一、探討新穎Indolylquinoline衍生物誘導非小細胞肺癌細胞凋亡機制二、鑑定具有清除肺癌幹細胞的藥物

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士班研究生論文. 一、探討新穎 Indolylquinoline 衍生物誘導非小細胞肺癌細胞凋亡機制 A Novel Indolylquinoline Derivative Induced Apoptosis in Human Non-small Cell Lung Cancer Cells. 二、鑑定具有清除肺癌幹細胞的藥物 The Identification of Drugs with Potential to Eliminate Lung Cancer Stem-like Cells. 研究生 : 巫佩岑 Pei-Tsen Wu 指導教授 : 方剛博士 Kang Fang. 中華民國一○三年七月 1.

(2) 誌謝這兩年的研究生涯，讓我理解到科學不只需要大膽假設與小心求證，從實驗流程的框架、每項步驟的微調、細節討論及實驗結果的反覆確認，這中間有許多困難需要克服，我能順利完成這篇論文，要感謝許多幫助及指導過我的人。首先，最要感謝的就是方剛教授，在我實驗及寫論文碰上瓶頸時，老師不但會與我討論，也不斷地引領我往不同路徑思考，也會在適當的時候激勵我，使我更具實驗動力，朝目標邁進。其次，要謝謝口試委員陳玉華與姚清發教授，對這篇論文提出很多建設性及邏輯性的建議，讓論文能更加完善。最後要感謝的是實驗室所有的夥伴們，帶我熟悉實驗室及指導細胞培養的雅竹及楷涵學姊，教導我儀器操作及原理的長亨學長，指導我實驗細節的景平學長，還有為我解惑的俊彥學長，一路下來相互鼓勵的采蓁及偉賢，不時協助我實驗進程的柏緯學弟。另外，我要感謝顯微鏡室的管理人員映伶、建文及佳薇。最後祝福玉玲學妹、文興學弟及潮永學弟能一路保持著科學精神及態度，順利克服未來的挑戰及完成實驗。. 2.

(3) 目錄壹、中文摘要………………………………….............4. 貳、英文摘要..…….…………………………………..6. 參、文獻回顧…...…………………………………..…8. 肆、研究目標………………………………….............12. 伍、材料與方法…………………………………….....13. 陸、結果........…………………….…………………....20. 柒、討論……………………………………….…….…23. 捌、參考文獻….……………………………………....26. 玖、圖…………………………………………………...32 3.

(4) 壹、中文摘要過去研究利用 MTT assay 以非小細胞肺癌細胞 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 為平台篩選了逾五百種小分子化合物，發現含有 indole 及 quinoline 這兩種官能基的小分子化合物 compound A，於低劑量下，會抑制 A549 及 H460 這兩株 NSCLC 細胞生長速率及抑制 A549 腫瘤生長，但對抑癌基因 p53 缺失的 H1299 細胞株則無影響，接著使用 western blot, MTT 及 flow cytometry，證實此藥物會誘導表現野生型 p53 的細胞產生凋亡，但是 p53 缺失的 H1299 細胞對此藥物的敏感度較低，而且不會出現凋亡。本論文內容是繼續探討此藥物對 NSCLC 細胞的調控生長機制與 p53 基因型的相關性。實驗主要是將 p53 缺失的 H1299，分別轉殖入 p53 DNA-binding domain 位點突變的 p53R267P 以及野生型 p53 的細胞株，其次再使用 MTT 實驗，發現以此藥物 10 µM 處理 H1299 轉殖野生型 p53 細胞 48 小時後的生長速率較轉殖 p53R267P 敏感度高 35％，繼續使用 propidium iodide 及 Annexin V 進行實驗，證實轉殖野生型 p53 細胞生長率的降低，是細胞凋亡造成，但以此藥物 10 µM 處理 H1299/p53R267P 細胞 48 小時後，細胞凋亡數目比例較 H1299/p53 細胞降低 39.2％，最後由 western blot 確認細胞凋亡與 p53 及其下游 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 裂解及 caspase-3 活化的蛋白質相關。這些實驗結果證明此藥物對表現野生型 p53 的 H1299/p53 細胞有最佳的治療效果，且野生型 p53 功能在此藥物誘導的凋亡機制中扮演了重要 4.

(5) 角色。未來實驗中將持續探討 compound A 如何降低腫瘤細胞生長，實驗會以癌症類幹細胞為模式，持續研究抑制腫瘤生長及轉移的機制。. 關鍵字：Indolylquinoline、細胞凋亡、p53、非小細胞肺癌. 5.

(6) 貳、英文摘要 Previously, we have screened more than five hundred compounds with small molecular weight through MTT assay. The findings have identified that lower concentrations of a small molecular compound A containing functional groups indole and quinoline was effective to inhibit the growth rate of wild-type p53 NSCLC cells and suppress tumor growth, but the drug is less sensitive to p53-null H1299 cells. All western blot, MTT, and flow cytometry experiments showed that the induced apoptosis in NSCLC cells involved wild-type tumor suppressor genes p53. The cells without p53 were less sensitive to compound A. The experiments keep on exploring the mechanism on how compound A regulates the growth and association with p53 status in cells. We have further tested the effect of the compound in p53-null H1299 cells with stable expression of mutated (H1299/p53R267P) and wild-type p53 (H1299/p53), respectively. Through MTT assay, after treated 10 µM compound A 48 hours, the data was shown more drug effective in H1299/p53 cells than H1299/p53R267P cells. The results proved that the efficacy is related to p53 genotype. Using flow cytometry and western blot experiments, we found that compound A can reduce proliferation rate through apoptotic cell death in the H1299/p53 cells, and the apoptosis percent of H1299/p53 cells is 39.2％ higher than H1299/p53R267P cells. We have also shown that the p53-dependent apoptotic cell death pathway began with activating p53, attenuating Bcl-2, activating caspase family proteins, and finally cleaving poly (ADP-ribose) polymerase. These results demonstrate that the cells with wild-type p53 were more sensitive to compound A. In the future, we will continue to explore the mechanisms on how compound A inhibits the growth and metastasis in lung cancer stem-like models. 6.

(7) Key words：Indolylquinoline, apoptosis, p53, non-small cell lung cancer. 7.

(8) 參、文獻回顧一、肺癌肺癌的發生涉及 10 個以上的基因突變，其中較常見的為 p16INK4a, p53, EGFR, K-ras 及 mTOR 路徑相關的分子突變[1] [2]，其中 p53 基因突變的肺癌病患佔約 56%[3]，所以發掘更多有治療效果的藥物，是近年來肺癌研究的主要目標之一。肺癌細胞可以分為小細胞肺癌 (small cell lung cancer, SCLC, 17%)、非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC, 80%) 以及 3%無特定型。其中非小細胞肺癌包括:鱗狀細胞癌 (squamous cell carcinoma, 30%) 、肺腺癌 (adenocarcinoma, 40%)、與未分化巨細胞癌 (large-cell undifferentiated carcinoma, 10%)[4]。. 二、目前臨床肺癌藥物類型目前癌症臨床上常使用的藥物是 cisplatin，它會與 DNA 結合，阻斷細胞生長而導致細胞死亡[5]。其它如使用前需基因檢測的個人化治療標靶藥物 Iressa (Gefitinib, 愛瑞莎)，它對 EGFR 激酶區域第 18-21 的表現序列（exon）有突變的病患較有效用，其作用機轉是與腫瘤細胞表面突變的受體結合後，阻斷 EGFR 下游活化，進而抑制腫瘤生長作用[6][7]。此外常見的放射藥物，Taxol (Paclitaxel, 太平洋紫杉醇)，它透過調控 p53，抑制. 8.

(9) 細胞有絲分裂，使細胞停滯於細胞週期 G2/M 期，它常與鉑金類藥物同時使用[8]。一些癌細胞具有高濃度的 glutathione 或 ATP binding cassette (ABC) 轉運蛋白，會和烷基類藥物結合減低藥性，或是經由細胞膜上通道蛋白排出藥物，所以經抗癌藥物治療後，難以殺死癌細胞，產生抗藥性負作用[9]，因此需要持續開發新的癌症治療藥物。三、抑癌基因 p53 前人的研究發現腫瘤抑癌基因 p53 其訊息 RNA 約 2.8Kb，它可轉譯出 393 個胺基酸的蛋白質[10] [11]。P53 的突變區大部分為 DNA-binding domain[12]，此區突變後，便無法和 DNA 結合進行 p53 的轉錄功能，也就無法修復 DNA 受損的細胞，當細胞累積大量受損的 DNA 後，使錯誤蛋白轉譯量變多，造成細胞內生長與其他功能異常突變的累積，進而增加癌症的發生機率[13]。p53 在癌細胞抗藥性也佔據重要角色，它可抑制抗藥基因 MDR-1 的轉錄，進而降低抗藥轉運子 P-glycoprotein 活性[14] ，使癌細胞抗藥性下降。四、p53 依賴的細胞凋亡路徑目前所知的抗癌藥物其機制多是以引發 p53 相關的細胞凋亡路徑 [15][16]. ，因此對表現 p53 野生型的癌細胞有較好的治療效果[17]。p53 調控. 的程序性死亡過程中，細胞膜會逐漸內縮，凋亡早期細胞膜外翻；晚期 9.

(10) 時膜的通透性增加，細胞核 DNA 被 endonuclease 降解成 180 bp - 200 bp 片段. [18] [19] [20]. ，且細胞凋亡特徵還有染色質濃縮、細胞膜產生小泡等現象. [21]. 。當細胞 DNA 受到紫外線或者游離輻射線破壞時，p53 會轉錄 GADD45. (growth arrest and DNA damage 45) 修補 DNA，同時會活化下游的 p21 基因使細胞週期停滯；但當 DNA 受到的傷害過程嚴重無法修補時，p53 則會誘發細胞 programmed death，又可稱其為 p53 依賴的細胞凋亡路徑 [22][23]. 。目前所知與 p53 相關聯的細胞凋亡路徑可大致區分為二 (一) 粒線. 體內源性路徑 (intrinsic mitochondrial pathway) 中 p53 透過促凋亡 Bcl-2 家族間接調控粒線體，例如:Bax、Bak 及 Bcl-2 等[24]。這些路徑會使粒線體釋出凋亡蛋白，例如: Bcl-2 蛋白家族中的促凋亡蛋白 Bax 活化後，會 oligomerization （寡聚化）到粒線體外膜上而形成孔道（pore），使 cytochrome c 從中釋出[25]，與 procaspase-9 及 apoptotic protease activating factor-1 (Apaf-1) 結合，形成 cyt c-Apaf-1-procaspase-9 多聚體，使 caspase-9 活化，caspase-9 再活化下游 caspase 系列蛋白（caspase-3, -6, -7），最後降解胞內重要蛋白，例如:DNA 修復蛋白 poly ADP-ribose polymerase [26]。 (二)外源性凋亡受體路徑 extrinsic death receptor pathway：當細胞膜上的死亡受體接收到 ligand 的訊號且與其作用後，會引起 caspase-8 的活化，再繼續觸發下游 caspase 系列蛋白活化，例如：p53 會誘導 DR5 活化 (TRAIL 的 death domain-containing receptor) ，DR5 會促使細胞 DNA 的 10.

(11) 損害，使得 caspase-8 的活化進而促進細胞凋亡[27] [28]。由上述可知於細胞凋亡的過程中 p53 的活化與降解，對粒線體內源性與外源性凋亡有關係。. 五、待測化合物 compound A 本研究使用的小分子 Indolylquinoline 衍生物 (compound A) 其結構同時包含 indole 及 quinoline 兩種官能基的化合物。之前的報導中指出 indole 的化合物 indole-3-carbinol 能抑制乳癌細胞 EGFR 表現[29]，並誘導細胞趨向粒線體細胞凋亡路徑，抗肺癌藥物 vinblastine 其結構也包含 indole 官能基。Quinoline 的衍生物 Camptothecin 與 Human topoisomerase I 結合使用會造成肺癌細胞 DNA 損傷，並誘導其趨向細胞凋亡[30] [31]。因而含有這兩種官能基的 Indolylquinoline 衍生物可能具有抗癌功效，目前此類衍生藥物用於治療利什曼蟲病(Leishmaniasis) ，被當成抗菌劑使用，其機轉尚未明晰[32]。而本實驗室尚未發表的結果顯示，以 10 M Indolylquinoline 的衍生物 compound A 處理 A549 及 H460 細胞後會誘導產生 p53 依賴的細胞凋亡，而抑制生長率，在動物實驗中也發現 compound A 可以抑制 A549 腫瘤生長，並且在此濃度處理後對裸鼠無毒殺性。本研究接續以轉殖野生型 p53 的 H1299 及轉殖 p53 DNA-binding domain 位點突變的 H1299/p53R267P 細胞證實了此藥物對 p53 功能正常的非小細胞肺癌細胞最敏感，能抑制細胞生長及誘導細胞凋亡，但對 p53 功能缺失或不. 11.

(12) 完全的細胞較不敏感，表示功能完整的 p53 在此藥物機制中是重要的調控基因。. 肆、研究目標一、確認 compound A 對野生型 p53 的肺癌細胞的藥性測試根據實驗室未發表的結果顯示 compound A 對有野生型 p53 的 A549 及 H460 細胞較敏感，但對 H1299 細胞無抑制生長功能，為了證明此藥物對野生型 p53 的肺癌細胞較敏感，實驗以 p53 缺失的 H1299、轉殖入野生型 p53 的 H1299/p53 及轉殖入 DNA-binding domain p53 R267P 位點突變的 H1299 穩定細胞株，繼續探討低劑量 compound A 處理後對細胞生長的影響，以及產生的細胞凋亡路經，p53 是否可促進細胞凋亡的傳遞訊息。如果此藥物的抑制效果是針對 p53 功能完整的肺癌細胞，則轉殖入野生型 p53 的 H1299 細胞對 compund A 將會有最佳的抑制生長效果，而對 p53 功能不全的細胞 H1299/p53R267P 和 H1299 敏感較低。二、確認 compound A 是否對 DNA binding domain p53 R267P 的病患具治療潛力在現有的藥物中，多數藥物對野生型 p53 的癌細胞具有較佳的治療效果，如 cisplatin[15]。約 56％肺癌病患，其 p53 DNA binding domain 具有點突變[3]，所以對 p53 基因突變的癌症患者有治療潛力的藥物持續在發. 12.

(13) 掘中，本研究也以 compound A 處理 H1299/p53R267P 細胞後進行瞭解。三、確認此藥物誘導的細胞凋亡路徑與 p53 是否有顯著的相關性由實驗室尚未發表的數據中得知，compound A 會誘導 A549 及 H460 細胞趨向 p53 依賴的細胞凋亡，但在 H1299 細胞則沒有出現，本文將以 H1299 , H1299/p53 及 H1299/p53R267P 細胞確認此藥物確認是否會誘導肺癌細胞的 p53 依賴的細胞凋亡路徑，並且與 p53 基因型的相關性作進一步探討。. 伍、材料方法一、細胞株本研究主要以 H1299、H1299/p53 以及 H1299/p53R267P 這三株非小細胞肺癌細胞進行研究。H1299 是缺乏 p53 基因的突變株。H1299/p53 以及 H1299/p53R267P 則是將 H1299 轉殖 p53 及 p53R267P 後，挑出穩定表現 p53 基因的肺癌細胞株進行繼代培養。H1299/p53R267P 其質體是延用已發表的論文，其建構方式是將 CMV 啟動子驅動 pcDNA3-p53 之質體，以點突變 (site-directed mutagenesis) 的方式，建構 p53 的突變位點，構築 pcDNA3-p53(R267P) 質體，其次將把此質體轉進 H1299 細胞中，經由抗生素選殖後，此細胞株可穩定表現 p53R267P 蛋白[36]。. 13.

(14) 二、細胞培養將細胞培養在 10% (v/v) 胎牛血清 (fetal bovine serum) 的 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 中後，置入 5% CO2、37℃的培養箱中。細胞繼代時，先移除舊培養液，以 1 mL PBS 將細胞洗過，然後移除 PBS，加入 trypsin-EDTA 後，於 37℃下作用 5 分鐘，以 DMEM 中止 trypsin-EDTA 的作用，緩慢將細胞從培養盤上打下，取適量的細胞放置於新的 6-cm 培養盤。細胞計數時，先將細胞收集到 15 mL 離心管中，以 800 rpm、5 分鐘離心，接著移除上清液，再加入 1 mL DMEM 將細胞混勻，取出 10 µL 以 trypan blue 稀釋和染色，最後以顯微鏡觀察並計數。. 三、細胞生長率分析 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay 數 1.5×103 個細胞，放入 96 -well plate 中，於培養箱中放置 24 小時，讓細胞貼附。24 小時之後將培養液移除，再放入含 compound A 的培養液 (10 % FBS)，此時的藥物濃度分別為 5、8 及 10 µM 與等體積 DMSO 做測試組。經過 48 小時後，將含待測藥物的培養液移除，接著加入 80 µL DMEM 和 10 µL 的 MTT (5 mg/mL) 試劑，置於培養箱中 3 小時。將含有 MTT 14.

(15) 的培養液移除，加入 100 µl 的 DMSO，待紫色結晶溶解後，以光電比色計 (BioRad) 測試樣品在波長 540 nm 下的吸光值。. 四、細胞蛋白質的萃取將藥物處理後的細胞樣品，移除上清液後，用 PBS 清洗一次，加入適量的 RIPA buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5) , 1 mM Na2EDTA, 1% sodium deoxycholate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 g/mL leupeptin) ，覆蓋後放入 4℃冰箱中搖晃 5 分鐘。以細胞刮勺刮起細胞與蛋白，並將含有細胞與蛋白的 RIPA buffer 放入 eppendorf，以 13,000 rpm 離心 25 分鐘。再將上清液取出移入另一個新的 eppendorf 中，接著保存於-20℃冰箱中，待後續的蛋白質定量。. 五、蛋白質定量利用 Bradford 的原理，在 96-well plate 中各孔加入 295 L Coomassie Blue (Bio-Rad protein assay, Coomassie® Brilliant Blue G-250 dye 1:4 ddH2O 稀釋)。其次取出保存於-20℃冰箱的蛋白，並使用已知的濃度的標準訂量品，蛋白質牛血清蛋白 BSA (bovine serum albumin; 2,000 g/mL) (Albumin Standard, Thermo #23209) 做為標準蛋白質，並將 BSA 分別以 PBS 倍率稀釋配置 1000、500、250、125、62.5 g/mL 等不同濃度的標準蛋白質定量品。 15.

(16) 接著將標準蛋白質定量品以 4 L 加入 96-well plate，而實驗蛋白質樣品以 1 L 加入。充分混勻後避光反應 10 分鐘，以連續性波長酵素免疫分析儀測量，用 OD595 nm 的吸光值。再以標準蛋白質定量品的吸光值製作出標準曲線，後換算樣品的蛋白質濃度接續做實驗。. 六、西方轉漬法用酒精擦拭製膠用的玻璃後，配置 12％的分離膠置入膠體製備裝置中，並在上層加入異丙醇壓製分離膠的表層使其平整並隔絕空氣氧化。分離膠凝固後將上層的異丙醇用 ddH2O 沖洗乾淨，接著配置 5％的聚集膠，並置入膠體製備裝置中的上層後插入齒梳。等待膠體完全凝固，將 running buffer 加入中型直立式電泳槽，然後將膠體與玻璃一同裝電泳槽，再將 running buffer 加滿過齒梳，接著移除把齒梳。將定量好的蛋白品取用 20 g (與 3× sample buffer (350 mM Tris-HCl (pH 6.8), 12％ SDS, 0.02％ bromophenol bule, 35％ glycerol, 30％ -mercaptoethanol) 一同放入 eppendorf 中均勻混和。接著放入乾浴槽以 95℃加熱 5 分鐘後取出。而後將樣品逐一置入分離膠中的 well 裡，並在第一格加入 1 L 蛋白質分子量標記蛋白 (prestained molecular weight markers，Infinigen EZColor II TM, IN1125) ，進行電泳。利用電源線將電源供應器與直立式電泳槽連接，電流方向為負到. 16.

(17) 正向下電泳，先以 60V 的電壓 30 分鐘使蛋白樣品聚集在聚集膠底部，再以 120V 的電壓 40 分鐘進行分離膠的電泳，進行分離。準備兩張濾紙，以及與膠體大小相似的聚硝化纖維膜 (nitrocellulose membrane, NC membrane; Pall Corporation) ，用濾紙與海綿在轉漬前須先以 transfer buffer 浸濕再進行轉漬。取出 SDS-PAGE 後將多餘膠體切除，從轉漬板夾負極端，依序疊上海綿、濾紙、膠體、待轉漬的膜、濾紙、海綿。將轉漬板夾夾緊，放入轉漬槽後裝填八分滿的 blotting buffer 進行轉漬，以 80V 的固定電壓轉漬 80 分鐘。使用 PBS-T (含 0.05% Tween-20 的 PBS ) 搖晃清洗 5 分鐘後以 5% 的 blocking buffer (5% skim milk 的 PBS-T) 浸泡轉漬完成的膜，在室溫下輕搖 1 小時，接著利用 PBS-T 搖晃清洗 4 次，每次 5 分鐘，之後加入適當稀釋倍率的一級抗體，放入 4℃冰箱中 1 天。一級抗體反應後，利用 PBS-T 搖晃清洗 4 次，每次 5 分鐘，接續加入以 1:5,000 稀釋的二級抗體室溫下反應 1 小時。再以 PBS-T 搖晃清洗 4 次，每次 5 分鐘，最後加入 ImmobilonTM western chemiluminescent HRP substrate (Millipore) (luminal reagent : peroxide solution = 1 : 1)，均勻覆蓋在膜上，再以冷光儀 (LAS3000/LAS4000, Fuji Film) 中的可見光與冷光呈像。. 七、Mitochondrial membrane potential (MMP) 17.

(18) 數 2×105 個細胞，放入 12-well plate 中，於培養箱中放置 24 小時，讓細胞貼附。24 小時之後將培養液移除之後，放入含待測藥物的培養液，此時的藥物濃度分別為 5、8、10 µM 及等體積 DMSO。12 小時後，將含待測藥物的培養液移除，接著加入 trypsin-EDTA，於 37℃下作用 5 分鐘，以 1× assay buffer（MitoPTTM Kit）中止 trypsin-EDTA 的作用，緩慢將細胞從培養盤上打下，置入 15 mL 離心管中以 900 rpm、5 分鐘離心，接著移除上清液，再加入 1 mL 1× assay buffer 將細胞混勻，再以 900 rpm 5 分鐘離心後移除上清液，接著每管各加入 250 L 含有 1% JC-1 的 1× assay buffer (MitoPTTM Kit) 染劑，於 37℃下避光作用 25 分鐘。將樣品過篩網後，以流式細胞儀 (Becton-Dickson, Mansfield, MA) 進行實驗，並用 FlowJo 軟體 (Tree Star, Inc.) 分析數據。. 八、以 propidium iodide (PI) 染色觀察細胞週期分布取 2×105 個細胞，置於 12-well plate 中，培養 24 小時待細胞貼附於盤底後，移除培養液，加入含待測藥物的新培養液，藥物濃度分別為 5、 8、10 µM 及等體積 DMSO。分別經過 24、36 及 48 小時後，將培養液收到 15 mL 離心管中，用 PBS 清洗細胞，並收到離吸管，再用 trypsin-EDTA 將細胞收集到離心管中，最後再用 PBS 將 12-well plate 中殘餘的細胞收到離心管中。以 1,200 rpm、5 分鐘離心，移除上清液，再. 18.

(19) 用 PBS 將細胞清洗兩次、離心、移除上清液後，加入 70%酒精，以固定細胞。置於 -20℃冰箱，一天過後之後即可上機。將樣品從 -20℃冰箱取出，離心之後清除上清液，再用 PBS 將細胞清洗兩次，離心後清除上清液，加入含有 10 µL PI (0.5 mg/mL) (Sigma, St. Louis, MO) 及 10 µL RNase A (20 mg/mL) (ICN Pharmaceutical；Costa Mesa, CA) 的 1 mL PBS，於室溫下避光 30 分鐘。將樣品過篩網後，以流式細胞儀 (Becton-Dickson, Mansfield, MA) 進行實驗，並用 FlowJo 軟體 (Tree Star, Inc.) 分析數據。. 九、以 propidium iodide (PI) 和 Annexin V 雙染色觀察細胞凋亡取 2×105 個細胞，置於 12-well plate 中，培養 24 小時待細胞貼附於盤底後，移除培養液，加入含待測藥物的新培養液，藥物濃度分別為 5、 8、10 µM 及等體積 DMSO。經過 48 小時後，先將培養液收到 15 mL 離心管中，用 PBS 清洗細胞，並收到離吸管，再用 trypsin-EDTA 將細胞收集到離心管中，最後再用 PBS 將 12-well plate 中殘餘的細胞收到離心管中。以 1,200 rpm、5 分鐘離心，移除上清液，再用 PBS 將細胞清洗兩次、離心、移除上清液後，加入含有 0.5 µL PI (50 µg/mL) (BD, Cat. 556547) 及 0.5 µl Annexin-V FITC (20 µg/mL) (BD, Cat. 556547) 的 100 µL 1x Annexin-V binding buffer，在室溫下避光 30 分鐘。. 19.

(20) 將樣品過篩網後，以流式細胞儀 (Becton-Dickson, Mansfield, MA)，並利用 FlowJo 軟體 (Tree Star, Inc.) 進行實驗。十、以免疫螢光染色觀察 cytochrome c 從粒線體中釋出取 2×105 個細胞，置於底部含玻片的 12-well plate 中，培養 24 小時待細胞貼附於盤底後，移除培養液，加入含待測藥物的新培養液，藥物濃度為 5 µM 及等體積 DMSO。經過 24 小時後，加入 hoechst 33342 (40 nM)染色 10 分鐘，移除上清液後以 PBS 將細胞清洗兩次，再以 4 % 福馬林固定 15 分鐘，接著以 PBS 將細胞清洗兩次後加入 Mitotracker (500 nM)染色 15 分鐘，再以 PBS 將細胞清洗兩次後加入 cytochrome c 抗體 (1:500) 處理 24 小時，然後以 PBS 將細胞清洗兩次後加入 goat-anti-rabbit antibody-FITC (1:500) 處理 24 小時，以 mounting buffer 封片後，用活細胞顯微鏡鏡行照相，最後以 Adobe photoshop 進行影像處理。. 陸、結果一、 Compound A 可以抑制含有 p53 NSCLC 的細胞生長實驗使用 MTT assay 測試 compound A 是否可抑制非小細胞肺癌生長。以不同濃度的 compound A 處理 A549, H1299, H1299/p53R267P 及 H1299/p53 四種細胞 48 小時後，A549 的細胞的 IC50 為 9.3 µM，而 H1299/p53 細胞的 IC50 為 9 µM，但實驗結果顯示 H1299 細胞以藥物 10 20.

(21) µM 處理 48 小時後未能抑制其生長 ( Fig 1 )，但 H1299/p53R267P 細胞其敏感度不若 H1299/p53 細胞，但在 10 µM 處理 48 小時後仍然下降 34%，而且有顯著差異。二、藥物抑制細胞生長的原因與細胞凋亡相關為了要確認此藥物對非小細胞肺癌的細胞週期的影響為何，由 PI 染色實驗中發現，在正控制組 A549 的細胞中，其 sub-G1 細胞數由 2.3 ％上升至 38.2％，G0/G1 期下降約 40%，G2/M 期上升約 5% (Fig 2A) ， H1299 細胞於加藥 48 小時後，其 sub G1 細胞數目未顯著增加，G0/G1,S 及 G2/M 則無明顯改變趨勢 (Fig 2B)，而在 sub G1 細胞數目增加最顯著的 H1299/p53 細胞，其 sub-G1 細胞數由 1.7％上升至 38.6％ (Fig 2C)，而 G0/G1 期下降約 33%，但 G2/M 的比例沒有改變，藥物對 H1299/p53R267P 細胞較不敏感，其 sub-G1 細胞數由 2.3％上升至 10.2％，G0/G1 下降約 13%，G2/M 期上升約 12% (Fig 2D)，推斷藥物會讓非小細胞肺癌停滯在 G2/M 期。推測 compound A 對 H1299/ p53R267P 細胞藥效不若 H1299/p53 細胞明顯。為了確認經藥物處理非小細胞肺癌後，其 sub-G1 細胞數上升是與細胞凋亡有關，再使用 Annexin V 和 PI 雙染實驗進一步分析，細胞凋亡早期時，其細胞內膜 PS 外翻，可染上 Annexin V 紅色螢光 (第四象限) ，凋亡晚期時，細胞膜通透性上升，也可染上 PI 藍色螢光 (第一象限)， 21.

(22) 但細胞壞死時，其細胞膜不完整只易染到 PI 藍色螢光 (第二象限) 。正控制組的 H460 細胞隨著藥物濃度 (5、8 及 10 µM) 的增加，早期及晚期細胞凋亡比例由 4.4％上升至 48.8％，H1299/p53 細胞隨著藥物濃度 (5、8 及 10 µM) 的增加，細胞凋亡比例由 6.1％上升至 33.1％，而顯示細胞壞死的第二象限於加藥前後細胞數目比例小於 5 %，表示藥物不會引起細胞壞死。H1299/p53R267P 細胞經藥物處理 48 小時後，細胞凋亡比例由 2.4％上升至 8.4％，H1299 細胞為 4.5％上升至 5.9％ (Fig 3)，證實細胞死亡是源於細胞凋亡，也因此可以證實 H1299/p53R267P 細胞對藥效的敏感性不若 H1299/p53 細胞敏感。三、藥物敏感性與野生型 p53 的肺癌細胞相關係實驗以 western blot 實驗確認 H1299/p53 細胞凋亡的路徑和 p53 基因型相關，A549 及 H1299/p53 兩種細胞以 5 µM 藥物處理 48 小時後，可觀察到 p53 上升時會抑制 Bcl-2 和 Bax 結合，且抑制 Bcl-2 表現，使粒線體外膜通透性增加，接著 cytochrome c 從中釋出，活化 caspase-3，其次降解一系列蛋白，如 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) ，H1299 及 H1299/p53R267P 細胞的 western blot 結果中，其 p53、PARP cleavage form、pro-caspase-3 及 Bcl-2 都沒有顯著改變。而以 8 µM 經不同時間點 (12、24 及 48 小時) 處理細胞後，也有類似結果 (Fig 4B)。所以此藥物會誘導野生型 p53 的非小細胞肺癌趨向 p53 相關路徑的細胞凋亡。 22.

(23) 四、藥物會降低細胞粒線體膜電位為了確認藥物會誘導 cytochrome c 從粒線體釋出，實驗以 5 µM 的藥物處理 H1299/p53 細胞 12 小時後，發現粒線體膜電位下降 61.3 % (Fig 5A)，在 H1299/p53R267P 細胞粒線體膜電位下降 9 % (Fig 5B)，這個結果顯示藥物能顯著抑制 H1299/p53 細胞的 Bcl-2 表現，使 Bax 蛋白於粒線體外膜形成通道，導致粒線體膜電為降低。在接續的免疫螢光染色觀察到以藥物 5 µM 處理 H1299 細胞 24 小時後，粒線體及 cytochrome c 無明顯聚集 (Fig 6 A)，但在 H1299/p53 細胞螢光染色圖中，其粒線體和細胞色素 c 有明顯的聚集情況，表示 cytochrome c 從粒線體中釋出 (Fig 6 B)，而在 H1299/p53R267P 細胞雖然無聚集情況，但 cytochrome c 的紅色螢光在加藥處理後會增加 (Fig 5 C)。證明此藥物會誘導 cytochrome c 從非小細胞肺癌的粒線體釋出至細胞質中。. 柒、討論一、Compound A 抑制非小細胞肺癌的增生，此機制和 p53 基因型相關未來的實驗中，能觀察 p53 下游蛋白 p21 活性[33]，以進一步確認 H1299/p53R267P 及 H1299/p53 這兩株細胞轉殖後的 p53 蛋白活性表現。在實驗室未發表論文中發現此藥物以低濃度處理 H1299 細胞，無法抑制其增生能力，但在具野生型 p53 的 A549 及 H460 細胞中，能抑制. 23.

(24) 其生長，本實驗則進一步確認此藥物，有明顯抑制 H1299/p53 細胞增生的能力，但對 H1299 及 H1299/p53R267P 兩種細胞，則無生長抑制效果 (Fig 1) 。在 A549, H1299, H1299/p53 及 H1299/p53R267P 這四株細胞中，A549 及 H1299/p53 細胞具有野生型的 p53 基因，因此，據研究結果推測，此藥物是對 p53 功能完整的非小細胞肺癌有良好的抑制增生效果。根據本文實驗，推測藥物對 H1299 細胞敏感較低，所以藥物處理後其細胞週期的分佈無明顯變化 (Fig 2B)，在正控制組 A549 細胞中，則發現 sub-G1 細胞數目及 G2/M 期上升 (Fig 2A)，推斷細胞死亡的同時也進行自我修補[34]，使細胞於 G2/M 期停滯，但是在 5 µM 處理 H1299/p53 細胞 48 小時後所造成的損傷，已使細胞無法進行修補，於是趨向細胞凋亡，使 sub-G1 細胞數目較顯著上升，而無法觀察到細胞週期的停滯 (Fig 2C)，最後在 H1299/p53R267P 細胞中，觀察到 sub-G1 細胞數目上升不若 H1299/p53 細胞明顯，所以藥物還是對 H1299/p53R267P 細胞有一定的敏感度，並停滯在 G2/M 期。推論當藥物的處理時間或是濃度減少，則可於非小細胞肺癌中觀察到更明顯的 G2/M 期停滯。在未來能以低於 5 µM 的藥物濃度或是作用短於 48 小時的 PI 染色實驗證明此結果推測，或是再加入 colony forming assay，佐證藥物會誘導 H1299/p53 細胞死亡及生長抑制。許多抗癌藥物對於野生型 p53 的癌細胞具有較高敏感性[16] [17]，因為 24.

(25) p53 是抑制腫瘤生長基因，當藥物誘導 p53 表現量升高後，可能會引起各種抑制癌細胞或是凋亡路徑的產生，如 Akt/PI3K 路徑[35]，所以研究如何藉由藥物調控抑癌基因家族的表達，是具有潛力的抗癌方法。二、此藥物可誘導非小細胞肺癌所引發的細胞凋亡與 p53 基因型相關從本文實驗結果得知，此藥物誘導 H1299/p53 細胞趨向凋亡， H1299/p53R267P 細胞次之，H1299 細胞則無此現象 (Fig 3 及 4)，所以對 DNA binding domain p53R267P 突變的患者，此藥物低濃度下可能不具有良好的治療潛力。過去報導 p53R267P 突變位點後會影響到細胞的生長及修補[13]，但以此藥物處理 H1299/p53R267P 細胞後，仍然能誘導細胞凋亡，但程度不若 H1299/p53 細胞明顯，推論 p53R267P 這個位點突變，仍具有部分 p53 功能。而大約 50％的肺癌病患中，其 p53 DNA binding domain 具有突變 [12]. ，因此在未來將以藥物施用於 p53 突變病人時，應可與其他藥物共同. 使用產生加成效應，才會發揮充分 compound A 藥效。. 25.

(26) 捌、參考文獻 [1] W.A. Cooper, D.C. Lam, S.A. O'Toole, J.D. Minna, Molecular biology of lung cancer. Journal of Thoracic Disease 5 (2013) S479-S490.. [2] C. Tan, H.Y. Xu, C.Y. Zhang, H. Zhang, C.M. Chen, W.M. Zhang, X.Y. Sun, Y.T. Jin, Effect of CYP1A1 MSPI polymorphism on the relationship between TP53 mutation and CDKN2A hypermethylation in non-small cell lung cancer. Archives of Medical Research 42 (2011) 669-676.. [3] P. Hainaut, M. Hollstein, p53 and human cancer: the first ten thousand mutations. Advances in Cancer Research 77 (2000) 81-137.. [4] A. Baldi, A. De Luca, V. Esposito, M. Campioni, E.P. Spugnini, G. Citro, Tumor suppressors and cell-cycle proteins in lung cancer. Pathology Research International 2011 (2011) 605042.. [5] H.Y. Chen, H.F. Chen, C.L. Kao, P.Y. Yang, S.C. Hsu, Interaction of electrons with cisplatin and the subsequent effect on DNA damage: a density functional theory study. Physical Chemistry Chemical Physics (2014).. [6] S. Igawa, M. Kasajima, M. Ishihara, M. Kimura, Y. Hiyoshi, M. Asakuma, S. Otani, K. Katono, J. Sasaki, N. Masuda, Comparison of the efficacy of gefitinib in patients with non-small cell lung cancer according to the type of epidermal growth factor receptor mutation. Oncology 87 (2014) 215-223.. 26.

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(32) 玖、圖. A549. H1299/p53R267P H1299/p53. H1299. Fig 1.測試 compound A 對非小細胞肺癌細胞生長抑制效果以 DMSO 及不同濃度的 compound A (5、8 及 10 µM) 作用 A549, H1299, H1299/p53 及 H1299/p53R267P 細胞 48 小時後以 MTT 試劑進行細胞染色，接著使用光電比色計測量其 OD 值。統計為三次獨立實驗的平均(平均值 ± 標準誤差)，取 DMSO 的 OD 值為 100% 作相對值，以 Paired t-test 計算 P 值。*P<0.05, **P<0.01. 32.

(33) (A) A549. (B) H1299. (C) H1299/p53. (D) H1299/p53R267P. Fig 2.compound A 處理非小細胞肺癌後，使 A549 及 H1299/p53 的 Sub-G1 細胞數目增加橫軸為細胞週期，縱軸為細胞數目百分比。以 DMSO 及不同濃度的 compound A (5、8 及 10 µM) 處理 A549, H1299, H1299/p53 及 1299/p53R267P 細胞 48 小時後，以流式細胞儀測試各細胞週期。統計為三次獨立實驗的平均(平均值 ± 標準誤差)，以 Paired t-test 計算 P 值。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.005. 33.

(34) (A). (B). Fig 3. 透過 Annexin V-PI 染色 compound A 誘導 H1299/p53 趨向細胞凋亡 (A) 橫軸為 Annexin V-PI 紅色螢光強度，縱軸為 PI 藍色螢光強度，第一象限為晚期細胞凋亡 (右上) ，第二象限為細胞壞死 (左上) ，第三象限為完整細胞 (左下) ，第四象限為早期細胞凋亡 (右下) 。非小細胞肺癌經 DMSO 及 compound A (5、8 及 10 µM) 作用 48 小時後，以流式細胞儀測試各細胞週期。(B) 實驗為一次獨立實驗結果。 34.

(35) (A) 以不同濃度的 compound A 處理 48 小時. (B)以 8 µM 的 compound A 處理不同時間點. Fig 4. 西方墨點法證明 compound A 誘導非小細胞肺癌趨向 p53 依賴的細胞凋亡 (A) 以 DMSO 及不同濃度的 Compound A (5、8 及 10 µM) 處理 A549, H1299, H1299/p53 及 H1299/p53R267P 細胞 48 小時 (B) 以 compound A 8 µM 處理 H1299, H1299/p53 及 H1299/p53R267P 細胞處理不同時間點 (0、12、24 及 48 小時)後萃取細胞蛋白質並取 20 µg 全蛋白進行西方轉漬 35.

(36) 法，以 GAPDH 作為 loading control。轉漬膜放置於一級抗體中，在 4℃下反應 24 至 48 小時後，加入二級抗體於室溫下反應一小時後，以 ECL 顯色。以 Multi Gauge V 2.1 軟體進行蛋白質定量，每組以 DMSO 蛋白量/ 其 GAPDH 的蛋白量當 1 作基準，最後以相對值表示其數值。. 36.

(37) (A) H1299/p53. µM (B) H1299/p53R267P. µM Fig 5. compound A 處理非小細胞肺癌 12 小時後的膜電位變化圖粒線體膜電位> 100 mv 時，JC-1 呈現紅色；粒線體膜電位< 100 mv 時， JC-1 呈現綠色 (A) H1299/p53 (B) H1299/p53R267P 以 FlowJo 7.6 做實驗結果 37.

(38) 圖的橫軸綠色螢光強度，縱軸為紅色螢光強度，當膜電位下降後，綠色螢光會增強，紅色螢光會減弱，所以細胞團會向右下移動。以 5 µM 的 compound A 處理 H1299/p53 細胞 12 小時後，以流式細胞儀觀察其螢光量變化，以 DMSO 組的膜電位作基準，當 100% 作統計圖，橫軸為藥物濃度，縱軸為細胞染 JC-1 後螢光下降相對比例。實驗為一次獨立實驗結果。. 38.

(39) (A) H1299. (B) H1299/p53. 39.

(40) (C) H1299/p53R267P. Fig 6. compound A 以 5 µM 處理轉殖不同 p53 基因型的非小細胞肺癌 24 小時後的免疫螢光染色圖藍色螢光是 Hoechst 33342，綠色螢光是 Mitotracker，紅色螢光是 cytochrome c。(A) 共軛焦顯微鏡，Scale = 25 μm (B) (C) 活細胞顯微鏡， Scale = 34 μm。以顯微鏡觀察 5 µM 的 compound A 處理 H1299,H1299/p53 及 H1299/ H1299/p53R267P 細胞 24 小時後的粒線體及 cytochrome c 有無聚集的橘黃色亮點，白色箭頭為橘黃聚集點。. 40.

(41) 鑑定具有清除肺癌幹細胞的藥物 The Identification of Drugs with Potential to Eliminate Lung Cancer Stem-like Cells. 41.

(42) 目錄壹、中文摘要………………………………….............43 貳、英文摘要..…….…………………………………..44 參、文獻回顧…...…………………………………..…45 肆、研究目標…………………………………............ 51 伍、材料與方法…………………………………….....51 陸、結果........…………………….……………….…...54 柒、討論……………………………………….………56 捌、參考文獻….……………………………………....60 玖、表………………………………….……………….69 壹拾、圖……………………………………………….….70. 42.

(43) 壹、中文摘要中草藥療法在近幾年被重視，因為以中草藥搭配放射療法能減低癌症病患副作用，提升體質。本實驗以可能具有較高轉移能力及抗藥性的肺癌類幹細胞為模式，研究中藥苦參 (Sophora flavescens) 、鴨膽子 (Brucea javanica)、夏枯草 (Prunella vulgaris) 及西藥 teroxirone 如何抑制肺癌類幹細胞生長。本實驗觀察幹細胞表面標誌 Nanog，確認肺癌類幹細胞平臺的建立，接續使用螢光顯微鏡觀察幹細胞在這些藥物處理下，H460, H1299/p53 及 A549 肺癌類幹細胞會隨藥物濃度及時間增加，其數目及形狀明顯的變少及變小，表示具有抑制肺癌類幹細胞生長的潛力，最後再以 western blot 實驗確認 teroxirone 會誘導 H460 肺癌類幹細胞走向 p53 依賴的細胞凋亡路徑。於先前研究中已知夏枯草可降低肝癌細胞的轉移力，苦參及鴨膽子可抑制 A549 腫瘤生長，此外，低劑量的 teroxirone 可抑制肺癌細胞生長及誘導細胞凋亡，所以日後將持續以此類模式探討這些藥物是否能抑制肺癌類幹細胞生長以及降低轉移能力。. 關鍵字：癌症類幹細胞、球狀細胞、teroxirone、夏枯草、苦參、鴨膽子、細胞凋亡、抗藥性、自我更新. 43.

(44) 貳、英文摘要 In recent years, the Chinese herb medicine therapy is taken seriously because this therapy combine with Radiotherapy can reduce side effect and improve constitution in cancer patients. The experiment based on the lung cancer stem-like cells model, which may be higher metastasis and resistance. To evaluate Chinese herb medicine Sophora flavescens , Brucea javanica , Prunella vulgaris and triep teroxirone can potentially eradicate lung cancer stem-like cells, we used human lung cancer stem-like cells as established from the parental cells. First, we used fluorescence microscopy to confirm that H460, A549 and H12PP/p53 stem-like cells changed in size and in numbers after the drugs treated. Finally, we used western blot experiment to confirm that teroxirone reduced the H460 stem-like cells numbers resulted from apoptotic cell death, and the apoptosis pathway is associated with p53and apoptosis proteins. Previously, we showed that the Chinese herb medicine Prunella vulgaris inhibited the metastasis capacity in liver cancer cells. Besides, Sophora flavescens and Brucea javanica inhibited A549 tumors growth.We also showed that teroxirone inhibited NSCLC cell growth that was caused by apoptotic cell death. In this work, we continued to use stem-like models to evaluate whether these drugs inhibit cells growth and metastatic property of the stem-like cells.. Key words：cancer stem-like cells, sphere, teroxirone, Prunella vulgaris, Sophora flavescens, Brucea javanica, apoptosis, drug resistence, self-renewal. 44.

(45) 參、文獻回顧一、癌症幹細胞理論幹細胞是未完全分化的細胞，具有高轉移力、抗藥性、增殖及自我更新 (self-renewal) 的能力，所以抗癌症藥物對此類細胞治療效果較差[1]。人體中幹細胞的無限生長和分化能力受到了基因控制；但基因失調時，幹細胞就會產生類似癌症的症狀，例如類似癌症細胞具有長生存期、繁殖、入侵鄰近組織和轉移到身體其他部位的能力 [2]。例如 : 人體中的幹細胞數目雖然少，但因其壽命長，細胞受到的 DNA 傷害比率會增大，因基突變的機率也隨之升高，使幹細胞的自我更新不再受到控制，而轉變成癌幹細胞[3]。. 自我更新是一種不對稱的細胞分裂，一顆分裂成與自身相同功能的幹細胞，另一顆則分化成具有特定功能的體細胞[4]，肺癌幹细胞依靠 Wnt 及 Notch 等信號通路進行自我更新，若這路徑失調，幹細胞會分化，進而促進腫瘤细胞的生長及擴散[5]。在前人的報導中，β-catenin 基因是 WNT signaling pathway 中已知重要的致癌基因[6]，在許多癌症中會有高表達的情況，當細胞內 β-catenin 失調增加後，會進入細胞核中，啟動細胞的自我更新及細胞生長…等功能。在肺癌細胞類幹細胞中，細胞會大量自分泌 stromal 45.

(46) cell-derived factor 1 (SDF-1a)，使細胞膜上的化學激素受體 chemokine (C-X-C motif) receptor 4 (CXCR4) 活化，促進 PI3K/mTOR 路徑，促使細胞生長及自我更新，在維持幹細胞特性中扮演重要角色[7]。. 抗藥性於化學治療時，通常是給予最大忍受劑量 (maximum tolerated dose, MTD) 治療癌細胞。當癌細胞對 MTD 無反應時，即代表抗藥性的產生。其原因包括（1）不當的藥物輸送（2）藥物代謝因素，如 CYP450 活性改變（3）藥物動力學因素，例如:藥物的代謝與排除[8] [9]，當具有高抗藥性的癌細胞，會過度表現穿膜轉運蛋白，藥物會經由此蛋白而從細胞內被排出[10]。例如: ATP binding cassette (ABC) 轉運蛋白的序列都帶有 ABC-nucleotide binding domain (NBD)，會與穿膜蛋白 (transmembranedomain,TMD) 組成細胞膜運輸孔道。目前已知有 48 種以上的 ABC 轉運蛋白[11]，例如:肺癌類幹細胞中會過量表現 P-glycoprotein (ABCB1)[12]。除此之外，有許多功能類似 ABC 轉運蛋白，如 RALBP1 (RLIP76) 是由 Ral binding protein, Rho/Ras-GAP、Ral effector protein 組成[13]，它們都會將藥物運輸至細胞外。另外許多的化療藥物屬於金屬螯合類如 cisplatin[14]，會被含有銅離子的轉運蛋白排出細胞，例如 CTR1[15]。經研究報導，另一種在幹細胞會高表達的轉運蛋白為 breast cancer resistance protein (ABCG2)，除了會使幹細胞排出多. 46.

(47) 種藥物外，也會排出 DNA 標記分子 Hoechst. [16]. 。. 入侵及轉移過去研究中，腫瘤內部因異常增生而呈現低氧狀態，會誘導 hypoxia-infucoble actor (HIF) 增加，使 VEGF 濃度升高[17]。Anexelekto (Axl) 在大腸癌、胃癌、皮膚癌、骨癌、乳癌及肺癌等的腫瘤組織中會過度表現，它會讓血管生成素濃度升高[18]。上述兩種機制都會促使血管新生，導致腫瘤的入侵及轉移，使細胞間質的金屬蛋白酶 (MMP-9) 基因與蛋白表現增強，進而分解細胞間質 (matrix) ，造成癌細胞轉移能力增強[19]，同時也活化激酶 (MAPK 及 Akt) 的訊息傳遞路徑。而在肺癌幹細胞的 MMP-9 表現量高於肺癌細胞[20]，所以發展藥物降低肺癌幹細胞的入侵及轉移力是重要實驗目標。. 表面標記分子 (一) 乙醛脫氫酶 (ALDH1) 和癌症幹細胞的分化、自我更新以及擴張有高度相關性[21] [22]，並且在肺癌幹細胞中具有高表現量，因此可做為確認細胞是否為肺癌幹細胞的標誌。 (二) 前人文獻中發現肺癌幹細胞的 Akt/PKB 路徑及 Bcl-2 表現量會增加，同時觀察到此現象與 CD133 過度表達相關，此外，CD133 也會受到培 47.

(48) 養環境中的氧氣濃度調節，例如：癌細胞在低氧環境下 CD133 表達量也會增加，因此 CD133 雖然也可做為肺癌幹細胞的標誌，但其機制仍不清楚[23]。在另一篇文獻中指出 casticin 可通過調節 Akt 磷酸化，抑制 A549 肺癌類幹細胞的轉移及入侵能力[35]，同時幹細胞表面分子標誌 CD133 的表現量也隨之下降，所以 CD133 +是觀察藥物對幹細胞有何效用的重要指標。. (三) Nanog 是幹細胞進行自我更新的指標。當幹細胞失去 Nanog 功能後，表示也會失去分化的能力[24]。有報導指出抑制卵巢癌幹細胞的 miR-214，會使 Nanog 的表現量下降，進而抑制幹細胞生長，因此 nanog 可當作幹細胞標誌之一[25]。. 二、Teroxirone (α-1,3,5-triglycidyl-s-triazinetrione ) 相關文獻 Teroxirone (α-TGT or NSC 296934) 是 Budnowki 於 1968 年使用 α-和 β-stereoisomers 所合成的三環氧化物[26]。α-和 β-teroxirone 具有良好的抗癌功能，但 α-stereoisomers 在水中有較好的溶解度，且更能增加存活率及延長壽命[27] [28]。根據前人研究，在哺乳動物實驗中，已發現此藥對許多癌症腫瘤以及對具有 cyclophosphamide 藥劑抗性的 P388 白血病有治療效果[29]。在臨床實驗當中，2,700 mg/m2 的高劑量使用下會導致細胞毒性並有強烈副作用，例如：白血球及血小板減少。所以在癌症五週療程中的 48.

(49) 建議用藥量為每天 16-450 mg/m2 ，其副作用會較低[30] [31]。並且，teroxirone 在體內的代謝速率較快 (半衰期 5 分鐘以內) ，因此須藉由持續動脈注射進行醫療[32]。先前報導中 teroxirone 會造成 NSCLC 細胞於細胞週期停滯[33]，此藥物 10 µM 處理 24 小時後，可以抑制功能完整的 p53 細胞生長及誘導 p53 依賴的細胞凋亡路徑. [34]. 。但是 teroxirone 與肺癌類幹細胞的研究仍付之. 闕如。. 三、夏枯草相關文獻有草夏至後即枯，故命名夏枯草 (Prunella vulgaris) ，別名麥穗夏枯草及鐵色草[36]，可全草入藥。據前人研究，具有醫治牙齦出血、殺菌、促進傷口癒合及降血壓等作用[49]，前人文獻中，曾有使用三草肺癌湯 (白花蛇舌草、夏枯草、魚腥草、半枝蓮等) 治療中晚期原發性肺癌的臨床案例[48]。前人報導中，夏枯草透過下調 Bcl-2，進而抑制 Bcl-2 和 Bax 結合，使促細胞凋亡家族的 Bax 和 Bad 表達量增加，誘導 NSCLC 細胞走向凋亡[37]。也有的文獻中指出，夏枯草藉由抑制金屬蛋白酶 MMP-2 及 MMP-9 的活性，可降低肝癌細胞的轉移及入侵能力，並且藥物抑制癌細胞轉移的能力可能和其 p53 基因型相關[38]。. 49.

(50) 過去的文獻指出廣藿香及冬蟲夏草等十四種混合中藥具有治療癌症幹細胞的潛力，可降低 SMO, ABCG2 及 CD133+等幹細胞標誌表現量，並抑制細胞生長[39]，由上述結果可知，夏枯草在治療癌症幹細胞上有發展的潛力。四、苦參相關文獻苦參 (Sophora flavescens) 其根部極具藥用價值，含多種生物鹼，例如具抗癌藥用的苦參鹼 (matrine) 及槐果鹼 (Sophocarpine) …等[40]。前人文獻中指出，非小細胞肺癌以苦參鹼處理後，會透過抑制 PI3K/mTOR signaling pathway 及下調 inhibitor of apoptosis protein (IAP) family 蛋白，誘導細胞凋亡產生[41]。在另一篇文獻中又發現，苦參鹼會誘導非小細胞肺癌產生 ROS，活化 p38 蛋白使肺癌細胞趨向 caspase 依賴的細胞凋亡路徑[42]。苦參鹼對許多癌細胞都具有療效，例如肺癌及前列腺癌…等[43]，所以可觀測苦參是否具有清除癌症幹細胞的潛力。五、鴨膽子相關文獻別名苦參 (Brucea javanica) ，常用以治療阿米巴病原蟲引起的痢疾 [44]. ，過去民間也廣泛運用此藥物在治療肺癌方面，臨床的證據顯示，此. 藥物搭配化學療法，對於病人癒後有良好效果，能增進病人免疫能力[45]。有研究指出，在動物實驗中，鴨膽子的果實萃取物可抑制胰臟癌細胞生 50.

(51) 長及腫瘤形成[46]。. 肆、研究目標一、建立肺癌類幹細胞的篩藥平臺前人已發表的文獻發現，在各種癌細胞中，許多癌症類幹細胞會具有較高抗藥性及轉移能力，所以癌症類幹細胞普遍被認為是癌細胞主要研究的項目之一，因此本論文的目標之一是想建立肺癌類幹細胞平臺，以測試夏枯草、苦參及鴨膽子三種中草藥及西藥 teroxirone 是否能降低肺癌類幹細胞的數量及大小。. 二、探討藥物可降低肺癌類幹細胞生長率，及其相關機制過去研究顯示，夏枯草及可降低肝癌的轉移力[]，teroxirone 可誘導表現野生型 p53 的肺癌細胞凋亡並抑制細胞生長[]，因此本論文研究這些藥物在肺癌類幹細胞中是否也有類似機制，實驗以 H1299、轉殖 p53 及 p53R267P 的 H1299 肺癌類幹細胞證實是否 teroxirone 對 p53 功能完整的肺癌類幹細胞最敏感。. 伍、材料與方法一、細胞株本論文 H460、A549、H1299、H1299/p53 以及 H1299/p53R267P 這五 51.

(52) 株 NSCLC 細胞進行實驗。H460 與 A549 均為 p53 野生型的細胞株，H1299 是缺乏 p53 基因的突變株。其中 H460 和 H1299 是屬於未分化巨細胞癌細胞株，而 A549 則是肺腺癌細胞株。H1299/p53 以及 H1299/p53R267P 則是使用 H1299，分別轉殖入野生型 p53 及 p53 R267P DNA-binding domain 位點突變的 p53R267P 以的細胞株，最後挑出穩定表現基因的肺癌細胞株進行繼代培養。細胞繼代時，先移除舊培養液，以 1 mL PBS 將細胞洗過，然後移除 PBS，加入 trypsin-EDTA 後，於 37℃下作用 5 分鐘，以 DMEM 中止 trypsin-EDTA 的作用，緩慢將細胞從培養盤上打下，取適量的細胞放置於新的 6-cm 培養盤。細胞計數時，先將細胞收集到 15 mL 離心管中，以 800 rpm、5 分鐘離心，接著移除上清液，再加入 1 mL DMEM 將細胞混勻，取出 10 µL 以 trypan blue 稀釋和染色，最後以顯微鏡觀察並計數。二、中草藥萃取實驗中所使用的三種中藥來自順天堂，採取水藥製作，將藥材以沸水處理後離心去除沉澱物質，取其上清液體，以 1 mg/mL 為儲存方式，因此水藥中具有高比例的水溶性分子，易被人體吸收。三、肺癌類幹細胞培養實驗使用 H460、A549、H1299、H1299/p53 以及 H1299/p53R267P 52.

(53) NSCLC 細胞株培養肺癌類幹細胞。數 1,000 顆 NSCLC 細胞置入 24-well plate 中 (ultra low attachment dish) ，加入 500 L 的 DMEM/F12 (20 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF, 1% B27, 4 g/mL insulin, 1% penicillin/streptomycin) ，接著放入 5% CO2、37℃的培養箱中培養 7-10 天後開始實驗[47]。 (Table 1) 四、免疫螢光染色鑑定幹細胞標誌計數 1,000 顆 NSCLC 細胞置入 24-well plate 中，加入 500 L 的 DMEM/F12，接著放入 5% CO2、37℃的培養箱中培養 5-7 天後加藥，放入含待測藥物的培養液 (DMEM/F12) ，此時苦參及鴨膽子濃度分別為 1、2 及 5 mg/mL，夏枯草的濃度為 2、5 及 10 mg/mL，而 teroxirone 的濃度為 10 及 20 µM，在加藥 24 小時後，以 Hoechst 33342 (40 nM) 染色 15 分鐘後以 4% paraformaldehyde 固定細胞，接著加入 Nanog antibody (1:500) 處理 24 小時之後移除上清液，最後加入 goat-anti-rabbit antibody-FITC (1:500) 處理 24 小時之後，以 Live image 照相並計算球體肺癌細胞數目。五、螢光顯微鏡觀察細胞及形態變化數 1,000 顆 NSCLC 細胞置入 24-well plate 中，加入 500 L 的 DMEM/F12，接著放入 5% CO2、37℃的培養箱中培養 5-7 天後加藥，放入含待測藥物的培養液 (DMEM/F12) ，使用的藥物濃度分別為 10 及 30 µM，在加藥 72 小時後，以 40×、100×及 200×不同倍率的螢光顯微鏡觀 53.

(54) 測球體肺癌細胞加藥 24、48 及 72 小時後，剩餘細胞的大小及形態變化並照相計算球體肺癌細胞數目。陸、結果一、確認癌症類幹細胞的建立為了確認癌症類幹細胞的建立，實驗透過 DMEM/F12 培養液，外加 EGF 及 FGF 生長因子將 A549, H460, H1299, H1299/p53 及 H1299/p53R267P 五種非小細胞肺癌細胞株培養在低貼附的培養皿，經過不. 同的培養天數後培養成肺癌類幹細胞 (Table 1) ，接著以幹細胞表面標誌分子 Nanog 免疫螢光染色後，以活細胞顯微鏡確認加藥前後的球狀細胞為肺癌類幹細胞。二、 Teroxirone 誘導野生型 p53 肺癌類幹細胞趨向細胞凋亡根據前人研究，teroxirone 是一種能清除肺癌細胞的潛力藥物，為了觀察此藥物在肺癌類幹細胞的效果，本實驗發現以 teroxirone 10 µM 處理 A549 肺癌類幹細胞 24 小時後細胞數目變少約 50% ， H460 肺癌類幹細胞以 teroxirone 30 µM 處理 72 小時後細胞數目變少約 70%，此外這兩株細胞也會變小，但此藥物對 H1299 肺癌類幹細胞的大小及數目無明顯影響 (Fig 1) ，而於轉殖的細胞中， H1299/p53 肺癌類幹細胞以 teroxirone 10 µM 處理 72 小時後細胞數目變少約 55% ，但此藥物對 H1299/p53R267P 肺癌類幹細胞的大小及 54.

(55) 數目無明顯影響 (Fig 2) ，利用 nanog 染色肺癌類幹細胞，並使用藥物處理 24 小時後，它們的細胞大小變化與上圖有類似結果，但 nanog 螢光量於加藥前後無明顯變化 (Fig 3) 。由 Nanog 的 western blot 實驗中證明，H460 肺癌類幹細胞相較一般的 H460 細胞具有更高的 Nanog 蛋白量，但以藥物 10 及 20 µM 處理 24 小時後，H460 細胞的 Nanog 無下降趨勢 (Fig 4) 。三、夏枯草降低野生型 p53 肺癌類幹細胞數目及大小本研究結果顯示，以夏枯草 5 mg /mL 處理 A549 肺癌類幹細胞 24 小時後，細胞逐漸變小及細胞數目變少約 30%，以此藥物 5 mg /mL 處理 H460 肺癌類幹細胞 72 小時後，細胞大小無明顯變化及數目變少約 56% ，但藥物對 H1299 肺癌類幹細胞的大小及數目無明顯影響 (Fig 5)，而於轉殖的細胞中，以藥物 5 mg /mL 處理 H1299/p53 肺癌類幹細胞 72 小時後，細胞逐漸變小及細胞數目變少約 40% ，但藥物對 H1299/p53R267P 肺癌類幹細胞的大小及數目無明顯影響 (Fig 6) 。利用 nanog 染色肺癌類幹細胞，並使用藥物處理 24 小時後，它們的細胞大小變化與上圖有類似結果，但 nanog 螢光量於加藥前後無明顯變化 (Fig 7) 。四、苦參降低肺癌類幹細胞數目及大小由實驗結果觀察到 H460 肺癌類細胞以此藥物 ( 1、2 及 5 mg /mL ) 55.

(56) 處理 24 小時後，細胞逐漸變小，且於藥物濃度 5 mg /mL 時，細胞數目下降約 60%，但 H1299 肺癌類幹細胞於加藥處理後，其細胞大小及數目無明顯變化，在轉殖的細胞中，H1299/p53R267P 肺癌類幹細胞以藥物處理後細胞逐漸變小，但細胞數目在藥物 5 mg /mL 時增加約一倍量。它們的 nanog 螢光量於加藥前後無明顯變化 (Fig 8) 。五、鴨膽子降低 H460 肺癌類幹細胞數目及大小論文結果顯示，H460 肺癌類幹細胞以此藥物 ( 1、2 及 5 mg /mL ) 處理 24 小時後，細胞逐漸變小的情形，且於藥物濃度 5 mg /mL 時，細胞數目下降約 60%，於同濃度下 H1299 肺癌類幹細胞的細胞數目下降約 38% ，在轉殖的細胞中，H1299/p53R267P 肺癌類幹細胞的細胞數目下降約 34% ，而這兩株細胞大小無明顯變化。它們的 nanog 螢光量於加藥前後無明顯變化 (Fig 9) 。. 柒、討論一、確認類肺癌幹細胞的建立據報導指出，肺癌類幹細胞具有高表達 nanog, ALDH 及 CD133 幹細胞表面分子的特徵[23] [24] [25]，本文實驗由免疫螢光染色及 western blot 確認類肺癌幹細胞平臺的建立，甚至經過轉殖的肺癌細胞也可培養成類肺癌幹細胞，如 H1299 及 H1299/p53R267P 肺癌類幹細胞。. 56.

(57) 二、肺癌類幹細胞經藥物處理後，可降低生長率，並可能與 p53 功能相關 (一) 根據前人的報導，低濃度的 teroxirone 會抑制野生型 p53 非小細胞肺癌細胞生長及誘導細胞凋亡[34]，本論文結果，A549 及 H460 的肺癌類幹細胞也會隨著加藥時間的增長而變小及變少並改變形狀，但對 H1299 肺癌類幹細胞無敏感性。於轉殖的細胞中，H1299/p53 肺癌類幹細胞會隨著加藥時間的增長而變小及變少並改變形狀，但藥物對 H1299/p53R267P 肺癌類幹細胞無明顯影響，證實此藥物劑量下對 p53 功能完整的肺癌類幹細胞最敏感，可能會產生 p53 相關的細胞死亡。最後以 H460 肺癌類幹細胞的 western blot 結果推測，其藥物所誘導的細胞凋亡路徑與非小細胞肺癌細胞類似，為 p53 依賴的細胞凋亡路徑，以藥物 10 µM 的低濃度處理 24 小時後，即可觀察到此現象，但以藥物 30 µM 處理 24 小時後，可能因 30 µM 藥效太強導致大多數細胞死亡難以收集到細胞蛋白質，但還需要更多的實驗證據佐證。 (二) 於夏枯草對表現野生型 p53 的 H460、A549 及 H1299/p53 肺癌類幹細胞的數量及大小有較明顯的抑制效果，但對於無 p53 的 H1299 及 p53 功能缺失的 H1299/p53R267P 肺癌類幹細胞無明顯影響，可能是由於夏枯草對野生型 p53 的肺癌類幹細胞較敏感，因此當細胞 p53 DNA binding domain 突變後，會降低此藥物的敏感度。 (三) 根據苦參的實驗結果，推測此藥物可使 H1299/p53R267P 肺癌類幹細胞 57.

(58) 間的結和力降低，形成許多體積較小的肺癌類幹細胞，所以經藥物 5 mg /mL 處理 72 小時後細胞數目增加到一倍量，且細胞逐漸變小。比較 H460, H1299 及 H1299/p53R267P 三種肺癌類幹細胞，苦參對 H460 肺癌類幹細胞最敏感。根據前人文獻，苦參可抑制 A549 及 H460 細胞生長[40]，結合肺癌類幹細胞的實驗結果，推斷苦參對野生型 p53 的肺癌類幹細胞較敏感，之後可利用轉殖野生型 p53 的 H1299 肺癌類幹細胞確認藥物敏感性是否與 p53 基因型相關。 (四) 鴨膽子同樣對 H460 肺癌類幹細胞的大小及數目有明顯的抑制效用，但對 H1299 及 H1299/p53R267P 肺癌類幹細胞的抑制作用較不明顯，推論此藥物的機制可能也和肺癌細胞的 p53 表現有相關性，但還需要更多的實驗證實，如以中草藥處理 H1299/p53 肺癌類幹細胞後觀察其結果。三、肺癌類幹細胞具有抗藥性由 Hoechst 螢光染色實驗中發現，肺癌類幹細胞經藥物處理後， Hoechst 的藍色螢光有不均勻的現象，推斷多數肺癌類幹細胞具有高抗藥性，所以部分細胞無法染進 Hoechst[16]，而這些類幹細胞經藥物處理後，其剩餘的細胞可能多數具有更高的抗藥性，待日後以更多的抗藥蛋白，例如使用 ABCG2 的 western 結果證實[16]。但在 H460 的 western blot 發現 adherent 細胞與癌症類幹細胞於加藥後的 p53 及 cytochrome c 結果相似， 58.

(59) 推論 H460 癌症類幹細胞的抗藥性不會顯著高於 H460 的 adherent 細胞。四、肺癌類幹細胞的自我更新、轉移及入侵能力實驗結果之一顯示，肺癌類幹細胞經這些藥物處理 24 小時後，它們的 nanog 螢光量無明顯改變，可能表示這些藥物無法降低肺癌類幹細胞的自我更新的能力，但還需要更多 western 實驗證明此推測。由 nanog 染色及蛋白的 western 結果推測，H460 肺癌類幹細胞自我更新能力比 H460 細胞高，並可分裂出更多具有高惡性的肺癌類幹細胞 [24]. ，且由 teroxirone 20 µM 處理 24 小時後，nanog 無明顯下降，表示. teroxirone 於此條件下無法降低 H460 肺癌類幹細胞的自我更新的能力，此推斷仍需更多實驗證明。在前人文獻中指出 CD133 的表現量與 A549 肺癌類幹細胞的轉移及入侵能力有正相關性[35]，所以日後可使用幹細胞表面分子標誌 CD133 的量化結果證實何種藥物可抑制肺癌類幹細胞的轉移及入侵能力[35]。根據本論文及前人相關研究中發現這些中草藥及西藥對肺癌細胞有生長抑制效果[38]，甚至會抑制具野生型 p53 的肺癌類幹細胞生長或降低其數目[34] [42]，日後將持續以肺癌類幹細胞為平臺，研究藥物降低癌症類幹細胞數目的機制及發掘具有治療肺癌潛力的新型小分子化合藥物或中草藥物。. 59.

(60) 捌、參考文獻 [1] A.M. Crous, H. Abrahamse, Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy? Stem Cell Research & Therapy 4 (2013) 129.. [2] E. Passegue, S. Rafii, M. Herlyn, Cancer stem cells are everywhere. Nature Medicine 15 (2009) 23.. [3] R. Pardal, M.F. Clarke, S.J. Morrison, Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nature Reviews. Cancer 3 (2003) 895-902.. [4] S. He, D. Nakada, S.J. Morrison, Mechanisms of stem cell self-renewal. Annual Review of Cell and Developmental Biology 25 (2009) 377-406.. [5] K.A. Hassan, L. Wang, H. Korkaya, G. Chen, I. Maillard, D.G. Beer, G.P. Kalemkerian, M.S. Wicha, Notch pathway activity identifies cells with cancer stem cell-like properties and correlates with worse survival in lung adenocarcinoma. Clinical Cancer Research 19 (2013) 1972-1980.. [6] Y. Xi, Y. Chen, Wnt signaling pathway: Implications for therapy in lung cancer and bone metastasis. Cancer Letters (2014).. [7] M.J. Jung, J.K. Rho, Y.M. Kim, J.E. Jung, Y.B. Jin, Y.G. Ko, J.S. Lee, S.J. Lee, J.C. Lee, M.J. Park, Upregulation of CXCR4 is functionally crucial for 60.

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一、探討新穎Indolylquinoline衍生物誘導非小細胞肺癌細胞凋亡機制 二、鑑定具有清除肺癌幹細胞的藥物

一、探討新穎Indolylquinoline衍生物誘導非小細胞肺癌細胞凋亡機制二、鑑定具有清除肺癌幹細胞的藥物