紅龍果X病毒之cis-acting elements與缺失性RNA之分析與應用

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國立臺灣大學生物資源暨農學院植物病理與微生物學系

碩士論文

Department of Plant Pathology and Microbiology College of Bioresources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

紅龍果 X 病毒之 cis-acting elements 與缺失性 RNA 之分析與應用

Analysis and application of cis-acting elements and defective RNA of Pitaya virus X

李芷菁 Chih-Ching Lee

指導教授：張雅君博士 Advisor: Ya-Chun Chang, Ph.D.

中華民國 103 年 7 月

July, 2014

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中文摘要

紅龍果為仙人掌科三角柱屬(Hylocereus spp.)之多年生攀附性植物，亦為近年台 灣大力推廣之熱帶水果，其田間栽種植株常遭受病毒為害。目前國內已發現紅龍 果被仙人掌 X 病毒(Cactus virus X, CVX)、蟹爪蘭 X 病毒(Zygocactus virus X, ZyVX) 及紅龍果 X 病毒(Pitaya virus X, PiVX)所感染，且這三種 potexvirus 病毒普遍存在 全台各地紅龍果果園中。PiVX 為本實驗室所發現鑑定之 Potexvirus 屬新病毒，我 們從感染 PiVX 的紅龍果植株萃取總量 RNA，以北方雜合分析發現一些小片段 RNA 與 PiVX 探針有反應；進一步選殖與序列分析，確認其為源自 PiVX 的缺失性 RNA (defective RNA, dRNA)。dRNA 為病毒基因體 RNA 經過缺失與重組後產生的次病毒分子，需輔助病毒(helper virus)提供複製酵素、鞘蛋白與移動蛋白等，才能在寄主體內複製、包被與移行。從紅龍果所選殖到不同長度之 PiVX dRNA 選殖株，先製備成 RNA 轉錄體，再與 PiVX 共同接種菸草原生質體，以篩選在輔助病毒存在下，複製效率最佳的 dRNA。經過數次的原生質體接種試驗，篩選出增殖能力最佳的 P1 dRNA，其保留了 5’端 645 nt 與 3’端 196 nt，總長度為 841 nt。為了將 PiVX dRNA 改造為可應用在植物上的病毒載體，我們以 P1 dRNA 為基礎，

構築兩種以不同方法表現綠色螢光基因(enhanced green fluorescent protein, EGFP) 的載體，分別為 P1-EF 與 P1-E。P1-EF 以複製酶的轉譯架構與外源基因結合，以形成融合蛋白；P1-E 為將 PiVX 鞘蛋白基因之次基因啟動子(subgenomic promoter, SGP)加入 PiVX dRNA 中，以 SGP 表現外源基因。其中，P1-E 已成功在菸草原生質體及白藜植株中表現 EGFP，但表現效率並不高。故嘗試短暫表現基因靜默抑制子 p19 於菸草與白藜植株，以期加強 P1-E 表現 EGFP 之能力；結果在白藜植株上，

p19 對 EGFP 之表現沒有顯著影響。而在非繁殖寄主菸草上，先短暫表現 p19 後再接種 P1-E，可以抗體偵測到 PiVX 鞘蛋白在菸草中累積，但以 GFP 抗體仍然無法 偵測到訊號。此外，欲研究 P1 dRNA 可被 PiVX 辨識並增殖的 cis-acting elements 序列，我們構築數個序列刪除株，同樣以菸草原生質體分析其活性。目前研究結

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果顯示 PiVX dRNA 的 5’端只需保留 435 nt，即可被 PiVX 輔助病毒所辨識並增殖。

另外，我們也由紅龍果中分離出 CVX 的缺失性 RNA，其保留 5’端 677 nt 及 3’端 591 nt，總長度為 1268 nt。進一步將其 RNA 轉錄體與 PiVX 以菸草原生質體測試活性，結果發現 CVX dRNA 可被 PiVX 複製，顯示 CVX dRNA 所保留的序列具有 被 PiVX 複製酶辨識的 cis-acting elements。

關鍵字 : 紅龍果 X 病毒、仙人掌 X 病毒、cis-acting elements、缺失性 RNA、病 毒載體、次基因啟動子

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Abstract

Pitaya, a climbing succulent plant in the family Cactaceae, has gradually become an important economic fruit in Taiwan. However, its cultivation is restricted by viral diseases. Cactus virus X (CVX), Zygocactus virus X (ZyVX) and Pitaya virus X (PiVX) have been reported to infect pitaya in Taiwan. These viruses are commonly found in the field. PiVX is a new member of the Potexvirus genus identified in our lab.

We extracted total RNA from infected pitaya and discovered some small RNAs reacting to PiVX probe by Northern blot. After cloning and sequence analysis, we confirmed that these small RNAs are defective RNAs (dRNAs) of PiVX. dRNAs are subviral RNAs produced from RNA virus via deletion and recombination. dRNAs depend on their parental virus (helper virus) to replicate, encapsidate and move in host plant. To select the PiVX dRNAs with best infectivity, transcripts of different dRNA clones from pitaya were analyzed with the help of PiVX transcripts in Nicotiana benthamiana protoplasts by Northern blot. After several independent inoculation assays, we found P1 dRNA, which contains 5’ 645 nt region and 3’ 196 nt region with its total length of 841 nucleotides had the best replication ability. In order to develop PiVX dRNA as a virus expression vector, we used P1-based vector to express enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene by two different ways and thus constructed P1-EF and P1-E. P1-EF combined the open reading frame of RNA-dependent RNA Polymerase (RdRP) with foreign gene to form a fusion protein.

P1-E recruited the subgenomic promoter (SGP) of PiVX into P1 dRNA to express foreign gene through sgRNA expression。According to experimental results, P1-E could successfully express EGFP in N. benthamiana protoplasts and Chenopodium quinoa plants, but the expression efficiency was low. To improve the expression efficacy of P1-E, we tried to express p19, a gene silencing suppressor, in N.

benthamiana and C. quinoa plants. The results indicated p19 had no significant effect on the expression of EGFP in C. quinoa plants. However, when P1-E was inoculated to N. benthamiana plant after transient expression of p19, PiVX CP accumulation increased but EGFP expression could not be detected by GFP antibody. In addition, in order to study the cis-acting elements that can be recognized and replicated by PiVX, we constructed and analyzed some deletion mutants of P1 dRNA in N. benthamiana

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protoplasts. The current result indicated that the dRNA containing only 5’ 435 nt region and 3’196 nt region could still be replicated by helper virus. Furthermore, we also cloned CVX dRNAs from pitaya plant, which contain CVX 5’ 677 nt region and 3’ 591 nt region with its total length of 1268 nucleotides. For testing the biological activity, transcripts of CVX dRNAs together with PiVX were inoculated to N.

benthamiana protoplasts, and Northern blot demonstrated CVX dRNAs could be replicated by PiVX. Accordingly, the result suggested that PiVX RdRP can recognize the cis-acting elements of CVX dRNAs.

Keywords: Pitaya virus X, Cactus virus X, cis-acting elements, detective RNA, viral vector, subgenomic promoter

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壹、前言

一、缺失性 RNA 研究歷史

缺失性病毒最早於動物病毒中發現，1944 年 Friedewald 純化流行性感冒病毒 (influenza virus)時發現有一些不完全病毒顆粒(incomplete virus particles)，且不具有感染能力(Friedewald & Pickels, 1944)。之後，Von Magnus 發現不完全病毒顆粒可以干擾野生型流行性感冒病毒之增殖，但尚不了解其缺失之處(Von Magnus, 1954)。直到 1956 年，Henle 與 Lief 發現不完全病毒顆粒的核蛋白(nucleoprotein) 與表面抗原(surface antigen)比例較野生型病毒低，推測不完全病毒顆粒缺失的部分為基因體核酸(Henle & Lief, 1956)。之後，這些不完全病毒顆粒被稱為 defective interfering (DI) particle (Huang & Baltimore, 1970)。目前已經發現 DI particle 普遍出 現於動物病毒中，但仍與病毒種類、寄主細胞種類與偵測方式有密切關聯(Roux et al., 1991)。

而植物病毒直到 1987 年 Hillman 等人以 Tomato bushy stunt virus (TBSV)接種 至菸草(Nicotiana clevelandii)時，發現菸草病徵有減緩的現象，抽取菸草 RNA 並以 北方雜合反應分析，此情況伴隨約 0.4 kb 的小分子 RNA 出現(Hillman et al., 1987)。

將 TBSV 與小分子 RNA 共同接種後發現，小分子 RNA 濃度越高，在菸草上的發病程度越緩和，葉片中之病毒量亦相對減少。進一步純化這些小分子 RNA 並進行 定序，發現其與 TBSV 具有序列上的同源性(Hillman et al., 1987)。因這些小分子 RNA 與動物病毒的 DI particle 性質相當接近，故 Hillman 等人認為這群小分子 RNA 應為植物病毒之缺失干擾性 RNA (defective interfering RNA, DI RNA)。因此，TBSV 為第一個被報導具有缺失干擾性 RNA 之植物病毒(Hillman et al., 1987)。

目前已發現有一些植物病毒可產生缺失性 RNA 或缺失干擾性 RNA，包含 tombusviruses (Burgyan et al., 1989；Hillman et al., 1987；Rochon et al., 1991；Rubino et al., 1995)、carmoviruses (Li et al., 1989)、potexviruses (Calvert et al., 1996；White

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et al., 1991；Yeh et al.,1999)、furovirus (Bouzoubaa et al., 1991；Chen et al., 1994)、

bromovirus (Damayamti et al., 1999；Pogany et al., 1995；Romero et al., 1993)、

closterovirus (Mawassi et al., 1995)及 cucumovirus (Graves et al., 1995)等。

二、缺失性 RNA 之形成與特性

多年來在不同的植物病毒中陸續發現，在病毒增殖的過程中，會伴隨一些小分子 RNA 出現，且有些具有干擾病毒增殖與病徵表現的能力。目前已知這些小分子 RNA 包含衛星核酸(satellite RNA)、衛星病毒(satellite virus)(Francki, 1985；

Prody et al., 1985)及缺失干擾性 RNA(Hillman et al., 1987)。這些小分子 RNA 皆不 具有自行增殖之能力，必須依賴輔助病毒(helper virus)協助才能正常增殖，但卻常擁有調節輔助病毒複製或病徵之能力。而缺失干擾性 RNA 來自於其親緣病毒基因體經缺失與重組後產生，故與親緣病毒或親緣關係相近之輔助病毒具序列上之同 源性；衛星核酸與衛星病毒則不具此同源性，來源並不清楚(Francki, 1985；Simon et al., 2004)。植物病毒缺失干擾性 RNA 的輔助病毒通常為其親緣病毒，但亦有缺

失干擾性 RNA 可被與親緣病毒序列相似之病毒協助複製之例子 (Takeshita et al., 2009)。不具有干擾病徵表現能力的病毒缺失株則稱為缺失性 RNA (defective RNA) (Chen et al., 1994；White et al., 1991)。而也有少部分植物病毒缺失干擾性會使病徵 加重(Li et al., 1989；Romero et al., 1993)。。

缺失性 RNA 源自於其輔助病毒序列片段組成(White & Morris, 1999)，其與輔助病毒的複製相同，需藉由輔助病毒的複製酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)合成，故目前對於缺失性 RNA 的形成機制有兩種假說(Pathak & Nagy, 2009)。第一種機制為 replicase driven template-switching mechanism : 當病毒基因體 RNA 進行複製時，複製酶攜帶尚未複製完成之新股 RNA 自原本的模板股脫落，

移至下游或另一模板股上重啟複製，而合成重組突變株(Nagy & Simon, 1997)。第二種機制為 forced template-switching mechanism:在複製酶已經完成新生 RNA 合成

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或未完成時，複製酶自模板股脫落並移至另一模板股重啟複製，但新生的 RNA 會受到寄主細胞之內切酶(endoribonuclease)或外切酶(exoribonuclease)作用而斷裂，再重新接合產生缺失性 RNA (Zhang & Nuss, 2008)。其中，第一種機制被認為是缺失性 RNA 最有可能形成的機制(Pathak & Nagy, 2009)，許多研究顯示進行生體外 RNA 複製時，當捐贈股(donor template)上具有斷裂、髮夾狀構造(hairpin structures)及富 含 AU 片段時，複製酶較有機會脫落(Cheng et al., 2002；Cheng & Nagy, 2003；Pogany

& Nagy, 2008；Wierzchoslawski & Bujarski, 2006)；而當複製酶脫落時攜帶之新生 RNA，與獲贈股(acceptor template)有 2-5 個核苷酸具互補性，即可使複製酶重啟複製(Nagy & Simon, 1997)。而缺失干擾性 RNA 及缺失性 RNA 依其基因體的組成型態可區分成兩型 : 嵌紋型(mosaic type)及單一片段移除型(single internal deletion type)。嵌紋型為由親緣病毒基因體數個不連續的區域片段直接或是部分重組後接 合而成(Hillman et al., 1987)；單一片段移除型為親緣病毒基因體中間序列發生大片 段的移除，只保留親緣病毒的5’及 3’端不等長的序列重新組合而成(Li et al., 1989；

White et al., 1991)。因缺失干擾性或缺失性 RNA 的基因體比輔助病毒短，且必須 仰賴輔助病毒方能增殖，故其保留的序列必定具有可被輔助病毒之複製酶 (RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)辨識的 cis-acting elements (Li & Simon, 1991；White et al., 1991)。

三、缺失性 RNA 之應用

缺失性 RNA 為由親緣病毒基因體經缺失及重組而形成，其基因體序列較一般病毒短非常多，以此進行分生研究較為容易，故為病毒學常用的工具。而因缺失性 RNA 普遍擁有較高的演化速度，故常以缺失性 RNA 進行病毒演化及 RNA 重 組的研究(Sztuba-Solińska et al., 2011)。缺失性 RNA 需輔助病毒之協助，才能進行 正常的複製、包被或移行，其所保留的序列必定有可被輔助病毒之蛋白辨識的 cis-acting elements ，故可以缺失性 RNA 進行輔助病毒序列特性之研究

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(Lewandowski & Dawson, 1998；Lough et al., 2006)。此外，大多數的缺失干擾性 RNA 具有減緩親緣病毒造成的病徵表現，使其具有於植物保護上應用的潛力，如 將蕙蘭輪點病毒(Cymbidium ring spot virus, CymRSV)的缺失干擾性 RNA 以轉基因 之方式，使菸草自行轉錄出缺失干擾性 RNA，成功使 CymMV 造成的病徵大幅減 輕(Kollàr et al., 1993)。另外，許多缺失性 RNA 具有轉譯架構，可在寄主細胞中轉 譯出重組蛋白；此種特性使缺失性 RNA 具有成為病毒載體，表現外源蛋白之潛力 (Sandoval et al., 2008)；且因缺失性 RNA 序列長度較短，複製能力較輔助病毒佳，

表現外源蛋白量較一般的病毒載體高，為其極大的優勢(Lico et al., 2008；Qiu &

Scholthof, 2007)。

四、病毒載體之研究

病毒載體為常用表現外源蛋白的方式，利用病毒接種之方便性，且感染寄主植物後大多會快速大量複製，因此外源基因伴隨著大量表現；且若病毒本身寄主 範圍廣泛，則可以在許多不同的寄主上表現外源基因(Scholthof et al., 1996)。而由 於病毒複製過程中，鞘蛋白的累積量較多，且於寄主植物中表現較為穩定，故以病毒之鞘蛋白次基因啟動子(subgenomic promoter, SGP)表現外源蛋白，成為構築植 物載體常用之工具(Dawaon et al., 1989；Chapman et al., 1992)；且使用完整的 SGP 序列表現外源基因，可有效增加外源蛋白的表現量(Grdzelishvili et al., 2000)。1992 年 Chapman 等人嘗試以 Potato virus X (PVX)當作載體，以 PVX 之鞘蛋白的啟動子 在菸草(N. clevelandii)上表現外源基因 β-glucuronidase (GUS)，結果發現 GUS 蛋白 確實可以大量表現，且可隨著病毒移動至系統葉(Chapman et al., 1992)。同樣使用 PVX 載體，以綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因取代 GUS 基因，也可得到相同的結果，且 GFP 在 UV 光下會有綠色螢光出現，可藉此來觀察病毒於 植物中之移動情形(Baulcombe et al., 1995)。而與 PVX 同屬於 Potexvirus 屬可感染 紅龍果的蟹爪蘭病毒 X (Zygocactus virus X, ZyVX)，也有利用其鞘蛋白基因啟動子

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在白藜表現外源基因的例子(Koenig et al., 2006)。但是由於病毒序列很長，其複製 時較常出現錯誤，且病毒移動時可能會剔除外源基因(Dawson et al., 1989)；而缺失 性 RNA 的序列較短，實驗較容易操作，且其被輔助病毒複製的效率很高；故 Burgyán 等人於 1994 年以 CymRSV 的缺失干擾性 RNA 當作病毒載體，結果發現確實可以 表現外源蛋白，但其表現效率與蛋白的插入位置相關(Burgyán et al., 1994)。此後陸 續有許多利用缺失干擾性或缺失性 RNA 作為載體之報導，且都可穩定大量表現外 源蛋白(Komarova et al., 2006；Qiu & Scholthof, 2007；Sandoval et al., 2008)。另外，

以缺失性 RNA 表現外源蛋白時，可同時研究病毒的分子特性；Lough 等人構築 PVX 5’端不同長度的人工刪除突變株，並以這些突變株表現 GFP，藉由綠色螢光的表現 來尋找與 PVX 細胞移動相關的 cis-acting elements (Lough et al., 2006)。

五、基因靜默抑制子之應用

植物因應病毒的攻擊，演化出病毒誘導基因靜默(virus-induced gene silencing, VIGS)與轉錄後基因靜默(posttranscriptional gene silencing, PTGS)抵禦病毒(Vance,

& Vaucheret, 2001)。而目前已經發現有些病毒存在 VIGS 與 PTGS 的抑制子，包括 potyviruses 之 helper component-proteinase (HC-Pro) (Anandalakshmi et al., 1998)與 Tomato bushy stunt virus (TBSV)之 p19 蛋白(Voinnet et al., 1999)。其中，Qiu 等人於

2002 年發現將 TBSV 以及欠缺 p19 的缺失干擾性 RNA 共同接種在菸草(N.

benthamiana)，會誘發 PTGS；但若再表現 p19 蛋白，則會使 PTGS 延遲發生；此

結果顯示 p19 是個很有效的 PTGS 抑制子(Qiu et al., 2002)。此外，p19 也會加強病 毒的系統性感染(Qu & Morris, 2002)。另外，Komarova 等人於 2006 年嘗試將 PVX 的 TGB1、TGB2、TGB3 及 CP 基因以報導基因 GFP 取代，並保留 SGP1，以此來 表現 GFP；而因缺乏 CP 會影響 PVX 的移動性，故以農桿菌注射法在菸草(N.

benthamiana)上表現 GFP。結果顯示 PVX 缺失株比全長病毒表現更多 GFP；且共 同表現 HC-Pro 與 GFP 之菸草葉片，所測到的 GFP 表現量較多(Komarova et al.,

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2006)。故以植物病毒表現外源蛋白時，共同表現基因靜默抑制子是不錯的方法。

六、紅龍果病毒 X 及仙人掌病毒 X 之介紹

紅龍果病毒 X (Pitaya virus X)及仙人掌病毒 X (Cactus virus X)，同屬於 Potexvirus 屬之病毒，且皆可感染紅龍果，為少數發現之紅龍果病毒(毛, 2008；劉,

2000)。PiVX 為本實驗室於陽明山紅龍果園分離並鑑定之一種新病毒，其為絲狀、

單鏈正意股 RNA 病毒，長約 450-500 nm，寬約 12-13 nm，基因體不包含 polyA 為 6677 個核苷酸(毛, 2008)。PiVX 可系統性感染紅龍果及白藜，在紅龍果上引起嵌 紋病徵，而於白藜上產生褪綠和壞疽病斑；另外，在紅藜 (Chenopodium amaranticolor)、番杏(Tetragonia expansa)及羽狀雞冠花(Celosia argentea)只能感染

接種葉(李, 2010)。經由全台各地紅龍果園之樣本採集與檢測，發現台北、宜蘭、

彰化及台東之紅龍果園皆已受到 PiVX 感染，PiVX 似乎已成為台灣紅龍果栽培的威脅因子(毛, 2008)。故本實驗室已於 2010 年構築 PiVX 具感染力的選殖株，供 PiVX 之相關研究使用。

而 CVX 在美國及歐洲都曾被報導，可能存在世界各地的仙人掌植物(Berck, 1971)；其病毒顆粒為絲狀，長度約 520 nm，寬度約 13 nm，基因體大小約 6.5 kb (Attathom et al., 1978)。劉瑞芬老師實驗室於 2000 年首先由台灣新竹地區分離出 CVX-Hu 病毒株，為第一個發現的紅龍果病毒病原(劉, 2000)。本實驗室也於 2006 年間分離出 CVX-NTU 病毒株，CVX-NTU 在白藜上造成的病徵 CVX-Hu 略有不同，前者為產生退綠斑點，後者為退綠壞疽之侷限性病斑(呂, 2007)。

七、 PiVX 缺失性 RNA 及鞘蛋白次基因啟動子(subgenomic promoter, SGP)之研究 陳君弢學長發現重複繼代接種 PiVX 的白藜會有小分子 RNA 出現，經過選殖後發現這群小分子訊號為 PiVX 的缺失性 RNA，之後更發現長期感染 PiVX 的紅龍果植株亦有缺失性 RNA，與於白藜中發現的缺失性 RNA 共同選殖出 9 種類型的

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PiVX 缺失性 RNA (陳, 2012)。將 9 種缺失性 RNA 與 PiVX 共同接種至白藜，有 5 種類型可在白藜上被 PiVX 增殖，包括由白藜選殖出的 PiVX-N1、PiVX-N2、

PiVX-N4、PiVX-N5，以及由紅龍果選殖出的 PiVX-P1。這些缺失性 RNA 皆為單 一片段移除型(Li et al., 1989)，保留 5’ 645 nt-859 nt 及 3’ 196 nt-768 nt 的序列。進 一步構築 5’端不同長度刪除株並在白藜上測試，推測 5’端序列範圍 356-562 nt 間，

為 PiVX 缺失性 RNA 在白藜上增殖所必須之序列(陳, 2012)。

次基因體 RNA (subgenomic RNA, sgRNA)之轉錄為單鏈正意股 RNA 病毒表現基因常用的策略，而合成 sgRNA 需藉由次基因啟動子(subgenomic promoter, SGP) 協助。何艾翎學姊以 5’ RACE 配合選殖與定序，定位出 PiVX 鞘蛋白 sgRNA 之轉錄起始點，其位於 PiVX 病毒全長的 5865 個核苷酸。藉由農桿菌注射法於菸草上分析，以轉錄起始點為+1，需保留-43 至+23 之序列，PiVX 鞘蛋白 sgRNA 才能正常表現，故此段序列應為 PiVX 鞘蛋白 sgRNA 的 SGP (何, 2012)。

八、研究動機

由於 PiVX 的寄主範圍狹窄，主要侷限在仙人掌科(Cactaceae)植物與少數指 示植物上，且 PiVX 在紅龍果不會造成嚴重的病徵，已成為一個優良且安全的病毒載體須具備的條件。而陳君弢學長已發現在感染 PiVX 的紅龍果植株上，可分離出 PiVX 的缺失性 RNA(陳, 2012)；加上缺失性 RNA 作為載體，較一般病毒載體容易操作，故本研究欲以缺失性 RNA 作為載體表現外源蛋白。因 PiVX 缺失性 RNA 通常會維持一個轉譯架構，試圖利用此特性以融合蛋白方式表現外源蛋白。另外，

何艾翎學姊已分析出 PiVX 鞘蛋白基因啟動子的位置，一般病毒的鞘蛋白 sgRNA 的表現量比全長基因體 RNA 高(何, 2012)。所以利用 PiVX 缺失性 RNA 表現外源蛋白之方式將分為兩種 : 以融合蛋白形式與利用鞘蛋白次基因啟動子表現。此外，陳君弢學長發現 PiVX 5’端的 356 nt-562 nt 之間應具有 PiVX 缺失性 RNA 於植物組織中累積必須之序列，故我藉由進一步構築 PiVX5’端突變株，以分析 PiVX

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複製相關的 cis-acting elements 區域，期望讓我們更加了解 PiVX 的序列特性，並 提供相關資訊供 Potexvirus 屬植物病毒之研究。

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貳、材料與方法

一、實驗材料

p35S-PiVX5 來自陽明山紅龍果(Hylocereus undatus)之紅龍果病毒 X (Pitaya virus X, PiVX)分離株 PiVX-P37，將全長 cDNA 嵌入帶有 CaMV 35S 啟動子的載體 p35S-GFP (Clonetech, Palo Alto, CA, USA)上，取代 GFP 基因，所構築之全長 cDNA 選殖株(李, 2010)。p35S-PiVX5 可以機械接種方式系統性感染紅龍果及白藜 (Chenopodium quinoa)，並在前者產生嵌紋病徵，在後者上形成褪綠斑點病徵 (李, 2010)。陳君弢學長將 p35S-PiVX5 置換至 pUC119 載體，同時在 PiVX 基因體前方加上噬菌體 T7 啟動子，構築出 pUC-PiVX 選殖株，可用於合成生體外轉錄體，以 接種菸草(Nicotiana benthamiana)原生質體。此外，從已知感染 PiVX 之紅龍果植株 中萃取其全 RNA，發現有天然產生的缺失性 RNA；將 PiVX 缺失性 RNA 選殖至 p35S 載體上，並篩選出具感染力的選殖株(陳, 2012)。本研究利用 PiVX 缺失性 RNA 選殖株 p35S-P1-4 為材料，構築出 pUC-P1，供菸草原生質體接種實驗使用。

pBIN61-GFP 由沈湯龍老師提供，pBIN61-P19-myc-ko 則是由實驗室黃裕雯同 學所構築，以此進行農桿菌注射法於白藜及菸草短暫表現 Tomato bushy stunt virus (TBSV)之 P19 蛋白。

二、實驗植物與栽種

本研究主要使用的植物為菸草(N. benthamiana)及白藜(C. quinoa)。栽種方式為 將適當數量種子放在填滿泥炭土的穴盤上，保持泥炭土濕潤，每日光照 16 小時。

待植物發芽約一週後，將幼苗移至裝有泥炭土與根基旺(3:1)混合介質的黑色軟盆內，一樣維持每日光照 16 小時，每週施用 2 次肥料。待白藜與菸草生長 4-5 週後，

即可進行實驗。

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三、缺失性 RNA 之選殖

(一)小量植物全 RNA 之萃取

取已知感染 PiVX 與 CVX 的田間紅龍果植株，以 Plant Total RNA Extraction Miniprep System (Viogene, Sunnyvale, CA, USA)進行植物全 RNA 萃取。首先秤取植物樣本 0.1 g，置於以 180^oC 處理過的研缽中，並加入適量液態氮，以杵將植物組織磨碎，快速將粉末倒入 1.5 mL 微量離心管中，再加入 450 μL RX 或 PRX buffer，

以震盪器劇烈震盪 10 秒鐘，接著將震盪後的混合液倒入已和 collection tube 組裝好的 shearing tube 中，以 13,000 rpm (Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge, Thermo, Wilmington, USA)離心 2 分鐘，以除去植物殘體。將 collection tube 中所收集之濾液與 230 μL 100%酒精均勻混合，並將混合液移至下方套有 collection tube 的 Plant Total RNA Mini Column 中，以 10,000 rpm 離心 1 分鐘，倒去 collection tube 中的濾液，再加入 500 μL WF buffer，以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，倒去 collection tube 中的濾液。接者，吸取 700 μL WS buffer 加入 Plant Total RNA Mini Column 中，以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，除去 collection tube 中的濾液，重複以 WS buffer 清洗之步驟 1 次。之後將 Plant Total RNA Mini Column 以 13,000 rpm 離心 5 分鐘，以除去殘留之 WS buffer。再將 Plant Total RNA Mini Column 移到 1.5 mL 離心管上，並將蓋子打開，靜置於室溫 5 分鐘，使酒精揮發完全。再加入 40 μL 無菌水，靜置 2 分鐘後，以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，將植物全 RNA 流洗至微量離心管。植物全 RNA 的品質及濃度以 Nanodrop (Nanodrop^®ND-1000, Thermo, Wilmington, USA)確認，取其中 5 μL 以 1% agarose gel/1X TAE 進行電泳，以 UVP 拍照系統分析 (BioDoc-It^TM Image system, Cambridge, UK)，剩餘的 RNA 保存於-80^oC。

(二)反轉錄聚合酶鏈鎖反應

將 11 μL 之植物全 RNA (約 400 ng)置於 1.5 mL 微量離心管中，加入 1 μL 之 5 μM 反向引子(PiVX-dT-Bam 或 NTU-dT-R)與 1 μL 之 10 mM dNTP mix，混合均勻

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後，置於 65ôC 水浴槽 15 分鐘，隨後置於冰上 5 分鐘。之後加入 4 μL 之 5X first-strand buffer (Invitrogen, Carlsbad, USA)、1 μL 0.1 M DTT (Invitrogen)、1 μL 之 rRNAsin (40 U/μL, Promega, Madison, CA, USA)和 1 μL 之 Superscript^TM III Reverse transcriptase (200 U/μL, Invitrogen)，混合均勻。置於 55ôC 反應 1 小時，以合成 cDNA 產物，置於-20ôC 備用。

在 0.2 mL PCR tube 中加入 10 μL 之 5X fusion DNA Polymerase buffer、1 μL 之 10 mM dNTP mix、1 μL 之 5 μM 正向引子(T7-sal-F 或 T7-farm-F)、1 μL 之 5 μM 反向引子(PiVX-dT-Bam 或 NTU-dT-R)，與作為模板之 4 μL 之 cDNA 產物，隨後加入 0.6 μL 之 Phusion DNA Polymerase (2 U/μL, NEB)，最後補水至 50 μL。並以以下條件進行 PCR 反應：94ôC 反應 5 分鐘，接著進行 94ôC/30 秒、55ôC/30 秒、72ôC/1 分鐘，30 個循環反應，最後以 72ôC 反應 10 分鐘，並降溫至 4ôC。取 5 μL 之 PCR 產物，以 1.2% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，確定有預期片段後，再將剩下的 45 μL 之 PCR 產物以相同方式進行電泳，從中切取預期片段，並進行核酸回收。

(三)從膠體回收核酸

核酸回收使用 QIAGEN^®II Gel Extraction Kit (QIAGEN, Duesseldorf, Germany)，將含有預期 DNA 片段之膠體切下，放入 1.5 mL 離心管中，以電子微量天秤秤取膠體重量，再加入 3 倍膠體體積之 QX1 (QIAGEN)與 10 μL QIAGEN II (QIAGEN)，置於 50^oC 水浴槽 10 分鐘，並每隔 2 分鐘上下搖晃，使膠體均勻溶解。

接者以 8,000 rpm 離心 1 分鐘，倒去上清液。再加入 500 μL QX1，輕拍使其中的 QIAGEN II 均勻懸浮，以 8,000 rpm 離心 1 分鐘，倒去上清液。之後加入 500 μL PE buffer，輕拍使 QIAGEN II 懸浮均勻後，以 8,000 rpm 離心 1 分鐘，重複此步驟 1 次。移除上清液，打開蓋子置於室溫風乾 10 分鐘，以除去殘存酒精。最後加入 20 μL 無菌水，輕拍混勻後，置於 50^oC 水浴槽 5 分鐘，再以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，

吸取上清液至新的微量離心管，此即為回收之核酸片段，置於-20^oC 保存備用。

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(四)限制酶截切反應與去磷酸化反應

將 20 μL 之 PiVX 缺失性 RNA 回收產物置於 1.5 mL 微量離心管中，加入 5 μL 之 10X BSA、5 μL 之 10X buffer 3、1 μL 之 BamHI (20 U/μL, NEB)、1 μL 之 SalI (20 U/μL, NEB)，以無菌水補至總體積為 50 μL，於 37^oC 處理 6 個小時後進行核酸回收。同時也將 2 μL pUC119 載體置入 1.5 mL 微量離心管中，加入 2.5 μL 之 10X BSA、2.5 μL 之 10X buffer 3、0.5 μL 之 BamHI、0.5 μL 之 SalI，最後以無菌水補 至總體積為 25 μL，於 37^oC 反應 4 個小時後進行核酸回收。隨後各取 1 μL 產物以 1.2% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析並定量。

將 20 μL 之 CVX 缺失性 RNA 核酸回收產物以 BamHI-HF (20U/μL, NEB)進行 酶切，再進行核酸回收。而經 BamHI 處理的 pUC119 載體則需進行去磷酸化反應 : 加入 5 μL 10X Antartic phosphatase buffer (NEB) 及 1.5 μL 之 Antartic phosphatase (5 U/μL, NEB)，並以水補至總體積為 50 μL，於 37^oC 反應 30 分鐘，再於 65^oC 反應 10 分鐘，去除酵素活性。隨後以 1.2% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，並進行核酸回收。

(五)接合反應

取 1 μL 純化後的 pUC119 置於 1.5 mL 微量離心管中，加入 1.5 μL 之 10X Ligation buffer (Fermentas, Burlington, Ontario, Canada)、1 μL 10 mM ATP、1 μL 之 T4 DNA Ligase (5 U/μL, Thermo, Wilmington, USA)，並加入純化之缺失性 RNA 的 cDNA 片段，使總體積為 15 μL。混合均勻後在室溫下反應 3 小時，再進行轉型作用。

(六)轉型作用

由-80^oC 冰箱取出裝有 130 μL Eschericia coli DH5α 菌株之勝任細胞的 1.5 mL 微量離心管，置於冰上使其自然解凍，再將接合反應之全部產物加入其中，輕拍

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混勻後置於冰上 30 分鐘，以 42^oC 熱休克處理 90 秒，再移至冰上 5 分鐘，即可將菌液均勻塗抹於含有 100 ppm ampicillin 之 LA 平板培養基上，於 37^oC 培養箱培養 12-16 小時。

(七)正確選殖株之篩選

1. 菌落聚合酶連鎖反應

隨機挑選上述 LA 平板培養基上之單一菌落進行菌落 PCR，以進行初步篩選。取 0.2 mL PCR tube 加入 4.5 μL 無菌水、0.25 μL 之 5 μM 正向及反向引子 (PiVX-F/M13-F)及 5 μL 2X Taq DNA Polymerase Master Mix RED (Ampiqon;

Tris-HCl pH 8.5, (NH4)2S04, 3 mM MgCl2, 0.2% Tween 20^®, 0.4 mM dNTPs, 0.2 U/µl Ampliqon Taq DNA polymerase, Inert red dye and stabilizer)；接著沾取少量單一菌落置入混合液中，混合均勻後即可進行聚合酶鏈鎖反應。以 TPersonal Thermocycler (Whatman Biometra GmbH, Gottingen, Germany)以下列條件進行反應: 94ôC 反應 5 分鐘，接著進行 94ôC /30 秒、55ôC /30 秒、72ôC /1 分鐘，30 個循環反應，最後以 72ôC 反應 10 分鐘，並降溫至 4ôC。反應完成後以 1% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，挑選符合預期之菌落進行小量質體 DNA 製備。

2. 小量質體 DNA 製備與篩選

挑取單一菌落至含 100 ppm ampicillin 的 5 mL LB 中，於 37^oC 培養箱中以 250 rpm 震盪培養 12-16 小時；然後依據 FavorPrep^TMPlasmid Extraction Mini Kit (Favorgen , Ping Tung, Taiwan)建議之方法進行小量質體 DNA 之製備。將所純化的質體 DNA 以構築時所使用的限制酶，或其他適宜之限制酶進行酶切反應，並以 1%

agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，挑選其中正確的選殖株，進行大量質體製備。

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3. pUC-P1 dRNA 之構築

將 PiVX 天然缺失性 RNA 選殖株 p35S-P1-4 (陳, 2012)，以限制酶 StuI 與 BamHI 進行酶切反應後，將 P1 dRNA 置換至帶有 T7 啟動子的載體上，構築 pUC-P1 dRNA。首先將 p35S-P1-39 與 pUC-PiVX 分別以限制酶 StuI (10 U/μL, NEB)與 BamHI (20 U/μL, NEB)進行酶切反應後，以 1% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，分別挑選 707 bp 與 3242 bp 之片段，進行核酸回收；前者為欠缺 5’端之缺失性 RNA 的 cDNA 片段，後者為帶有缺失性 RNA 之 5’端片段的 pUC119 載體。將兩者進行接 合反應後，與 E. coli DH5菌株之勝任細胞進行轉型作用。並以 PiVX-F 與 M13-F 引子對進行菌落 RCR，初步篩選符合預期之菌落，然後進行小量質體 DNA 製備，

將質體以 StuI 與 BamHI 進行酶切，以確定正確之選殖株並定序，完成 pUC-P1 dRNA 之構築。

4. 序列比對與分析

以 GeneDoc (Multiple Sequence Alignment Editor & Shading Ustility, Version 2.5.000)觀看定序完成之缺失性 RNA，並以 Clustal X (Thompson et al., 1994)進行序 列比對，再以 Vector-NTI (NTI Advance^TM 11.0, Invitrogen, Carlsbad, California, USA) 進行序列分析。並輔以 MFOLD 進行 RNA 二級結構預測。

四、生體外轉錄體之製備 (一) 限制酶直線化質體

取小量製備之質體 DNA：pUC-PiVX、pUC-P1 dRNA、pUC-1P dRNA、pUC-2P dRNA、pUC-5P dRNA，以限制酵素 BamHI 進行酶切反應後，以 1% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，確認其反應完全後，進行核酸回收，回收之直線化質體置於 -20^oC 冰箱備用。

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(二) 生體外轉錄反應

在 1.5 mL 之微量離心管中，加入 1 μg 上述已直線化之質體 DNA 作為模板，

與 5 μL 5X T7 transcription buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、5 μL (ACU)TP (5 mM each)、0.5 μL GTP (5 mM, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)、0.625 μL cap analog (10 mM NEB, Ipswish, MA, USA)、0.5 μL rRNasin (40 U/μL , Promega, Madison, WI, USA) 及 1 μL T7 RNA polymerase (50 U/μL , Invitrogen)，於 37ôC 反應 15 分鐘後，加入 4.5 μL GTP (5 mM)，總反應體積為 50 μL，隨後繼續於 37ôC 反應 75 分鐘。取稀釋 50 倍之 1 μL 生體外轉錄體，以 1% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，並利用 UVP 系統拍照，以 ImageJ 估算生體外轉錄體之產量，剩餘分裝保存於-80ôC 備用。

五、原生質體之製備、接種與分析 (一) 原生質體之製備

使用的所有器具皆以鋁箔紙包覆，於 180^oC 處理 4 小時，以保持無菌及 RNase-free 之狀態。使用的植物為 4-6 週大之菸草，秤取葉片約 5 g，以 700 mL 1%

次氯酸鈉表面消毒 2 分鐘後，以二次蒸餾水漂洗 3 次，以除去殘留之次氯酸鈉，

接著以濾紙吸去葉片殘留之水分。將葉片置於玻璃板上，先以刀片去除中肋，剩餘之葉片再切成約 2 mm x 4 mm 之長條狀，平鋪於兩個玻璃皿中，以 0.2 mM minipore filter (Sartorius, Goettingen, Germany) 過濾 25 mL enzyme digestion buffer [25 mg BSA, 15 mg pectinase, 300 mg cellulose, 25 mL 0.55 M mannitol-0.1% MES (pH5.7) ]，平均分配至兩個培養皿，避光於 25^oC 反應 16 小時。反應完成後，輕輕搖晃培養皿使其內的菸草組織懸浮，再以 150 目尼龍網過濾植物殘體，將濾液平分至 4 支 15 mL 玻璃試管中，以 300 rpm (KUBOTA 2010, Tokyo, Japan )離心 5 分鐘。隨後以玻璃滴管除去上層液，加入 2 mL 0.55 M mannitol-0.1% MES，輕拍打

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試管底部，使沉澱物均勻懸浮。再以玻璃滴管吸取 2 mL 0.55 M sucrose 溶液，伸至試管底部緩慢加入，形成 sucrose cushion。再以 300 rpm 離心 5 分鐘，比重適當的菸草原生質體會累績在 sucrose cushion 與 mannitol-MES 的交界處，形成深綠色層帶。吸取該處之原生質體置於新試管中，再加入 5 mL 0.55 M mannitol-0.1% MES 溶液，輕拍混合均勻。以 300 rpm 離心 5 分鐘，吸去上層液，再加入 2 mL 0.55 M mannitol-0.1% MES 溶液，輕拍使沉澱物懸浮。隨後以 300 rpm 離心 5 分鐘，吸去上層液，將沉澱物重新懸浮於 1 mL 0.55 M mannitol-0.1% MES 溶液中，並集中於一管，均勻懸浮後，於光學顯微鏡下以血球計數器計算細胞數目，平均產量約為 8-11 X 10⁴ cells/mL。

(二) 原生質體之接種

將 4 X 10⁵個菸草原生質體置於 12 X 75 mm 玻璃之指形管中，以 300 rpm (KUBOTA 2010)離心 5 分鐘，除去上清液，留下 100 μL 液體，輕晃使原生質體均勻懸浮，再將適量之生體外轉錄體加入原生質體懸浮液中，輕晃混合均勻，吸出 所有原生質體懸浮液至裝有 150 μL PEG inoculation buffer (Jones et al., 1990)之指 形管中，20 秒內輕拍指形管底部 40 下，並以穩定的速率加入 500 μL 0.55 M mannitol-0.1% MES 溶液 3 次，並輕拍使混合均勻。置於冰上 10 分鐘後，以 300 rpm 離心 5 分鐘。接著吸去上層液，加入 2 mL 0.55 M mannitol-0.1% MES 溶液，並輕拍指形管底部，使沉澱物重新懸浮以洗去殘留之 PEG inoculation buffer。以 300 rpm 離心 5 分鐘，除去上層液，加入 750 μL protoplast culture medium (Jones et al., 1990)，

並輕拍指形管底部，均勻懸浮沉澱物，以石臘膜封口，於 25^oC 光照下培養 48 小時。

(三) 原生質體之全 RNA 之萃取與分析

取培養完成之原生質體輕拍懸浮後，以 300 rpm 離心 5 分鐘，除去上層液後，

將沉澱之原生質體以 Plant Total RNA Extraction Miniprep System 進行小量全 RNA

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之萃取。萃取出之原生質體全 RNA，取 5 μL 以 1% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，剩餘之 RNA 置於-20^oC 冰箱備用，或直接進行北方雜合分析。

六、缺失性 RNA 在白藜上之接種

首先將缺失性 RNA 置換至帶有 CaMV 35S 啟動子的載體上，利用已構築之 p35S-P1dRNA 在 155 nt 處有單一 StuI 切位，以及 pUC119 載體上具有之 BamHI 切 位，將其他的缺失性 RNA 由 pUC 置換到 p35S 載體上，所用之方法與 5.7.3 相同。

本試驗使用 4-5 週之白藜植株，首先配置接種源，在 1.5 mL 微量離心管中加入 20 μg p35S-PiVX 或 p35S-PiVX-dRNAs ，或同時加入 20 μg p35S-PiVX 與 p35S-PiVX-dRNAs，並以 ddH2O 將體積調整至相同。接著輕輕將欲接種之白藜葉片上之白粉抹去，撒上適量之金鋼砂後，將接種源均勻塗抹全葉，每株白藜接種 3 片葉子，於 10 與 20 天後分別收取接種葉與系統葉，進行植物全 RNA 之萃取與分析。

七、北方轉漬與雜合法分析

(一) PiVX 5’端、CVX 3’端與 EGFP 專一性 DNA 探針之製備

以 p35S-PiVX、pUC-CVX3 與 pGR-PiVX-EGFP 為模板，利用 PCR 反應分別製備PiVX 5’端、CVX 3’端與 EGFP 專一性 DNA 探針，使用之引子對如下：PiVX 使用 PiVX-F 與 37-R6 引子，CVX 使用 Farm-F 與 Farm-R1 引子，EGFP 則使用 SacII-EGFP-F 與 XhoI-EGFP-R 引子。取 5 ng 之模板 DNA 加入 0.2 mL PCR tube 中，接著加入 5 μL 10X DyNAzyme^TM buffer (Finnzyme, Espoo, Finland)、2 μL 10X Digoxigenin (DIG)-11-dUTP labeling mix (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)、2.5 μL 5 μM 正向引子與 2.5 μL 5 μM 反向引子，再加入 0.5 μL DyNAyme^TM II DNA Polymerase (2 U/μL, Finnzyme)，最後補水至 50 μL。並以下列條件進行 PCR: 94ôC 反應 5 分鐘，接著進行 94ôC /30 秒、55ôC /30 秒、72ôC /30 秒，

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30 個循環反應，最後以 72ôC 反應 10 分鐘，並降溫至 4ôC。取 2 μL 之 PCR 產物以 1.2% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，確認條帶正確後，稀釋 10 倍，分裝至 0.2 mL PCR tube 中，置於-80ôC 冰箱備用。

(二) 北方轉漬法

取適量植物全 RNA，加入等體積之 2X RNA loading Dye (Fermentas, Bulington, Ontario, Canada)，混合均勻後以 70^oC 加熱 10 分鐘，再放置冰上 5 分鐘，以解開 RNA 的二級結構。接著將處理完之樣品以 1% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，

再利用毛細現象使膠體中的 RNA 轉印至尼龍膜 (Hybond-N⁺, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)上，步驟為：將寬度略大於膠體的濾紙 (3MM, Whatman, England)放在已架於長方盒的玻璃板上，並使濾紙兩端垂入盒內，以接觸盒內之 20X SSC buffer (AMRESCO, Solon, OH, USA)。濾紙完全潤濕後，將膠片背面朝上放在濾紙上，再蓋上已經以 20X SSC buffer 潤濕的尼龍膜與 2 張濾紙，上述步驟皆須避免氣泡存在間隙。接著以石臘膜將膠體周圍密封避免 20X SSC buffer 逸散，並覆蓋適量之擦手紙或吸水海綿，其上以重物壓住，於室溫下靜置 12-16 小時。

(三) 北方雜合反應

轉漬完成後，將尼龍膜小心取出，略為風乾後進行 UV crosslinking (UV Stratalinker 1800, Stratagene, La Jolla, CA, USA)，使 RNA 固定於尼龍膜上。接著以廠商(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)建議之方法略加修改後進行。以鑷子將尼龍膜放入內有 20 mL hybridization solution 之雜合管中，於 50ôC 之雜合箱 (YIH DER HR-80, Taiwan)中，以 10 rpm 進行 pre-hybridization 反應 1 小時。DNA 核酸探針在使用前須進行變性反應，將已分裝之 20 μL DNA 探針於 96ôC 作用 10 分鐘，再移至冰上冷卻 5 分鐘，短暫離心後加入 hybridization solution，於 50ôC 下轉速 10 rpm 進行雜合反應 12-16 小時。

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反應完成後，取出尼龍膜，加入適量高鹽溶液(2X SSC, 0.1% SDS)於室溫震盪漂洗 2 次，每次 10 分鐘。再加入適量預熱至 65^oC 之低鹽溶液(0.1X SSC, 0.1% SDS) 於 65^oC 震盪漂洗 2 次，每次 15 分鐘。接著以適量之 Buffer I (11.61 g maleic acid, 30 mL 5 M NaCl, 8 g NaOH, 加 ddH2O 至 1 L)於室溫浸洗尼龍膜 1 分鐘，再以 100 mL Buffer II (10 mL 10% Blocking reagent, 90 mL Buffer I)於室溫下以 50 rpm 震盪 30 分鐘。接著取 1 μL alkaline phosphate-conjugated anti-DIG antibody (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)加入 20 mL 之 Buffer II，於室溫下以 50 rpm 震盪 45 分鐘。然後以適量 Buffer I 於室溫下清洗 2 次，每次 15 分鐘。清洗完畢後取出尼龍膜至透明塑膠袋中，加入 600 μL CDP-Star (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)，於黑暗中作用 15 分鐘後，除去多餘溶液後封口，以 X 光底片進行曝光，沖洗底片後即可觀察結果。

八、pUC-P1-EF 及 pUC-P1-E 之構築

欲以 P1 dRNA 作為表現載體以表現外源蛋白，我選擇以產生融合蛋白與利用 PiVX 鞘蛋白次基因體 RNA 啟動子，兩種不同策略表現綠色螢光蛋白，因此構築 pUC-P1-EF 及 pUC-P1-E。首先設計帶有 SacII 切位之反向引子 P1-SacII-R，以及帶 有 HpaI 及 XhoI 切位之反向引子 P1-HpaI-XhoI-R，配合正向引子 PiVX-map-F1，

利用反向聚合酶鏈鎖反應(inverse PCR)在 pUC-P1 的 RdRP 與 CP 之間新增加 SacII 切位，以構築 pUC-P1S；或是創造出 HpaI 與 XhoI 切位，以構築 pUC-P1HX。方 法如下：取一 0.2 mL PCR tube 加入 3 ng pUC-P1 dRNA、4 μL 之 5X fusion HF buffer (NEB, Ipswish, MA, USA)、1 μL 之 10 mM dNTP mix、1 μL 之 5 μM 正向引子、1 μL 之 5 μM 反向引子，隨後加入 0.6 μL 之 Phusion DNA Polymerase (2U/μL, NEB)，最後補水至 20 μL，混合均勻後進行 inverse PCR。反應條件如下: 96ôC 反應 5 分鐘，接著進行 96ôC /30 秒、60ôC /1 分鐘、72ôC /5 分鐘，25 個循環反應，最後以 72ôC 反應 10 分鐘，並降溫至 4ôC。

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將核酸純化後，接著進行磷酸化反應：取一 1.5 mL 離心管加入 1.5 μL 10X T4 DNA ligase buffer (Fermentas, ulington, Ontario, Canada)、1 μL 10 mM ATP 與 1 μL T4 polynucleotide kinase (10 U/μL, NEB)，並加入純化後的 PCR 產物至總體積為 15 μL，置於 37^oC 作用 1 小時。再加入 0.5 μL 10X T4 DNA ligase buffer、1 μL 10 mM ATP、0.5 μL T4 DNA ligase (5 U/μL, Thermo, Wilmington, USA)及 3 μL ddH₂O，於室溫下作用 4 小時，即可進行大腸桿菌轉型。經過菌落 PCR 與酶切反應篩選正確菌落，並製備小量質體 DNA。

將 pGR-PiVX-EGFP (何, 2012)與帶有 SacII 切位的 pUC-P1S，分別以 SacII 及 XmaI 酶切後，以 1% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，從中挑選預期片段，並進

行核酸回收，接著進行接合反應，以大腸桿菌進行轉型作用後，再進行菌落 PCR 篩選，經過小量質體製備並經酶切確認後，再由定序確定無誤，即完成 pUC-P1-EF 之構築(圖四)。以相同方式利用 HpaI 及 XhoI 對 pGR-PiVX-EGFP 和帶有 HpaI-XhoI 切位的 pUC-P1HX 進行酶切，電泳分析，核酸片段純化與接合反應，以構築 pUC-P1-E (圖四)。

九、p35S-P1-E 與 pGR-P1-E 之構築

已構築完成之 p35S-PiVX-P1 ( 陳 , 2012) 與 pGR-PiVX ( 何 , 2012) ，以及 pUC-P1-E 皆帶有 StuI 及 BamHI 之切位，因此使用這兩種酵素對三種質體 DNA 進 行酶切，以及後續之接合反應，而完成 p35S-P1-E 與 pGR-P1-E 之構築，所使用之方法與 5.7.3 相同。

十、影響 PiVX 複製之 cis-acting elements 分析 (一) 構築 5’端不同長度之缺失性 RNA

利用可和 pUC-PiVX-P1 dRNA 之 CP 保留區域起始位置專一結合之正向引子 PiVX-map-F1 ，及設計與 RdRP 保留區域不同位置專一性結合之反向引子 PiVX-map-R3 與 PiVX-map-R4 ，以下列配方配置 PCR 反應溶液： 3 ng 之

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pUC-PiVX-P1 dRNA、3 μL 5X Phusion HF buffer (NEB, Ipswish, MA, USA)、1 μL 10 mM dNTP mix、1 μL 之 5 μM 正向引子 PiVX-map-F1、1 μL 之 5 μM 反向引子 (PiVX-map-R3 與 PiVX-map-R4)、1 μL Phusion DNA polymerase (2 U/μL, NEB)，補水至 20 μL，反應條件為: 96ôC 反應 5 分鐘，接著進行 96ôC/30 秒、55ôC/1 分鐘、

72ôC/3 分鐘，25 個循環反應，最後以 72ôC 反應 10 分鐘，並降溫至 4ôC。取 1 μL 產物以 1% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，確定為預期片段大小後，將剩餘產物進行核酸回收。

隨後進行磷酸化反應，於 1.5 mL 微量離心管中加入 11.5 μL 核酸回收產物，接著加入 1.5 μL 之 10X T4 ligase buffer (Fermentas, Burlington, Ontario, Canada)、1 μL 之 10 mM ATP 與 1μL 之 T4 Polynucleotide kinase (NEB)，總體積為 15 μL，於 37^oC 反應 1 小時。接著進行接合反應，將 0.5 μL 之 10X ligase buffer (Fermentas)、1 μL 之 10 mM ATP、與 0.5 μL 之 T4 DNA Ligase (5 U/μL, Thermo, Wilmington, USA)加入至上述產物中，並補水至 20 μL，於 4^oC 反應隔夜後，進行轉型作用。以 PiVX-F 與 M13-F 作為引子對進行菌落 PCR，挑選符合預期之菌落進行小量質體 DNA 製 備，將製備完成之質體 DNA 以 PvuII 進行酶切，以確定取得正確之刪除突變株，

稱之為 pUC-P1-R3 與 pUC-P1-R4。

(二) 菸草原生質體接種與分析

使用 4-5 週之菸草植株，並將菸草原生質體分離後，以 PiVX 之生體外轉錄體與 P1-R3/P1-R4 之生體外轉錄體，共同或單獨接種(莫耳數比 1:10)，經過 48 小時後抽取原生質體全 RNA，並以北方雜合反應進行分析。

十一、接種紅龍果實生苗

單獨或共同接種 p35S-PiVX 與 p35S-P1-EGFP 各 20 μg 至白藜葉片，接種後 20 天採收白藜系統葉約 1g，加入 500 μL 0.01 M sodium phosphate buffer (pH 7.4)，在

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經 180^oC 烘箱滅菌之研缽內以杵磨碎。接著以數支蟲針沾取汁液，再戳於紅龍果實生苗之三角莖，可連戳多次。經過一個月再萃取紅龍果全 RNA，同時可取一部份組織進行鏡檢，以觀察是否有綠色螢光蛋白表現。

十二、以農桿菌注射法進行病毒選殖株之接種 (一) 農桿菌轉型

利用液態氮冷凍法將 pGR-PiVX、pGR-P1-EGFP、pBIN61、pBIN61-P19 及 pBIN61-GFP 轉型至農桿菌 Agrobacterium tumefaciens 菌株 C58C1 中。取 1 μg 欲 轉入之質體 DNA 加至勝任細胞中，輕拍後丟入液態氮 1 分鐘，再移至 37^oC 水浴 5 分鐘，接著加入 1 mL 2X DYT 培養液，置於 28^oC 培養箱以轉速 250 rpm 震盪培養 2 小時。以 13,000 rpm (Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge, Thermo, Wilmington, USA)離心 1 分鐘，留下 100 μL 上清液，回溶沉澱物後即可進行塗盤，約 2-4 天可看到單一菌落於培養基上生長。

(二) 農桿菌注射法

從培養基上挑選單一菌落至含有 50 ppm kanamycin 之 LB 培養液中，於 28^oC 培養箱以轉速 250 rpm 震盪培養 12-16 小時。以 MMA [10 mM MES (pH 5.6), 10 mM MgCl2, 200 μM acetosyringone]對半稀釋，並以 5500 rpm (Centrifuge Z 383 K, Hermle, Wehingen, Germany)離心 15 分鐘，去除上清液後，加入 1 mL MMA 回溶沉澱物，

並將菌液濃度調至 OD600等於 0.5，即可用無針頭之 1 mL 針筒注射 4 週大的菸草與白藜，所注射的葉片為第 3、4 與 5 片本葉。

十三、以農桿菌注射表現 Tomato bushy stunt virus (TBSV) P19 蛋白於菸草及白藜 (一) 以農桿菌表現 P19 蛋白後再表現 EGFP

取 4-5 週大的菸草及白藜植株，以農桿菌注射法表現 pBin61-P19-myc-ko 及

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pBin61，一天後再共同接種 p35S-PiVX 及 p35S-P1-E 至有注射農桿菌的菸草與白藜，接種方法與方法六相同；經過 5 天後收取接種葉，以 anti-GFP 及 anti-PiVX 鞘蛋白之一次抗體進行西方轉漬分析，並偵測綠色螢光蛋白表現情形。

(二) 以農桿菌表現 P19 與 EGFP

取 4-5 週大的菸草及白藜植株，將 pGR-PiVX 及 pGR-P1-E 與 pBin61-P19-myc-ko 或 pBin61 共同以農桿菌注射法處理葉片，5 天後收取接種葉片，進行西方轉漬分析。

十四、西方轉漬分析法

(一) 聚丙烯醯氨膠體電泳

以 Hofel 蛋白質電泳系統 (Mighty Small II E 250, Pharmacia Biotech) 進行聚丙烯醯氨膠體電泳。首先製備 12.5%之分離膠體(separating gel)：在燒杯中依序加入 12.6 mL ddH2O、9.375 mL 40% acrylamide/bisacrylamide、7.5 mL 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 、 0.3 mL 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) 、 0.03 mL N,N,N’,N’-tetramethylethylene diamine (TEMED) 及 0.15 mL 20% ammonium persulfate (APS)；快速搖晃燒杯使溶液均勻混合後，迅速倒入鑄膠器中，並立即加入 1 mL 95%酒精，使膠面平整。靜置約 30 分鐘後，倒除酒精。接著配置 5%焦集膠體 (stacking gel) : 在燒杯中依序加入 9 mL ddH₂O 、 1.875 mL 40%

acrylamide/bisacrylamide、3.75 mL 1.0 M Tris-HCl (pH 6.8)、0.15 mL 10% SDS、0.015 mL TEMED 及 0.12 mL 20% APS，快速搖晃燒杯使溶液混合均勻後，迅速注入約 1-2 mL 之焦集膠體至分離膠體上方，並迅速插入齒梳(comb)。待膠體凝固後，小心移去齒梳，並以清水清洗樣本槽中殘留之凝膠，即可使用。

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(二) 樣品製備及聚丙烯醯氨膠體電泳分析

秤取適量植物樣本，置於以 180^oC 處理之研缽中，並加入適量液態氮，以杵將植物組織磨碎。接著加入植物樣品兩倍量的 GUS extraction buffer (5 mL 0.5 M EDTA, 250 μL 100% Triton X-100, 175 μL 14.3 M β-mercaptoethanol, 0.25 g SDS, 0.83 g NaH₂PO₄, 1.93 g Na₂HPO₄, pH 8.0, 補 ddH₂O 至 250 mL)，以杵混合均勻後，

倒入 1.5 mL 微量離心管，以 13,000 rpm (Centrifuge Z216MK, HERMLE, Wehingen, Germany)離心 10 分鐘。取 15 μL 之上清液和 5 μL 4X SDS sample buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 1% β-mercaptoethanol, 12.5 mM EDTA, 0.02% bromophenol blue)混合均勻，於 96^oC 加熱 10 分鐘，使蛋白質變性。接著將膠片置於電泳槽內，加入處理完畢之樣品後，即可進行電泳。電泳結束後去除焦集膠體，以 Coomassie brilliant R-250 (CBR)染色觀察，之後即可進行西方轉漬免疫反應。

(三) 免疫轉漬分析

主要參考 Molercular Cloning 所描述之方法 (Sambrook and Russell, 2001) : 將電泳結束分離的膠體浸泡在 CAPS (10 mM CAPS, 0.32 mM DTT, 15% methanol, pH 10.5)中，於室溫下以 50 rpm 搖晃 10 分鐘。接著裁剪一張與分離膠體(8.3 X 6.6 cm²) 相同大小之 Hybond^TM- PVDF 膜 (Millipore, Darmstadt, Germany)，與兩張相同大小的濾紙。以甲醇(methanol)浸濕 PVDF 膜，再浸泡於 CAPS 中，並將濾紙也浸泡於 CAPS 內。接著依序在正極之電極板上鋪上一張濾紙、PVDF 膜、分離膠體及濾紙，

並蓋上負極之電極板。以 100 mA 之電流轉印，轉印 30 分鐘後取出 PVDF 膜，置於以 PBS 配置之 5%脫脂奶粉中，於 37^oC 震盪反應 1 小時。倒掉牛奶，加入以 1%

脫脂奶粉稀釋 10,000 倍之 anti-PiVX 一次抗體，或稀釋 2000 倍之 anti-GFP 一次抗體，於 37^oC 震盪反應 1 小時後；以 PBST 清洗三次，每次 15 分鐘，再加入以 1%

脫脂奶粉稀釋 20,000 倍之含鹼性磷酸酶連結體之 anti-rabbit 二次抗體，於 37^oC 震

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盪反應 1 個小時後；以 PBST 清洗三次，每次 15 分鐘。最後加入 1 mL chemiluminescent HRP substrate (Millipore)，反應 5 分鐘內，迅速進行壓片，沖洗底片並觀察結果。

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參、結果

一、 PiVX 缺失性 RNA 之選殖與分析

本實驗室發現從 2010 年接種 PiVX-P37 分離株之紅龍果植株中，可天然產生 PiVX 缺失性 RNA，並從中選殖出具生物活性的 P1 缺失性 RNA (陳, 2012)。而本研究欲得到更多類型的天然產生之 PiVX 缺失性 RNA，以篩選出在 PiVX 輔助病毒的複製之下，累積量最佳的缺失性 RNA。利用田間採集且確認感染 PiVX 的紅龍果植株(F1 及 F5 植株)，萃取其全 RNA，再利用針對 PiVX 基因體 5’端 1-29 核苷酸的 PiVX-F 為正向引子，而反向引子 PiVX-dT-Bam 可針對 3’端-包括 poly A 在內 的 46 個核苷酸進行專一性黏合，並在 poly A 末端帶有一個 BamHI 切位，經由反 轉錄作用與聚合酶鏈鎖反應後，以電泳進行分析。由結果可看到在 1 kb、0.85 kb 及約 0.6 kb 處有明顯的 DNA 條帶 (附錄一)。將這些 DNA 片段分別切下純化後，

與之前已得到的 pUC-P1 選殖株，與 pUC119 載體以 SalI 及 BamHI 酶切，再進行 黏合反應；接著轉型至 Eschericia coli DH5α 菌株中，並培養於含有 ampicillin 的 LA 平板培養基上。隨機挑取 72 個菌落以 PCR 進行篩選，由 PCR 產物大小正確的菌株中挑取 10 個選殖株，抽取質體 DNA，再經酵素酶切，以確定是否為預期大小。

從中選取 6 個選殖株進行定序，結果發現其中 2 個為非 PiVX 序列，而其他 4 個 PiVX 缺失性 RNA 可分成 3 種類型，分別稱之為 1P、2P 與 5P，其中 2P 有 2 個選殖株，1P 及 5P 各 1 個；加上之前已獲得的 P1 (陳, 2012)，因此目前 PiVX 缺失性 RNA 共有 4 種類型。其中 1P 與 P1 類似，5’端保留 PiVX 完整的 5' UTR 與部分 RdRP 基因之序列，3’端則由 CP 基因部分序列與完整的 3’UTR 所組成(圖一 A)。2P 與 5P 的 5’端所保留的部分與前兩者相似，但 3’端部分卻不含 CP 序列，只有不完整的 3’UTR (圖一 A)。若仔細分析其序列，1P 與 P1 不同處在於 1P 保留較長的 5’

端及3’端序列，分別是 5’端 747 個核苷酸與 3’端 262 個核苷酸，總長度(不含 polyA)

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為 1009 個核苷酸；而 P1 的 5’端與 3’端則各有 645 個與 196 個核苷酸，全長為 841 個核苷酸。2P 保留了 5’端 521 個核苷酸，加上 3’端 43 個核苷酸，總長度為 564 個核苷酸。5P 總長度為 610 個核苷酸，由 5’端 578 個核苷酸與 3’端 32 個核苷酸所組成(圖一 A)。其中，因 1P 由田間紅龍果篩選而來，經由 geneDoc 分析，1P 與 P1 之序列有 9 個核苷酸的差異(附錄二)，而以程式預測將兩者轉譯成胺基酸之結果，兩者皆未維持鞘蛋白部分之轉譯架構，只保留複製酶之轉譯架構(圖一 B)。而兩者轉譯後有 1 個胺基酸不同，1P 可表現一個 225 個胺基酸之重組蛋白，P1 則具有一個由 193 個胺基酸構成之重組蛋白；而 2P 與 5P 則分別表現一個 145 個與 169 個胺基酸的重組蛋白(圖一 B)。

二、測試 PiVX 缺失性 RNA 於菸草原生質體中之複製能力

將製備完成之缺失 RNA 的生體外轉錄體以電泳分析，並以 EtBr 染色且拍攝影像後，利用 ImageJ 進行定量分析，再進行菸草原生質體接種試驗。將 PiVX 缺失性 RNA 包含 P1、1P、2P-1、2P-2、5P 之生體外轉錄體，各約 7 μg 單獨接種，或是和莫耳數比 10:1 之 PiVX 生體外轉錄體混合，共同接種至菸草原生質體中；48 小時後抽取原生質體全 RNA，以 PiVX 5’端專一性探針進行北方雜合分析。實驗結果顯示有接種 PiVX 生體外轉錄體者，皆有 PiVX 基因體 RNA 的訊號。單獨接種 PiVX 缺失性 RNA 者，未偵測到任何訊號。而所有 PiVX 缺失性 RNA 與 PiVX 共同接種的處理中，只有 P1 出現明顯的缺失性 RNA 條帶，1P 則呈現較弱的雜合訊號，至於 2P 與 5P 沒有偵測到反應(圖二)。由多次實驗結果可知，只有 PiVX 輔助病毒存在時，缺失性 RNA P1 及 1P 才可以在菸草原生質體中複製累積，而其中又以 P1 的複製能力最佳，2P 與 5P 則不具複製能力。

三、測試 PiVX 缺失性 RNA 於白藜植株系統葉之累積能力

依據菸草原生質體接種實驗結果，P1 缺失性 RNA 之複製能力較其他缺失性

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RNA 為佳，但 1P 缺失性 RNA 有時也會有明顯的複製現象(未出示資料)。為進一步確認 PiVX 缺失性 RNA 在植物上的複製與移動能力，遂將 1P 缺失性 RNA 由 pUC 載體置換至由 CaMV 35S promoter 驅動之載體，以構築出 p35S-1P。加上實驗室原先構築的 p35S-P1 (陳, 2012)與 p35S-PiVX (李, 2010)，共同或單獨接種至 4-5 週大的白藜植株，每棵白藜接種 3 片葉。經過 10 與 20 天，分別觀察接種葉與系統葉之病徵，並萃取接種葉與系統葉之全 RNA，以 PiVX 之 5’端探針進行北方雜合反應分析。結果顯示在 PiVX 的協助下，於未接種之白藜系統葉可偵測到 P1 缺失性 RNA 之累積(圖三 A)。但 1P 在 PiVX 的協助下，雖可於白藜接種葉累積 1P 的 RNA (未出示資料)，但卻無法在系統葉測得 1P 的 RNA 訊號(圖三 A)。單獨接種兩種 PiVX 缺失性 RNA 的處理，皆無法在系統葉偵測到缺失性 RNA 之累積(圖三 A)。由此可知，P1 缺失性 RNA 可與 PiVX 一起進行系統性移動，但 1P 可能只能在接種葉上進行複製與細胞間移動。比較接種後 20 天白藜系統葉的病徵，1P 缺失性 RNA 與 PiVX 共同接種時，與單獨接種 PiVX 的病徵並無顯著差異；但 P1 缺失性與 PiVX 共同接種的病徵較 PiVX 單獨接種的病徵略為嚴重(圖三 B)。

四、以 PiVX 缺失性 RNA 為載體表現外源蛋白

(一)以菸草原生質體分析 P1 載體利用鞘蛋白次基因體 RNA 啟動子或表現融合蛋

白之方法表現綠色螢光蛋白之效果

前述研究結果為 P1 缺失性 RNA 在菸草原生質體的複製能力最佳，又可在白藜植株行系統性移動，故選擇以 P1 缺失性 RNA 作為表現載體，用來表現外源蛋白。以綠色螢光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)作為外源蛋白，使用兩種不同的方式表現 EGFP；其中 pUC-P1-EF 是將 P1 缺失性 RNA 的 RdRp N 端與 EGFP 形成融合蛋白，同時保留完整的 PiVX 鞘蛋白(圖四)；而 pUC-P1-E 則是利用 PiVX 鞘蛋白次基因體 RNA 啟動子(何, 2012)，先轉錄出帶有 EGFP 序列的次基因體 RNA，再轉譯出 EGFP (圖四)。

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將 P1-E 與 P1-EF 的生體外轉錄體單獨接種，或與 PiVX 的生體外轉錄體共同接種至菸草的原生質體，接種後 48 小時，以螢光顯微鏡進行觀察，並且萃取原生質體全 RNA，再以北方雜合反應分析 RNA 累積情形。共同接種 PiVX 與 P1-E 的菸草原生質體，經過 48 小時後可看到有綠色螢光表現(圖五 A)；而共同接種 PiVX 與 P1-EF 的處理，則無法觀察到螢光表現(圖五 A)。使用 PiVX 5’端專一性探針及 EGFP 共同偵測，結果發現與 PiVX 共同接種之處理，P1-E 有複製的現象，但相較於 P1 缺失性 RNA，P1-E 的累積量較少(圖五 B)；而 P1-EF 則沒有被 PiVX 複製的情形(圖五 C)。當再以 EGFP 探針偵測時，可看到 P1-E 與 PiVX 共同接種的處理，

呈現 P1-E 清楚的雜合訊號(圖五 B)，可是卻未偵測到預期產生之次基因體 RNA。

(二) 以白藜植株分析 P1 載體利用鞘蛋白次基因體 RNA 啟動子表現綠色螢光蛋白

之效果

因 P1-E 在菸草原生質體內可被 PiVX 複製，遂將 P1-E 置換到至由 CaMV 35S promoter 驅動之載體上，構築 p35S-P1-E。再將 p35S-P1-E 與 P35S-PiVX 共同或單獨接種至 4-5 週大小的白藜植株，經過 20 天後，抽取植物全 RNA，以 EGFP 專一性探針進行北方雜合反應，並以螢光顯微鏡觀察白藜系統葉的螢光蛋白表現情形，以分析 p35S-P1-E 在 PiVX 協助下之系統性移動情形。以螢光顯微鏡觀察接種後的白藜系統葉，可看到只有 p35S-PiVX 與 p35S-P1-E 共同接種的白藜系統葉才有綠色螢光蛋白表現(圖六 A)，其餘則沒有綠色螢光蛋白表現。北方雜合反應結果顯示與 p35S-PiVX 共同接種時，在白藜系統葉可偵測到 P1-E RNA 訊號，可是卻未偵測到預期產生之次基因體 RNA (圖六 B)，而其他處理則沒有訊號出現。

五、短暫表現基因靜默抑制子 P19 對 PiVX 缺失性 RNA 載體表現 EGFP 之影響 根據上述研究結果，P1 載體表現 EGFP 的效率並不高(圖五及圖六)，雖然將 P1-E 接種於菸草原生質體與白藜植株，皆可以北方雜合反應偵測到 EGFP RNA 的