第二章 ：材料與方法
第二節、 實驗方法
壹、松杉靈芝乙醇萃取
1. 秤取松杉靈芝粉末，25 g 溶於 2500 mL 無水乙醇。
2. 室溫震盪，overnight。
3. 抽氣過濾兩次，將靈芝粉末不溶的顆粒濾除，保留澄清濾液。
4. 利用減壓濃縮原理，將濾液的溶媒蒸發，得到濃稠膠狀的靈芝乙 醇萃取物。
5. 秤取所得的靈芝乙醇萃取物，每 100 mg 靈芝乙醇萃取物以 1 mL 無水乙醇回溶。
6. 回溶的靈芝乙醇萃取物通過0.22 μm 濾膜，分裝於微量離心管，
-20°C 冷藏。
貳、細胞株培養
(詳見附錄三，參照「高銘欽教授實驗室細胞培養標準操作程序」，
編撰者：李宜臻)
ㄧ、解凍細胞株標準操作程序 二、繼代培養細胞株標準操作程序 三、冷凍細胞株標準操作程序
參、測量松杉靈芝萃取物對細胞株的生長曲線
1. 24 孔盤分別種入 7.5*10
6
cells/well (HSC-3)及 4.5*106
cells/well (SCC-4)。2. 第二天取 DPBS 及 10% EtOH in DPBS 及各種(3 種)不同濃度的松 杉靈芝乙醇萃取物(0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL)100 μL 加
入。
3. 經反應 12、24、48、72 小時後，加入 0.5 mL trypsin-EDTA，然 後至於恆溫培養箱中作用。
4. 加入 0.5 mL 含 10% FBS 之細胞培養液中和 trypsin-EDTA 活性並 且將細胞打下。
5. 以hemocytometer 計算細胞的數目。
肆、測量松杉靈芝萃取物對細胞株的半數抑制濃度(IC
50 )
一、細胞密度(cell density)之測試1. 96 孔盤之上下兩列為空白組(blank)，只注入 180 μL 細胞培養液。
2. 其餘每兩排注入不同數量之細胞數(在 180 μL 細胞培養液內)，分 別為2000 顆、4000 顆、6000 顆、8000 顆、10000 顆、12000 顆，
細胞數少的靠外側，細胞數多的靠內側。
3. 第二天每個 well 各加入 20 μL DPBS。
4. 72 hr 後，每個 well 各加入 20 μL MTT，再將 96 孔盤放入恆溫培 箱。
5. 約 3~4 hr 後，將 96 孔盤取出，吸取上清液 170 μL。
6. 再加入 200 μL DMSO 溶劑。
7. 以水平震盪器搖晃 5 分鐘之後，讀取吸光值(545 nm-690 nm)。
8. 將過換算，即可獲得最適合之細胞密度。
二、細胞半數致死劑量(IC
50
)之測試1. 96 孔盤分為兩個區塊，左邊為 HSC-3，右邊為 SCC-4。
2. 上下兩列為空白組(blank)，只注入 180 μL 細胞培養液；其餘注入 2000 cells/180 μL 細胞培養液。
3. 第二天，取各種(5 種)松杉靈芝乙醇萃取物濃度 20 μL，低濃度在 外，高濃度在內，加入每個well 當中；其中第六排之上半部加入 20 μL 松杉靈芝乙醇萃取物溶媒；第六排之下半部加入 20 μL DPBS。
4. 72 hr 後，每個 well 各加入 20 μL MTT，再將 96 孔盤放入恆溫培 箱。
5. 約 3~4 hr 後，將 96 孔盤取出，吸取上清液 170 μL。
6. 再加入 200 μL DMSO 溶劑。
7. 以水平震盪器搖晃 5 分鐘之後，讀取吸光值(545 nm-690 nm)。
8. 將過換算，即可獲得松杉靈芝萃取物對細胞株半數抑制濃度 (IC
50
)。伍、測量松杉靈芝萃取物對細胞株的移動能力 (創傷癒合試驗
Wound closure assay)
1. 於六孔盤種入 2*10
5
cells/well(全滿)。2. 第二天，抽掉細胞培養液，改用不含血清的細胞培養液。
3. 第三天，配置含有不同濃度松杉靈芝乙醇萃取物的細胞培養液(不 含血清)。
4. 顯微鏡觀察 6 孔盤內細胞生長狀況，確定細胞生長及形態正常，
抽掉細胞培養液(留下少許細胞培養液在 well 中)。
5. 用 p200 tip 在每個 well 中劃出一道中分線(wound)，並於上方做 記號(作為每次顯微鏡觀察位置的基準)。
6. 用 DPBS 將每個 well 輕沖之後洗去。
7. 加入含有不同濃度松杉靈芝乙醇萃取物的細胞培養液，將 6 孔盤 放入恆溫培養箱。
8. 於不同時間點用顯微鏡觀察每個 well 中創傷(wound)癒合的情 況，並照相。
9. 根據照片來分析不同濃度松杉靈芝乙醇萃取物對細胞株創傷癒 合的影響。
陸、測量松杉靈芝萃取物對細胞株的生長週期
1. 將收集下來的細胞加入 5 mL 75%乙醇後混合均勻，置入-20°C 冰
箱冷凍至隔天。
2. 以 2000 rpm 於 4°C 離心 5 分鐘，之後移除上清液。
3. 將 5 mL 含有 1% FBS 之 PBS 沖洗細胞兩次，每次以 2000 rpm 於 4°C 離心 5 分鐘，之後移除上清液。
4. 加入 0.5 mL DNA extraction solution 後均勻混何，於室溫下反應 5 分鐘。
5. 以 2000 rpm 於 4°C 離心 10 分鐘，之後移除上清液。
6. 加入 0.5 mL PI staining buffer，於室溫下反應 30 分鐘。
7. 進行FACS 分析。
柒、二維凝膠電泳(2-Dimension Gel Electrophoresis) (參考：王以均，
2007)
一、樣品製備(Sample preparation) 1. 將細胞收成 pellet。
2. 加入 pellet 體積約三倍的 2-DE lysis buffer (使用前加入 Bio-Lyte 3-10 Ampholyte，及 50 mM DTT)。
3. 強烈震盪並置於-20°C 冰箱 30 分鐘。
4. 離心，13000 rpm，4°C，20 分鐘。
5. 取上清液。
6. 加入 10%TCA/Acetone(使用前加入 20 mM DTT)，vortex。
(10%TCA/Acetone 與 protein sample 的體積比為 9:1) 7. 使蛋白質在-20°C 沉澱 2 hr。
8. 離心，13000 rpm，4°C，10 分鐘。
9. 用 P200 將上清液盡量移除。
10. 加入冰 Acetone(使用前加入 20 mM DTT)500 μL，vortex。
11. spin down。
12. 用 P200 將上清液盡量移除。
13. 重覆步驟 10-12 三次。
14. 使沉澱下來的蛋白質 air dry。
15. 加 入 適 量 的 2-DE lysis buffer ( 使 用 前 加 入 Bio-Lyte 3-10 Ampholyte，及 50 mM DTT)回溶。
16. 震盪 30 分鐘。
17. 離心，13000 rpm，4°C，10 分鐘。
18. 取上清液。
19. Bradford 蛋白質定量，Standard curve R
2
≧0.99。20. 取已定量好的蛋白質 200 μg，加入適量的 2-DE lysis buffer (使用 前加入Bio-Lyte 3-10 Ampholyte，及 50 mM DTT)使體積補足至 320 μL。
二、一維等電點聚焦電泳(Isoelectric Focusing) 1. 將 strip 從-20°C 取出回溫。
2. 用去離子水沾溼濾紙片，置於 IEF focusing tray 兩旁的電極線，
輕壓使濾紙片和電極線密合無氣泡。
3. 取 300 μL 蛋白質樣品溶液，均勻加入等電點聚焦盤中，切勿有 氣泡。
4. 用鑷子撕去 strip 表面上的塑膠片，將膠面朝下，標有 pH 值得一 端朝正極，覆於蛋白質樣品溶液上，切勿有氣泡。
5. 加入 2 mL 礦物油。
6. 等電點聚焦盤置於 PROTEAN IEF cell，開始進行 rehydration 及 蛋白質等電點聚焦。
7. 結束後，用去離子水清沖洗膠背面，用試鏡紙吸去多餘水分、礦 物油。
三、SDS-聚炳烯膠體電泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis) 1. 配膠(10% acrylamide gel)，可先暫存於 4°C，使用之前回溫。
2. Overlay agarose 用水浴加熱溶解，將膠的底部補平。
3. 將 strip 膠 面 朝 下 ， 置 於 rehydration/equilibration tray ， 加 入 equilibration buffer I (4 mL/strip)。
4. 搖晃 20 分鐘。
5. 用去離子水沖洗 strip 背面，試鏡紙吸去多餘水分，膠體朝下放入 另一格。
6. 加入 equilibration buffer II (4 mL/strip)。
7. 搖晃 20 分鐘。
8. 將些許 running buffer 加入兩玻璃間，以利 strip 滑入。
9. 倒去 running buffer，用擦手紙將多餘的水分移除。
10. 濾紙片沾 5 μL 的 protein ladder，放於 strip 旁。
11. 用 overlay agarose 進行封膠。
12. 設定冷卻循環水槽於 10°C。
13. 跑膠
四、膠體內蛋白質固定(Gel Fixation) 1. 跑完膠後，將膠取下。
2. 泡於 fixation buffer，overnight。
3. 用去離子水 wash，15 分鐘，至少三次。
五、膠體染色(VisPRO 5 minutes Protein Stain Kit)
1. 將膠泡在 50 mL Solution (1)搖晃 20 分鐘，倒掉 Solution (1)。
2. 用去離子水洗兩次，倒掉去離子水。
3. 加入 50 mL Solution (2)，用手劇烈搖晃，直至膠體呈現白色，倒
掉Solution (2)。
4. 用去離子水洗兩次，倒掉去離子水。
5. 將膠體掃瞄存檔。
6. 用PE 保鮮袋將膠體加入少取去離子水密封，存於 4 ºC。
捌、膠體內蛋白質水解(In Gel Digestion) 一、清洗膠體(Washing of gel pieces)
1. 將膠體取出，以去離子水清洗，10 分鐘，三次。
2. 將 blue tip 尖端截去，挖取有興趣的 spots，放入微量離心管。
3. 加入 100 μL 的 50% ACN/25 mM Ammonium bicarbonate，震盪 15 分鐘。
4. spin down。
5. 去除液體。
6. 重覆步驟 3-5 一次。
二、脫水(Dehydrate)
1. 加入 100 μL 的 ACN，震盪 5 分鐘。
2. spin down。
3. 去除液體。
4. air dry(直至膠體變成白色粒狀，能在微量離心管彈跳)。
三、胰蛋白酶水解(Digestion)
1. 加入 2 μL 的 Trypsin solution(20 ng/μL in 25 mM Ammonium bicarbonate)。
2. 於 4°C 靜置 1hr。
3. 加入 2 μL 的 25 mM Ammonium bicarbonate。
4. 置於 37°C，overnight。
四、蛋白質萃取(Extract)
1. 加入 2 μL 的 1% TFA/100% ACN。
2. 超音波震盪 10 分鐘。
3. spin down。
4. 取上清液。
玖、介質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜儀(MALDI-TOF/TOF) 及資料庫應用
1. 取 0.5 μL sample，輕點於 target 中央，待 sample 自然風乾後，再 點0.5 μL HCCAmatrix 於 sample 上，自然風乾。
2. Mascot 資料庫搜尋設定
Taxonomy：Homo sapiens (human) Database：NCBInr
Enzyme：Trypsin
Global Modifications：Carbamidomethyl (C) Variable Modifications：Oxidation (M) Missed cleavage <=1
Mass Tol. MS：100 ppm MS/MS Tol ：0.8 Da
拾、西方墨點法(Western Blotting) 一、樣品製備(Sample preparation) 1. 將細胞收成 pellet。
2. 加入約與 pellet 體積等量的 HEPES/NP-40 cell lysis buffer(使用前
加入 Protease Inhibitor Cocktail, Na3VO4, Phosphatase Inhibitor Cocktail)。
3. 強烈震盪並置於冰上-20°C 冰箱 30 分鐘。
4. 離心 13,000 rpm，4 ºC，15 分鐘。
5. 取上清液。Bradford 蛋白質定量，Standard curve R
2
≧0.99。6. 取已定量好的蛋白質樣品, 加適量 HEPES/NP-40 lysis buffer 及 2X sample buffer，將各樣品的蛋白質含量及體積調為一致。
7. 水浴法將 Sample 沸煮 3~5 分鐘，待樣品自然冷卻後再置於-20 ºC 儲藏。
二、製膠 (可暫存於 4ºC)
凝集膠：5 % acrylamide gel 分離膠：10-12 % acrylamide gel
三、跑膠
上膠：70V，30 分鐘 下膠：110V，90 分鐘
四、蛋白質轉漬 (transfer) 75V，3.5 小時
五、Immunoblotting
1. 將轉漬完成的 PVDF 膜泡入 5% 脫脂奶粉 (in TBST)中，室溫下
搖晃1 個小時 (或 4 ºC overnight)。
2. 取出 PVDF membrane，泡入 TBST，搖晃 5 分鐘，三次。
3. 取出 PVDF 膜，再泡入含有一級抗體的 5% BSA in TBST 中， 4 ºC overnight。
4. 取出 PVDF 膜，泡入 TBST，搖晃 5 分鐘，三次。
5. 取出 PVDF 膜，再泡入含有二級抗體的 5% 脫脂奶粉 in TBST
中，室溫下搖晃1 小時。
6. 取出 PVDF 膜，泡入 TBST，搖晃 5 分鐘，三次。
7. 底片壓片，分析。