2006)。故以植物病毒表現外源蛋白時，共同表現基因靜默抑制子是不錯的方法。
六、 紅龍果病毒 X 及仙人掌病毒 X 之介紹
紅龍果病毒 X (Pitaya virus X)及仙人掌病毒 X (Cactus virus X)，同屬於 Potexvirus 屬之病毒，且皆可感染紅龍果，為少數發現之紅龍果病毒(毛, 2008；劉,
2000)。PiVX 為本實驗室於陽明山紅龍果園分離並鑑定之一種新病毒，其為絲狀、
單鏈正意股 RNA 病毒，長約 450-500 nm，寬約 12-13 nm，基因體不包含 polyA 為 6677 個核苷酸(毛, 2008)。PiVX 可系統性感染紅龍果及白藜，在紅龍果上引起嵌 紋 病 徵 ， 而 於 白 藜 上 產 生 褪 綠 和 壞 疽 病 斑 ； 另 外 ， 在 紅 藜 (Chenopodium amaranticolor)、番杏(Tetragonia expansa)及羽狀雞冠花(Celosia argentea)只能感染
接種葉(李, 2010)。經由全台各地紅龍果園之樣本採集與檢測，發現台北、宜蘭、
彰化及台東之紅龍果園皆已受到 PiVX 感染，PiVX 似乎已成為台灣紅龍果栽培的 威脅因子(毛, 2008)。故本實驗室已於 2010 年構築 PiVX 具感染力的選殖株，供 PiVX 之相關研究使用。
而 CVX 在美國及歐洲都曾被報導，可能存在世界各地的仙人掌植物(Berck, 1971)；其病毒顆粒為絲狀，長度約 520 nm，寬度約 13 nm，基因體大小約 6.5 kb (Attathom et al., 1978)。劉瑞芬老師實驗室於 2000 年首先由台灣新竹地區分離出 CVX-Hu 病毒株，為第一個發現的紅龍果病毒病原(劉, 2000)。本實驗室也於 2006 年間分離出 CVX-NTU 病毒株，CVX-NTU 在白藜上造成的病徵 CVX-Hu 略有不 同，前者為產生退綠斑點，後者為退綠壞疽之侷限性病斑(呂, 2007)。
七、 PiVX 缺失性 RNA 及鞘蛋白次基因啟動子(subgenomic promoter, SGP)之研究 陳君弢學長發現重複繼代接種 PiVX 的白藜會有小分子 RNA 出現，經過選殖 後發現這群小分子訊號為 PiVX 的缺失性 RNA，之後更發現長期感染 PiVX 的紅龍 果植株亦有缺失性 RNA，與於白藜中發現的缺失性 RNA 共同選殖出 9 種類型的
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PiVX 缺失性 RNA (陳, 2012)。將 9 種缺失性 RNA 與 PiVX 共同接種至白藜，有 5 種類型可在白藜上被 PiVX 增殖，包括由白藜選殖出的 PiVX-N1、PiVX-N2、
PiVX-N4、PiVX-N5，以及由紅龍果選殖出的 PiVX-P1。這些缺失性 RNA 皆為單 一片段移除型(Li et al., 1989)，保留 5’ 645 nt-859 nt 及 3’ 196 nt-768 nt 的序列。進 一步構築 5’端不同長度刪除株並在白藜上測試，推測 5’端序列範圍 356-562 nt 間，
為 PiVX 缺失性 RNA 在白藜上增殖所必須之序列(陳, 2012)。
次基因體 RNA (subgenomic RNA, sgRNA)之轉錄為單鏈正意股 RNA 病毒表現 基因常用的策略，而合成 sgRNA 需藉由次基因啟動子(subgenomic promoter, SGP) 協助。何艾翎學姊以 5’ RACE 配合選殖與定序，定位出 PiVX 鞘蛋白 sgRNA 之轉
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複製相關的 cis-acting elements 區域，期望讓我們更加了解 PiVX 的序列特性，並 提供相關資訊供 Potexvirus 屬植物病毒之研究。
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貳、材料與方法
一、 實驗材料
p35S-PiVX5 來自陽明山紅龍果(Hylocereus undatus)之紅龍果病毒 X (Pitaya virus X, PiVX)分離株 PiVX-P37，將全長 cDNA 嵌入帶有 CaMV 35S 啟動子的載體 p35S-GFP (Clonetech, Palo Alto, CA, USA)上，取代 GFP 基因，所構築之全長 cDNA 選殖株(李, 2010)。p35S-PiVX5 可以機械接種方式系統性感染紅龍果及白藜 (Chenopodium quinoa)，並在前者產生嵌紋病徵，在後者上形成褪綠斑點病徵 (李, 2010)。陳君弢學長將 p35S-PiVX5 置換至 pUC119 載體，同時在 PiVX 基因體前方 加上噬菌體 T7 啟動子，構築出 pUC-PiVX 選殖株，可用於合成生體外轉錄體，以 接種菸草(Nicotiana benthamiana)原生質體。此外，從已知感染 PiVX 之紅龍果植株 中萃取其全 RNA，發現有天然產生的缺失性 RNA；將 PiVX 缺失性 RNA 選殖至 p35S 載體上，並篩選出具感染力的選殖株(陳, 2012)。本研究利用 PiVX 缺失性 RNA 選殖株 p35S-P1-4 為材料，構築出 pUC-P1，供菸草原生質體接種實驗使用。
pBIN61-GFP 由沈湯龍老師提供，pBIN61-P19-myc-ko 則是由實驗室黃裕雯同 學所構築，以此進行農桿菌注射法於白藜及菸草短暫表現 Tomato bushy stunt virus (TBSV)之 P19 蛋白。