應用蛋白質體學方法探討松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞的生長; The Molecular Mechanism of Growth Inhibition on Human Oral Cancer Cells by Ganoderma tsugae Extracts via Proteomics Approach

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(1)中國醫藥大學基礎醫學研究所碩士學位論文應用蛋白質體學方法探討松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞的生長. The Molecular Mechanism of Growth Inhibition on Human Oral Cancer Cells by Ganoderma tsugae Extracts via Proteomics Approach. 指導教授：高銘欽. 教. 研究生：李佩怡. 中華民國九十八年七月. 授.

(2) 中文摘要靈芝長久以來即被用在醫療用途上，特別是在東亞地區。在傳統中國醫學中，靈芝即被用來延長人的壽命和治療很多疾病，近代醫學更顯示出靈芝能夠治療癌症。靈芝的主要成分為多醣體和三萜類，多醣體主要是經由增強人體的免疫力因而達到抗癌的效果；三萜類主要是經由毒殺癌細胞而達到抗癌的效果。本實驗室主要使用松杉靈芝為實驗材料，之前的結果顯示松杉靈芝能對抗許多癌細胞，包括卵巢癌、乳癌、肺癌、皮膚癌、口腔癌及大腸直腸癌，本論文為了進一步探討松杉靈芝抑制口腔癌細胞的分子機轉，使用蛋白質體學技術。經由二維凝膠電泳及 PDQuest 分析軟體分析差異點，最後利用 MALDI-TOF/TOF 分析，及 MASCOT 資料庫比對，在 HSC-3 細胞株中鑑定出 42 個蛋白質差異點；在 SCC-4 細胞株中鑑定出 33 個蛋白質差異點。之後將這些蛋白質匯入 GeneGo Meta CoreTM 分析各蛋白質之間相互關係圖，在兩株不同的口腔癌細胞中找到相同的訊息傳遞路徑，另外也找到各別的訊息傳遞路徑。本論文對未來利用松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞的生長提供了可能的訊息傳遞路徑。. 關鍵詞：松杉靈芝、口腔癌、蛋白質體學. i.

(3) 英文摘要 Abstract Traditional Chinese Medicine (TCM) has been used to preserve the human vitality, to promote longevity, and for the prevention or treatment of a variety of diseases including cancer. Ganoderma, also known as Lingzhi, is a TCM and has been used for medicinal purposes for centuries. Among the eight common species of Ganoderma in Taiwan, Ganoderma tsugae (Gt) has been used in our study for fighting cancers. Our preliminary data showed that Gt extracts could inhibit the growth of human oral cancer cell lines, HSC-3 and SCC-4. To further unravel its molecular mechanism, a proteomics approach was applied. The proteomics experiments revealing the cancer cell growth inhibiting effect of Gt extracts was found to be associated with regulation of 42 proteins for HSC-3, and 33 proteins for SCC-4. All these proteins were subjected to the GeneGo Meta Core analysis to search for the possible molecular pathways. Interestingly, similar molecular pathways were found for these two oral cancer cell lines responding to Gt extracts treatment. These data suggest the possible molecular pathways leading to human oral cancer cell growth inhibition after Gt extracts treatment. Moreover, it may also be beneficial to the clinical treatment of human oral cancers.. Keywords : Ganoderma tsugae, oral cancer, proteomics. ii.

(4) 誌謝終於順利完成論文了，能夠完成要感謝的人太多了，包括我的父母、我的指導老師、口試委員、還有實驗室的學長姐、同學、學弟妹、還有基醫所的同學們、還有很多很多人。感謝父母的支持，我才能無後顧之憂的完成這個學位。感謝高銘欽老師這兩年的指導。感謝口試委員，白壽雄老師、鍾景光老師、蔡士彰老師、莊子超老師，在論文上給我的建議。感謝明翰、漢鵬、傑文、秀學學長和以均學姐在實驗技術上的教導。感謝蛋白質體中心的欣儀、彣欣和玉晴學姊，謝謝你們在質譜儀上的大力幫忙。感謝正祐學長和欣怡，幫忙處理實驗室很多瑣事。感謝雪婷，在我最後寫論文時，幫我很多格式的設定。感謝永旭和涵方，替實驗室帶來很多快樂。感謝國榮，謝謝小游的貼心。感謝映伶、宛霖、孟珣、惠雯、張恆、唯哲、致葳、紋凱和紓涵，謝謝你們幫實驗室很多忙。還有要謝謝基醫所的同學們，雖然我們沒有再同一棟大樓，相處的機會也很少，不過還是要謝謝你們陪伴我這兩年。. iii.

(5) 目錄中文摘要. i. 英文摘要. ii. 誌謝. iii. 表目錄. vii. 圖目錄. viii. 縮寫表. ix. 第一章：緒論. 11. 第一節、研究緣起與目的. 11. 第二節、靈芝(Ganoderma, Reishi, Lingzhi). 13. 壹、靈芝概述. 13. 貳、靈芝之分類、分佈及其外形構造. 13. 參、靈芝之化學組成及其生理功能. 14. 肆、松杉靈芝(Ganoderma tsugae). 16 18. 第三節、蛋白質體學壹、蛋白質體學的定義. 18. 貳、蛋白質體學的研究方法. 18. 參、蛋白質鑑定技術. 20 22. 第二章：材料與方法. 22. 第一節、實驗材料壹、細胞株. 22. 貳、松杉靈芝. 23. 參、化學試劑藥品. 23. 肆、主要器材儀器. 26 27. 第二節、實驗方法 iv.

(6) 壹、松杉靈芝乙醇萃取. 27. 貳、細胞株培養. 28. 參、測量松杉靈芝萃取物對細胞株的生長曲線. 28. 肆、測量松杉靈芝萃取物對細胞株的半數抑制濃度(IC50). 29. 伍、測量松杉靈芝萃取物對細胞株的移動能力 (創傷癒合試驗. 31. Wound closure assay). 31. 陸、測量松杉靈芝萃取物對細胞株的生長週期. 31. 柒、二維凝膠電泳(2-Dimension Gel Electrophoresis). 32. 捌、膠體內蛋白質水解(In Gel Digestion). 36. 玖、介質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜儀(MALDI-TOF/TOF)及資料庫應用. 37. 拾、西方墨點法(Western Blotting). 38 41. 第三章：結果第一節、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株的影響. 41. 壹、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株的生長抑制曲線. 41. 貳、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株的半數抑制濃度(IC50). 41. 參、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株形態的影響. 41. 肆、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株移動能力的影響. 42. 伍、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株生長週期的影響. 42. 陸、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株生長週期蛋白質的影響. 43. 第二節、以二維電泳、質譜分析以及資料庫比對找出松杉靈芝萃取物對口腔 43. 癌細胞株蛋白質表現的影響. 壹、以二維凝交電泳及介質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜分析投予松杉靈芝萃取物後之口腔癌細胞株蛋白質表現的影響. 43. 貳、彙整所有經二維電泳、質譜分析所得的蛋白質. 44. 第三節、應用生物資訊學推測松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞株可能的訊息 v.

(7) 傳遞路徑. 45. 第四節、驗證松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞株的訊息傳遞路徑. 46 48. 第四章：討論第一節、蛋白質體學研究方法討論. 48. 第二節、相同的訊息傳遞路徑圖. 49. 第三節、各別的訊息傳遞路徑圖. 53. 第五章：結論. 57. 第六章：參考文獻. 59. 第七章：圖表. 65. 第一節、表. 65. 第二節、圖. 71 89. 附錄附錄一、台灣地區常見野生靈芝一覽表(許瑞祥教授發表). 89. 附錄二、靈芝的主要成分及其療效. 90. 附錄三、細胞株培養方法. 91. 附錄四、流式細胞儀使用之緩衝液配置. 94. 附錄五、二維凝膠電泳及膠體內蛋白質水解試劑及緩衝液配置. 95. 附錄六、二維凝膠電泳條件. 98. 附錄七、GeneGO Meta CoreTM (version 5.1 build 16271) signaling networks legend. 99. 附錄八、西方墨點法試劑及緩衝液配置. vi. 102.

(8) 表目錄 Table 1.1 經二維電泳、質譜分析篩選所得的蛋白質. 65. Table 1.2 經二維電泳、質譜分析篩選所得的蛋白質. 67. Table 2.1 經二維電泳、質譜分析篩選所得蛋白質之功能分類表. 69. Table 2.2 經二維電泳、質譜分析篩選所得蛋白質之功能分類表. 70. vii.

(9) 圖目錄 Figure 1 實驗流程圖. 71. Figure 2 松杉靈芝萃取物對細胞株生長曲線的測量. 72. Figure 3 松杉靈芝萃取物對細胞株之半數抑制濃度(IC50)測量. 73. Figure 4 松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株形態的影響. 74. Figure 5 松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株移動能力的影響. 75. Figure 6 松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株生長週期的影響. 77. Figure 7 松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株生長週期蛋白質的影響. 79. Figure 8 二維凝膠電泳及膠體影像分析. 81. Figure 9 利用 GeneGO Meta CoreTM (version 5.1 build 16271)繪出各蛋白質之間的相互關係. 83. Figure 10 松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞生長可能訊息傳遞路徑. 84. Figure 11 松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞訊息傳遞路徑之相關蛋白質的變化 86. viii.

(10) 縮寫表 2-DE. Two-Dimensional Gel Electrophoresis. ACN. Acetonitrile. APS. Ammonium persulfate. BSA. Bovine serum albumin. DMSO. Dimethyl Sulfoxide. DTT. 1,4-Dithiothreitol. eIF3S2. Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit I. ENO1. alpha-enolase. EtGt. Ganoderma tsugae Ethanol extracts. FBS. Fetal Bovine Serum. FUMH. Fumarate hydratase. GCR-alpha. Glucocorticoid receptor-alpha. HCCA. Cyano-4-hydroxycinnamic acid. HNF4-alpha. Hepatocyte nuclear factor 4-alpha. hnRNP H1. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1. IC50. The half maximal inhibitory concentration. MALDI-TOF P4HB. Matrix-assisted laser desorption/ionization-Time of flight Protein disulfide-isomerase. PDIA3. Protein disulfide-isomerase A3. PVDF. Polyvinylidene fluoride. RAD23B. UV excision repair protein RAD23 homolog B. SDS-PAGE. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis ix.

(11) TE. Trypsin-EDTA. STIP1. Stress-induced-phosphoprotein 1. TCA. Trichloroacetic acid. TEMED. N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine. TFA. Trifluoroacetic acid. TGF-beta 1. Transforming growth factor beta-1. TGF-beta receptor type II TTC1. Transforming growth factor-beta receptor type-2. PPase. Inorganic pyrophosphatase. PCBP-1. Poly(rC)-binding protein 1. CstF64. Cleavage stimulation factor 64 kDa subunit. G3P2. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. FUBP1. Far upstream element-binding protein 1. TPT1. Translationally-controlled tumor protein. CSDA. Cold-shock domain protein A. eEF1B. Elongation factor 1-beta. GRP78. 78 kDa glucose-regulated protein. GRP75. Stress-70 protein, mitochondrial. Tetratricopeptide repeat protein 1. x.

(12) 第一章：緒論第一節、研究緣起與目的衛生署表示自民國七一年迄今，癌症高居國人十大死因之首，且發生率與死亡率逐年增加，成為國人健康主要的威脅。根據衛生署的統計，自民國八十一年以後口腔癌的發生率及死亡率節節上升超過了鼻咽癌，已成為國人頭頸部癌症的第一位，其死亡率位居於癌症十大死因之六。不僅罹病平均年齡下降，而且每年發現的新病例及死亡人數都已超過千人。許多因素與口腔癌有關，其中最主要的就是嚼檳榔，台灣口腔癌患者中，八成以上有嚼食檳榔的習慣，而好發的部位為頰黏膜及舌。除檳榔外，菸酒亦與口腔癌有密切關係，如同時有嚼檳榔、吸菸及飲酒等習慣者，則得到口腔癌之危險性更高。其他如口腔衛生不佳，長期溫度或化學物質的刺激，齒列不正或不適合的假牙，對舌頭、齒齦或咽頰造成慢性的傷害，口腔粘膜上的白斑，都可能會在一段時間以後產生癌症。口腔癌的治療包括外科手術、放射治療及化學藥物治療，其中手術切除是治療口腔癌最重要的步驟。文獻指出早期(第一、二期) 接受正規適當的治療，3 年的存活率可達 72%，5 年的存活率可有 60%，若是晚期(第三、四期)，則存活率將分別降為 61%及 30%。 11.

(13) 本實驗室多年來即以癌症研究為主軸，早期以基因治療為主，近年來致力於抗癌中草藥研發。傳統中草藥至今已沿用數千年不衰，神奇功效屢有所聞，然而藥方和藥材品質良莠不齊，加以沒有適當的系統研究技術與科學鑑定方法，所以始終無法如西藥般被美國FDA承認而成為流通世界各地的處方藥物。2003年11月耶魯大學藥學教授鄭永齊院士成立中藥全球化聯盟 (Consortium for Globalization of Chinese Medicine, CGCM, http://www.tcmedicine.org)，主旨推動中草藥的全球化，並以輔導廠商取得FDA中草藥新藥核可為目標，因此目前研究中草藥正是時機。本實驗室以松杉靈芝萃取物進行抗癌研究已有多年，目前已證實松杉靈芝萃取物能夠抑制癌細胞的生長，包括卵巢癌、乳癌、肺癌、皮膚癌、口腔癌及大腸直腸癌。其中松杉靈芝萃取物抑制大腸直腸癌細胞生長是使得細胞停止在 G2/M 期(Hsu et al., 2008)；且松杉靈芝萃取物能夠藉由抑制表皮生長因子接受器(EGFR)及血管生長因子(VEGF)，而達到抑制皮膚癌的生長(Hsu et al., 2009)。然而松杉靈芝萃取物抑制其他癌細胞的作用機轉尚未清楚，本論文為了解松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞的作用機轉，利用蛋白質體學技術做進一步的探討。. 12.

(14) 第二節、靈芝(Ganoderma, Reishi, Lingzhi) 壹、靈芝概述依據古書《神農本草經》記載，將三百六十五種草根、木、皮、動物、石、生藥依其效能分類為「上藥」、「中藥」、「下藥」等三部分，將靈芝分在上品類藥中之最高品，地位比人參還高，所謂「上藥」乃指「以養命為目的，無毒，長期服用，不具副作用。此等藥材能輕身、滋補元氣、防止老化，並有延命的效果」，因而又被稱為「瑞草」、「仙草」，日本則稱之為「吉祥茸」。. 貳、靈芝之分類、分佈及其外形構造 1979 年 Alexopolus 所建立的真菌分類系統中，靈芝應是屬於真菌界 (Myceteae) 、無鞭毛菌門（ Amastigomycota ）、擔子菌綱 (Basidiomycetes) 、無蕈褶目（ Aphyllophorales ）、多孔菌科 (Polyporaceae)中的靈芝屬（Ganoderma）。而台大農化系許瑞祥教授將現行台灣地區常見之野生靈芝分為八大類，分別是樹舌靈芝、台灣靈芝、拱狀靈芝、靈芝、熱帶靈芝、小孢子靈芝、松杉靈芝、新日本靈芝。靈芝一般生長在濕度高且光線昏暗的山林中，因此世界上靈芝主要分布在亞、澳、非及美洲的熱帶及亞熱帶，溫帶地區則少見。. 13.

(15) 靈芝不是植物，自身不能進行光合作用，主要生長在腐樹或是其樹木的根部，只能從其他有機物或是腐樹中攝取養料，少數種類對寄主的要求比較專一。靈芝的外形主要由堅硬的菌蓋(pileus)所構成，有些種類會長出菌柄(stipe)托住菌蓋，有些則缺乏。菌蓋的切面圖自上而下可分為三部份，分別為菌蓋皮殼(crust)、菌肉層(context)及菌管層(tube)。菌蓋形狀、色澤與紋路，菌肉的顏色與構造，菌管的長短、顏色，菌管口的大小、形狀、密度等，都是區分靈芝種類的參考指標。. 參、靈芝之化學組成及其生理功能靈芝的主要成分包括高分子多醣體(polysaccharides)、三萜類 (triterpenes) 、腺苷(adenosine)、生物鹼(alkaloids)及微量元素(trace element)等。現代醫學研究顯示，靈芝的多種生理活性物質，其功效有，能夠增強機體免疫功能、有解驚、安神、解毒等功效、可有效降低抗生素的毒副作用、可輔助治療腫瘤、可顯著增強人體免疫功能、提高機體的抗病能力及靈芝孢子能夠抑制腫瘤細胞生長，提高晚期腫瘤患者免疫力。以下簡介靈芝的主要化學成分及其生理功效。. 一、多醣體(polysaccharides) 多醣體為靈芝的主要成分之一，水溶性高，主要以β(1→3)主鏈 14.

(16) 及 (1 → 6) 支鏈結構組成，又稱為 β−glucan ，人體內並沒有分解 β−glucan 的酵素，因此不易被分解，並在體內發揮多種生理功能。多醣體分子量大，一般並無法進到細胞裡，然而它卻能發揮功效，中研院翁啟惠院士的研究團隊指出，靈芝多醣扮演的是一個訊號傳遞者的角色，它可以透過巨噬細胞表面的 TLR4 受體啟動免疫反應，並沒有直接進到細胞裡面，且靈芝多醣體作用的受體(receptor）不只一個。Ma et al. (2009)指出，靈芝多醣體可以修復 Cyclophosphamide 所導致的毒性及免疫抑制作用。. 二、三萜類(triterpenes) 三萜類化合物為靈芝另一主要成分，為靈芝苦味的來源，又稱為靈芝酸，主要存在於靈芝子實體當中。萜類為多個 C5 的異戊二烯單元(isoprenoids)所組成之天然物，由六個異戊二烯單元所組成之具有三十個碳原子之構造及稱為三萜類。 Chen et al. (2009)指出，靈芝乙醇萃取物對 Hep 3B 細胞有細胞毒性，且隨著劑量的增加和時間的增長，細胞毒性愈明顯；為了進一部探測有效成分為何，作者初步做了分離，發現有效成分在第六個分層；接著作者使用高效液相層析儀分離出兩個有效物質，分別為 9,11-dehydroergosterol peroxide [9(11)-DHEP]及 ergosterol peroxide. 15.

(17) (EP)。Liu et al. (2009)也指出，靈芝乙醇萃取物可以藉由細胞凋亡及生長週期停滯而達到抗腫瘤(MDA-MB-231)增生的能力。靈芝乙醇萃取物能夠抑制前列腺細胞癌的生長(Liu et al., 2009)。Wang et al. (2009)指出，靈芝三萜類可以抑制 platelet-derived growth factor (PDGF)-BB 所活化的 hepatic stellate cells (HSCs)增生，藉由抑制 PDGF beta Receptor 的磷酸化，因而可以有效避免或治療肝纖維化。. 三、其他成分研究指出，靈芝所含的腺苷(adenosine)具有抗血小板凝集的作用(Shimizu et al., 1985) ，降低血液粘度，可防止血栓的形成，預防動脈硬化。而由靈芝菌絲體中分離出的小分子蛋白質 LZ-8，具有免疫調節的功能(van der Hem et al.,1996)；除此之外，Lin et al. (2009) 在近期指出，LZ-8 可以藉由 NF-B 及 MAPK 訊息傳遞路徑，使得單核白血球分化出來的樹突細胞活化及成熟。Wu et al. (2009)指出，靈芝水萃取物(glycopeptides)能夠清除過氧化物自由基，可做為天然的抗氧化劑。. 肆、松杉靈芝(Ganoderma tsugae) 本實驗室所使用之松杉靈芝粉末，是由中國文化大學陳精祥教. 16.

(18) 授所栽培提供(羅桂英菌種場，桃園縣青溪里光文街 55 號)。依據台大農化系許瑞祥教授之發表，台灣常見之靈芝可分為八大類，其中松杉靈芝之菌柄為紅褐色或紫褐色，菌蓋為腎形近扇形，孢子之大小為 9-11 X 6-8 μm，寄生在針葉樹或闊葉樹，俗名為高山赤芝、赤芝。松杉靈芝最早的研究是始於 1992 年，Won 等人指出，松杉靈芝能夠提高脾臟的自然殺手細胞和血清中的干擾素。除此之外，松杉靈芝能夠使 Hep 3B 細胞停止在 G2/M 期，且能使細胞凋亡(Gan et al., 1998)；能夠抗氧化(Mau et al., 2002)；能夠抗發炎(Ko et al., 2008)。 Wang et al., 1993, Zhang et al., 1994, Yue et al., 2006, 相繼指出，松杉靈芝能夠抗癌。本實驗室對大腸直腸癌及皮膚癌有初步的研究，發現松杉靈芝萃取物能抑制大腸直腸癌細胞生長，使得細胞停止在 G2/M 期(Hsu et al., 2008)；且松杉靈芝萃取物能夠藉由抑制表皮生長因子接受器(EGFR)及血管生長因子(VEGF)，而達到抑制皮膚癌的生長(Hsu et al., 2009)。對於抑制口腔癌細胞株的作用機轉尚未完全解開，本論即以此做進一步的研究。. 17.

(19) 第三節、蛋白質體學壹、蛋白質體學的定義基因體學的研究在人類基因體被解開後，可以說是達到了頂峰。基因體學的研究主要是基因在染色體上的分佈有無變異，即在不同生理情況下的表現。為了處理這龐大的資料，生物資訊學隨之而產生。基因主要再於四個鹼基的相互配對，他們之所以會對人類細胞產生影響，只要在於 DNA 會轉譯成 mRNA 接著在轉錄成蛋白質，因而蛋白質的研究，可以說是繼基因體研究之後必須走的道路。蛋白質體學是研究多種蛋白質組成的系統，往往是分析一段序列、再藉由資料庫的比對，推測出它的特性，換句話說，蛋白質體學的焦點，放在「系統」的行為，而不是「單一組成」的行為(Daniel et al., 2002)。. 貳、蛋白質體學的研究方法蛋白質體學的研究方法主要分三大部分，待測蛋白質的分離 (Analytical protein separations)、蛋白質的分解(Protein digestion)、質譜儀的分析和資料庫的搜尋(MS analysis and database searching)。蛋白質的分離有很多種方式，像是一維電泳、二維電泳，或者是高效液相層析法、免疫沉澱法等方式。本實驗所使用的是二維電. 18.

(20) 泳方式，將蛋白質進行分離，第一維先進行等電點聚焦，利用蛋白質具有不同等電點的特性，使蛋白質在不同 pH 梯度膠中移動分離；接著再利用分子量大小不同進行分離。研究者可以在二維電泳膠上同時分析數百個至數千個蛋白質，比起傳統的蛋白質電泳技術解析度甚好，並且可以快速的比較性質相近的細胞或組織在受到不同環境壓力之下的蛋白質差異表現，並可回到基因的層次進行操縱與調控(Klose et al., 1995)。目前二維電泳技術已經廣泛應用在動植物與醫藥研發上的應用，不只限於人類的蛋白質片段，許多物種均有所應用，像是細菌、病毒、酵母菌和其他更高等有機體(Costello et al., 1997)。蛋白質的分解部份，由於質譜儀和資料庫搜尋最適合的胺基酸為 6 到 20 個胺基酸，因此要將待測蛋白質送進質譜儀之前，需要做酵素切割的動作，將蛋白質切成胜肽片段，以利儀器做出正確的判斷。將蛋白酶切割出的胜肽產物送入質譜儀，可測出胜肽的質量，經過資料庫的搜尋比對，即可得知蛋白質有可能為何。除此之外，透過質譜的分析可以得知胺基酸的序列為何，進而獲得簡單的蛋白質結構，像是雙硫鍵的存在、轉錄後的磷酸化、糖化、乙醯化的修飾等。知道待測蛋白質的組成和一些結構的資訊後，便能推測它可. 19.

(21) 能具有的功能。. 參、蛋白質鑑定技術一、埃德曼 Edman sequencing (Edman et al., 1967) 為傳統的方法，其原理主要是蛋白質經由 N 端水解，再經由液相層析法讀取胺基酸序列。雖此法已沿用許久，但有期限制所在，每次定序以不超過 13 個胺基酸為限，除此之外，若蛋白質的 N 端帶有共價修飾的官能基 (acetylation 、 phosphorylation 、 formylation……)，就很難判別出正確的胺基酸。此法雖仍用以今日的蛋白質定序，但如需大量分析，就以不敷使用(Gevaert et al., 2000)。. 二、蛋白質質譜儀鑑定質譜(Mass spectrometry)的發明，帶給了研究蛋白質的人無限的希望。質譜讓我們利用分子的質量快速的鑑定出一個試樣中的化合物結構，這項技術早就被化學家運用在小型與中型的分子鑑定工作上，這項工具靈敏到能探察非常少量的分子。然而從前對於質譜的運用僅在於小分子，對於像蛋白質這樣大的分子是一籌莫展；因為在進行質譜分析時，必須將分子氣化及帶上電荷。對於較小的分子而言，並不是相當困難，然而對於大的生物分子（如蛋白質分子），. 20.

(22) 要將分子氣化及帶電，同時不能傷害分子的完整性，就不是一件容易的事了。拜 2002 年的三位諾貝爾化學獎得主所賜(John B. Fenn; Koichi Tanaka; Kurt Wüthrich)將質譜的技術做最有效率的用，且突破了小分子及固液相的限制，成功的運用這種技術於蛋白質的研究上。. 現今有兩種做法能使得蛋白質轉變為氣態離子而不會改變其結構與形體。其中由 John B. Fenn (1994)所發展的方法是運用一個很強的電場將試樣噴灑出去(electrospray ionisation)，而產生一個個帶電荷並能自由飛翔的離子。另一種方式 Koichi Tanaka (1998)所提出，是運用一個強烈的雷射脈衝，在適當的條件下(視能量，與試樣的結構和化學環境而定)運作，試樣可接受雷射脈衝的能量而被釋放成為自由的離子 (matrix assisted laser desorption ionisation)。. 二維電泳的蛋白質分離技術廣泛被應用，使研究者可以快速的篩選出具差異性的蛋白質，新的蛋白質研究領域結合分子生物技術與電腦資訊，更可以幫助科學家了解疾病的過程。此為強而有力的技術，因此本論文以其為工具，探討松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞生長的作用機轉。. 21.

(23) 第二章：材料與方法第一節、實驗材料壹、細胞株細胞株名稱. HSC-3 (有高度轉移能力). 菌種中心編號. JCRB0623. 組織來源. 人類，舌頭，麟狀上皮細胞癌，男性，64 歲. 冷凍批號. Lot-09032003. 培養基. MEM 細胞培養液，含有 10%胎牛血清. 培養條件. 37°C，5% CO2. 細胞株名稱. SCC-4. 菌種中心編號. BCRC60142. 組織來源. 人類，舌頭，麟狀上皮細胞癌，男性，55 歲. 冷凍批號. Lot-01559. 培養基. DMEM/F12 細胞培養液，含有 10%胎牛血清. 培養條件. 37°C，5% CO2. 22.

(24) 貳、松杉靈芝由中國文化大學陳精祥教授所栽培提供(羅桂英菌種場，桃園縣青溪里光文街 55 號)。. 參、化學試劑藥品 1. 下列產品購自美國 Amresco 公司： Tris (Cat. no. 0826-1kG) Agarose (Cat. no. 0710-250G) TEMED (Cat. no. 0761-25ML) 2. 下列產品購自美國 J.T.Baker 公司(友和代理)： Urea (Cat. no. 4204-01) Glycerol (Cat. no. 2136-01) Glycine (Cat. no. 4059-02) 2-Propanol (Cat. no. 9084-03) Ammonium persulfate (APS) (Cat. no. 0762-01) Sodium chloride (NaCl) (Cat. no. 3624-05) HEPES (Cat. no. 4018-04) Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) (Cat. no. 3003-01) Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Cat. no. 9224-03) Ethanol (Cat. no. 8006-05) Acetonitrile (ACN) (Cat. no. 9017-03) Acetic acid, Glacial (Cat. no. 9508-03) 3. 下列產品購自美國 SIGMA 公司(友和代理)：. 23.

(25) CHAPS (Cat. no. C9426-5G) Iodoacetamide (IAA) (Cat. no. I1149-25G) 2-Mercaptoethanol (2-ME) (Cat. no. M3148-100ML) Bovine serum albumin (BSA) (Cat. no. A2153-50G ) Phosphatase Inhibitor Cocktail (Cat. no. P2850) Protease Inhibitor Cocktail (Cat. no. P8340) Propidium iodide (PI) (Cat. no. D4170) 4. 下列產品購自美國 BIO-RAD 公司： 40% Bio-Lyte 3/10 Ampholyte (Cat. no. 163-1113) Mineral oil (Cat. no. 163-2129) 30% Acrylamide/Bis (37.5:1) (Cat. no. 161-0158) Bradford protein assay dye (Cat. no. 500-0006) ReadyStrip IPG strips (Cat. no. 163-2007(pH3-10)， 163-2009(pH3-10NL)，163-2008(pH4-7)) 5. 下列產品購自日本 Wako 純藥工業株式會社(友和代理)： Sodium dodecyl sulfate (SDS) (Cat. no. 196-08675) Tween-20 (Cat. no. 167-1151) 6. 下列產品購自美國 Mallinckrodt chemicals 公司(友和代理)： Anhydrous Methyl Alcohol (Cat. no. 3041-68) 7. 下列產品購自瑞士 Roche 公司： Protease inhibitor cocktail tablet (Cat. no. 11836.153.001) 8. 下列產品購自 Visual protein(友和代理)： VisPro (Cat. no. VP1001-500) 24.

(26) 9. 下列產品購自 BIOSYNTHAG 公司(友和代理)： 1,4-Dithiothreitol (DTT) (Cat. no. D8200) 10. 下列產品購自 GIBCO 公司(量子代理)： 0.25% (1X) Trypsin-EDTA (Cat. no. 25200-072) Trypan blue (0.4%) (Cat. no. 15250-016) DPBS (Cat. no. 21600-010) 11. 下列產品購自 Hyclone 公司(岑祥代理)： STANDARD Fetal bovine serum (FBS) (Cat. no. SH30088.03) DMEM/F-12 1:1 (Cat. no. SH30023.02) 12. 下列產品購自德國 Riedel-de Haën 公司： Magnesium chloride (MgCl2) (Cat. no. 31413) Trifluoroacetic acid (TFA) (Cat. no. 61030) 13. 下列產品購自德國 MERCK 公司： Potassium chloride (KCl) (Cat. no. 1.04936.1000) 14. 下列產品購自瑞士 Fluka 公司： NP-40 (Cat. no. 74385) 15. 下列產品購自美國 Promega 公司(勁因代理)： Sequencing Grade Modified Trypsin (Cat. no. V5111) 16. 下列產品購自法國Fermentas公司： PageRulerTM Prestained Protein Ladder Plus (Cat. no. SM1811) PageRulerTM Unstained Protein Ladder Plus (Cat. no. SM0661) 17. 下列產品購自Abcam公司(量子代理)： Calreticulin antibody (Cat. no. ab2907) 25.

(27) ERp57 antibody [MaP.Erp57] (Cat. no. ab13506) STIP1 antibody (Cat. no. ab37752) Rabbit polyclonal to chicken IgY-H&L (HRP) (Cat. No. ab6753) 18. 下列產品購自Cell signaling公司(細胞科技代理)： Anti-rabbit IgG HRP (Cat. No. 7074) Biotinylated protein ladder detection pack (Cat. No. 7727) 19. 下列產品購自Santa cruz公司(弘晉代理)： Anti-mouse IgG HRP (Cat. No. sc-2005) GRP78 antibody (Cat. No. sc-13539) α-Enolase antibody (Cat. No. sc-100812) Rad23B antibody (Cat. No. sc-49042) Cyclin A antibody (Cat. No. sc-751) Cyclin B1 antibody (Cat. No. sc-752) Cyclin D1 antibody (Cat. No. sc-718) Cyclin E antibody (Cat. No. sc-247) P21 antibody (Cat. N0. sc-397) P27 antibody (Cat. No. sc1641) 20. 下列產品購自Calbiochem公司(默克代理)： Mouse anti-actin monoclonal antibody (Cat. No. MAB1501). 肆、主要器材儀器 1. 二氧化碳培養箱：MCO-20AIC, SANYO Electric Biomedical Co, Ltd 2. 恆溫水浴槽：B206-T2, FirStek Scientific, USA 26.

(28) 3. 倒立式顯微鏡：OLYMPUS CK2 4. 水流抽氣機：AS-1, EYELA, Japan 5. 恆溫循環水槽：NCB-1200, EYELA, Japan 6. 冷凍離心機：AllegraTM X-22R Centrifuge, Beckman Coulter, Inc 7. 電泳供應器：Bio-Rad Laboratories 8. 等電點聚焦電泳設備：PROTEAN IEF Cell, Bio-Rad Laboratories 9. SDS-PAGE 兩片式電泳設備：PROTEAN II xi 2-D Cell, Bio-Rad Laboratories 10. 電源供應器：Amersham Biosciences Electrophoresis Power Supply EPS 1001 11. 二維電泳膠體掃瞄器：EPSON PERFECTIONTM 4990 PHOTO 12. 介質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜儀：MALDI-TOF/TOF, Bruker Daltonics UltraFlexIII, ImagePrep 13. 分析天平：AL104, Mettler-Toledo International Inc. 14. 流式細胞分析儀：FACSCanto, BD Biosciences. 第二節、實驗方法壹、松杉靈芝乙醇萃取 1. 秤取松杉靈芝粉末，25 g 溶於 2500 mL 無水乙醇。 2. 室溫震盪，overnight。. 27.

(29) 3. 抽氣過濾兩次，將靈芝粉末不溶的顆粒濾除，保留澄清濾液。 4. 利用減壓濃縮原理，將濾液的溶媒蒸發，得到濃稠膠狀的靈芝乙醇萃取物。 5. 秤取所得的靈芝乙醇萃取物，每 100 mg 靈芝乙醇萃取物以 1 mL 無水乙醇回溶。 6. 回溶的靈芝乙醇萃取物通過 0.22 μm 濾膜，分裝於微量離心管，. -20°C 冷藏。. 貳、細胞株培養 (詳見附錄三，參照「高銘欽教授實驗室細胞培養標準操作程序」，編撰者：李宜臻) ㄧ、解凍細胞株標準操作程序二、繼代培養細胞株標準操作程序三、冷凍細胞株標準操作程序. 參、測量松杉靈芝萃取物對細胞株的生長曲線 1. 24 孔盤分別種入 7.5*106 cells/well (HSC-3)及 4.5*106 cells/well (SCC-4)。 2. 第二天取 DPBS 及 10% EtOH in DPBS 及各種(3 種)不同濃度的松杉靈芝乙醇萃取物(0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL)100 μL 加 28.

(30) 入。 3. 經反應 12、24、48、72 小時後，加入 0.5 mL trypsin-EDTA，然後至於恆溫培養箱中作用。 4. 加入 0.5 mL 含 10% FBS 之細胞培養液中和 trypsin-EDTA 活性並且將細胞打下。 5. 以 hemocytometer 計算細胞的數目。. 肆、測量松杉靈芝萃取物對細胞株的半數抑制濃度(IC50) 一、細胞密度(cell density)之測試 1. 96 孔盤之上下兩列為空白組(blank)，只注入 180 μL 細胞培養液。 2. 其餘每兩排注入不同數量之細胞數(在 180 μL 細胞培養液內)，分別為 2000 顆、4000 顆、6000 顆、8000 顆、10000 顆、12000 顆，細胞數少的靠外側，細胞數多的靠內側。 3. 第二天每個 well 各加入 20 μL DPBS。 4. 72 hr 後，每個 well 各加入 20 μL MTT，再將 96 孔盤放入恆溫培箱。 5. 約 3~4 hr 後，將 96 孔盤取出，吸取上清液 170 μL。 6. 再加入 200 μL DMSO 溶劑。 7. 以水平震盪器搖晃 5 分鐘之後，讀取吸光值(545 nm-690 nm)。. 29.

(31) 8. 將過換算，即可獲得最適合之細胞密度。. 二、細胞半數致死劑量(IC50)之測試 1. 96 孔盤分為兩個區塊，左邊為 HSC-3，右邊為 SCC-4。 2. 上下兩列為空白組(blank)，只注入 180 μL 細胞培養液；其餘注入 2000 cells/180 μL 細胞培養液。 3. 第二天，取各種(5 種)松杉靈芝乙醇萃取物濃度 20 μL，低濃度在外，高濃度在內，加入每個 well 當中；其中第六排之上半部加入 20 μL 松杉靈芝乙醇萃取物溶媒；第六排之下半部加入 20 μL DPBS。 4. 72 hr 後，每個 well 各加入 20 μL MTT，再將 96 孔盤放入恆溫培箱。 5. 約 3~4 hr 後，將 96 孔盤取出，吸取上清液 170 μL。 6. 再加入 200 μL DMSO 溶劑。 7. 以水平震盪器搖晃 5 分鐘之後，讀取吸光值(545 nm-690 nm)。 8. 將過換算，即可獲得松杉靈芝萃取物對細胞株半數抑制濃度. (IC50)。. 30.

(32) 伍、測量松杉靈芝萃取物對細胞株的移動能力 (創傷癒合試驗 Wound closure assay) 1. 於六孔盤種入 2*105 cells/well(全滿)。 2. 第二天，抽掉細胞培養液，改用不含血清的細胞培養液。 3. 第三天，配置含有不同濃度松杉靈芝乙醇萃取物的細胞培養液(不含血清)。 4. 顯微鏡觀察 6 孔盤內細胞生長狀況，確定細胞生長及形態正常，抽掉細胞培養液(留下少許細胞培養液在 well 中)。 5. 用 p200 tip 在每個 well 中劃出一道中分線(wound)，並於上方做記號(作為每次顯微鏡觀察位置的基準)。 6. 用 DPBS 將每個 well 輕沖之後洗去。 7. 加入含有不同濃度松杉靈芝乙醇萃取物的細胞培養液，將 6 孔盤放入恆溫培養箱。 8. 於不同時間點用顯微鏡觀察每個 well 中創傷(wound)癒合的情況，並照相。 9. 根據照片來分析不同濃度松杉靈芝乙醇萃取物對細胞株創傷癒合的影響。. 陸、測量松杉靈芝萃取物對細胞株的生長週期 1. 將收集下來的細胞加入 5 mL 75%乙醇後混合均勻，置入-20°C 冰 31.

(33) 箱冷凍至隔天。 2. 以 2000 rpm 於 4°C 離心 5 分鐘，之後移除上清液。 3. 將 5 mL 含有 1% FBS 之 PBS 沖洗細胞兩次，每次以 2000 rpm 於 4°C 離心 5 分鐘，之後移除上清液。 4. 加入 0.5 mL DNA extraction solution 後均勻混何，於室溫下反應 5 分鐘。 5. 以 2000 rpm 於 4°C 離心 10 分鐘，之後移除上清液。 6. 加入 0.5 mL PI staining buffer，於室溫下反應 30 分鐘。 7. 進行 FACS 分析。. 柒、二維凝膠電泳(2-Dimension Gel Electrophoresis) (參考：王以均， 2007). 一、樣品製備(Sample preparation) 1. 將細胞收成 pellet。 2. 加入 pellet 體積約三倍的 2-DE lysis buffer (使用前加入 Bio-Lyte 3-10 Ampholyte，及 50 mM DTT)。 3. 強烈震盪並置於-20°C 冰箱 30 分鐘。 4. 離心，13000 rpm，4°C，20 分鐘。 5. 取上清液。 6. 加入 10%TCA/Acetone(使用前加入 20 mM DTT)，vortex。 32.

(34) (10%TCA/Acetone 與 protein sample 的體積比為 9:1) 7. 使蛋白質在-20°C 沉澱 2 hr。 8. 離心，13000 rpm，4°C，10 分鐘。 9. 用 P200 將上清液盡量移除。 10. 加入冰 Acetone(使用前加入 20 mM DTT)500 μL，vortex。 11. spin down。 12. 用 P200 將上清液盡量移除。 13. 重覆步驟 10-12 三次。 14. 使沉澱下來的蛋白質 air dry。 15. 加入適量的 2-DE lysis buffer ( 使用前加入 Bio-Lyte 3-10 Ampholyte，及 50 mM DTT)回溶。 16. 震盪 30 分鐘。 17. 離心，13000 rpm，4°C，10 分鐘。 18. 取上清液。 19. Bradford 蛋白質定量，Standard curve R2≧0.99。 20. 取已定量好的蛋白質 200 μg，加入適量的 2-DE lysis buffer (使用前加入 Bio-Lyte 3-10 Ampholyte，及 50 mM DTT)使體積補足至 320 μL。. 33.

(35) 二、一維等電點聚焦電泳(Isoelectric Focusing) 1. 將 strip 從-20°C 取出回溫。 2. 用去離子水沾溼濾紙片，置於 IEF focusing tray 兩旁的電極線，輕壓使濾紙片和電極線密合無氣泡。 3. 取 300 μL 蛋白質樣品溶液，均勻加入等電點聚焦盤中，切勿有氣泡。 4. 用鑷子撕去 strip 表面上的塑膠片，將膠面朝下，標有 pH 值得一端朝正極，覆於蛋白質樣品溶液上，切勿有氣泡。 5. 加入 2 mL 礦物油。 6. 等電點聚焦盤置於 PROTEAN IEF cell，開始進行 rehydration 及蛋白質等電點聚焦。 7. 結束後，用去離子水清沖洗膠背面，用試鏡紙吸去多餘水分、礦物油。. 三、SDS-聚炳烯膠體電泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis) 1. 配膠(10% acrylamide gel)，可先暫存於 4°C，使用之前回溫。 2. Overlay agarose 用水浴加熱溶解，將膠的底部補平。 3. 將 strip 膠面朝下，置於 rehydration/equilibration tray ，加入 equilibration buffer I (4 mL/strip)。. 34.

(36) 4. 搖晃 20 分鐘。 5. 用去離子水沖洗 strip 背面，試鏡紙吸去多餘水分，膠體朝下放入另一格。 6. 加入 equilibration buffer II (4 mL/strip)。 7. 搖晃 20 分鐘。 8. 將些許 running buffer 加入兩玻璃間，以利 strip 滑入。 9. 倒去 running buffer，用擦手紙將多餘的水分移除。 10. 濾紙片沾 5 μL 的 protein ladder，放於 strip 旁。 11. 用 overlay agarose 進行封膠。 12. 設定冷卻循環水槽於 10°C。 13. 跑膠. 四、膠體內蛋白質固定(Gel Fixation) 1. 跑完膠後，將膠取下。 2. 泡於 fixation buffer，overnight。 3. 用去離子水 wash，15 分鐘，至少三次。. 五、膠體染色(VisPRO 5 minutes Protein Stain Kit) 1. 將膠泡在 50 mL Solution (1)搖晃 20 分鐘，倒掉 Solution (1)。 2. 用去離子水洗兩次，倒掉去離子水。 35.

(37) 3. 加入 50 mL Solution (2)，用手劇烈搖晃，直至膠體呈現白色，倒掉 Solution (2)。 4. 用去離子水洗兩次，倒掉去離子水。 5. 將膠體掃瞄存檔。 6. 用 PE 保鮮袋將膠體加入少取去離子水密封，存於 4 ºC。. 捌、膠體內蛋白質水解(In Gel Digestion) 一、清洗膠體(Washing of gel pieces) 1. 將膠體取出，以去離子水清洗，10 分鐘，三次。 2. 將 blue tip 尖端截去，挖取有興趣的 spots，放入微量離心管。 3. 加入 100 μL 的 50% ACN/25 mM Ammonium bicarbonate，震盪 15 分鐘。 4. spin down。 5. 去除液體。 6. 重覆步驟 3-5 一次。. 二、脫水(Dehydrate) 1. 加入 100 μL 的 ACN，震盪 5 分鐘。 2. spin down。 3. 去除液體。 36.

(38) 4. air dry(直至膠體變成白色粒狀，能在微量離心管彈跳)。. 三、胰蛋白酶水解(Digestion) 1. 加入 2 μL 的 Trypsin solution(20 ng/μL in 25 mM Ammonium bicarbonate)。 2. 於 4°C 靜置 1hr。 3. 加入 2 μL 的 25 mM Ammonium bicarbonate。 4. 置於 37°C，overnight。. 四、蛋白質萃取(Extract) 1. 加入 2 μL 的 1% TFA/100% ACN。 2. 超音波震盪 10 分鐘。 3. spin down。 4. 取上清液。. 玖、介質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜儀(MALDI-TOF/TOF) 及資料庫應用 1. 取 0.5 μL sample，輕點於 target 中央，待 sample 自然風乾後，再點 0.5 μL HCCAmatrix 於 sample 上，自然風乾。 2. Mascot 資料庫搜尋設定 37.

(39) Taxonomy：Homo sapiens (human) Database：NCBInr Enzyme：Trypsin Global Modifications：Carbamidomethyl (C) Variable Modifications：Oxidation (M) Missed cleavage <=1 Mass Tol. MS：100 ppm MS/MS Tol ：0.8 Da. 拾、西方墨點法(Western Blotting) 一、樣品製備(Sample preparation) 1. 將細胞收成 pellet。 2. 加入約與 pellet 體積等量的 HEPES/NP-40 cell lysis buffer(使用前加入 Protease Inhibitor Cocktail, Na3VO4, Phosphatase Inhibitor Cocktail)。 3. 強烈震盪並置於冰上-20°C 冰箱 30 分鐘。 4. 離心 13,000 rpm，4 ºC，15 分鐘。 5. 取上清液。Bradford 蛋白質定量，Standard curve R2≧0.99。 6. 取已定量好的蛋白質樣品, 加適量 HEPES/NP-40 lysis buffer 及 2X sample buffer，將各樣品的蛋白質含量及體積調為一致。 38.

(40) 7. 水浴法將 Sample 沸煮 3~5 分鐘，待樣品自然冷卻後再置於-20 ºC 儲藏。. 二、製膠 (可暫存於 4ºC) 凝集膠：5 % acrylamide gel 分離膠：10-12 % acrylamide gel. 三、跑膠上膠：70V，30 分鐘下膠：110V，90 分鐘. 四、蛋白質轉漬 (transfer) 75V，3.5 小時. 五、Immunoblotting 1. 將轉漬完成的 PVDF 膜泡入 5% 脫脂奶粉 (in TBST)中，室溫下搖晃 1 個小時 (或 4 ºC overnight)。 2. 取出 PVDF membrane，泡入 TBST，搖晃 5 分鐘，三次。 3. 取出 PVDF 膜，再泡入含有一級抗體的 5% BSA in TBST 中， 4 ºC overnight。. 39.

(41) 4. 取出 PVDF 膜，泡入 TBST，搖晃 5 分鐘，三次。 5. 取出 PVDF 膜，再泡入含有二級抗體的 5% 脫脂奶粉 in TBST 中，室溫下搖晃 1 小時。 6. 取出 PVDF 膜，泡入 TBST，搖晃 5 分鐘，三次。 7. 底片壓片，分析。. 40.

(42) 第三章：結果第一節、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株的影響壹、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株的生長抑制曲線如圖 2 所示，兩株細胞在投予松杉靈芝萃取物(0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL)，分別於 12、24、48、72 小時，利用 trypan blue 算其細胞總數，結果顯示出隨著給予松杉靈芝的劑量增加，或者是隨著時間的增長，細胞生長速率明顯比控制組來的慢。. 貳、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株的半數抑制濃度(IC50) 利用 MTT assay 得知，如圖 3 所示，松杉靈芝萃取物對 HSC-3 細胞株之 IC50 為 100 μg/mL，對 SCC-4 細胞株之 IC50 為 250 μg/mL。其原理為 MTT 會和活細胞的粒線體琥珀酸脫氫酶反應，而產生藍色結晶，最後再用 DMSO 將藍色結晶回溶，測其吸光值經過換算即可得知松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株之抑制濃度為何。. 參、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株形態的影響如圖 4 所示，兩株口腔癌細胞株原本形態規則，飽滿，排列緊密。投予松杉靈芝萃取物後(2 倍 IC50，24 hr)，HSC-3 細胞形態呈現尖細，挾長不規則狀；SCC-4 細胞株旁出現很多小碎片般的殘骸。. 41.

(43) 將這些細胞收集，利用二維凝膠電泳、及質譜分析以及資料庫比對，找出松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株蛋白質表現的影響。. 肆、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株移動能力的影響創傷癒合試驗結果如圖 5 所示，HSC-3 細胞株為高轉移能力的細胞株，經過 24H 後，控制組的傷口已經完全癒合；然而在處理松杉靈芝萃取物(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL)後，傷口沒有癒合的狀況。SCC-4 細胞株經過 48H 後，控制組的傷口完全癒合；然而處理松杉靈芝萃取物(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL)組，傷口沒有癒合的狀況。由此可知松杉靈芝萃取物會抑制口腔癌細胞株 HSC-3 & SCC-4 傷口癒合速率，表示可能降低口腔癌細胞株 HSC-3 & SCC-4 移動能力。. 伍、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株生長週期的影響如圖 6 所示，口腔癌細胞株 HSC-3 投予松杉靈芝萃取物(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL)，SCC-4 投予松杉靈芝萃取物(0.25 mg/mL、0.5 mg/mL)，24 小時後，將細胞收下固定，進行 FACS 分析，結果顯示出投予松杉靈芝萃取物後細胞明顯的停止在 G2/M 期，且隨著加藥濃度越高，停止在 G2/M 期的細胞數越多。. 42.

(44) 陸、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株生長週期蛋白質的影響口腔癌細胞株 HSC-3 投予松杉靈芝萃取物(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL)及 1% EtOH 當做控制組；SCC-4 投予松杉靈芝萃取物(0.25 mg/mL、0.5 mg/mL) 及 1% EtOH 當做控制組，24 小時後將細胞收下，取 60 μg 蛋白質利用西方墨點法做生長週期相關蛋白質的影響。如圖 7 所示(7a 為 HSC-3 細胞株，7b 為 SCC-4 細胞株)， cyclin A、cyclin B 在處理松杉靈芝萃取物後有下降的趨勢，且隨著加藥濃度越高，下降趨勢越明顯。 P21、 P27 在處理松杉靈芝萃取物後有上升的趨勢，且隨著加藥濃度越高，上升趨勢越明顯。. 第二節、以二維電泳、質譜分析以及資料庫比對找出松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株蛋白質表現的影響壹、以二維凝交電泳及介質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜分析投予松杉靈芝萃取物後之口腔癌細胞株蛋白質表現的影響一開始先利用 pH3-10L 的等電點 pH 梯度膠來進行二維凝膠電泳，目的是要觀察大部份蛋白質落再哪些等電點區域內，結果得知大部分的蛋白質都落在 pH4-8 內。因此再進一步利用 pH3-10NL 及 pH4-7L 將大部份的蛋白質分離開來，如圖 7 所示。利用 PDQuest 分析軟體分析差異點，在 HSC-3 細胞株中找到 56. 43.

(45) 個差異點(34 個點表現量上升，22 個點表現量下降)；SCC-4 細胞株中找到 49 個差異點(11 個點表現量上升，38 個點表現量下降)。將分析所得的差異點擷取下來，進行膠體內蛋白質水解，利用 MALDI-TOF/TOF 分析，及 MASCOT 資料庫比對，在 HSC-3 細胞株中鑑定出 42 個蛋白質差異點(23 個點表現量上升，19 個點表現量下降)，詳見表 1.1；在 SCC-4 細胞株中鑑定出 33 個蛋白質差異點(7 個點表現量上升，26 個點表現量下降)，詳見表 1.2。. 貳、彙整所有經二維電泳、質譜分析所得的蛋白質匯整經二維電泳、質譜分析所得的蛋白質，HSC-3 細胞株中鑑定出 42 個蛋白質差異點，將這些蛋白質依功能分類，如表 2.1 所示，可分為結構性蛋白質、和蛋白質摺疊修飾運輸相關的蛋白質、代謝相關、轉錄因子、mRNA 裁減相關的蛋白質、轉譯因子、壓力調節相關蛋白質、鈣結合蛋白質、核甘酸修補蛋白質、合成嘌零的蛋白質，和細胞貼附相關的蛋白質、蛋白質降解，以及其他蛋白質。SCC-4 細胞株中鑑定出 33 個蛋白質差異點，如表 2.2 所示，可分為結構性蛋白質、和蛋白質摺疊修飾運輸相關的蛋白質、代謝相關、轉錄因子、mRNA 加工處理相關的蛋白質、轉譯因子、壓力調節相關蛋白質、鈣結合蛋白質、核甘酸修補蛋白質、抗死亡的蛋白質，以及其. 44.

(46) 他蛋白質。較引人注意的是，有些蛋白質在兩株細胞株中皆有找到，且表現量一致。包括結構性蛋白質中的 TUBB，和蛋白質摺疊修飾運輸相關的蛋白質 PDIA3(protein disulfide isomerase)、NSFL1C(p47)，代謝相關 FH(fumarate hydratase precursor)、ENO1(Chain A, Crystal Structure Of Human Enolase 1) ，壓力調節相關蛋白質 STIP1(stress-induced-phosphoprotein. 1. (Hsp70/Hsp90-organizing. protein))，鈣結合蛋白質 CALR(calreticulin precursor)，核甘酸修補蛋白質 RAD23B(UV excision repair protein RAD23 homolog B)。其中有些蛋白質在兩株細胞株中皆有找到，但其表現量不一致，有可能的原因為，為不同細胞株，所以即使投予相同的藥物，其細胞中的些微變化仍然會不一樣。另外，在 HSC-3 細胞株中找到的 HNRNPH1( heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1)，PDQuest 分析表現量並非一致增加或下降，為何會有如此的結果，仍待我們做進一步的確認。. 第三節、應用生物資訊學推測松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞株可能的訊息傳遞路徑將所得的蛋白質，利用其 gi number，匯入 GeneGo Meta CoreTM (http://portal.genego.com)，選擇物種(homo sapiens)，選擇細胞種類來 45.

(47) 源 (pre-filter) ，選擇建立關係圖的方式 (auto-expand or shortest pathway……)，建立各蛋白質之間相互關係圖(build network)，最後整理建立出的相互關係圖，以作為後續研究方向的參考。在 HSC-3 細胞株中，匯入 42 的蛋白質，其中有 27 個蛋白質被繪在此網路圖內，如圖 9a 所示；在 SCC-4 細胞株中，匯入 33 個蛋白質，其中有 23 個蛋白質被繪在此網路圖內，如圖 9b 所示。投予松杉靈芝萃取物後，在兩株不同細胞株(HSC-3 及 SCC-4) 中發現相同訊息傳遞路徑圖，如圖 10a 所示；除此之外，也發現了各別的訊息傳遞路徑圖，圖 10b 為 HSC-3 路徑圖，圖 10c 為 SCC-4 路徑圖。. 第四節、驗證松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞株的訊息傳遞路徑圖 10a 為投予松杉靈芝萃取物後，在兩株不同細胞株(HSC-3 及 SCC-4)中相同訊息傳遞路徑圖，實心圈起來的蛋白質為二維凝膠電泳中找出的差異點，挑選三個蛋白質(STIP1、calreticulin、PDIA3)，利用西方墨點法做進一部的驗證。由圖 11 可看出，STIP1 在處理松杉靈芝萃取物後，有和二維電泳一樣的結果，有些微的下降趨勢。 PDIA3 在處理松杉靈芝萃取物後，有和二維電泳一樣的結果，有些. 46.

(48) 微的下降趨勢。calreticulin 在處理松杉靈芝萃取物後，有和二維電泳一樣的結果，有些微的上升趨勢。因此西方墨點法的結果初步顯示出，STIP1、calreticulin、PDIA3、的表現皆會受松杉靈芝萃取物而有不同程度的影響。圖 10c 為投予松杉靈芝萃取物後，在 SCC-4 中找到的訊息傳遞路徑圖，實心圈起來的蛋白質為二維凝膠電泳中找出的差異點，挑選 GRP78，利用西方墨點法做進一部的驗證。由圖 11b 可看出， GRP78 在處理松杉靈芝萃取物(0.5 mg/mL)後，有和二維電泳一樣的結果，些微的下降趨勢。然而在處理更高濃度時(0.75 mg/mL)，卻有上升的趨勢。. 47.

(49) 第四章：討論第一節、蛋白質體學研究方法討論本論文使用蛋白質體學的方式，篩選出被松杉靈芝所改變的蛋白質。從二維凝膠電泳到染色，PDQuest 軟體分析，膠體內水解，及最後的質譜分析及 MASCOT 資料庫比對是一連串環環相扣的實驗，當中任何一步驟的差錯都有可能造成樣品污染或者是最後的數據判讀錯誤。在染色的部份，本實驗室不是使用傳統常用的染劑，而是使用 Reverse stain (VisPRO 5 minutes Protein Stain Kit)。此染劑可以和 polyacrylamide 作用，形成白色的 zinc-imidazole 複合物；然而在有蛋白的地方會避免染劑作用，而形成透明的。Lin et al. (2009)將常用的染劑(silver stain、Sypro Ruby、CBR stain)和 VisPRO 5 minutes Protein Stain Kit 進行全方面的比較，結果顯示出 VisPRO 5 minutes Protein Stain Kit 有五大特色： (1)高敏感性，可以染到 1.8 ng 的蛋白質。 (2)線性範圍可以達到 140 ng 的蛋白質。 (3)對於蛋白質的酸鹼中性，沒有很明顯的偏好。 (4)高背景值，但此問題可藉由 Melanie 4 分析軟體所解決。 (5)為負染色，因此對於質譜分析相容性高(因為沒有退染的問題)。 48.

(50) 比較令人擔憂的問題為第 4 項，此染劑會造成高背景值，雖文獻指出此問題可藉由 Melanie 4 分析軟體解決，然而本論文所使用的為 PDQuest 軟體，不知是否會造成判讀誤差，仍需做進一步深入的研究。即使相同的蛋白質樣品，每次所得的二維電泳圖譜不盡相同，為了減少誤差，我們使用各 3 片(對照組 3 片、實驗組 3 片)二維電泳圖譜進行 PDQuest 軟體分析，找到的蛋白質差異點(1.7 倍)，更以統計軟體來進行統計，決定其是否有統計學上的意義，再進行膠體內水解。且在本實驗中，為了減少挖錯點或者是樣品遭受污染，導致質譜分析及 MASCOT 資料庫(NCBI database)比對判讀錯誤，經由反覆數次的挖取不同片膠體的相對位置，以確認蛋白質的正確身份。然而在 HSC-3 細胞株中卻發現，HNRNPH1( heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1)，PDQuest 分析表現量並非一致增加或下降，推測松杉靈芝萃取物對此蛋白質並沒有專一性，導致其表現量不穩定。. 第二節、相同的訊息傳遞路徑圖為了探討松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞生長的作用機轉，本實驗室選用口腔癌細胞株 HSC-3 及 SCC-4 進行進一步的研究，此兩 49.

(51) 株細胞皆為口腔麟狀上皮細胞癌，投予松杉靈芝萃取物後，找到的蛋白質差異點，經過 Genego 分析，畫出相同的訊息傳遞路徑圖，這條訊息傳遞路徑可能可做為松杉靈芝萃取物抑制口腔麟狀上皮細胞癌的作用機轉，下面一一介紹這些蛋白質。. 壓力調節相關蛋白質 STIP1(減少)(stress-induced-phosphoprotein 1 (Hsp70/Hsp90-organizing protein))，扮演 co-chaperones 角色，將 Hsp70 及 Hsp90 組織結合在一起。Chaperones 的功能主要在於幫助蛋白質的摺疊、或維持蛋白質的構造及功能，STIP1 在處理松杉靈芝後表現量下降，因此推測松杉靈芝可能會影響蛋白質的摺疊、構造及功能，而導致細胞生長受到抑制。. 和蛋白質摺疊修飾運輸相關的蛋白質 PDIA3( 減少 )(protein disulfide isomerase)、NSFL1C(減少)(p47)。近來有很多研究專注於再 PDIA3 的功能，Oliver et al. (1997)指出，在醣蛋白合成的過程當中， PDIA3 可以和 calnexin 及 calreticulin 結合，扮演著 molecular chaperone 的角色。Kondo et al. (1997)指出，在 NSFL1(p97)所主導的膜融合過程當中，p47 扮演著輔因子的角色。故推測這些和蛋白質摺疊修飾運輸相關的蛋白質，在處理松杉靈芝萃取後物表現量下降，而導致細胞的生長受到抑制。 50.

(52) 鈣結合蛋白質 CALR(增加)(calreticulin precursor)，為一多功能的蛋白質，主要功能是在內質網扮演著儲存鈣離子的角色。Burns et al. (1994)發現 CALR 也存在於核中，故推測其和基因轉錄的調控相關。Obeid et al. (2007)指出，anthracyclins 所誘導的細胞死亡，是藉由快速的將 CALR 移到細胞表面，因此 Obeid et al.推測 CALR 在抗癌免疫反應中也扮演重要的角色。故推測松杉靈芝萃取物處理癌細胞後，細胞進行計畫性死亡，CALR 表現量上升，而這些 CALR 便做為被吞噬細胞所辨視的訊號，促使死亡細胞被正常地吞噬。Chen et al. (2009)指出，CALR 過表現可增加 PIGF 和 VEGF 表現，增加血管新生的能力，促進細胞的增生和移動；免疫組織染色結果顯示，微血管密度、淋巴轉移、低存活率都和 CALR 呈現正相關關係。另外 Silvia et al. (2002)年指出，當 thrombospodin 和 CALR 結合在一起時，會促進細胞的 focal adehesion diassambly，進而增加細胞的移動能力。然而本研究顯示出，經由松杉靈芝處理過後的口腔癌細胞移動能力被抑制，且 CALR 表現量上升，為何會有不同的結果，能待我們做進一步的研究。. 另外 Obeid (2008), Panaretakis et al. (2008)指出，PDIA3 在 CALR 扮演抗癌反應中角色時，也佔有一席之地。Obeid (2008)指出，PDIA3 51.

(53) 為重要蛋白質，藉著控制 CALR 移到細胞表面，因而達到控制抗癌免疫反應的效果，因此 PDIA3 在抗癌免疫反應中可以當作一個新的指標。. 核苷酸修補蛋白質 RAD23B(增加)(UV excision repair protein RAD23 homolog B)，DNA 修復是細胞將基因上的損壞移除的重要機制，而核苷酸切除修復主要修復經紫外線照射或致癌化學藥品造成的大形 DNA 構形改變，RAD23 是一出芽酵母菌的核苷酸切除修復因子，已知和蛋白質的降解也有關，在人類則有兩個同源基因：分別是 hHR23A 和 hHR23B。Sugasawa et al. (1998)指出，在核苷酸切除修復的過程當中，RAD23B 是最早被發現的修復因子，他會引進其他修復因子，完成修復的工程。松杉靈芝萃取物處理癌細胞後，發現 RAD23B 的表現量上升，可能原因為松杉靈芝嚴重損壞癌細胞的 DNA，因此癌細胞才會大量表現 RAD23B。. 代謝相關 FH(減少)(fumarate hydratase precursor)、ENO1(減少)(Chain A, Crystal Structure Of Human Enolase 1)。FH 是 TCA cycle 裡的酵素，主要功能是將 fumarate 轉換成 malate；ENO1 為醣解酵素，兩者同時下降，代表細胞的產能減少，因而可能減少癌細胞的生長。 52.

(54) 第三節、各別的訊息傳遞路徑圖除此之外，由於這兩株細胞株的來源不同，HSC-3 從日本細胞庫購入，是口腔麟狀上皮細胞癌轉移到頸部淋巴，從頸部淋巴分離取得，經研究指出其為高轉移能力的細胞株；SCC-4 從食品工業發展研究所購入，此細胞再被分離取得之前，病患有接受放射線及化療藥物(methotrexate)治療長達十六個月之久。因此除了相同的訊息傳遞路徑外，也找到各別的訊息傳遞路徑，下面介紹這些各別訊息傳遞路徑中的蛋白質。. 葡萄糖調控蛋白質 78 GRP78(減少)(Glucose-Regulated Protein 78)。Hendershot et al. (1994)指出，GRP78 又稱為 BiP (immunoglobulin heavy chain-binding protein)，為 HSP70 (heat shock protein 70)的成員之ㄧ，位於內質網中，具有鈣離子結合能力以及保護的功能，能夠幫助新合成之蛋白質的折疊，使其具有正確的功能和結構。故本論文推測，松杉靈芝萃取物會減少 GRP78 的表現，導致細胞合成正確蛋白質能力受損，因而達到抑制細胞生長的能力。Zhang et al. (2009), Virrey et al. (2008), Pyrka et al. (2007), Lee et al. (2006) 指出，GRP78 和化療藥物的敏感性和抗藥性有相關，當 GRP78 被 knockdown 後，會增加細胞株對化療藥物 CPT-11, etoposide(VP-16), temozolomide, 53.

(55) 5-fluorouracil and CPT-11 的敏感性；當 GRP78 過表現時，會增加細胞株對化療藥物 etoposide(VP-16) and temozolomide 的抗藥性。 Sadava. et al. (2009)指出，靈芝萃取物可以顛覆小形肺癌細胞. (small-cell lung cancer)對化療藥物(etoposide 及 doxorubicin)的抗藥性；除此之外 Li et al. (2008)也指出，靈芝(Ganoderma lucidum polysaccharides)可以藉由減少 MDR-1 及 MDR-associated protein (MRP)1 的表現，而顛覆抗藥性癌細胞(adriamycin (ADM)-resistant leukemic cell line K562/ADM)對化療藥物(doxorubicin)的抗藥性。故本論文推測，如果在使用化療藥物治療癌症時，輔助給予松杉靈芝萃取物，而松杉靈芝萃取物可以使得 GRP78 的表現量下降，GRP78 的表現量下降可以增加細胞對化療藥物的敏感性，如此一來，治療效果更明顯，但這僅止於推測，能需做進一步的實驗進行驗證。至於在處理高濃度的松杉靈芝萃取物後(0.75mg/mL)，GRP78 的表現量經西方墨點法分析，結果為上升的，推測高濃度的松杉靈芝萃取物已對細胞造成壓力，因此 GRP78 在此扮演 chaperones 的角色。. Tumor protein, translationally-controlled 1(減少)(TPT1)。Kim et al. (2009)指出，TPT1 為細胞質內 Na,K-ATPase 的抑制劑；且由 Akt 路徑所調控的細胞生長，PLC-gamma 路徑所調控的細胞移動能力，. 54.

(56) TPT1 扮演重要的角色。Hsuan et al. (2005)指出，TPT1 可藉由抑制 Mcl-1 的 ubiqutinalation 而影響 Mcl-1 的分解，因此而增加 Mcl-1 蛋白的半衰期，Mcl-1 屬於 Bcl-2 家族之一，Bcl-2 可阻止細胞凋亡。故本論文推測投予松杉靈芝萃取物後，TPT1 表現量下降，會增加 Mcl-1 的分解(而 Mcl-1 屬於 Bcl-2 家族之一)，Mcl-1 下降，阻止細胞凋亡的就減少，也就是說細胞凋亡增加。. Sanders et al. (1996)指出，Eukaryotic elongation factor-1 (EF1)由四個 subunits 組成，分別是 EF1-alpha, EF1-beta, EF1-gamma 和 EF1-delta。在轉譯過程當中，EIF-alpha-GTP 藉由 GTP 水解成 GDP，將 aminoacyl-tRNA 轉移到核醣體上(ribosome)，EF1-alpha-GDP 再藉由 EF1-beta, -gamma, and -delta subunits 的幫忙，恢復成 EIF-alpha-GTP。. Cans et al. (2003)發現 TPT1 傾向於穩定 EF1-alpha-GDP 的形式，因而影響了 EF1-beta, -gamma, and -delta subunits 主導的 GDP exchange reaction，因此作者推測 TPT1 存在著抑制鳥糞嫖零核甘酸分離(guanine nucleotide dissociation inhibitor)的活性，因而影響了蛋白質合成過程當中的延長步驟。. 55.

(57) Saito Y et al. (2008)指出，表現 cold shock domain protein A 可以藉由直接和 serum response element (SRE)或 hypoxia response element (HRE)結合，因而抑制血管新生和淋巴管增生。. Kleijnen et al (2000)指出，ubiquilin 參予 proteasome 所主導的蛋白質降解，在處理松杉靈芝萃取取物後，其表現量上升，則推測蛋白質降解也上升，因而導致細胞生長受阻。. 葡萄糖調控蛋白質 75 GRP75(減少)(Glucose-Regulated Protein 75)，為 Hsp70 成員之ㄧ，主要存在於粒線體內，可以將粒線體蛋白質從細胞質內運輸到粒線體。除此之外，Wadhwa et al. (1998)指出 GRP75 可以降低抑癌基因 p53 的活性；Wadhwa et al. (2006)指出， GRP75 在很多腫瘤組織中都有過表現的現象；Ling (2008)指出， GRP75 過表現可以抑制 glucose deprivation (GD) injury 所造成的細胞凋亡，主要是藉由抑制 Bax 結構的改變，而延緩 cytochrome c 的釋放。總而言之，GRP75 如果過表現，對細胞是一種傷害，而在松杉靈芝萃取物處理後，其表現量下降，對細胞無疑是好的。. 56.

(58) 第五章：結論本論文主要是要探討松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞的影響。結果顯示出：一、松杉靈芝萃取物會影響口腔癌細胞株的生長週期，使得細胞停止在 G2/M 期。二、2D/MALDI-TOF/TOF 蛋白質體學的研究方式可大量而有效的篩選出經松杉靈芝萃取物處理後口腔癌細胞內產生改變的蛋白質。三、松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞(HSC-3 & SCC-4)生長可能的作用機轉 (1)影響 chaperones(PDIA3, calreticulin, STIP1)，因而抑制口腔癌細胞的增生及存活。 (2)影響代謝作用相關的蛋白質(FH, ENO1)，因而影響口腔癌細胞的生長。四、松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞(HSC-3)生長可能的作用機轉 (1)影響 G3P2，因而影響 HSC-3 的 ATP 合成。 (2)影響 ubiquilin，因而影響 HSC-3 的蛋白質降解。五、松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞(SCC-4)生長可能的作用機轉 (1)影響 GRP75，因而影響 SCC-4 的細胞凋亡。 57.

(59) (2)影響 GRP78，因而影響 SCC-4 的抗藥性。 (3)影響 TPT1, eEF1B, 因而影響 SCC-4 的生長週期。. 58.

(60) 第六章：參考文獻 Apetoh L, Ghiringhelli F, Zitvogel L. 2007. [Calreticulin dictates the immunogenicity of anti-cancer chemotherapy and radiotherapy]. Med Sci (Paris) 23: 257-258. Baldwin MA. 2004. Protein identification by mass spectrometry: issues to be considered. Mol Cell Proteomics 3: 1-9. Burns K, Atkinson EA, Bleackley RC, Michalak M. 1994. Calreticulin: from Ca2+ binding to control of gene expression. Trends Cell Biol 4: 152-154. Burns K, Duggan B, Atkinson EA, Famulski KS, Nemer M, Bleackley RC, Michalak M. 1994. Modulation of gene expression by calreticulin binding to the glucocorticoid receptor. Nature 367: 476-480. Cans C, Passer BJ, Shalak V, Nancy-Portebois V, Crible V, Amzallag N, Allanic D, Tufino R, Argentini M, Moras D, Fiucci G, Goud B, Mirande M, Amson R, Telerman A. 2003. Translationally controlled tumor protein acts as a guanine nucleotide dissociation inhibitor on the translation elongation factor eEF1A. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 13892-13897. Chen RH, Miettinen PJ, Maruoka EM, Choy L, Derynck R. 1995. A WD-domain protein that is associated with and phosphorylated by the type II TGF-beta receptor. Nature 377: 548-552. Chi LM, Lee CW, Chang KP, Hao SP, Lee HM, Liang Y, Hsueh C, Yu CJ, Lee IN, Chang YJ, Lee SY, Yeh YM, Chang YS, Chien KY, Yu JS. 2009. Enhanced interferon signaling pathway in oral cancer revealed by quantitative proteome analysis of microdissected specimens using 16O/18O labeling and integrated 2DLC-ESI-MALDI tandem MS. Mol Cell Proteomics. Clarke C, Smyth MJ. 2007. Calreticulin exposure increases cancer immunogenicity. Nat Biotechnol 25: 192-193. Daniel H. 2002. Genomics and proteomics: importance for the future of nutrition research. Br J Nutr 87 Suppl 2: S305-311. 59.

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(66) 第七章：圖表第一節、表 Table 1.1 經二維電泳、質譜分析篩選所得的蛋白質. (HSC-3 細胞株中鑑定出 42 個蛋白質差異點) Theor. NCBI accession MOWSE spot. target protein. Official Symbol. sequence. fold. coverage. difference. molecular no.. score mass(kDa)/pI. 1509 ↑ heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F. HNRNPF. gi|4826760. 143. 45.985/5.38. 6%. 1.78. 2205 ↓ CGI-150 protein. GLOD4. gi|4929769. 58. 55.832/8.99. 3%. 0.43. 2206 ↓ pyrophosphatase 1. PPA1. gi|11056044. 48. 33.095/5.54. 7%. 0.2. EIF3I. gi|4503513. 140. 36.878/5.38. 12%. 2.13. 4403 ↑ tubulin, beta polypeptide. TUBB. gi|57209813. 72. 48.135/4.70. 39%. 2.23. 4507 ↓ protein disulfide isomerase. PDIA3. gi|860986. 144. 57.043/6.10. 6%. 0.45. 4520 ↑ heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1. HNRNPH1. gi|5031753. 208. 49.484/5.89. 10%. 2.36. 6502 ↓ heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1. HNRNPH1. gi|5031753. 230. 49.484/5.89. 11%. 0.45. STIP1. gi|5803181. 125. 63.227/6.40. 5%. 0.51. 7307 ↑ PDZ and LIM domain 1. PDLIM1. gi|13994151. 111. 36.505/6.56. 68%. 2.76. 7308 ↓ Chain A, Crystal Structure Of Human Enolase 1. ENO1. gi|203282367. 71. 47.350/6.99. 39%. 0.33. 8302 ↓ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. GAPDH. gi|31645. 68. 36.202/8.26. 4%. 0.37. VDAC1. gi|238427. 73. 30.737/8.63. 6%. 0.49. 2304 ↓ F-actin capping protein alpha-1 subunit. CAPZA1. gi|5453597. 99. 33.073/5.45. 9%. 0.32. 3204 ↓ pyrophosphatase 1. PPA1. gi|11056044. 117. 33.095/ 5.54. 11%. 0.46. eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 2 beta, 3301 ↑ 36kDa. stress-induced-phosphoprotein 1 (Hsp70/Hsp90-organizing 6604 ↓ protein). Porin 31HM [human, skeletal muscle membranes, Peptide, 9201 ↓ 282 aa]. 65.