以 GeneDoc (Multiple Sequence Alignment Editor & Shading Ustility, Version 2.5.000)觀看定序完成之缺失性 RNA，並以 Clustal X (Thompson et al., 1994)進行序 列比對，再以 Vector-NTI (NTI AdvanceTM 11.0, Invitrogen, Carlsbad, California, USA) 進行序列分析。並輔以 MFOLD 進行 RNA 二級結構預測。
四、生體外轉錄體之製備 (一) 限制酶直線化質體
取小量製備之質體 DNA：pUC-PiVX、pUC-P1 dRNA、pUC-1P dRNA、pUC-2P dRNA、pUC-5P dRNA，以限制酵素 BamHI 進行酶切反應後，以 1% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，確認其反應完全後，進行核酸回收，回收之直線化質體置於 -20oC 冰箱備用。
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(二) 生體外轉錄反應
在 1.5 mL 之微量離心管中，加入 1 μg 上述已直線化之質體 DNA 作為模板，
與 5 μL 5X T7 transcription buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、5 μL (ACU)TP (5 mM each)、0.5 μL GTP (5 mM, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)、0.625 μL cap analog (10 mM NEB, Ipswish, MA, USA)、0.5 μL rRNasin (40 U/μL , Promega, Madison, WI, USA) 及 1 μL T7 RNA polymerase (50 U/μL , Invitrogen)，於 37oC 反應 15 分鐘後，加入 4.5 μL GTP (5 mM)，總反應體積為 50 μL，隨後繼續於 37oC 反應 75 分鐘。取稀釋 50 倍之 1 μL 生體外轉錄體，以 1% agarose gel/1X TAE 進行電泳 分析，並利用 UVP 系統拍照，以 ImageJ 估算生體外轉錄體之產量，剩餘分裝保存 於-80oC 備用。
五、原生質體之製備、接種與分析 (一) 原生質體之製備
使用的所有器具皆以鋁箔紙包覆，於 180oC 處理 4 小時，以保持無菌及 RNase-free 之狀態。使用的植物為 4-6 週大之菸草，秤取葉片約 5 g，以 700 mL 1%
次氯酸鈉表面消毒 2 分鐘後，以二次蒸餾水漂洗 3 次，以除去殘留之次氯酸鈉，
接著以濾紙吸去葉片殘留之水分。將葉片置於玻璃板上，先以刀片去除中肋，剩 餘之葉片再切成約 2 mm x 4 mm 之長條狀，平鋪於兩個玻璃皿中，以 0.2 mM minipore filter (Sartorius, Goettingen, Germany) 過濾 25 mL enzyme digestion buffer [25 mg BSA, 15 mg pectinase, 300 mg cellulose, 25 mL 0.55 M mannitol-0.1% MES (pH5.7) ]，平均分配至兩個培養皿，避光於 25oC 反應 16 小時。反應完成後，輕輕 搖晃培養皿使其內的菸草組織懸浮，再以 150 目尼龍網過濾植物殘體，將濾液平 分至 4 支 15 mL 玻璃試管中，以 300 rpm (KUBOTA 2010, Tokyo, Japan )離心 5 分 鐘。隨後以玻璃滴管除去上層液，加入 2 mL 0.55 M mannitol-0.1% MES，輕拍打
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試管底部，使沉澱物均勻懸浮。再以玻璃滴管吸取 2 mL 0.55 M sucrose 溶液，伸 至試管底部緩慢加入，形成 sucrose cushion。再以 300 rpm 離心 5 分鐘，比重適當 的菸草原生質體會累績在 sucrose cushion 與 mannitol-MES 的交界處，形成深綠色 層帶。吸取該處之原生質體置於新試管中，再加入 5 mL 0.55 M mannitol-0.1% MES 拍指形管底部，使沉澱物重新懸浮以洗去殘留之 PEG inoculation buffer。以 300 rpm 離心 5 分鐘，除去上層液，加入 750 μL protoplast culture medium (Jones et al., 1990)，
並輕拍指形管底部，均勻懸浮沉澱物，以石臘膜封口，於 25oC 光照下培養 48 小 時。
(三) 原生質體之全 RNA 之萃取與分析
取培養完成之原生質體輕拍懸浮後，以 300 rpm 離心 5 分鐘，除去上層液後，
將沉澱之原生質體以 Plant Total RNA Extraction Miniprep System 進行小量全 RNA
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之萃取。萃取出之原生質體全 RNA，取 5 μL 以 1% agarose gel/1X TAE 進行電泳 分析，剩餘之 RNA 置於-20oC 冰箱備用，或直接進行北方雜合分析。
六、缺失性 RNA 在白藜上之接種
首先將缺失性 RNA 置換至帶有 CaMV 35S 啟動子的載體上，利用已構築之 p35S-P1dRNA 在 155 nt 處有單一 StuI 切位，以及 pUC119 載體上具有之 BamHI 切 位，將其他的缺失性 RNA 由 pUC 置換到 p35S 載體上，所用之方法與 5.7.3 相同。
本試驗使用 4-5 週之白藜植株，首先配置接種源，在 1.5 mL 微量離心管中加入 20 μg p35S-PiVX 或 p35S-PiVX-dRNAs ， 或 同 時 加 入 20 μg p35S-PiVX 與 p35S-PiVX-dRNAs，並以 ddH2O 將體積調整至相同。接著輕輕將欲接種之白藜葉 片上之白粉抹去，撒上適量之金鋼砂後，將接種源均勻塗抹全葉，每株白藜接種 3 片葉子，於 10 與 20 天後分別收取接種葉與系統葉，進行植物全 RNA 之萃取與分 析。