom/presspacs/CNBP_031032，同步刊登於全球專業新聞網 站，並獲全球發行量最大英文報 The Times of India 選為"8 most popular heal th news of 2012"。

六、參考文獻

Balbo, S., R. J. Turesky, et al. (2014). "DNA adductomics." Chemical Research in Toxicology 27(3):

356-366.

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1

國科會補助專題研究計畫項下出席國際學術會議心得報告

日期：104 年 6 月 1 日

一、參加會議經過 & 與會心得

2015 年國際輻射研究年會在日本京都國際會議廳(Kyoto International Conference Center)舉辦，

今年的主軸為“Radiation Science Shaping the Future of the Earth and Mankind”。輻射科學的範疇廣 大，含括許多分支例如輻射相關物理、化學、生物及醫藥，每個領域近年來都有極大的進展。

由於日本在 2011 年 3 月 11 日的地震引發福島第一原子力發電所(Fukushima Daiichi Nuclear Power Plant)的重大核災事件，成為本次研討會的關注重點。有幾個場次特別針對該事件進行熱烈 討論並交換意見，試圖找出學界與社會的能源共識。此外輻射在醫療上的應用是今年的另一亮點。

輻射對於 DNA 的損傷長久以來備受關注。本實驗室近來對於量測表觀遺傳(epigenetics)的鹼基 修 飾 極 感 興 趣 。 最 新 的 研 究 證 實 5-methyl-2'-deoxycytidine 在 體 內 經 Tet 酵 素 氧 化 為 5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine 是重要的 DNA 去甲基化機制；但外在暴露游離輻射也可造成 5-methyl-2'-deoxycytidine 氧化為 5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine。因此在 ICRR 2015 我們發表了 在尿液中量測 5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine 的質譜技術。相似的概念也在 ICRR 2015 中由加拿

計畫編號 NSC 100-2628-B-040-001-MY4

計畫名稱

質譜法發展新穎的基因鍵結體學(DNA Adductomics):全面評估檳榔及 香菸所造成的 DNA 鹼基修飾

出國人員

姓名 趙木榮 服務機構

及職稱

中山醫學大學職業安全衛生系 教授

會議時間 104 年 5 月 25 日至

104 年 5 月 29 日 會議地點 日本，Kyoto

會議名稱 The 15th International Congress of Radiation Research (ICRR 2015) 發表論文

題目

Quantitative analysis of 5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine in human urine

by automated online solid-phase extraction LC-MS/MS

2

大的著名學者 Jean Cadet 提出，他量測了四個 cytosine 經輻射造成的氧化產物 5-hydroxycytosine、

5,6-dihydroxy-5,6-dihydrouracil 、 5-hydroxyhydantoin 及 1-carbamoyl-4,5-dihydroxy-2-oxoimidazolidine 。 此 外 還 有 5-methylcytosine 的 氧 化 產 物 5-amino-5-methylhydantoin、5-hydroxymethylcytosine 及 5-formylcytosine。這皆暗示著輻射的暴露 可能影響表觀遺傳，亦即基因的表現。

3

二、所發表之論文

Mu-Rong Chao, Yi-Hung Tsai, Chiung-Wen Hu. “Quantitative analysis of 5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine

in human urine by automated online solid-phase extraction LC-MS/MS”. the 15th International Congress of Radiation Research, 3-PS3B-08, May 25-29, 2015, Kyoto, Japan.

4

科技部補助計畫衍生研發成果推廣資料表

日期:2015/10/19

科技部補助計畫

計畫名稱: 質譜法發展新穎的基因鍵結體學(DNA Adductomics)：全面評估檳榔及香菸所 造成的DNA鹼基修飾

計畫主持人: 趙木榮

計畫編號: 100-2628-B-040-001-MY4 學門領域: 公共衛生及環境醫學

無研發成果推廣資料

100年度專題研究計畫研究成果彙整表

計畫主持人：趙木榮 計畫編號：100-2628-B-040-001-MY4

計畫名稱：質譜法發展新穎的基因鍵結體學(DNA Adductomics)：全面評估檳榔及香菸所造成的DNA鹼 基修飾

成果項目

量化

單位

備註（質化說明

：如數個計畫共 同成果、成果列 為該期刊之封面 故事...等）

實際已達成 數（被接受 或已發表）

預期總達成 數（含實際 已達成數）

本計畫實 際貢獻百

分比

國內

論文著作

期刊論文 0 0 100%

篇

研究報告/技術報告 0 0 100%

研討會論文 1 100 60%

專書 0 0 100% 章/本

專利 申請中件數 0 0 100%

已獲得件數 0 0 100% 件

技術移轉 件數 0 0 100% 件

權利金 0 0 100% 千元

參與計畫人力

（本國籍）

碩士生 3 100 100%

博士生 0 0 100% 人次

博士後研究員 1 100 100%

專任助理 2 100 100%

國外

論文著作

期刊論文 9 0 70%

篇

2篇為本計畫獨 力完成，7篇為 2個計劃的共同 成果；有兩篇 Impact

factor大於5。

研究報告/技術報告 9 0 60%

研討會論文 0 0 100%

專書 0 0 100% 章/本

專利 申請中件數 0 0 100%

已獲得件數 0 0 100% 件

技術移轉 件數 0 0 100% 件

權利金 0 0 100% 千元

參與計畫人力

（外國籍）

碩士生 0 0 100%

博士生 0 0 100% 人次

博士後研究員 0 0 100%

專任助理 0 0 100%

其他成果

（無法以量化表達之 成果如辦理學術活動

本計畫研究成果發表於Chemical Research in Toxicology (2012)主題Direct- acting DNA alkylating agents present in aqueous extracts of areca nut and its products，首先證實檳榔子水萃物不須經由代謝能直接造成DNA烷基化

、獲得獎項、重要國 際合作、研究成果國 際影響力及其他協助 產業技術發展之具體 效益事項等，請以文 字敘述填列。）　　

損傷。榮獲美國化學會(ACS)以新聞特稿發佈""""Chewing betel quid exposes half a billion people to direct carcinogens""""

""""http://portal.acs.org/portal/PublicWebSite/pressroom/presspacs/CN BP_031032，同步刊登於全球專業新聞網站，並獲全球發行量最大英文報 The Times of India 選為""""""""8 most popular health news of

2012""""""""。

成果項目 量化 名稱或內容性質簡述

科 教 處 計 畫 加 填 項 目

測驗工具(含質性與量性) 0

課程/模組 0

電腦及網路系統或工具 0

教材 0

舉辦之活動/競賽 0

研討會/工作坊 0

電子報、網站 0

計畫成果推廣之參與（閱聽）人數 0

科技部補助專題研究計畫成果報告自評表

請就研究內容與原計畫相符程度、達成預期目標情況、研究成果之學術或應用價 值（簡要敘述成果所代表之意義、價值、影響或進一步發展之可能性）、是否適 合在學術期刊發表或申請專利、主要發現或其他有關價值等，作一綜合評估。

1. 請就研究內容與原計畫相符程度、達成預期目標情況作一綜合評估

■達成目標

□未達成目標（請說明，以100字為限）

　　□實驗失敗 　　□因故實驗中斷 　　□其他原因 說明：

2. 研究成果在學術期刊發表或申請專利等情形：

論文：■已發表 □未發表之文稿 □撰寫中 □無 專利：□已獲得 □申請中 ■無

技轉：□已技轉 □洽談中 ■無 其他：（以100字為限）

本研究計劃經費支持下共發表SCI期刊論文9篇，成果豐碩。

3. 請依學術成就、技術創新、社會影響等方面，評估研究成果之學術或應用價值

（簡要敘述成果所代表之意義、價值、影響或進一步發展之可能性）（以 500字為限）

本研究四年來成功發展DNA adductomics分析法，所開發DNA adductomics質譜 研究法，將可提供生物醫學領域嶄新的技術平台，以作為臨床(如化療)、化學 預防或毒物暴露評估的重要研究工具。

香菸與檳榔暴露對人體的健康危害，已經無庸置疑。它們在生物體內可形

成的DNA adducts種類繁多，先前的研究皆由鎖定特定化合物來探討各別形成

的DNA adducts，但都無法完整且同一時間描述香菸與檳榔暴露所造成的DNA鹼

基修飾全貌。本研究將可運用於檳榔及香菸暴露所造成的DNA adducts特徵探

討，追朔在檳榔及香菸中尚未知曉的重要致基因毒物作為疾病預防或暴露指標

的重要參考。