微電泳晶片製造與晶片接合技術
Micr ofabr ication Bonding Technique for Micr o-Electr ophor esis
Chip
計畫編號：NSC
89-2218-E-006-097-執行期限：八十九年八月一日至九十年七月三十一日
主持人：林裕城 成功大學工程科學系
共同主持人：
計畫參與人員：
一、摘要 本計畫設計與製造微晶片式生化電泳 分析系統，包括微系統設計製造及發展晶 片接合技術兩部分，並且在晶片接合後將 利用雷射誘導螢光偵測系統進行微 PMMA 晶片電泳之偵測。首先，在微製造方面， 應用微機電製程技術之準分子雷射微加工 在 PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)晶片上製作 T 型微流管道；在晶片接合技術方面以融 合接合技術完成 PMMA 對 PMMA 的接 合；在偵測方面，其機制為應用電場驅動 方式在微流管道兩端施加電壓，進行樣本 預濃縮，並以毛細管電泳之技術分離出不 同大小片段的 DNA 分子。實驗結果顯示 T 型微流管道可以成功達到樣本預濃縮之機 制。本計劃成功完成晶片微流道及樣品濃 縮機械結構加工，改進傳統十字型毛細管 電泳的訊號強度，達到低成本高分離效率 的微晶片式電泳。 關鍵詞：微晶片式生化電泳、PMMA、微 機電系統、準分子雷射 Abstr act A microstructure onpoly-methylmetacrylate (PMMA) for sample
concentration and electrophoresis was
fabricated. This microfabricated structure was able to increase the detection signal and
lower the sample amount used in
electrophoretic analysis. The thin film electrode located at the T-intersection of the sample injection and separation channels provides the current path for the injection channel but restrains the DNA molecules from passing through. This can accumulate
DNA molecules and increase the
concentration before performing
electrophoretic analysis.
Experiments show that the DNA fragments can be concentrated greater than samples without a concentrator at the injection tee. The experimental results also demonstrated that the detected signal intensities of the separated DNA fragments in the tee-type chip with a sample
preconcentrator were greater than that
obtained in a conventional cross-type CE chip with an identical initial sample concentration.
Keywords：MEMS, PMMA, DNA molecules,
二、簡介
毛細管電泳(Capillary Electrophoresis, CE )是近年來在生化分析技術的一大突 破。1980 年代早期，學界指稱使用電壓驅 動 樣 本 分 離 ， 可 以 提 升 毛 細 管 電 泳 (Capillary Electrophoresis, CE)分離效率。 1981 年，Jorgenson 和 Lukacs 使用內徑 75µm，長度為 100 公分的毛細管來分離胺 機 酸 和 peptides ， 得 到 理 論 平 版 高 度 為 1µm[1]，大約為高效能液相分析層法的分 離效率之數百倍。1980 年代晚期到 90 年代 早期，CE 的商機漸明，有廠家願意將毛細 管電泳的學界研究成果轉為工業界的製定 設備，從此 CE 技術走入商品化階段。在 1992 年時 Manz 等人首先以微製程技術將 樣品分離管道與樣品注入管道導入矽晶片 中 來 製 作 毛 細 管 電 泳 (Capillary Electrophoresis, CE)中的分離系統[2]，以蝕 刻 的 方 法 在 矽 晶 片 上 蝕 刻 微 流 管 道 (microchannel)來代替毛細管。在此之後， CE 晶 片 的 研 究 就 朝 此 方 向 持 續 的 在 進 行，目的在研發出更具優勢的晶片[3-7]。 到了 90 年代晚期，已經有很多開業醫師及 醫學檢驗單位廣泛的使用 CE 商品，至此， CE 相關技術與週邊設備開始邁入蓬勃發 展的階段。由於微晶片式毛細管電泳是利 用半導體製程中微影、蝕刻等技術在晶片 上製作微流管道，在製作上頗為繁瑣耗 時。有鑑於此，本計畫採用準分子雷射光 蝕刻微加工技術來改善此缺點，並以高分 子材料 PMMA 為製作微流管道的基材，以 製作出低成本、高效能的微晶片式生化電 泳晶片。 三、研究方法 I. 微晶片式生化電泳之設計 本 研 究 預 濃 縮 前 處 理 電 泳 晶 片 採 PMMA 為晶片加工基材，配合準分子雷射 與半導體製程完成晶片製作。整個晶片尺 寸為長寬 75 mm × 25mm，而 Laser 光蝕刻 PMMA 基材微流管道，設計成樣本注入流 道：長 5mm ×寬 80µm ×深 20µm；樣本分 離流道：長 50 mm × 寬 80µm × 深 20µm。 上層 PMMA 晶片之樣品注入孔使用機械 式微鑽孔 2 mm 孔徑，晶片之電極微結構， 採 PVD 蒸鍍金屬於晶片上蓋，用以維持樣 品注入微流管道之導電性，並將樣品順利 收集且集中至微流道 T 字交接處，以做為 樣品分離前的濃縮。如圖一所示為預濃縮 晶片結構圖。 II. 實驗設計 本實驗之先期研究使用直接螢光偵 測設備為偵測電泳預濃縮晶片之偵測系 統，其中雷射激發光源波長為 532 nm 之綠 光，經由光學偵測顯微鏡組（Olympus BX60, Japan），作聚焦偵測，並透過光學倍增管 PMT (Hamamatsu R928, Japan)作螢光訊號 收集。電泳進樣預濃縮首先將 1×TBE (Tris borate EDTA) 緩 衝 液 藥 品 注 入 至 微 流 管 道 ， 而 後 將 DNA PCR Marker 與 EtBr (Ethidium bromide, USA)螢光染料充分混 合之後，由樣品注入孔進樣。進樣時施加 電壓為 150 Volts，其電場強度為 300 V/cm 在注入管道之間。如圖二 A、B 兩點分別 為 A：樣本進樣預濃縮前處理訊號偵測點， B：電泳分離樣本訊號偵測點。 在偵測樣本分離訊號之前，我們將樣 本預濃縮的部分設計成 A、B 兩實驗，目 的在於分析樣本由不同方式注入晶片中及 DNA 量的差異對訊號強度的相互關係。 A、樣本定濃度 將 原 始 濃 度 5µg/ml DNA （ PCR Marker）稀釋成濃度 1µg/ml，接著以體積
比 DNA：Loading Dye 為 5：1 的比例混合 再將此溶液與 EtBr. (1µg/ml)等體積混合成 實驗所需的樣本。 分別汲取 0.5µl、1.0µl、1.5µl、2µl 四 種不同體積，作同濃度不同體積之樣本與 預濃縮之訊號之間的比較。 B、樣本定體積 將 原 始 濃 度 5 µg/ml DNA （ PCR Marker）分別稀釋成濃度 1µg/ml、2µg/ml、 3µg/ml、4µg/ml、5µg/ml 五種不同濃度， 從每種濃度之溶液取出相同體積之樣本， 作不同濃度之樣本與預濃縮之訊號之間的 比較。 經由 A、B 兩實驗之結果，我們可以 找出樣本及晶片預濃縮之訊號的特性曲 線，而後進行樣本分離實驗，將結果與 CE 晶片作比較，證明此晶片確實能達到樣本 欲濃縮之功能。 III. 微晶片式生化電泳之製程 晶片製程包含微電極和微流道製作， 製程步驟分述如下： 1.晶片微電極
(a) 晶片基材清潔(Clean PMMA Substrate) (b) 金屬蒸鍍(Deposit Au and Ti )
(c) 旋轉塗佈光阻(Spin coating photo-resist) (d) 曝光(Photo-lithography)
(e) 顯影(Developing)
(f) 金 屬 蝕 刻 (Gold etching and Titanium etching)
(g) 去光阻(Remove photo-resist and clean)
2.晶片微流道
(a) 晶片基材清潔(Clean PMMA substrate)
(b) 準分子雷射加工(Laser ablation) (c) 晶 片 清 潔 與 低 溫 烘 乾 (Micro channel fabricated) 在完成底層的電泳微流管道和上層的 微注入孔後，必須應用接合技術將兩層 PMMA 做接合處理。而本計畫之接合技術 是 使 用 PMMA-PMMA 低 溫 熱 壓 融 接 (fusion bonding)技術，PMMA 晶片材料的 接合機制是將晶片藉由低溫(160o C)融合而 將晶片接合在一起，如圖三所示為融合接 合示意圖，此種接合技術必須考慮避免高 溫降至室溫時所產生的熱應力對材料的影 響，所以融合接合應採用相同的材質，如 PMMA 對 PMMA，或矽對矽之接合。另 外，本研究因蒸鍍金屬薄膜電極之故，於 接合參數的要求將更為嚴格，包括接合前 晶片材質接面的平整度、潔淨度及烤箱溫 度與夾製具上下施加壓力的適當控制，其 應 用 的技 術 是以 PMMA 的軟化點，將 PMMA 加熱至 160℃並控制其加熱時間及 退火時間，而達成融接目的。 PMMA-PMMA 融合接合機制： （1）晶片清潔。 （2）晶片對準與夾製具加壓固定。 （3） 入恆溫烘箱中高溫接合。 （4） 溫下自然冷卻退火處理。 IV. 直接螢光偵測系統 激發光與發射光聚焦徑 L4、L5， 當激發(excite)光打在樣本上使其發射(emit) 出 特 定 波 長 的 光 線 經 過 光 電 子 倍 增 管 (photo-multiplier tube, PMT)收集再作光轉 電訊號放大而檢出樣本分離結果。另外， 偵測訊號的高頻背景雜訊被提出探討，原 因是汞燈光源的波長連續性在空間中就有 先天的穩定度較差(poor spatial stability)的
因素，另外的雜訊來源可能是因為毛細管 本身管壁對於入射光的散射(scattering)也 會對螢光訊號造成一定程度的干擾。因 此，相較其他的偵測法如雷射誘導螢光 (Laser-induced Fluorescence Detection)或者 UV 可見光偵測(UV Visible Detection)，直 接螢光偵測法在極微量的樣本偵測上比吸 光度測定法有選擇性佳與較高穩定度的表 現，且直接螢光偵測法的靈敏度也較吸光 度測定法高一個數量級以上，另外系統架 構簡單，操作容易更是其特點。 圖四所示為本研究所使用之螢光偵 測系統架構圖，使用汞燈作為激發光源， 激 發 光 光 路 在 顯 微 鏡 (BX60, Olympus, Japan)內經過 530-550nm 波長的帶通濾鏡 組由接物鏡透射出，聚焦於預濃縮晶片的 偵測點上。DNA 分子經誘導所發出的螢 光，被另一 580nm 波長透鏡過濾出此光 頻 ，再 以光 電 倍增 管 (R928, Hamamatsu, Japan)將此螢光訊號轉為電壓訊號放大偵 測檢出。 V. 微電泳晶片電壓控制系統 電壓驅動的控制上，撰寫控制流程程 式對電源供應器下達電壓輸出指令，GPIB 卡接收到使用者命令，轉換編碼後發出動 作命令提示低壓電源供應器輸出 24 伏特電 壓驅動繼電器或高壓電源供應器輸出電壓 分離 DNA 樣本。由於實驗上的樣本分離高 壓供應高達 1.5∼3kV，在各線路及元件的 接點必須以耐高熱、防短路的絕緣膠、絕 緣套做好絕緣安全保護，並防止高壓產生 的電弧及電磁場對偵測系統的干擾。 如圖五為偵測及電壓控制系統圖，電 壓控制是以 LabVIEW 程控兩台 3kV 滿刻 度的直流電源供應器作為樣本電泳分離電 壓源，另外搭配兩台低壓電源供應器控制 3 顆高壓繼電器動作時間，切換樣本注入驅 動電壓與分離驅動電壓的供應時序控制。 當樣本注入電壓驅動時，低壓電源供應器 暫不開啟，3 顆高壓繼電器處於常開接點位 置，高壓電源以 300V/cm 電場強度將樣本 推送至流道 T 字交匯處，DNA 樣本於此同 時進行堆積的動作，時間在 200 秒後，低 壓電源供應器開啟，驅動 3 顆高壓繼電器 處於接通高壓電源位置，以 1.5kV 電壓開 始推動樣本分離。 四、結果與討論 樣品分離與偵測結果分述如下： 1.不同濃度同體積電極吸附樣本 此實驗目的在於校正樣本濃度與相對 應偵測訊號強度，便於驗證實驗中訊號值 與濃度值間之線性關係，濃度對訊號強度 的關係如圖六所示。 2.同濃度不同體積偵測訊號分析 此設計實驗目的在於觀察樣本在晶片 預濃縮微結構設計上實際的效用與測試系 統穩定度。圖七表示樣本注入之後，慢慢 被吸附於電極四周之訊號，在達到飽和之 後訊號強度會趨於穩定。將圖七中每種不 同體積作預濃縮達到穩定的值取出，將其 與訊號強度作兩者之間的比較，由圖八可 看出兩者間的線性度。 五、結論 本研究使用高分子材料 PMMA 作為 晶片基材，其融合準分子雷射、半導體微 製程技術，製作晶片式電泳預濃縮系統， 為本研究之最大特點。本研究已成功的完 成晶片微流道及樣品濃縮微機械結構加 工，所有製程參數業經測試穩定，有效的 控制了實驗參數(諸如樣本濃縮、分離之環 境與訊號擷取區域透光性等參數之穩定)。
七、參考文獻
1. J. W. Jorgenson, K. D. Lukacs, ”
Capillary Zone Electrophoresis,”
Science, 1983, vol.222, pp.266-272.
2. A. Manz, D. J. Harrison, E. M. J.
Verpoorte, J. C. Fettinger, A. Paulus, H. Ludi, H. M. Widmer, “Planar Chips Technology for Miniaturization and Integration of Separation Techniques
into Monitoring Systems,” J.
Chromatogr., 1992, vol. 593,
pp.253-258.
3. A. Guttam, E. Szoko, “Capillary Gel
Electrophoresis Separation of DNA
Restriction Fragments in a
Discontinuous Buffer System,” J. of Chromatogr., A, 1999, vol. 744, pp. 321-324.
4. J. W. Hong, K. Hosokawa, T. Fujii, M.
Seki, and I. Endo, ”An Inexpensive
PDMS (polydimethylsiloxane)
Microchip for Capillary Gel
Electrophoresis,” The 10th International Conference on solid-state Sensors and Actuators, 1999, pp. 760-763.
5. C. S. Effenhauser, G. J. M. Bruin, A.
Paulus, and. M. Ehrat, “Integrated Capillary Electrophoresis on Flexible Silicone Microdevices ： Analysis of
DNA Restriction Fragments and
Detection of Single DNA Molecules on Microchips,” Anal. Chem., 1997, vol. 69, pp. 3451-3457.
6. D.C. Duffy, J. C. McDonald, O. J. A.
Schueller, and G. M. Whitesides, “Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly (dimethylisloxane),” Anal. Chem., 1998, vol. 70, pp. 4974-4984.
7. A.T. Woolley, K. Lao, A. N. Glazer, R.
A. Mathies, “Capillary Electrophoresis Chips with Integrated Electrochemical Detection,” Anal. Chem., 1998, vol. 70, pp. 684-688.
八、附圖
圖一 樣本預濃縮晶片結構示意圖
圖二 偵測點示意圖
R2 = 0.9918 0 5 10 15 0 1 2 3 4 5 6 Sample concentration(µg/ml) Signal (V) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 10 20 30 40 50 Time (sec) Normalized signal . 2.0 ul 1.5 ul 1.0 ul 0.5 ul 圖四 直接螢光系統偵測圖 圖五 為偵測及電壓控制系統圖 圖六 濃度對訊號強度的關係 圖七 不同體積之預濃縮訊號圖 y = 0 . 5 2 0 6 x - 0 . 0 5 7 3 R2 = 0 . 9 9 6 3 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 1 . 2 0 0 . 5 1 1 . 5 2 2 . 5 S a m p le v o lu m e ( u l) Normalized signal 圖八 體積與訊號強度之關係
