縮寫對照表 (Abbreviation) ANS anthocyanidin synthase
cDNA complementary DNA CHI chalcone isomerase CHS chalcone synthase
DFR dihydroflavonol 4-reductase dNTP deoxynucleotide triphosphate EDTA ethylenediamine tetraacetic acid EST expressed sequence Tag
EtBr ethidium bromide F3’H flavonoid 3’-hydroxylase F3’,5’H flavonoid 3’,5’-hydroxylase FHT flavanone 3beta-hydroxylase LB Luria –Betani
NCBI National Center for Biotechnology Information NUP nested universal primer
PCR polymerase chain reaction RACE rapid amplification of cDNA end SDS sodium dodecyl sulfate
TBE Tris borate-EDTA buffer
UFGT UDP-glucose: flavonoid 3-O- glucosyltransferase UPM universal primer mix
第一章 前言 蝴蝶蘭 ( Phalaenopsis ) 因花姿如蝴蝶般飛舞而得此名，國人對 蝴蝶蘭尤其偏愛，其中以台灣原生種白花蝴蝶蘭 P. amabilis var. formosa 因色彩大方及型態優美而聞名世界。世界分布在南洋諸島菲 律賓、婆羅洲、印尼、馬來西亞各地約有五、六十種原生種。高溫多 濕河川海岸邊的森林樹木多是蝴蝶蘭附著生長的地方，色彩多種，從 純白、粉紅、黃花著斑、線斑都有。育種家們利用各種搜取到的珍貴 原生種進行人工交配，改良出各種花色、花型的蝴蝶蘭，有大白花、 紫紅花、黃花紅斑、紅點、紅線、純黃、白花紅心等色彩，在各種蘭 展都中都可以看到。蝴蝶蘭是「蘭花之后」，當之無愧。 當今我國蝴蝶蘭水準冠世界，以品種與產量，可稱「蝴蝶蘭王 國」。由於優質品種多不甚舉，在大量栽培技術與花期調控技巧下， 國內全年均有開花株供應。 由於蝴蝶蘭代表「幸福」，其花朵色彩亮麗，花姿優雅。經過組 裝後，華麗至極，已成為喜慶送禮、居家或店面裝飾的主流花品。蝴 蝶蘭是不難栽培的品種，大都盆栽，但如果多用心栽植於蛇木板或厚 皮的樹幹上，開花時，更是風姿絕美，百賞不厭。 而花色常常是決定花卉作物價值的重要指標之一，目前市面上商品化
的花卉，大都經自然界中原生花卉改良，培育而來。若某類花卉的原 生種源之花色基因種類少，即會限制該類花卉培育其他各式花色的潛 力，因而影響該花卉的普及化。由於生物技術之快速發展，目前已有 許多色素合成基因已被分離、選殖，而且被應用於花色基因之轉殖 上，成功地創造出新的花色品種，如矮牽牛的紫紅色品種之育成，即 轉入一外源花色基因而來 ( Shimada et al., 1999 )。期待蝴蝶蘭也能在 花色形成有相當的研究，開拓國內外蝴蝶蘭市場的大門。 在 成 功 大 學 生 命 科 學 系 陳 虹 樺 教 授 實 驗 室 的 姬 蝴 蝶 蘭 ( P. equestris ) 花苞之表現序列標誌資料庫中，蘇靖棻 ( 蘇，2002 ) 曾鑑 定其花色形成相關基因 （ 附圖一 ），包括：具有全長序列的一個 chalcone synthase ( CHS )，一個 chalcone isomerase ( CHI )，與一個 anthocyanidin synthase ( ANS )，及一個 UDP -glucose: flavonoid 3-O- glucosyltransferase ( UFGT ) 的 PeUFGT2，但未見這些基因在四種花 苞呈現差異性。本論文進一步選殖二個未具有全長序列的UFGT 分別 是 PeUFGT1 與 PeUFGT3 酵素基因，並連同 CHS、CHI、ANS 及
第 二 章 文獻探討
2.1 蝴蝶蘭簡介
蝴蝶蘭分布於南北緯度 23 度之間，全世界有 45 原生種，其原 產地由本省恆春半島，經菲律賓，新幾內亞，澳洲北部，印尼，馬來 西亞，中南半島至喜馬拉亞山麓。台灣原生蝴蝶蘭有兩種：一為大朵 白花蝴蝶蘭 ( P. amabilis var. formosana ) 分布於恆春半島，台東和蘭 嶼森林區，另一為小朵桃紅色姬蝴蝶蘭 ( P. equestris ) 分布於小蘭 嶼。原生種由於未加保護，在原生地已瀕絕跡，幸國內栽培蝴蝶蘭園 遍佈全省，使台灣集世界優秀蝴蝶蘭品種及原生種於一身。 2.2 植物花色的起源 植物花色起源於傳粉者億萬年的選擇，是長期進化的結果。顯花 類植物於古生代的泥盆紀在地球上出現，而有顯花植物出現是在白堊 紀初期，授粉的昆蟲約出現在中生代侏羅紀 ( 張，1989 )。動物主要 是以昆蟲或鳥類，最初因為取食而偶然遇到不顯眼的花，順帶傳播了 花粉；植物因此逐漸改變單純依靠風和水來授粉的模式，開始以花瓣 的擴大、呈現非綠色、發出香味且分泌蜜汁，特別是形成鮮豔的花色， 招引昆蟲或鳥類來取食 ( Vainstein et al., 2001 )，成為蟲媒花或鳥媒 花。不同動物作為傳粉者具備不同顏色偏好，如：蜜蜂最喜黃色和藍
色，故蜂媒花多具這兩種花色；蜂鳥喜歡紅色；蝶類喜歡紅色或紫色 等亮麗花色；傳粉者的顏色偏好直接關係到植物能否呈特定花色且繼 續生存 ( Glegg and Durbin, 2000 )。自然界中，特定植物的花色突變 種常會被傳統的傳粉者忽視而難以維持其存在，現存的花色是傳粉者 長期選擇的結果。 2.3 植物花色素的進化 植 物 花 色 的 進 化 是 以 其 色 素 的 進 化 為 討 論 基 礎 。 矢 車 菊 素 ( cyaniding ) 是最原始的花色素，在裸子植物的花之中最為常見。被 子植物的風媒花也具花青素 ( anthocyanin )，但風媒花無選擇上的壓 力而表現出的花色單調。天竺葵色素 ( pelargonidin ) 和飛燕草素 ( delphinidin ) 是由花青素演化而來，前者主要存在於熱帶較進化的 花中，是花青素喪失突變和減少羥基 ( -OH ) 的結果，後者主要存在 於溫帶較進化的植物內，如報春花科 ( Primulaceae ) 和唇形科 ( Labiatae ) 等，是花青素獲得突變和增加羥基的結果；花色素的甲基 化也常出現在較進化的植物中；在較進化的植物科中黃酮 ( flavone ) 比黃酮醇 ( flavonoid ) 分佈的更廣泛 ( 李，2001 )。某些自花受粉植 物儘管不再需要以花色吸引動物為其傳粉，但其花仍保留遠系繁殖祖 先的花色素，也許這為其後代返回遠系繁殖留了後路 ( 李，2001 )。
色 素 的 進 化 以 其 基 因 的 進 化 為 基 礎 ， 如 苯 基 苯 乙 烯 酮 合 成 酶 ( chalcone synthase, CHS ) 最早起源於苔蘚，與脂肪酸合酶 ( fatty acid synthase ) 基因可能具同一個祖先。 2.4 花青素的結構 花青素是屬於類黃酮的一種色素，為花色的主要組成。目前已有 百 種 的 花 青 素 從 植 物 中 被 分 離 出 來 且 定 出 結 構 ( Harborne and Williams, 2000 )。花青素會因所帶有羥基的數目、羥基甲基化的程 度、醣基化的種類、數目及位置與糖基所連接的脂肪酸或芳香族酸的 種類及數目的不同影響其植物花色的表現。一般花青素的取代作用可 分類為四種：一、羥基化作用，羥基取代基發生取代作用的位置通常 是C-3’、 C-4’ 及 C-5’，若取代基的數目越多，則會偏向藍紫色系， 如天竺葵色素 ( pelargonidin )，僅有一個羥基，呈朱紅色，當羥基數 達三個時，則會呈現出紫色或是藍色系，如飛燕草素 ( delphindin )。 二、醣化作用，取代基為葡萄糖 ( glucose )、半乳糖 ( galactose )、鼠 李糖 ( rhamnose )、阿拉伯糖 ( arabinose ) 及木糖 ( xylose ) 等，取 代作用越多顏色越深。三、醯化作用，取代基為香豆酸、3, 4-二羥肉 桂酸 ( caffeic acid )、4-羥-3-甲氧-肉桂酸 ( ferulic acid )、羥基甲苯酸 ( p-hydroxybenzoic acid )、丁二酸 ( succinic acid ) 及醋酸 ( acetic
acid )等。四、甲基化作用，取代基為 -CH3，發生取代作用的位置常 是C-3’、 C-5’，取代基的數目若是越多，則會偏向紅色系，如 petunidin，只有一個甲基，當甲基數增多時，紅色也會漸漸的增加， 如malvadin 會呈現出杜鵑花色 ( Mazza and Minlati, 1993 )。
2.5 花色表現的生理學機制
花瓣液泡中的 pH 值直接與花色相關。儘管花瓣細胞液泡 pH
值多在 2.5~7.5 之間，但紅色花的細胞液泡比藍色花的酸性更強；紅 色 花 衰 老 時 液 泡 的 pH 值 會 增 加 且 花 色 變 藍 ( Stewart et al., 1975 )。月季花( Rosa chinensis ) 花色偏藍或偏紫的品種，花瓣表皮 細胞 pH 值會偏高 ( Mol et al., 1999 )。牽牛花 ( Ipomoea nil ) 的紫 色花瓣帶藍色斑塊，紫色區和藍色區色素成分相同，但藍色區的 pH 值比紫色區的高 0.7 ( Tanaka et al., 2000 )。花色素呈色具 pH 值的依 賴性：pH < 2 顏色會呈紅或黃；pH < 3 時為紅或藍； pH > 6時則呈 多種顏色；pH 3~6時形成的無色甲醇可再轉化為無色順式甲酮 ( cis-chalcone，CE ) 和反式甲酮 ( trans-chalcone，CZ )；在特定的 pH 值溶液中，花色苷的幾種型式達成平衡且表現特定顏色 ( Brouillard and Houbois, 1977； Chen and Hrazdina, 1981；Mazza and Brouillard, 1990；邱 和 範，1998 )。一般情況下，花色苷在低 pH 值下為紅色
且穩定，在弱酸性的液泡 pH 值下更趨藍色且常不穩定 ( Strack and Wray, 1989；Tanaka et al., 1998 ) 。pH 值也影響花色苷的共色作用 而影響花色 ( Brouillard, 1983 )。黃酮和黃酮醇酸性越強黃色越淺， 鹼性越強黃色越深 ( 蘇，1996；李，2001 )。但是，類胡蘿蔔素的顏 色則不隨 pH 值而變化 ( 蘇，1996 )。其次，花發育階段對花色形成 也有一定的影響。花發育分為緩慢生長階段和快速生長階段，前者由 花瓣細胞分裂引起，後者由花瓣細胞體積擴大引起，而且色素大量積 累 ( Weiss and Halevy, 1989；Martin and Gerats, 1993 )。花色苷的合 成常在花即將開放前或花發育的早期達到最高峰 ( Giuliano et al., 1993 )。另外，植物激素也與花色形成息息相關。花藥產生的吉貝素 ( Gas ) 轉運至花瓣而發揮作用 ( Weiss et al., 1995 )，GAs 是促進花 色苷合成的共同信號，直接以類似的動力學性質誘導 CHS
、
chalcone isomerase ( CHI ) 和 dihydroflavonol-4-reductase ( DFR ) 和類黃酮 -3-O-葡糖基轉移酶 ( UDP-glucoseflavonoid-3-O-glucosyltransferase, UF3GT ) 基因等表達 ( Weiss et al., 1995 )，又可間接地誘導某些反式 作用因素的合成，再啟動花色苷合成相關基因的表達 ( 程等人， 2002 )，如 GAs 可專一性地以間接方式誘導和維持矮牽牛花冠 CHS 的轉錄 ( Weiss et al., 1992 )。類黃酮基因的轉錄也受 GAs 的間接調 控 ( 陳，1994 )。但離層酸 ( ABA ) 能拮抗 GAs 的誘導效果 ( Weisset al., 1995 )。乙烯可促進 phytoene synthase ( PSY ) 基因表達
( Bartley and Scolnik, 1994 )，也影響類胡蘿蔔素的種類 ( Perucka, 1997 )。 2.6 影響植物花色表現的環境因素 2.6.1 生態因素 (1) 授粉者： 不同生態環境分佈不同花色的花主要因為環境中特定的 最活躍授粉者，如 Polemoniaceae 科中的蜂鳥媒花花冠長而窄且花色 深紅，蜂媒花花冠短而開放且花色幾乎均為藍色，蝶媒花花冠介於二 者之間、花色紫紅或粉紅 ( Harborne, 1993 )。不同地區的不同授粉者 可使同一種植物表現不同花色；適應能力強的植物遷到新的棲地時可 很快變換花色而與環境相適應 ( 李，2001 )。許多植物的花色可塑性 很大，可隨現有的或潛在的授粉者而關閉、變更或重建特定色素的合 成，甚至花色隨授粉者更替而作出快速反應，如 Ipompsis aggregata 的花色由紅經粉紅再到白，是因為偏好紅色的授粉者蜂鳥南遷後，由 偏好白色的白線天蛾 ( Hyles lineate )再為其授粉 ( 李，2001 )。植物 花色形成及其調控機制是由這個種的花色型和其相競爭種的花色型 之間的相對頻率來維持 ( Kay, 1978 )。 (2) 真菌侵染或機械損傷： 真菌侵染或機械損傷可誘導色素合成相關
基因表達，如 CHS 可被真菌或機械損傷誘導 ( Ryder et al., 1987 )。 法國菜豆 ( Phaseolus vulgaris ) 唯一的 CHI 也是如此 ( Mehdy and Lamb, 1987 )。真菌侵染和創傷誘導合成的類黃酮除了貢獻於花色 外，也具備抗病功能 ( 孟，2000；汪 和 彭，2000 )。 (3) 人為影響： 如合理整形修剪和蔬花等園藝措施可促進多種花著色 ( 朱，1997 )。 2.6.2 物理因素 (1) 光 (a)光強度： 弱光使花色較淡 ( Griesbach, 1992 )，充足的光照促使固有花色 形成 ( 黃， 1990；程等人，2002 )，過強光照破壞色素且損傷花色， 尤其是對於陰生植物 ( 黃，1990 )。光影響花色苷合成是由葉片 ( 程 等人，2002 ) 或萼片 ( Moscovici et al., 1996 ) 接受光信號，再傳遞 到花冠產生效應。光信號受體有光敏素、隱花色素和UV-B 受體 ( Moscovici et al., 1996 )，每種植物至少有兩種受體參與 ( Mohr, 1994 )。光調節花色素合成可通過物理因素間接增強基因表達，也可 直接增強結構基因或調節基因表達。多種反式作用因素與光反應基因 的順式元件作用實現不同的光反應，光可以補充或代替其他調節基因 產物的作用 ( 孟，2000 )。同時，光透過光合作用為花色苷合成提供
物質基礎，並調節花色素合成中相關酶的活性 ( Saure, 1990 )。類黃 酮的合成也只有在光下才順利進行 ( 程，2000；汪 和 彭，2000 )。 適度光照促進類胡蘿蔔素合成 ( 徐 和 張，2000 )，光強也影響葉黃 素迴圈 ( Yamamoto, 1985 )。 (b) 光質： 各種光均可促進花色苷的積累，藍光和紅光最為有效 ( 黃， 1990 ； 程 等 人 ， 2002 ) 紫 外 光 也 會 參 與 ， 如 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 ( phenylalanine ammonialyase, PAL ) 基因 ( 謝等人，2000 )、CHS 和 矮牽牛的 CHI A ( 林，1998 ) 表達可被紫外光誘導，高山花卉和熱 帶花卉也因較多紫外光而花色濃豔。歐芹 ( Petroselium crispum ) 存 在光敏素反應型、藍光反應型和紫外光反應型，不同種和不同組織類 黃酮合成受控於不同類型 ( Pfaff and Wellmann, 1982；Schmelzer et al., 1988 )。 (c) 光週期： 光週期延長使草原龍膽 ( Eustomagrandiflorum ) 花瓣中花色苷 的量逐漸增加，但黃酮醇的量沒有顯著變化 ( Uddin et al., 2001 )。 (2) 溫度： 不同花適應不同溫度。喜溫植物開花時，溫度偏高使花色豔麗； 但花期溫度偏高使大部分植物，尤其是喜低溫植物，花色暗淡；溫度
稍低時，多數植物花色鮮豔且維持較長時間; 溫度過低使花色不鮮豔 且不表現固有花色 ( 黃，1990；程，2000 )。同種植物花色也可因溫 度而異，如櫻草 ( Primula obconica ) 20 ℃左右開粉紅色花，30 ℃左 右開純白花 ( 黃，1990 )。 (3) 水分： 適度水分使植物顯示固有花色且花色維持長久，失水使花色轉 深，但花瓣易軟化 ( 黃，1990 )。 2.6.3 化學因素 (1) 礦物質營養： 礦質離子主要通過與特定花色苷產生螯合效應而改變花色。Al3+ 和Mg2+等能與花色苷 B 環上的O-二羥基螯合 ( 王，2002 )，常使花 色苷更穩定，且花色也更穩定而偏藍 ( 鄭，1994；Tanaka et al., 1998 )，如鴨蹠草 ( Commelina communis ) 花中 Mg2+ 與花色苷螯合 ( 李，2001；Harborne, 1988 ) 。繡球花 ( Hydrangea macrophylla ) 卻 因其翠雀素-3-葡糖苷與 Al3+ 絡合、並以 3-chlorogenic acid 為共色素 而表現從紅色變為藍色的花色 ( Takeda and Itoi, 1985 )。礦物質離子 也通過影響花色素的代謝而改變花色。氮肥過多抑制花色苷形成並導 致著色不良，K+ 本身使花色苷合成的增加並不顯著 ( Saure, 1990 )。 geranylgeranyl- pyrophosphatesynthase ( GGPS ) 的活性依賴Mn2+，
Mn2+ 是決定GGPP ( geranylgeranylpyrophosphate ) 是否用於合成類 胡蘿蔔素的關鍵因素 ( Dogbo et a l., 1988 )。 (2) 醣類 ( saccharide )： 醣是花色苷組成之一，也是調控花色苷合成的信號分子 ( Sharir et al., 2000 )，其中己糖激酶 ( hexokinase ) 為信號感測器 ( 程等人， 2002 )，如在草原龍膽的切花培養中發現：蔗糖 ( sucrose ) 對花瓣中 花色素的比例和花色苷總量有顯著影響 ( Uddin et al., 2001 )。糖可專 一性地提高 GAs 的效果 ( Weiss and Halevy, 1989 )。但蔗糖對矮牽 牛 CHS 的表達和花色苷的合成也具有普通的代謝效應 ( Weiss et al., 1992；Beno et al., 1997 )。 (3) 其他： 如：氧分子可促進花色苷降解，抗壞血酸在低溫時穩定花色苷且 在較高溫時破壞花色苷，均影響花色 ( 任等人，1995 )。除草劑達草 滅( flurazon ) 等可抑制有色類胡蘿蔔素的合成而導致花色變淡 ( Chamovitzet al., 1991 )。 2.7 轉糖酶之研究 UDP-glycosyltransferases （ GTs ；EC 2.4.1）是一個大家族 ( superfamily )，負責催化核苷酸糖上的醣基轉移到疏水性的小分子
上，即醣化作用 ( Shigeyuki et al., 2004 )。在高等植物的液泡中，許 多二次代謝物會因 GTs 的作用轉換其醣結合體 ( glycoconjugates ) 結構 ( Goro et al., 2003 )。此外，植物的 GTs 對於色素的穩定性及 生長調節皆是十分重要的。目前，一些植物的 GT cDNAs 已被選殖 及特性分析，例如，阿拉伯芥的基因組包含了將近 120 個 GTs。這 種 轉 醣 酶 有 多 種 的 醣 接 受 體 ， 包 括 ：flavonoids 、 anthocyanins 、 terpenoids、sterols 及 thiohydroximates ( Shigeyuki et al., 2004 )。 Flavonol glycosides 在阿拉伯芥中是多種重要組成中之ㄧ，在 2003 年開始有描述關於 flavonoid glycosyltransferases 功能的報導。在阿 拉 伯 芥 中 找 到UDP-rhamnose:flavonol-3-O-rhamnosyltransferase 及 UDP-glucose:flavonol-3-O-glycoside-7-O-glucosyltransferase 個 別 在 quercetin 及kaempferol 的 3-OH 位置與 kaempferol-3-O-rhamnoside 及 quercetin-3-O-rhamnoside 的 7-OH 位置處，皆參與轉糖的工作 ( Patrik et al., 2003 )。雛菊花中的 betanidin 5-O-glucosyltransferase 在 betanidin 及 許 多 不 同 的 黃 酮 醇 牽 涉 到 區 域 專 一 性 的 糖 化 作 用 ( Judith et al., 2004 )。而在花青素生合成的路徑上，UFGT 的演化又 較其上游基因更為快速地發展並被發現中 ( Lu and Mark, 2003 )。花 青素在植物體中扮演著花色由紅色到藍色之間顏色表現的主要組 成，並且也提升吸引授粉昆蟲的機會。而在花青素生合成的路徑上，
醣化作用對於花色的穩定及增加其水溶性尤其重要。在玫瑰花的花青 素研究中發現 3GT 會影響紅色花青素的合成 ( Jun et al., 2005 )。
第三章 材料與方法 3-1.實驗材料 利用兩種不同花色的蝴蝶蘭：紅花紅心的 P. Wedding Promenade 與白花白心的 P. amabilis ，以每約 0.5 公分為分界，取其 5 個不同 開花時期的花苞。第一時期大小為 0.5 mm；第二時期大小為 0.5~1.0 mm；第三時期大小為 1.0~1.5 mm ；第四時期大小為 1.5 mm 以上； 第五時期為已開花 ( 圖 1 ) 。與白花紅心的 P. Luchia lady 取其第二 開花時期之萼片、花瓣、蕊柱及唇瓣 ( 圖 2 )，萃取確認過品質的 RNA ( 圖九、圖十、圖十一 )，當北方雜合反應實驗研究的材料。 3-2.實驗方法 3.2.1 萃取總 RNA 秤取 1.0 克的實驗材料於 180 ℃ 滅菌過的研缽中，不時加入液 態氮並同時將之磨成粉末狀，在其未解凍前，再加入 5 ml 的裂解緩 衝液 ( 5 M guanidine monothiocyanate，10 mM Na2EDTA，50 mM Tris-HCl pH 7.5，8 % β-mercaptoethanol )，繼續研磨成液態狀。在 4℃下，以 13,000 rpm ，離心 15 分鐘 ( Sorvall RC5C Plus, SS-34 rotor, CT. )。加入 40 ml 4 M LiCl 於上清液中，於 4 ℃ 下靜置過夜， 以將 RNA 沉澱下來。隔天，在 4 ℃ 下，以 13,000 rpm，離心 90 分
鐘，去除上清液，並加入 12 ml 3 M LiCl 震盪均勻。在 4 ℃下，以 13,000 rpm，離心 60 分鐘，去除上清液，並加入 6 ml 緩衝液 ( 0.1 % SDS，10 mM Tris-HCl， pH 7.5，1 mM Na2EDTA )，回溶震盪 45 分 鐘。之後，以等體積的 phenol : chloroform : IAA (25：24：1) 萃取兩 次 ， 以 及 等 體 積 的 chloroform 萃 取 一 次 ； 最 後 加 入 等 體 積 的 isopropanol 以及 1/10體積的 3 M NaOAc，於 –80 ℃ 下，靜置 30 分鐘，以沉澱 RNA。於 4 ℃ 下，以 13,000 rpm，離心 20 分鐘 ( Eppendorf 5417R, F45-30-11 rotor, Hamburg, Germany )；之後再以 75 % 酒精洗鹽一次，於 4 ℃ 下，以 13,000 rpm，離心 15 分鐘。去 除上清液，以真空乾燥機 ( DNA Mini, Heto, Norcross, GA ) 50 ℃ 乾 燥 2~3 分鐘，最後將之溶於 60~100 µl 不等的 DEPC/ddH2O 中， 並利用分光比色計 ( Beckman, Spectrophotometer DU640B, Palo Alto, CA )，於 OD260/280 條件下，偵測 RNA 含量。 3.2.2 RNA 電泳 先將拖盤、製膠槽、尺梳、及電泳槽用 0.1N NaOH 浸濕 15 分 鐘以除去 RNase，若是器具經常使用，則以酒精潤濕即可。再用大量 自來水沖洗掉殘留在器皿上具滑膩感的 NaOH，最後以 DEPC 水潤 濕。配置 1 % 的洋菜膠 ( 0.2 g agarose，20 ml 10 mM phosphate
補 DEPC 水到總體積為 10 µl ，50 ℃ 水浴 1 小時後，放置冰上 5 分鐘。再加入 2 µl RNA dye，在 10 mM phosphate buffer（pH 5.0）、 100 伏特電泳跑 20 分鐘。將跑完電泳的洋菜膠放入 50 mM NaOH 及 0.2 M NaOAC 中各 15 分鐘，其間以二次水沖洗酸鹼溶液，最後以 EtBr 溶液染色 15 分鐘，照相 ( AlphaImager 200 )。
3.2.3 RACE
利用 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit ( Clontech, Palo Alto, CA ) 來進行 cDNA 片段 3’ 和 5’ 端的增殖反應。 3.2.3.1 3’-RACE 3.2.3.1.1 製備第一股 cDNA 取 40 ng 來自紅花橘心姬蝴蝶蘭第 4 時期花苞的 total RNA， 加入 1 µl 3’-CDS primer，混合均勻後 70 ℃ 水浴 2 分鐘，然後置 於冰上 2 分鐘。再加入 2 µl 5 X First-Strand buffer，1 µl DTT ( 20 mM )，1 µl dNTP Mix ( 10 mM )，1 µl Power Script ( 200 units/µl )， 混合均勻後於 42 ℃ 下水浴 90 分鐘。之後加入 250 µl Tris buffer ( 10 mM ) 稀釋第一股 cDNA，並於 72 ℃ 下，水浴 7 分鐘。
3.2.3.1.2 3’端 cDNA 製備 (1)第一次 PCR 反應
取 2.5 µl 3’-RACE-ready cDNA，加入 5 µl universal primer mix ( UPM ) ( 10 X )，2 µl gene specific primer ( GSP；10 µM )，5µl 10 × Ex Tag buffer，1 µl dNTP Mix ( 10 mM )，0.5 µl Ex Tag ( 5 unit/µl )， 並加入 34 µl PCR-grade water，使總體積為 50 µl 。首先以 94 ℃， 5 分鐘讓第一股 cDNA 與 RNA 分開，再來的條件為 35 cycles的 94 ℃，30 秒；67 ℃，30 秒；72 ℃，4 分鐘，和 72 7 ℃ 分鐘，最 後 4 ℃ 保存。反應後取 5 µl 的產物直接進行 1 % 洋菜膠電泳觀察 結果。
(2)第二次 PCR 反應
取 3’-RACE 產物，加入 2 µl nested universal primer ( NUP ) primer ( 10 µM )，1 µl nested GSP ( 10 µM )，5 µl 10 × Ex Tag buffer， 1 µl dNTP Mix ( 10 mM )， 1 µl Ex Tag ( 5 unit/µl )，並加水使總體積 為 50 µl 。首先以 94 ℃，5 分鐘讓雙股 cDNA 分開，再來的條件 為 35 cycles 的 94 ℃，30 秒；60 ℃，30 秒；72 ℃，4 分鐘和 72 ℃， 7 分鐘，最後 4 ℃ 保存。反應後取 3 µl 的產物直接進行 1 % 洋菜 膠電泳觀察結果。 3.2.3.2 5’-RACE 3.2.3.2.1 製備第一股 cDNA
取 1500 ng 來自紅花橘心姬蝴蝶蘭第 2 時期花苞的總 RNA， 加入 1 µl 的 5’-CDS primer 和 1 µl 的 SMART II Oligo，混合均勻 後70 ℃ 水浴 2 分鐘，然後至於冰上 2 分鐘。再加入 2 µl 5 X First-Strand buffer ，1 µl DTT ( 20 mM )，1 µl dNTP Mix ( 10 mM )，1 µl Power Script ( 200 units/µl )，混合均勻後於 42 ℃ 下水浴 90 分 鐘。之後加入 250 µl Tris-EDTA buffer ( 10 mM ) 稀釋第一股 cDNA，並於 72 ℃ 下，水浴 7 分鐘。
3.2.3.2.2 5’端 cDNA 製備 (1)第一次 PCR 反應
取 2.5 µl 5’ RACE-ready cDNA，加入 5 µl universal primer mix ( UPM ) ( 10 X )，2 µl GSP1 ( 10 µM )，5 µl 10 X Ex Tag buffer，4 µl dNTP Mix ( 2.5 mM )，0.5 µl Ex Tag ( 5 unit/µl )，並加入 PCR-grade water，使總體積為 50 µl。首先以 94 ℃，5 分鐘讓第一股 cDNA 與 RNA 分開，再來的條件為 35 cycles 的 94 ℃，30 秒；67 ℃，30 秒； 72 ℃，4 分鐘和 72 ℃，7 分鐘，最後 4 ℃ 保存。反應後取 5 µl 的 產物直接進行 1 % 洋菜膠電泳觀察結果。
(2)第二次 PCR 反應
取 5’-RACE產物稀釋 20 倍，加入2 µl nested universal primer ( NUP ) primer ( 10 µM )，2 µl nested GSP ( 5 µM )，5µl 10 X Ex Tag
buffer，4 µl dNTP Mix ( 2.5mM )，0.5 µl Ex Tag ( 5 unit/µl )，並加水 使總體積為 50 µl。首先以 94 ℃，5 分鐘讓雙股 cDNA 分開，再來 的條件為 35 cycles 的 94 ℃，30 秒；60 ℃，30 秒；72 ℃，4 分鐘 和 72 ℃，7 分鐘,最後 4 ℃ 保存。反應後取 3 µl 的產物直接進行 1 % 洋菜膠電泳觀察結果。 3.2.4 自洋菜膠回收 DNA 片段
利用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction kit ( Geneaid, Taipei, Taiwan ) 來回收洋菜膠中 DNA 片段。用乾淨的刀片切取洋菜膠上的 DNA 片段，將之放入微量離心管中。加入 500 µl 的 DF Buffer，將 之震盪混合。置於 55 ℃ 下，15 分鐘，並於每 2~3 分鐘搖晃一次， 直至膠體完全溶解為止。以 8,000 rpm ( DF Column in Collection Tube )，離心 30 秒。去除上清液，加入 500 µl 的 Wash Buffer，以 8,000 rpm 離心 30 秒。去除上清液，再以 13,000 rpm ，離心 2 分 鐘，以乾燥之。最後加入 15 µl 的 Elution Buffer，置於室溫下 2 分 鐘以混合 DNA，再以 13,000 rpm 離心 2 分鐘，以溶出 DNA 離心 液。 3.2.5 DNA 定序 3.2.5.1 質體接合
利 用 pGEM-T Easy vector System 套 組 ( Promega, Madison, WI )，進行質體接合。取1 µl pGEM-T Easy載體 ( 50 ng/µl, Promega )， 加入 DNA 片段 ( DNA 片段之莫爾濃度：載體莫爾濃度 = 3：1 )、 1 µl 10X T4 ligase、1 µl 10X T4 ligation buffer，於 4 ℃ 下，12~16 個 小時。 3.2.5.2 基因的轉型作用 ( Transformation ) 取 1 µl 的重組質體，加入 25 µl 的勝任細胞 ( DH5α ) 中，置 於冰上 30 分鐘後，轉置於 37 ℃ 水浴槽準確計時 30 秒，再放置 冰上 2 分鐘。之後加入 500 µl SOC 培養液，置於 37 ℃，1000 rpm 下，振盪培養 90 分中。將菌液均勻塗抹在含 Ampicillin ( 50 ng/µl ) 的 LB 洋菜膠上，置於 37 ℃ 下培養 16~18 小時。 3.2.5.3 微量製備質體 於 LB 培養基上挑選單一菌落，以 3 ml LB 培養液加 3 µl Ampicillin ( 50 ng/µl )，在 37 200 rpm ℃ 下震盪培養 14~18 小時。 利用 High-Speed Plasmid Mini Kit 套組 ( Geneaid, Taipei, Taiwan ) 來抽取質體 DNA。取 1500 µl 的菌液，以最高轉速於微量離心機 中，離心 1 分鐘，將菌離下來。除去上清液後，加入 200 µl 的 PD1 Buffer，震盪均勻。加入 200 µl 的 PD2 Buffer，緩慢上下顛倒 10
次，於室溫下靜置 2 分鐘，使菌體的細胞壁破裂，以釋出 DNA。加 入 300 µl 的 PD3 Buffer，緩慢上下顛倒 10 次，此時會有白色的沉 澱物出現。以最高轉速於微量離心機中，離心 3 分鐘。將上清液倒 入已放入 Collection Tube 的 PD Column，以 8000 rpm 離心 30 秒 後，除去上清液。加入 400 µl 的 W1 Buffer，以 8000 rpm 離心 30 秒後，除去上清液。加入 600µl 含有酒精的 Wash Buffer，以 8000 rpm 離心 30 秒後，除去上清液，再以最高轉速離心 2 分鐘，以除 去剩餘酒精。將 PD Column 置於新的 1.5 ml 的離心管中，加入 50 µl 的 Elution Buffer 於 PD Column 的正中央，靜置 2 分鐘後，以 最高轉速離心 2 分鐘，得到質體。利用分光比色計 ( Beckman )，於 OD 260/280 下，偵測 DNA 含量。 利用限制酵素 EcoR I 切割，搭配洋菜膠電泳，來確定 DNA 重 組片段的正確性。 3.2.5.4 DNA 自動定序 3.2.5.4.1 Big Dye 反應
取 200 ng 重組 DNA，加入 1.5 µl Big Dye、1.5 µl 緩衝液、1.0 µl primer ( 5 pmol/µl ) ，補無菌水始總體積為 10 µl 。混和均勻後， 進行 PCR 反應:先 96 ℃，3 分鐘，再 60 個循環的 96 ℃，15 秒；
3.2.5.4.2 酒精沉澱 加入 48 µl 的溶液 ( 80% EtOH : 0.1N NaOAc = 50：2 )，震盪均 勻後置於室溫避光 10 分鐘。以 3500 rpm 離心 15 分鐘，之後倒扣 酒精於吸水紙上，再倒扣離心 1500 rpm，45 秒，加入 100 µl 的 70 % 酒精進行震盪，以 3500 rpm 離心 10 分鐘，倒扣酒精於吸水紙 上，再倒扣離心 1500 rpm，45 秒，最後封保鮮膜及鋁箔紙，送給基 龍米克斯生技公司進行定序工作。 3.2.6 電腦輔助序列分析 3.2.6.1 序列比對 將所得到的核苷酸序列利用軟體 Sequencher V. 4.1 (GeneCode, Ann Arbor, MI, U.S.A.) 對序列進行移除載體及 poly A 序列的編輯 工作並確認序列的正確性，再送入美國國家生物技術中心 National Center of Biotechnology Information ( NCBI ) 的BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，進行基因庫比對。
3.2.6.2 多序列比對 ( multiple sequences alignment ) 及親源演化分 析 ( phylogenetic analysis )
利用 CLUSTAL W 軟體，進行多序列比對工作；以及 MEGA 2 軟體 ( neighbor-joining )，進行序列演化分析。
3.2.7 北方雜合 3.2.7.1 探針的製備
在 CHS、CHI、ANS、PeUFGT1
、
PeUFGT2 及 PeUFGT3 的3’UTR 設計引子，分別是：PeCHS_left、PeCHS_right；PeCHI_left、 PeCHI_right；PeANS_left、PeANS_right；F04_3’S =>、F04_3’S <=； H08_3’S =>、H08_3’S <=；H09_3’S =>、H09_3’S <=（ 表一 ），以 cDNA 當模板進行 PCR 反應來製備特異性高之探針 DNA。利用 RediprimeTM II 套組 ( Biotech, Buckinghamshire, England ) 來製備探 針。取 25 ng DNA，補水到 45 µl，於沸水中水浴 5 分鐘後，迅速 放置冰上 5 分鐘。將液體加入 Random Prime 反應試管中，充分混 和。加入 3 µl α-32P dCTP，再充分混和後，於 37 ℃ 下反應 1 小時。 最後於沸水中水浴 5 分鐘後，迅速放置冰上 5 分鐘，終止反應。 3.2.7.2 探針品質的測定 取 1 µl 製備好的探針加入 5 µl tRNA ( 10 µg/µl ) 並加入 995 µl 的水，混和均勻。取出 10 µl 並以同心圓點於 GF/C 濾膜上，風乾 後加入閃爍液 ( biodegradable counting scinitillation liquid )。其餘的溶 液加入 107 µl 75 % TCA，及 206 µl 5 M NaCl，靜置冰上 30 分 鐘。將溶液倒至 GF/C 濾膜上，並抽真空，之後以 5 % TCA 溶液沖
洗 5次，再 95 % 酒精沖洗 5 次。當濾膜風乾後，加入閃爍液。最 後利用 β-counter ( Beckman Counter TM ) 偵測探針的活性。
3.2.7.3 北方雜合反應
以 glyoxal 處理過的 RNA 樣本經電泳後，直接轉漬到耐隆濾膜 ( Hybond-N+, Amershan Pharmacia, Piscataway, NJ )，進行雜合反應。 預先裁好的要比所要轉漬的膠體稍大的濾膜一張，以真空轉漬器 ( VacuGene XL, Amershan Parmacia ) 將 RNA 自膠體轉漬到濾膜 上，以 25 mM Na-PO4 ( pH 7.0 ) 緩衝液轉漬 90 分鐘。利用UV鏈結 儀 ( UV Stratalinker 1800, StraTagene, LaJolla, CA ) 將 RNA 共價鍵 結在濾膜上。
將濾膜置於雜合管中，加入預雜合溶液 ( 0.75 M NaCl，50 mM Tris pH 7.5，0.1 % NaP2O7，1 % SDS，1 mM EDTA，1× Denhardt’s solution，0.1 mg/ml salmon sperm DNA，50 % formamide，10 % dextran sulfate )，放入 42 ℃ 雜合箱內 2 小時。預雜合過後，把製備好的探 針以 100 ℃ 水浴加熱 5 分鐘再以 4 ℃ 冷卻 5 分鐘後，加入管中， 於42 ℃進行雜合作用。 40~48 小時後，先以清洗液 ( 2× SSC, 0.1 % SDS ) 於室溫下清洗兩次，每次各 15 分鐘。再以清洗液 ( 0.1× SSC、0.1 % SDS ) 於 42 ℃ 下清洗 30 分鐘視情況再於 60 ℃ 下清 洗 15 分鐘。最後將濾膜置於 2× SSC 溶液中清洗後晾乾，於 -80 ℃
進行自動放射顯影。 3.2.8 利用基因槍探討 PeUFGT3 基因於白花之暫時性表現 3.2.8.1 PeUFGT3 重組質體之構築 3.2.8.1.1 以 PCR 方法大量製備 PeUFGT3 轉基因 利用引子組 H09 forward 及 H09 reversed 進行 PCR 反應，可以 得到 PeUFGT3 約 1.6 kb 的片段，兩端都含有 Spe I 的切位，所得 之DNA 片段以 Spe I 酵素處理並純化。 3.2.8.1.2 載體 DNA 以 Spe I 處理 取純化好的 pCAMBIA 1304 載體 DNA 57.5 µl ( 10 µg )，加入 4 µl NE buffer3 及 5 µl Spe I，以無菌水補足反應體積至 100 µl，於 37 ℃ 下作用 14~18 小時後，72 ℃ 下作用 10 分鐘，進行回收。
3.2.8.1.3 載體 DNA 之去磷酸根處理 ( dephosphorylation )
取純化好的 pCAMBIA 1304 載體 DNA 30 µl ( 約 5 µg )，加入 4 µl NE buffer3 、2 µl CIP ( calf intestinal phosphatase )，並以無菌水補 足反應體積至40 µl，於 37 ℃下作用 30 分鐘後再加入 1 µl CIP，繼 續再37 ℃下作用 30 分鐘以去除 5’ 端的磷酸根，最後以 65 ℃下作 用15 分鐘。
3.2.8.1.4 PeUFGT3 重組質體之接合反應
取經 CIP 處理過的 pCAMBIA 1304 載體 1.5 µl，加入經 Spe I 確認過含 insert 的 PeUFGT3 1.6 kb DNA 片段約 1.5 kb （圖十七） 2.5 µl ，再加入 5 µl 2× ligation buffer 及 1 µl T4 DNA ligase ，於 4 ℃ 作用 16 小時以上。
3.2.8.1.5 篩選含 sense 和 antisense 構築體的 E. coli
挑出長在含 kanamycin 的 LB agar plate 上的菌落，接種在含
有 kanamycin 的 3 ml LB broth 培養液，以 37 ℃、200 rpm 震盪隔 夜培養，抽出質體，以插入基因之特有酵素切位 Nco I，檢驗插入之 基因為正接或反接。因為插入基因 PeUFGT3 在 1061 及 1130 位置 處都有 Nco I 切位。若為正接，則會有 1061 bp 及 69 bp 兩的片 段；若為反接，則會有約 300 bp 片段（圖二十一）。 3.2.8.2 金粒子無菌處理 稱 30 mg 的金粒子於 1.5 ml 的微量離心管中 ( 金粒子大小為 1.6 µm )，加入 1 ml 70 % 的酒精 ( 100 % 酒精，震盪 1~2 分鐘 )， 劇烈震盪 3~5 分鐘後，靜置酒精下 15 分鐘，以離心的方式離心 5 秒， 使金粒子沉澱( 於室溫下離心 10,000 rpm 1 分鐘 )，移除懸浮液，重 覆以下清洗步驟 3 次。加入 1 ml 無菌水震盪 1 分鐘之後，以短暫 離心方式離心 1 分鐘使金粒子沉澱，去除上清液，經 3 次清洗過程
後，加入 500 µl 滅菌過的 glycerol 使金粒子濃度達 60 mg/ml，備 製好的金粒子可置於室溫下達二週，也可置於 -4 ℃ 下保存。保存乾 燥的金粒子時，需置於乾燥、無氧化的環境以減少結塊。
3.2.8.3 Coating Washed DNA 於金粒子
震盪保存於 50 % glycerol 的金粒子 5 分鐘，使結塊的金粒子分 開。取50 µl金粉約 3 mg置於 1.5 ml eppendorf 中依序加入 ( 需不斷 震盪時加入 ) 5 µl DNA ( 1 µg/µl )、50 µl 2.5 M CaCl2、20 µl 0.1 M spermidine ( free base, tissue culture grade )，持繼震盪 2-3 分鐘，靜置 1 分鐘，離心 2 分鐘，移除液體部分。加入 140 µl 70 % 酒精 ( spectrophotometric grade )，去除液體部分，加入 140 µl 100 % 酒 精，去除液體部分，加入 48 µl 100 % 酒精。利用輕拍方式使管壁上 的顆粒搖晃數次，之後再以低速震盪 2~3 秒，每次取 6.6 µl 的溶液 提供基因槍擊發一次。 3.2.8.4 基因槍擊發條件 將 混 合 過 的 金 粒 子 與 裸 露 的 DNA ， 以 Bio-Rad 公 司 的 PDS-1000/He biolistic 基因槍系統 ( 附圖三 )，利用高壓氦氣的方式 提供足夠的衝擊力，在 1350 psi 條件下，將帶有 DNA 的金粒子射 出，刺穿細胞壁及細胞膜，而將附著在金粒子上的基因帶入細胞中。
第四章 結果
4.1 蝴蝶蘭中 PeUFGT1
、
PeUFGT2、
PeUFGT3 全長序列的分析4.1.1 PeUFGT1 基因
由於在 EST database 中沒有 PeUFGT1 cDNA clone 的全長序 列，只有 534 bp。因此利用 RACE 技術進行 5’ 端與 3’ 端序列的 的 增 殖 反 應 。 利 用 引 子 UPM 、 EFCP009F04-3’-RACE 以 及 引 子 NUP、EFCP009F04-3’-RACEN 分別進行第一次及第二次 3’-RACE 增殖反應，得到 450 bp ，經序列比對確認得到 3 端末端序列( 圖 三 ) 。 再 利 用 引 子 UPM 、 F04-5’-RACE-GSP1 以 及 NUP 、 F04-5’-RACE-GSP2 與 NUP、F04-5’-RACE-GSP2 (2nd) 分別進行 2 次 5’-RACE 增殖反應，個別得到 1100 及 800 bp ( 圖四 )。所得到 的質體 DNA 以自動序列分析儀進行序列的分析，序列經過分析校正 後，最後得到 PeUFGT1 的序列為 1,569 bp。
4.1.2 PeUFGT2 基因
PeUFGT2 的 cDNA clone 在 EST database 中，經過序列分析，
比對結果經過校正後得到 1711 bp ，為 PeUFGT2 的全長序列。
4.1.3 PeUFGT3 基因
PeUFGT3 基因在 EST database 中同樣沒全長序列，只有 738 bp。因此利用與 PeUFGT1 同樣的方法進行 5’ 端與 3’ 端序列的增殖 反應。利用引子 UPM、EFCP036H09-3’-RACE 以及引子 NUP、 EFCP036H09-3’-RACEN 進行 3’ 端序列的增殖反應得到 800 bp (圖 五) ； 以 及 利 用 H09-5’-RACE-GSP1 與 H09-5’-RACE-GSP2 、 H09-5’-RACE-GSP2-2nd 、 H09-5’-RACE-GSP2-3th 分 別 進 行 3 次
5’RACE 增殖反應，個別得到 1100、600、800 bp ( 圖六 )，最後精 序列分析後得到 PeUFGT3 的全長序列為 1,625 bp。
4.2 紅花橘心姬蝴蝶蘭之 PeUFGT1、PeUFGT2
、
PeUFGT3 進行多序列比對
利用 NCBI 內的基因庫 ( GenBank )，搜尋不同物種，包括 ： petunia 3GT ( BAA89008 )、gentian 3GT ( BAA12737 )、grape 3GT ( AAB81683 )、maize 3GT ( CAA31856 )、verbena 5GT ( BAA36423 )、 petunia 5GT ( BAA89009 ) 、 perilla 5GT ( BAA12737 ) 、 Stevia
rebaudiana GT ( AAR06913 )，共 8 個與 glucosyltransferase 相關的
全長胺基酸序列，連同 PeUFGT1、PeUFGT2 及 PeUFGT3，利用 CLUSTAL W 軟體，進行多序列比對 ( 圖七 )。結果顯示 PeUFGT2 序列比對與 verbena ( 馬鞭草 )、petunia ( 牽牛花 ) 及 perilla ( 紫 蘇 ) 的 5GT 較 相 似 。 而 PeUFGT1 及 PeUFGT3 則 與 Stevia
rebaudiana ( 甜菜 ) GT 較接近。 4.3 紅花橘心姬蝴蝶蘭之 PeUFGT1、PeUFGT2 及 PeUFGT3 與其他 植物間親源演化分析 將蝴蝶蘭的 PeUFGT1、PeUFGT2 及 PeUFGT3 基因與其他物 種 ( 包括蘭科、禾本科、豆科、玄參科、唇形花科、茄科、葡萄科…. 等) 共 19 種 ， 包 括 ： egg-plant 3GT ( X77369 ) 、 petunia3GT ( BAA89008 )、gentian 3GT ( BAA12737 )、grape 3GT ( AAB81683 )、
maize 3GT ( CAA31856 )、Sorghum bicolor GT ( AAT42163 )、Vigna angularis GT ( BAB86928 )、Nicotiana tabacum GT ( AAB36653 )、 scuttellaria 7GT ( BAA83484 )、gentian 3'GT ( BAC54092 )、Stevia rebaudiana GT ( AAR06913 )、Arabidopsis thaliana GT ( AAP49527 )、 D. bellidiformis 5GT ( Y18871 )、perilla 5GT ( BAA36421 )、verbena 5GT ( BAA36423 ) 、 petunia 5GT ( BAA89009 )、 torenia 5GT ( AB076698 )、Petunia 3RT ( CAA50377 )、petunia RT ( Z25802 ) 與轉 糖酶相關的氨基酸序列，利用 MEGA 2 軟體 ( neighbor-joining )， 進行序列演化分析 ( 圖八 )。結果發現 PeUFGT1 的親緣關係與阿 拉伯芥 ( Arabidopsis ) 的 GT、黃芩 ( Scuttellaria ) 的 7GT、龍膽 花 ( Gentain ) 的 3’GT、彩虹菊 ( Dorotheanthus bellidiformis ) 的 5GT 為 較 接 近 的 族 群 ； PeUFGT2 與 高 梁 ( Sorghum ) 、 菸 草 ( Nicotiana )及紅豆( vigna )的 GT 親緣演化關係較為接近；而
PeUFGT3 則與 Stevia rebaudiana GT 親緣演化關係最為接近。
4.4 CHS
、
CHI、
ANS、
PeUFGT1、
PeUFGT2、
PeUFGT3 在不同花色的蝴蝶蘭中北方雜合反應的表現情形
4.4.1 CHS
利用 CHS 探針，對白花白心的 P. amabilis 與紅花紅心的 P.
CHS 在 P. amabilis
與
P. Wedding Promenade 都有表現，其中在 P. Wedding Promenade 開花的第 2 到第 3 時期表現量增高，第 4 時期後開始降低，但到開花後的第5 時期還持續有表現。
4.4.2 CHI
結果顯示 CHI 在 P. amabilis
與
P. Wedding Promenade 都有表現，但到開花後的第5 時期則偵測不到其表現 ( 圖十二 ) 。
4.4.3 ANS
結果顯示 ANS 在 P. amabilis
與
P. Wedding Promenade 也都有表現，與 CHS 雷同的在 P. Wedding Promenade 開花的第 2 到第 3 時期表現量增高，第4 時期後開始降低，但到開花後的第 5 時期還持 續有表現；但不同的是 ANS 在 P. amabilis 開花後的第 5 時期沒有表 現 ( 圖十二 ) 。
4.4.4 PeUFGT1
結果顯示 PeUFGT1 在 P. amabilis 與 P. Wedding Promenade 中 都有表現，其中在 P. Wedding Promenade 開花的第 4 時期表現量最 多，到第5 時期則有下降的趨勢。但在 P. amabilis 則是到了第 5 時 期才開始有大量表現 ( 圖十三 ) 。
4.4.5 PeUFGT2
結果顯示 PeUFGT2 在 P. amabilis
與
P. Wedding Promenade 中都無明顯表現，表現上並無顯著的差異性 ( 圖十三 ) 。
結果顯示 PeUFGT3 在 P. amabilis
與
P. Wedding Promenade的表現中有明顯的差異，其中在 P. amabilis 的 5 個開花時期都偵測 不到有表現。然而，在 P. Wedding Promenade 中在第 1 時期就開始 有些微表現，到了第 2 及第 3 時期時，表現量開始增高，到了第 4 時期又開始下降，到第 5 時期時表現量最低 ( 圖十三 ) 。
4.5 CHS
、
CHI、
ANS、
PeUFGT1、
PeUFGT2、
PeUFGT3 在白花紅心蝴蝶蘭不同花部北方雜合反應的表現情形 4.5.1 CHS 對白花紅心的 P. Luchia lady 蝴蝶蘭針對其萼片、花瓣、蕊柱 及唇瓣進行北方雜合反應 ( 圖十四 )。結果顯示 CHS 在蕊柱的表 現中明顯的比在萼片、花瓣及唇瓣中表現量低。但 CHS 不論在白 色的萼片與花瓣，或紅色的唇瓣中均有表現。 4.5.2 CHI 利用 CHI 探針，對結果顯示 CHI 在蕊柱的表現中也明顯的比 在萼片、花瓣及唇瓣中表現量低。但 CHI 同樣的在白色的萼片與花 瓣，或紅色的唇瓣中均有表現 ( 圖十四 ) 。 4.5.3 ANS 結果顯示 ANS 在蕊柱的表現中比在萼片、花瓣及唇瓣中表現量 低。但 ANS 同樣的在白色的萼片與花瓣，或紅色的唇瓣中均有表現 ( 圖十四) 。 4.5.4 PeUFGT1
其萼片、花瓣、蕊柱及唇瓣進行北方雜合反應 ( 圖十五 )。結果顯示 PeUFGT1 也在蕊柱的表現中比在萼片、花瓣及唇瓣中表現量低。其 中表示 PeUFGT1 在白色的萼片與花瓣，或紅色的唇瓣中都會有表 現。 4.5.5 PeUFGT2 利用 PeUFGT2 探針，結果顯示 PeUFGT2 在蕊柱及唇瓣中才 有表現，在萼片、花瓣中則偵測不到有表現 ( 圖十五 ) 。 4.5.6 PeUFGT3
利用 PeUFGT3 探針，對白花紅心的 P. Luchia lady 蝴蝶蘭針對 其萼片、花瓣、蕊柱及唇瓣進行北方雜合反應 ( 圖十五 )。結果顯示
PeUFGT3 在萼片、花瓣、蕊柱間均偵測不到表現，只觀察到表現在
紅色唇瓣的部位。
4.6 PeUFGT3 基因於白花白心蝴蝶蘭之暫時性表現情形
將 pCAMBIA 1304 質體測試基因槍擊發所需不同的壓力：450 psi、650 psi、900 psi，1100 psi、1350 psi 及 1550 psi 後，選擇 1350 psi 為最佳的擊發壓力條件 ( 表二，圖十八 )。去磷酸根後的 pCAMBIA 1304 質體 與 PeUFGT3 重組( 圖十九、二十 )，經確認正、反接 後 ( 圖二十一 )，以 1350 psi 為基因槍擊發之壓力條件，利用金粒 子將 PeUFGT3 基因帶入 P. amabilis 第三開花時期花苞的萼片及花 瓣與第五時期已開花的萼片中。結果顯示花苞的萼片及花瓣經 Gus 染色後有藍色表現，表示成功轉入 PeUFGT3 基因，但沒有觀察到有 紅色的顏色出現 ( 圖二十二 )。
第五章 討論
1. PeUFGT 進行 5’端 RACE 反應
在 PeUFGT1 及 PeUFGT3 進行 5’ RACE 時，較難得到 5’端末 端的序列。原因可能為在設計引子時，序列上有蝴蝶蘭特殊且重複的 序列，導致 PCR 完經純化且定序結果，讀不到 NUP 的序列，兩端 皆為自己所設計的引子序列。此問題經重新設計引子的序列，避開蝴 蝶蘭特殊且重複的序列，因此能快速延長5’端序列的序列。
2. 紅花橘心姬蝴蝶蘭之 PeUFGT1
、
PeUFGT2 及 PeUFGT3 與其他植物間進行多序列比對
將 PeUFGT1
、
PeUFGT2 及 PeUFGT3 與其他植物之轉糖酶氨基酸，包括 ：petunia 3GT、gentian 3GT、grape 3GT、maize 3GT、 perilla 5GT、verbena 5GT、petunia 5GT 及 Stevia rebaudiana GT 共 8 個 glucosyltransferase 全長胺基酸序列，進行多序列比對。結果顯示其 間並未具有很高的相似度。原因可能是未選取到合適的比對物種，導 致未能在序列比對上看出其序列關係。
3. 紅花橘心姬蝴蝶蘭之 PeUFGT1
、
PeUFGT2 及 PeUFGT3 與其他植物間親源演化分析
在 PeUFGT1
、
PeUFGT2 及 PeUFGT3 與其他植物間親源演化分析的結果，我們發現 PeUFGT2 與菸草及豆科的 GT 基因間的演 化關係最為接近，並與矮牽牛、葡萄、茄科、龍膽屬的 3GT 較為接 近。而 PeUFGT3 除了與 Stevia rebaudiana GT 接近外，與 PeUFGT1 演化關係較接近 ( 圖八 ) 。
4. CHS
、
CHI、
ANS、
PeUFGT1、
PeUFGT2、
PeUFGT3 在不同花色與不同花部蝴蝶蘭中的表現情形
花色素的合成經常在花即將開花前或是花發育的早期，表現達到 最高峰 ( Giuliano et al., 1993 )。在 2003 年時，Masako 等日本人將 龍膽花的花包發育過程區分為 4 個時期，分別為尚未有顏色的小花 苞當作第一開花時期；第二開花時期為開始有呈現顏色的花苞；第三 時期為開花前顏色已有明顯表現的大花苞；第四時期為開花完全的花 瓣。以 3’GT 作為探針，進行北方雜合反應。結果發現 3’GT 在 第 一時期開始有表現，第二到第三時期表現量達到最高峰，第四時期則 完全沒有表現 ( Masako et al., 2003 )。Kobayashi 等人則以葡萄作為 研 究 對 象 ， 討 論 UFGT 在 白 葡 萄 與 紅 葡 萄 果 皮 之 間 的 表 現 ( Kobayashi et al., 2001 )。北方雜合反應的結果顯示 UFGT 只會在紅 葡萄的果皮中有表現，而在白葡萄中則沒有表現，表示 UFGT 與紅 色果皮的表現有相當的關係。在本論文研究中，我們利用北方雜合技 術，來觀察參與花青素合成的酵素，包括：CHS
、
CHI、
ANS 基因，在白花白心的 P. amabilis 、紅花紅心的 P. Wedding Promenade 與白 花紅心的 P. Luchia lady 等三種不同花色蝴蝶蘭 mRNA 的表現情形。 結果發現 CHS
、
CHI、
ANS 不論是在白花白心的 P. amabilis 、紅花紅心的 P. Wedding Promenade 或白花紅心的 P. Luchia lady 之中，其 mRNA 的表現上並未有明顯的差異。由此結果得知，這些基因的表 現量多寡或是表現的時期，並不是直接影響花色形成的主要原因。此 結果與 蘇靖棻論文結果相同 (蘇，2002)，雖然本論文設計特異性高 之探針，而 蘇靖棻論文是以基因全長序列當探針。由此推測影響花 色形成的原因可能是位於花青素合成路徑上的下游基因。因此，以同 樣的實驗條件下觀察 PeUFGT1
、
PeUFGT2、
PeUFGT3 的表現情形。發現 PeUFGT1
、
PeUFGT2 同樣的也未有明顯的表現差異。此花白心的 P. amabilis 與紅花紅心的 P. Wedding Promenade 之間具有 明顯差異。在紅花紅心的 P. Wedding Promenade 之第二開花時期， mRNA 的表現量增多，到第三開花時期表現達最高峰，到了第四開花 時期開始降低。從花苞外觀進行觀察比較，花苞顏色深淺的表現情況 在第二時期開始呈現顏色，到了第三到第四時期顏色最深，符合實驗 的結果。而在白花白心的 P. amabilis 看不出有明顯表現。因此再觀 察 PeUFGT3 在白花紅心的 P. Luchia lady 中不同花部的表現情形， 發現在白色花部之萼片、花瓣、蕊柱之間，都沒有看到 mRNA 的表 現，反而是在紅色的唇瓣花部中，有明顯的表現，而外觀上也只有唇 瓣為紅色。由此推測，PeUFGT3 在蝴蝶蘭紅色花色形成的路徑上可 能扮演重要的關鍵角色。 5.利用基因槍進行 PeUFGT3 基因暫時性表現的情形 在 Bio-Rad 公司以 PDS-1000/He 裝置對不同受體組織的轟擊參 數設定中，對蝴蝶蘭花苞未有標準的參數設定。所以在轉殖我們所要 觀察的基因之前，先利用只打未接有轉基因的質體調整基因槍所需壓 力的條件。發現條件在1350 psi 時，將質體打入欲觀察目標的效果最 好。因此選定這個壓力為進行基因槍轉殖蝴蝶蘭的條件 ( 表二 )。構 築 結 果 顯 示 目 標 物 經 Gus 染 色 後 有 藍 色 表 現 ， 表 示 成 功 轉 入 PeUFGT3 基因的質體。而藍色的部分大多集中在片緣,少集中在片 中，也許是基因槍擊發時角度的誤差，或是花瓣邊緣的細胞分裂較旺 盛所造成的。但未發現花器組織呈現紅色反應，PeUFGT3 為何不表 現？有待進一步深入探討。
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表一、本論文中所使用的引子 引子名稱 5’Æ3’ 核苷酸序列 EFCP036H09-3’-RACE CCGCCGGCTTCGGTCGTTTACGT EFCP036H09-3’-RACEN GTGCAAAGGTTCAACAAGCTGGC EFC009F04-3’-RACE GGATTTGCGACTCATTGTGGTTGGAATTC EFC009F04-3’-RACEN GGTGACATGGCCGTTGTTTGC H09_5’-RACE-GSP1 GACCTCACTCTTAATTTAACCGAATGCAATCCCCATCA H09_5’-RACE-GSP2 CCTCCTCCTCCACCACCACC H09_5’-RACE-GSP2 (2nd) ACGCAATGATCGGCACACCACTG H09_5’-RACE-GSP2 (3rd) GCAGTGGGCTAACCGCAAAAATGT F04_5’-RACE-GSP1 AACAATTTAAGACAATATATGAGTCCCCAAGATACGC F04_5’-RACE-GSP2 CTTCGCTCTCATCTTCCTCTCCTC F04_5’-RACE-GSP2 (2nd) CAAAATTCTTCGGTTCCAACTCCATG H09_3’S => TGCGGGGTGGAACTCG H09_3’S <= GAAACAGAAATACAAAGTACTAAACTACAT F04_3’S => ATAATGAGAAGTTTTTGTTGGATGTT F04_3’S <= AGAACCAAAGAGCCAAACCTG H08_3’S => TTGGGGTGTGGGGATGG H08_3’S <= TGCAACCGGATAAAAGTGA PeCHS_left TGTGCTTGATTGGAACTCTATTTTT PeCHS_right TGCCACCAATCGGAACG PeCHI_left ACAGATGGGAAAGGTGAGAGCA PeCHI_right TGCAGTGACCATTTGAAAGCC PeANS_left CTGCCATTAGAGCCGGTGAA PeANS_right CCAGATAGGTTCGGCCAAAGTAC H09-forward CCACTAGTATGTCCCCCGACCAAATCCAACCAGTAA H09-reversed CCACTAGTATGTCCATTGCGTGTGATATGAGCAACAAAGGC 註: EFC009F04 (PeUFGT1)、EFCP023H08 (PeUFGT2) 與 EFCP036H09
表二、測試基因槍擊發所需不同的壓力對 Gus 表現的影響 擊發時間/ 氦氣壓力 條件（psi） 450 650 900 1100 1350 1550 第一次擊 發 （－） （－） （＋） （＋） （＋） 第二次擊 發 （＋） （＋）（＋）（＋）（＋） （＋） （＋） 第三次擊 發 （＋）（＋） （＋）（＋） 附註: 使用材料為 P. amabilis 第三時期之萼片與花瓣，其中，（－）：沒表現； （＋）：越多表示Gus 染色呈藍色的訊號越強。
1 2 3 4 5 (stage) 1 2 3 4 5 (stage) 1 2 3 4 5 (stage) 1 2 3 4 5 (stage)
圖一、 P. Wedding Promenade 與 P. amabilis ，5 個不同開花時期的 定義。第一時期大小為 0.5 mm；第二時期大小為 0.5~1.0 mm；第三 時期大小為 1.0~1.5 mm ；第四時期大小為 1.5 mm 以上；第五時期 為已開花。
花瓣 蕊柱 脣瓣 脣瓣(紅色) 萼片 (cm) 花瓣 蕊柱 脣瓣 脣瓣(紅色) 萼片 (cm)
2000 450 bp 1 2 M M 3000 1500 1000 500 450 bp 2000 3000 1500 1000 500 2000 450 bp 1 2 M M 3000 1500 1000 500 450 bp 2000 3000 1500 1000 500
圖三、PeUFGT1 進行 3’RACE 增殖反應。Lane 1 表示 PeUFGT1 第 二次 3‘RACE-PCR 增值反應的結果。Lane 2 表示 PeUFGT1 在第 二次 3‘RACE 後回收的 DNA 片段，約 450 bp。M 為 DNA 標記， 以下如同。
1100 bp 800 bp 1 1 2 M M 2000 3000 1500 1000 500 2000 3000 1500 1000 500 1100 bp 800 bp 1 1 2 M M 2000 3000 1500 1000 500 2000 3000 1500 1000 500
圖 四 、 PeUFGT1 進 行 5’RACE 增 值 反 應 。 Lane 1 為 第 一 次 5‘ RACE 後回收的 DNA 片段，約 1100 bp 。Lane 2 為第二次 5‘ RACE 後回收的 DNA 片段，約 800 bp。
800 bp 2 1 3 M M 800 bp 2000 3000 1500 1000 500 800 bp 2 1 3 M M 800 bp 2000 3000 1500 1000 500
圖五、PeUFGT3 進行 3’RACE 增值反應。Lane 1 表示利用第一次 RACE-PCR 產物稀釋 20 倍進行第二次 RACE-PCR 的結果；Lane 2 表示利用第一次 RACE-PCR 產物稀釋 50 倍進行第二 3‘RACE-PCR 的結果。 Lane 3 表示 PeUFGT3 在 3‘ RACE 後回收的 DNA 片段， 約 800 bp 。
1100 bp M 1 600 bp 800 bp M 2 M 3 2000 3000 1500 1000 500 1100 bp M 1 600 bp 800 bp M 2 M 3 2000 3000 1500 1000 500
圖六、PeUFGT3 5‘ RACE 後回收的 DNA 片段。Lane 1 為第一次回 收的片段，約 1100 bp。 Lane 2 為第二次回收的片段，約 600 bp。 Lane 3 為第三次回收的片段，約 800 bp。
