本實驗室發現從 2010 年接種 PiVX-P37 分離株之紅龍果植株中，可天然產生 PiVX 缺失性 RNA，並從中選殖出具生物活性的 P1 缺失性 RNA (陳, 2012)。而本 研究欲得到更多類型的天然產生之 PiVX 缺失性 RNA，以篩選出在 PiVX 輔助病毒 的複製之下，累積量最佳的缺失性 RNA。利用田間採集且確認感染 PiVX 的紅龍 果植株(F1 及 F5 植株)，萃取其全 RNA，再利用針對 PiVX 基因體 5’端 1-29 核苷 酸的 PiVX-F 為正向引子，而反向引子 PiVX-dT-Bam 可針對 3’端-包括 poly A 在內 的 46 個核苷酸進行專一性黏合，並在 poly A 末端帶有一個 BamHI 切位，經由反 轉錄作用與聚合酶鏈鎖反應後，以電泳進行分析。由結果可看到在 1 kb、0.85 kb 及約 0.6 kb 處有明顯的 DNA 條帶 (附錄一)。將這些 DNA 片段分別切下純化後，
與之前已得到的 pUC-P1 選殖株，與 pUC119 載體以 SalI 及 BamHI 酶切，再進行 黏合反應；接著轉型至 Eschericia coli DH5α 菌株中，並培養於含有 ampicillin 的 LA 平板培養基上。隨機挑取 72 個菌落以 PCR 進行篩選，由 PCR 產物大小正確的 菌株中挑取 10 個選殖株，抽取質體 DNA，再經酵素酶切，以確定是否為預期大小。
從中選取 6 個選殖株進行定序，結果發現其中 2 個為非 PiVX 序列，而其他 4 個 PiVX 缺失性 RNA 可分成 3 種類型，分別稱之為 1P、2P 與 5P，其中 2P 有 2 個選 殖株，1P 及 5P 各 1 個；加上之前已獲得的 P1 (陳, 2012)，因此目前 PiVX 缺失性 RNA 共有 4 種類型。其中 1P 與 P1 類似，5’端保留 PiVX 完整的 5' UTR 與部分 RdRP 基因之序列，3’端則由 CP 基因部分序列與完整的 3’UTR 所組成(圖一 A)。2P 與 5P 的 5’端所保留的部分與前兩者相似，但 3’端部分卻不含 CP 序列，只有不完整 的 3’UTR (圖一 A)。若仔細分析其序列，1P 與 P1 不同處在於 1P 保留較長的 5’
端及3’端序列，分別是 5’端 747 個核苷酸與 3’端 262 個核苷酸，總長度(不含 polyA)
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為 1009 個核苷酸；而 P1 的 5’端與 3’端則各有 645 個與 196 個核苷酸，全長為 841 個核苷酸。2P 保留了 5’端 521 個核苷酸，加上 3’端 43 個核苷酸，總長度為 564 個核苷酸。5P 總長度為 610 個核苷酸，由 5’端 578 個核苷酸與 3’端 32 個核苷酸 所組成(圖一 A)。其中，因 1P 由田間紅龍果篩選而來，經由 geneDoc 分析，1P 與 P1 之序列有 9 個核苷酸的差異(附錄二)，而以程式預測將兩者轉譯成胺基酸之結 果，兩者皆未維持鞘蛋白部分之轉譯架構，只保留複製酶之轉譯架構(圖一 B)。而 兩者轉譯後有 1 個胺基酸不同，1P 可表現一個 225 個胺基酸之重組蛋白，P1 則具 有一個由 193 個胺基酸構成之重組蛋白；而 2P 與 5P 則分別表現一個 145 個與 169 個胺基酸的重組蛋白(圖一 B)。
二、測試 PiVX 缺失性 RNA 於菸草原生質體中之複製能力
將製備完成之缺失 RNA 的生體外轉錄體以電泳分析，並以 EtBr 染色且拍攝影 像後，利用 ImageJ 進行定量分析，再進行菸草原生質體接種試驗。將 PiVX 缺失 性 RNA 包含 P1、1P、2P-1、2P-2、5P 之生體外轉錄體，各約 7 μg 單獨接種，或 是和莫耳數比 10:1 之 PiVX 生體外轉錄體混合，共同接種至菸草原生質體中；48 小時後抽取原生質體全 RNA，以 PiVX 5’端專一性探針進行北方雜合分析。實驗 結果顯示有接種 PiVX 生體外轉錄體者，皆有 PiVX 基因體 RNA 的訊號。單獨接 種 PiVX 缺失性 RNA 者，未偵測到任何訊號。而所有 PiVX 缺失性 RNA 與 PiVX 共同接種的處理中，只有 P1 出現明顯的缺失性 RNA 條帶，1P 則呈現較弱的雜合 訊號，至於 2P 與 5P 沒有偵測到反應(圖二)。由多次實驗結果可知，只有 PiVX 輔 助病毒存在時，缺失性 RNA P1 及 1P 才可以在菸草原生質體中複製累積，而其中 又以 P1 的複製能力最佳，2P 與 5P 則不具複製能力。
三、測試 PiVX 缺失性 RNA 於白藜植株系統葉之累積能力
依據菸草原生質體接種實驗結果，P1 缺失性 RNA 之複製能力較其他缺失性
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RNA 為佳，但 1P 缺失性 RNA 有時也會有明顯的複製現象(未出示資料)。為進一 步確認 PiVX 缺失性 RNA 在植物上的複製與移動能力，遂將 1P 缺失性 RNA 由 pUC 載體置換至由 CaMV 35S promoter 驅動之載體，以構築出 p35S-1P。加上實驗室原 先構築的 p35S-P1 (陳, 2012)與 p35S-PiVX (李, 2010)，共同或單獨接種至 4-5 週大 白。以綠色螢光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)作為外源蛋白，使用 兩種不同的方式表現 EGFP；其中 pUC-P1-EF 是將 P1 缺失性 RNA 的 RdRp N 端 與 EGFP 形成融合蛋白，同時保留完整的 PiVX 鞘蛋白(圖四)；而 pUC-P1-E 則是 利用 PiVX 鞘蛋白次基因體 RNA 啟動子(何, 2012)，先轉錄出帶有 EGFP 序列的次 基因體 RNA，再轉譯出 EGFP (圖四)。
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將 P1-E 與 P1-EF 的生體外轉錄體單獨接種，或與 PiVX 的生體外轉錄體共同 接種至菸草的原生質體，接種後 48 小時，以螢光顯微鏡進行觀察，並且萃取原生 質體全 RNA，再以北方雜合反應分析 RNA 累積情形。共同接種 PiVX 與 P1-E 的 菸草原生質體，經過 48 小時後可看到有綠色螢光表現(圖五 A)；而共同接種 PiVX 與 P1-EF 的處理，則無法觀察到螢光表現(圖五 A)。使用 PiVX 5’端專一性探針及 EGFP 共同偵測，結果發現與 PiVX 共同接種之處理，P1-E 有複製的現象，但相較 於 P1 缺失性 RNA，P1-E 的累積量較少(圖五 B)；而 P1-EF 則沒有被 PiVX 複製的 情形(圖五 C)。當再以 EGFP 探針偵測時，可看到 P1-E 與 PiVX 共同接種的處理，
呈現 P1-E 清楚的雜合訊號(圖五 B)，可是卻未偵測到預期產生之次基因體 RNA。
(二) 以白藜植株分析 P1 載體利用鞘蛋白次基因體 RNA 啟動子表現綠色螢光蛋白
之效果
因 P1-E 在菸草原生質體內可被 PiVX 複製，遂將 P1-E 置換到至由 CaMV 35S promoter 驅動之載體上，構築 p35S-P1-E。再將 p35S-P1-E 與 P35S-PiVX 共同或單 獨接種至 4-5 週大小的白藜植株，經過 20 天後，抽取植物全 RNA，以 EGFP 專一 性探針進行北方雜合反應，並以螢光顯微鏡觀察白藜系統葉的螢光蛋白表現情 形，以分析 p35S-P1-E 在 PiVX 協助下之系統性移動情形。以螢光顯微鏡觀察接種 後的白藜系統葉，可看到只有 p35S-PiVX 與 p35S-P1-E 共同接種的白藜系統葉才 有綠色螢光蛋白表現(圖六 A)，其餘則沒有綠色螢光蛋白表現。北方雜合反應結果 顯示與 p35S-PiVX 共同接種時，在白藜系統葉可偵測到 P1-E RNA 訊號，可是卻 未偵測到預期產生之次基因體 RNA (圖六 B)，而其他處理則沒有訊號出現。
五、短暫表現基因靜默抑制子 P19 對 PiVX 缺失性 RNA 載體表現 EGFP 之影響 根據上述研究結果，P1 載體表現 EGFP 的效率並不高(圖五及圖六)，雖然將 P1-E 接種於菸草原生質體與白藜植株，皆可以北方雜合反應偵測到 EGFP RNA 的
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表現，但以西方轉漬法無法偵測菸草原生質體的 EGFP 表現(未出示資料)，而在白 藜上的螢光蛋白訊號則不穩定(未出示資料)，推測可能是 EGFP 表現效率較差而以 西方轉漬法無法穩定偵測。為改善表現效率低的情況，希冀利用基因靜默抑制子 Tomato bushy stunt virus (TBSV)之 P19 來加強 P1-E 表現。首先將 pBIN61-P19 或
pBIN61 以農桿菌注射至 4 週大的菸草及白藜，經過一天後再機械接種 p35S-PiVX 與 p35S-P1-E 至有處理的菸草與白藜，再經過 5 天收取接種葉，以 PiVX-CP 抗體 與 GFP 抗體進行西方轉漬分析。由結果顯示，在白藜上表現 P19 並不會增加 P1-E 的 EGFP 表現，只要 PiVX 在白藜內的複製達到某種量，即可測到 EGFP 表現(圖 七 A)。因菸草不是 PiVX 的寄主，可見到在有表現 P19 的菸草，才能偵測到 PiVX 的鞘蛋白(圖七 B)，表示在菸草上表現 P19 蛋白確實有助於 PiVX 的感染，但卻無 法使 P1-E 表現 EGFP(圖七 B)。
由於上述在菸草上先表現 P19 再接種 p35S-PiVX 與 p35S-P1-E 可以成功偵測 到 PiVX 的累積，卻無法表現 EGFP ，推測有可能以機械接種的方法表現 EGFP 所需的時間較久，故將 p35S-P1-E 置換至可以農桿菌注射法的載體：pGR-P1-E，
與 pGR-PiVX (何, 2012)及 pBin-P19 共同以農桿菌注射法接種菸草與白藜，菸草收 取 5 天的接種葉進行西方轉漬分析。本實驗所做的處理有單獨以農桿菌注射 pGR-PiVX、pGR-P1-E 或 pBin-GFP，共同注射 pGR-PiVX 與 pGR-P1-E，共同注射 pGR-PiVX、pGR-P1-E 與 pBin-P19/pBin61。由結果顯示只要有注射 pGR-PiVX 的 菸草，即能以 PiVX-CP 抗體偵測到訊號，但以 GFP 抗體卻依然無法偵測到以 P1 載體表現之 EGFP (圖八 B)。而以農桿菌注射法表現於白藜，收取接種後 3、5 及 8 天的接種葉，皆無法偵測 PiVX 鞘蛋白之表現，也無法偵測到 GFP 的表現(圖八 A)，表示以農桿菌注射白藜的方法似乎有些條件不適當，因而在本研究中未有結 果。
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