七、 北方轉漬與雜合法分析
(一) PiVX 5’端、CVX 3’端與 EGFP 專一性 DNA 探針之製備
以 p35S-PiVX、pUC-CVX3 與 pGR-PiVX-EGFP 為模板，利用 PCR 反應分別 製備PiVX 5’端、CVX 3’端與 EGFP 專一性 DNA 探針，使用之引子對如下：PiVX 使用 PiVX-F 與 37-R6 引子，CVX 使用 Farm-F 與 Farm-R1 引子，EGFP 則使用 SacII-EGFP-F 與 XhoI-EGFP-R 引子。 取 5 ng 之模板 DNA 加入 0.2 mL PCR tube 中，接著加入 5 μL 10X DyNAzymeTM buffer (Finnzyme, Espoo, Finland)、2 μL 10X Digoxigenin (DIG)-11-dUTP labeling mix (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)、2.5 μL 5 μM 正向引子與 2.5 μL 5 μM 反向引子，再加入 0.5 μL DyNAymeTM II DNA Polymerase (2 U/μL, Finnzyme)，最後補水至 50 μL。並以下列 條件進行 PCR: 94oC 反應 5 分鐘，接著進行 94oC /30 秒、55oC /30 秒、72oC /30 秒，
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30 個循環反應，最後以 72oC 反應 10 分鐘，並降溫至 4oC。取 2 μL 之 PCR 產物以 1.2% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，確認條帶正確後，稀釋 10 倍，分裝至 0.2 mL PCR tube 中，置於-80oC 冰箱備用。
(二) 北方轉漬法
取適量植物全 RNA，加入等體積之 2X RNA loading Dye (Fermentas, Bulington, Ontario, Canada)，混合均勻後以 70oC 加熱 10 分鐘，再放置冰上 5 分鐘，以解開 RNA 的二級結構。接著將處理完之樣品以 1% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，
再利用毛細現象使膠體中的 RNA 轉印至尼龍膜 (Hybond-N+, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)上，步驟為：將寬度略大於膠體的濾紙 (3MM, Whatman, England)放在已架於長方盒的玻璃板上，並使濾紙兩端垂入盒內，以接觸盒內之 20X SSC buffer (AMRESCO, Solon, OH, USA)。濾紙完全潤濕後，將膠片背面朝上 放在濾紙上，再蓋上已經以 20X SSC buffer 潤濕的尼龍膜與 2 張濾紙，上述步驟皆 須避免氣泡存在間隙。接著以石臘膜將膠體周圍密封避免 20X SSC buffer 逸散，並 覆蓋適量之擦手紙或吸水海綿，其上以重物壓住，於室溫下靜置 12-16 小時。
(三) 北方雜合反應
轉漬完成後，將尼龍膜小心取出，略為風乾後進行 UV crosslinking (UV Stratalinker 1800, Stratagene, La Jolla, CA, USA)，使 RNA 固定於尼龍膜上。接著以 廠商(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)建議之方法略加修改後進行。以 鑷子將尼龍膜放入內有 20 mL hybridization solution 之雜合管中，於 50oC 之雜合箱 (YIH DER HR-80, Taiwan)中，以 10 rpm 進行 pre-hybridization 反應 1 小時。DNA 核酸探針在使用前須進行變性反應，將已分裝之 20 μL DNA 探針於 96oC 作用 10 分鐘，再移至冰上冷卻 5 分鐘，短暫離心後加入 hybridization solution，於 50oC 下 轉速 10 rpm 進行雜合反應 12-16 小時。
19 鐘。接著取 1 μL alkaline phosphate-conjugated anti-DIG antibody (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)加入 20 mL 之 Buffer II，於室溫下以 50 rpm 震盪 45 分鐘。然後以適量 Buffer I 於室溫下清洗 2 次，每次 15 分鐘。清洗完畢後取出尼 龍膜至透明塑膠袋中，加入 600 μL CDP-Star (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)，於 黑暗中作用 15 分鐘後，除去多餘溶液後封口，以 X 光底片進行曝光，沖洗底片後 即可觀察結果。
八、pUC-P1-EF 及 pUC-P1-E 之構築
欲以 P1 dRNA 作為表現載體以表現外源蛋白，我選擇以產生融合蛋白與利用 PiVX 鞘蛋白次基因體 RNA 啟動子，兩種不同策略表現綠色螢光蛋白，因此構築 pUC-P1-EF 及 pUC-P1-E。首先設計帶有 SacII 切位之反向引子 P1-SacII-R，以及帶 有 HpaI 及 XhoI 切位之反向引子 P1-HpaI-XhoI-R，配合正向引子 PiVX-map-F1，
利用反向聚合酶鏈鎖反應(inverse PCR)在 pUC-P1 的 RdRP 與 CP 之間新增加 SacII 切位，以構築 pUC-P1S；或是創造出 HpaI 與 XhoI 切位，以構築 pUC-P1HX。方 法如下：取一 0.2 mL PCR tube 加入 3 ng pUC-P1 dRNA、4 μL 之 5X fusion HF
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將核酸純化後，接著進行磷酸化反應：取一 1.5 mL 離心管加入 1.5 μL 10X T4 DNA ligase buffer (Fermentas, ulington, Ontario, Canada)、1 μL 10 mM ATP 與 1 μL T4 polynucleotide kinase (10 U/μL, NEB)，並加入純化後的 PCR 產物至總體積為 15 μL，置於 37oC 作用 1 小時。再加入 0.5 μL 10X T4 DNA ligase buffer、1 μL 10 mM ATP、0.5 μL T4 DNA ligase (5 U/μL, Thermo, Wilmington, USA)及 3 μL ddH2O，於 室溫下作用 4 小時，即可進行大腸桿菌轉型。經過菌落 PCR 與酶切反應篩選正確 之構築(圖四)。以相同方式利用 HpaI 及 XhoI 對 pGR-PiVX-EGFP 和帶有 HpaI-XhoI 切位的 pUC-P1HX 進行酶切，電泳分析，核酸片段純化與接合反應，以構築
十、影響 PiVX 複製之 cis-acting elements 分析 (一) 構築 5’端不同長度之缺失性 RNA
利用可和 pUC-PiVX-P1 dRNA 之 CP 保留區域起始位置專一結合之正向引子 PiVX-map-F1 ， 及 設 計 與 RdRP 保 留 區 域 不 同 位 置 專 一 性 結 合 之 反 向 引 子 PiVX-map-R3 與 PiVX-map-R4 ， 以 下 列 配 方 配 置 PCR 反 應 溶 液 ： 3 ng 之
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pUC-PiVX-P1 dRNA、3 μL 5X Phusion HF buffer (NEB, Ipswish, MA, USA)、1 μL 10 mM dNTP mix、1 μL 之 5 μM 正向引子 PiVX-map-F1、1 μL 之 5 μM 反向引子 (PiVX-map-R3 與 PiVX-map-R4)、1 μL Phusion DNA polymerase (2 U/μL, NEB)，補 水至 20 μL，反應條件為: 96oC 反應 5 分鐘，接著進行 96oC/30 秒、55oC/1 分鐘、
72oC/3 分鐘，25 個循環反應，最後以 72oC 反應 10 分鐘，並降溫至 4oC。取 1 μL 產物以 1% agarose gel/1X TAE 進行電泳分析，確定為預期片段大小後，將剩餘產 物進行核酸回收。
隨後進行磷酸化反應，於 1.5 mL 微量離心管中加入 11.5 μL 核酸回收產物，接 著加入 1.5 μL 之 10X T4 ligase buffer (Fermentas, Burlington, Ontario, Canada)、1 μL 之 10 mM ATP 與 1μL 之 T4 Polynucleotide kinase (NEB)，總體積為 15 μL，於 37oC 反應 1 小時。接著進行接合反應，將 0.5 μL 之 10X ligase buffer (Fermentas)、1 μL 之 10 mM ATP、與 0.5 μL 之 T4 DNA Ligase (5 U/μL, Thermo, Wilmington, USA)加 入至上述產物中，並補水至 20 μL，於 4oC 反應隔夜後，進行轉型作用。以 PiVX-F 與 M13-F 作為引子對進行菌落 PCR，挑選符合預期之菌落進行小量質體 DNA 製 備，將製備完成之質體 DNA 以 PvuII 進行酶切，以確定取得正確之刪除突變株，
稱之為 pUC-P1-R3 與 pUC-P1-R4。
(二) 菸草原生質體接種與分析
使用 4-5 週之菸草植株，並將菸草原生質體分離後，以 PiVX 之生體外轉錄體 與 P1-R3/P1-R4 之生體外轉錄體，共同或單獨接種(莫耳數比 1:10)，經過 48 小時 後抽取原生質體全 RNA，並以北方雜合反應進行分析。
十一、接種紅龍果實生苗
單獨或共同接種 p35S-PiVX 與 p35S-P1-EGFP 各 20 μg 至白藜葉片，接種後 20 天採收白藜系統葉約 1g，加入 500 μL 0.01 M sodium phosphate buffer (pH 7.4)，在
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經 180oC 烘箱滅菌之研缽內以杵磨碎。接著以數支蟲針沾取汁液，再戳於紅龍果 實生苗之三角莖，可連戳多次。經過一個月再萃取紅龍果全 RNA，同時可取一部 份組織進行鏡檢，以觀察是否有綠色螢光蛋白表現。
十二、以農桿菌注射法進行病毒選殖株之接種 (一) 農桿菌轉型
利用液態氮冷凍法將 pGR-PiVX、pGR-P1-EGFP、pBIN61、pBIN61-P19 及 pBIN61-GFP 轉型至農桿菌 Agrobacterium tumefaciens 菌株 C58C1 中。取 1 μg 欲 轉入之質體 DNA 加至勝任細胞中，輕拍後丟入液態氮 1 分鐘，再移至 37oC 水浴 5 分鐘，接著加入 1 mL 2X DYT 培養液，置於 28oC 培養箱以轉速 250 rpm 震盪培養 2 小時。以 13,000 rpm (Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge, Thermo, Wilmington, USA)離心 1 分鐘，留下 100 μL 上清液，回溶沉澱物後即可進行塗盤，約 2-4 天可 看到單一菌落於培養基上生長。
(二) 農桿菌注射法
從培養基上挑選單一菌落至含有 50 ppm kanamycin 之 LB 培養液中，於 28oC 培養箱以轉速 250 rpm 震盪培養 12-16 小時。以 MMA [10 mM MES (pH 5.6), 10 mM MgCl2, 200 μM acetosyringone]對半稀釋，並以 5500 rpm (Centrifuge Z 383 K, Hermle, Wehingen, Germany)離心 15 分鐘，去除上清液後，加入 1 mL MMA 回溶沉澱物，
並將菌液濃度調至 OD600等於 0.5，即可用無針頭之 1 mL 針筒注射 4 週大的菸草 與白藜，所注射的葉片為第 3、4 與 5 片本葉。
十三、以農桿菌注射表現 Tomato bushy stunt virus (TBSV) P19 蛋白於菸草及白藜 (一) 以農桿菌表現 P19 蛋白後再表現 EGFP
取 4-5 週大的菸草及白藜植株，以農桿菌注射法表現 pBin61-P19-myc-ko 及
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pBin61，一天後再共同接種 p35S-PiVX 及 p35S-P1-E 至有注射農桿菌的菸草與白 藜，接種方法與方法六相同；經過 5 天後收取接種葉，以 anti-GFP 及 anti-PiVX 鞘 蛋白之一次抗體進行西方轉漬分析，並偵測綠色螢光蛋白表現情形。
(二) 以農桿菌表現 P19 與 EGFP
取 4-5 週 大 的 菸 草 及 白 藜 植 株 ， 將 pGR-PiVX 及 pGR-P1-E 與 pBin61-P19-myc-ko 或 pBin61 共同以農桿菌注射法處理葉片，5 天後收取接種葉 片，進行西方轉漬分析。
十四、西方轉漬分析法
(一) 聚丙烯醯氨膠體電泳
以 Hofel 蛋白質電泳系統 (Mighty Small II E 250, Pharmacia Biotech) 進行聚丙烯 醯氨膠體電泳。首先製備 12.5%之分離膠體(separating gel)：在燒杯中依序加入 12.6 mL ddH2O、9.375 mL 40% acrylamide/bisacrylamide、7.5 mL 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 、 0.3 mL 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) 、 0.03 mL N,N,N’,N’-tetramethylethylene diamine (TEMED) 及 0.15 mL 20% ammonium persulfate (APS)；快速搖晃燒杯使溶液均勻混合後，迅速倒入鑄膠器中，並立即加 入 1 mL 95%酒精，使膠面平整。靜置約 30 分鐘後，倒除酒精。接著配置 5%焦集 膠 體 (stacking gel) : 在 燒 杯 中 依 序 加 入 9 mL ddH2O 、 1.875 mL 40%
acrylamide/bisacrylamide、3.75 mL 1.0 M Tris-HCl (pH 6.8)、0.15 mL 10% SDS、0.015 mL TEMED 及 0.12 mL 20% APS，快速搖晃燒杯使溶液混合均勻後，迅速注入約 1-2 mL 之焦集膠體至分離膠體上方，並迅速插入齒梳(comb)。待膠體凝固後，小 心移去齒梳，並以清水清洗樣本槽中殘留之凝膠，即可使用。
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倒入 1.5 mL 微量離心管，以 13,000 rpm (Centrifuge Z216MK, HERMLE, Wehingen, Germany)離心 10 分鐘。取 15 μL 之上清液和 5 μL 4X SDS sample buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 1% β-mercaptoethanol, 12.5 mM EDTA, 0.02% bromophenol blue)混合均勻，於 96oC 加熱 10 分鐘，使蛋白質變性。接著將 膠片置於電泳槽內，加入處理完畢之樣品後，即可進行電泳。電泳結束後去除焦 集膠體，以 Coomassie brilliant R-250 (CBR)染色觀察，之後即可進行西方轉漬免疫 反應。
(三) 免疫轉漬分析
主要參考 Molercular Cloning 所描述之方法 (Sambrook and Russell, 2001) : 將 電泳結束分離的膠體浸泡在 CAPS (10 mM CAPS, 0.32 mM DTT, 15% methanol, pH 10.5)中，於室溫下以 50 rpm 搖晃 10 分鐘。接著裁剪一張與分離膠體(8.3 X 6.6 cm2) 相同大小之 HybondTM - PVDF 膜 (Millipore, Darmstadt, Germany)，與兩張相同大小 的濾紙。以甲醇(methanol)浸濕 PVDF 膜，再浸泡於 CAPS 中，並將濾紙也浸泡於 CAPS 內。接著依序在正極之電極板上鋪上一張濾紙、PVDF 膜、分離膠體及濾紙，
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盪 反 應 1 個小時後 ；以 PBST 清洗三次，每次 15 分鐘。最後加入 1 mL chemiluminescent HRP substrate (Millipore)，反應 5 分鐘內，迅速進行壓片，沖洗底 片並觀察結果。
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