第一節、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株的影響
壹、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株的生長抑制曲線
如圖 2 所示，兩株細胞在投予松杉靈芝萃取物(0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL)，分別於 12、24、48、72 小時，利用 trypan blue
算其細胞總數，結果顯示出隨著給予松杉靈芝的劑量增加，或者是 隨著時間的增長，細胞生長速率明顯比控制組來的慢。
貳、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株的半數抑制濃度(IC
50 )
利用 MTT assay 得知，如圖 3 所示，松杉靈芝萃取物對 HSC-3
細胞株之IC
50
為100 μg/mL，對 SCC-4 細胞株之 IC50
為 250 μg/mL。其原理為MTT 會和活細胞的粒線體琥珀酸脫氫酶反應，而產生藍色 結晶，最後再用 DMSO 將藍色結晶回溶，測其吸光值經過換算即可 得知松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株之抑制濃度為何。
參、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株形態的影響
如圖 4 所示，兩株口腔癌細胞株原本形態規則，飽滿，排列緊 密。投予松杉靈芝萃取物後(2 倍 IC
50
，24 hr)，HSC-3 細胞形態呈現 尖細，挾長不規則狀；SCC-4 細胞株旁出現很多小碎片般的殘骸。將這些細胞收集，利用二維凝膠電泳、及質譜分析以及資料庫比對，
找出松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株蛋白質表現的影響。
肆、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株移動能力的影響
創傷癒合試驗結果如圖 5 所示，HSC-3 細胞株為高轉移能力的 細胞株，經過 24H 後，控制組的傷口已經完全癒合；然而在處理松 杉靈芝萃取物(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL)後，傷口沒有癒 合的狀況。SCC-4 細胞株經過 48H 後，控制組的傷口完全癒合；然 而處理松杉靈芝萃取物(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL)組，傷
口沒有癒合的狀況。由此可知松杉靈芝萃取物會抑制口腔癌細胞株 HSC-3 & SCC-4 傷口癒合速率，表示可能降低口腔癌細胞株 HSC-3
& SCC-4 移動能力。
伍、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株生長週期的影響
如圖 6 所示，口腔癌細胞株 HSC-3 投予松杉靈芝萃取物(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL)，SCC-4 投予松杉靈芝萃取物(0.25 mg/mL、0.5 mg/mL)，24 小時後，將細胞收下固定，進行 FACS 分 析，結果顯示出投予松杉靈芝萃取物後細胞明顯的停止在G2/M 期，
且隨著加藥濃度越高，停止在G2/M 期的細胞數越多。
陸、松杉靈芝萃取物對口腔癌細胞株生長週期蛋白質的影響
口腔癌細胞株 HSC-3 投予松杉靈芝萃取物(0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL)及 1% EtOH 當做控制組；SCC-4 投予松杉靈芝 萃取物(0.25 mg/mL、0.5 mg/mL) 及 1% EtOH 當做控制組，24 小時 後將細胞收下，取 60 μg 蛋白質利用西方墨點法做生長週期相關蛋 白質的影響。如圖7 所示(7a 為 HSC-3 細胞株，7b 為 SCC-4 細胞株)，
cyclin A、cyclin B 在處理松杉靈芝萃取物後有下降的趨勢，且隨著 加藥濃度越高，下降趨勢越明顯。 P21、 P27 在處理松杉靈芝萃取 物後有上升的趨勢，且隨著加藥濃度越高，上升趨勢越明顯。
第二節、以二維電泳、質譜分析以及資料庫比對找出松杉 靈芝萃取物對口腔癌細胞株蛋白質表現的影響
壹、以二維凝交電泳及介質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜分析 投予松杉靈芝萃取物後之口腔癌細胞株蛋白質表現的影響
一開始先利用 pH3-10L 的等電點 pH 梯度膠來進行二維凝膠電 泳，目的是要觀察大部份蛋白質落再哪些等電點區域內，結果得知 大部分的蛋白質都落在 pH4-8 內。因此再進一步利用 pH3-10NL 及 pH4-7L 將大部份的蛋白質分離開來，如圖 7 所示。
利用 PDQuest 分析軟體分析差異點，在 HSC-3 細胞株中找到 56
個差異點(34 個點表現量上升，22 個點表現量下降)；SCC-4 細胞株
中找到49 個差異點(11 個點表現量上升，38 個點表現量下降)。
將分析所得的差異點擷取下來，進行膠體內蛋白質水解，利用 MALDI-TOF/TOF 分析，及 MASCOT 資料庫比對，在 HSC-3 細胞
株中鑑定出42 個蛋白質差異點(23 個點表現量上升，19 個點表現量 下降)，詳見表 1.1；在 SCC-4 細胞株中鑑定出 33 個蛋白質差異點(7 個點表現量上升，26 個點表現量下降)，詳見表 1.2。
貳、彙整所有經二維電泳、質譜分析所得的蛋白質
匯整經二維電泳、質譜分析所得的蛋白質，HSC-3 細胞株中鑑 定出42 個蛋白質差異點，將這些蛋白質依功能分類，如表 2.1 所示，
可分為結構性蛋白質、和蛋白質摺疊修飾運輸相關的蛋白質、代謝 相關、轉錄因子、mRNA 裁減相關的蛋白質、轉譯因子、壓力調節 相關蛋白質、鈣結合蛋白質、核甘酸修補蛋白質、合成嘌零的蛋白 質，和細胞貼附相關的蛋白質、蛋白質降解，以及其他蛋白質。SCC-4 細胞株中鑑定出33 個蛋白質差異點，如表 2.2 所示，可分為結構性 蛋白質、和蛋白質摺疊修飾運輸相關的蛋白質、代謝相關、轉錄因 子、mRNA 加工處理相關的蛋白質、轉譯因子、壓力調節相關蛋白 質、鈣結合蛋白質、核甘酸修補蛋白質、抗死亡的蛋白質，以及其
他蛋白質。
較引人注意的是，有些蛋白質在兩株細胞株中皆有找到，且表 現量一致。包括結構性蛋白質中的 TUBB，和蛋白質摺疊修飾運輸 相關的蛋白質PDIA3(protein disulfide isomerase)、NSFL1C(p47)，代 謝相關 FH(fumarate hydratase precursor)、ENO1(Chain A, Crystal Structure Of Human Enolase 1) ， 壓 力 調 節 相 關 蛋 白 質 STIP1(stress-induced-phosphoprotein 1 (Hsp70/Hsp90-organizing protein))，鈣結合蛋白質 CALR(calreticulin precursor)，核甘酸修補蛋 白質RAD23B(UV excision repair protein RAD23 homolog B)。
其中有些蛋白質在兩株細胞株中皆有找到，但其表現量不一致，有 可能的原因為，為不同細胞株，所以即使投予相同的藥物，其細胞 中的些微變化仍然會不一樣。
另外，在 HSC-3 細胞株中找到的 HNRNPH1( heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1)，PDQuest 分析表現量並非一致增加或 下降，為何會有如此的結果，仍待我們做進一步的確認。
第三節、應用生物資訊學推測松杉靈芝萃取物抑制口腔癌 細胞株可能的訊息傳遞路徑
將所得的蛋白質，利用其 gi number，匯入 GeneGo Meta Core
TM
(http://portal.genego.com)，選擇物種(homo sapiens)，選擇細胞種類來源(pre-filter) ， 選 擇 建 立 關 係 圖 的 方 式 (auto-expand or shortest pathway……)，建立各蛋白質之間相互關係圖(build network)，最後 整理建立出的相互關係圖，以作為後續研究方向的參考。在 HSC-3 細胞株中，匯入 42 的蛋白質，其中有 27 個蛋白質被繪在此網路圖 內，如圖9a 所示；在 SCC-4 細胞株中，匯入 33 個蛋白質，其中有 23 個蛋白質被繪在此網路圖內，如圖 9b 所示。
投予松杉靈芝萃取物後，在兩株不同細胞株(HSC-3 及 SCC-4) 中發現相同訊息傳遞路徑圖，如圖 10a 所示；除此之外，也發現了 各別的訊息傳遞路徑圖，圖10b 為 HSC-3 路徑圖，圖 10c 為 SCC-4 路徑圖。
第四節、驗證松杉靈芝萃取物抑制口腔癌細胞株的訊息傳 遞路徑
圖 10a 為投予松杉靈芝萃取物後，在兩株不同細胞株(HSC-3 及 SCC-4)中相同訊息傳遞路徑圖，實心圈起來的蛋白質為二維凝膠電 泳中找出的差異點，挑選三個蛋白質(STIP1、calreticulin、PDIA3)，
利用西方墨點法做進一部的驗證。由圖11 可看出，STIP1 在處理松 杉靈芝萃取物後，有和二維電泳一樣的結果，有些微的下降趨勢。
PDIA3 在處理松杉靈芝萃取物後，有和二維電泳一樣的結果，有些
微的下降趨勢。calreticulin 在處理松杉靈芝萃取物後，有和二維電
泳一樣的結果，有些微的上升趨勢。因此西方墨點法的結果初步顯 示出，STIP1、calreticulin、PDIA3、的表現皆會受松杉靈芝萃取物 而有不同程度的影響。
圖 10c 為投予松杉靈芝萃取物後，在 SCC-4 中找到的訊息傳遞 路徑圖，實心圈起來的蛋白質為二維凝膠電泳中找出的差異點，挑 選 GRP78，利用西方墨點法做進一部的驗證。由圖 11b 可看出，
GRP78 在處理松杉靈芝萃取物(0.5 mg/mL)後，有和二維電泳一樣的 結果，些微的下降趨勢。然而在處理更高濃度時(0.75 mg/mL)，卻有 上升的趨勢。