成大研發快訊 第六卷 第六期 - 2008年十一月十四日
[ http://research.ncku.edu.tw/re/articles/c/20081114/4.html ]
斑馬魚抗凋亡蛋白zfBcl-X
L
阻斷β
野田病毒蛋白α
誘發 粒線體調控之第二型細胞壞死吳鴻程1,2,3、邱傳勝1、吳金洌4、龔紘毅4、陳鳴泉5、呂明偉4、洪健睿1,2,*
1國立成功大學生物科技研究所
2國立成功大學海洋環境與科技研究中心
3嘉南藥理科技大學食品科技學系
4中央研究院細胞與個體生物學研究所
5國立高雄海洋科技大學海洋生物技術學系 [email protected]
Fish & Shellfish Immunology (2008) 24: 436-449.
背景：
細胞凋亡(Apoptosis)為調控組織發育(tissue development)、細胞恆態 穩定(homeostasis)與疾病的重要機制。細胞凋亡與細胞壞死(necrosis) 為調控真核細胞死亡的兩大方式，細胞壞死常見於病毒感染等外界環 境因素所造成之細胞死亡；細胞凋亡則為正常組織之為維持細胞恆態 穩定所進行之生理過程。瞭解這項機制將有助於魚病治療之進行。
粒線體內存在許多蛋白質以調控細胞進行凋亡的過程，例如位於粒線 體膜間隙(mitochondrial intermembrane space)的細胞色素c
(cytochrome c)，Smac(second mitochondria-derived activator of caspase)/DIABLO(direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI)、細胞凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor；AIF)以及核酸
內切酶G (endonuclease G)等，這些蛋白質在促凋亡訊息的刺激下將由粒線體釋放，並且進入細胞質中；
當細胞粒線體膜電位(mitochondrial membrane permeability transition pore；MMP)流失將促進某些促進 凋亡的訊號，例如apoptosis-specific activation caspase的活化以造成細胞發生凋亡。因此，向來在
caspase-dependent pathway的凋亡機制上，粒線體被視為是個扮演中心調控者的角色，但是目前對於水產 病毒所誘發的細胞凋亡現象仍尚未有太多的研究。
野田病毒(Nodavirus)基因體由單股正股之兩段式RNA所構成，其3’端無poly(A)構造，兩段基因中較大的 片段為RNA1(約3.1 kb)，轉譯出約100 kDa的蛋白A，其功能為RNA複製酶(RNA-dependent RNA polymerase；RdRp)；另一小片段的基因為RNA2(約1.4 kb)則會轉譯成大小約為42 kDa的外殼蛋白α。
儘管病毒的感染帶給水產養殖業相當大的經濟衝擊，但是對於betanodaviruses的研究仍不是非常詳盡，因 此瞭解病毒的分子調控機制將有助於釐清病毒的感染過程與疾病預防。在先前的研究報告中，我們發現赤 點石斑神經壞死病毒(Redspotted grouper nervous necrosis virus；RGNNV) TN1病毒株將誘發石斑魚肝臟 細胞株(grouper liver cell line；GL-av)產生第二型細胞壞死(secondary necrosis)與細胞凋亡的現象，同時 粒線體在細胞凋亡的中期(mid-apoptotic stage)將發生膜電位流失，若利用Bcl-2家族抗凋亡蛋白zfBcl-XL
與zfMcl-1a將能有效抑制細胞死亡的現象。因此於本篇研究中，我們進一步證實RGNNV中的蛋白α能誘發 細胞凋亡與後凋亡細胞壞死現象，在凋亡機制方面，我們發現蛋白α誘發之細胞粒線體膜電位失衡與
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cytochrome c之釋放有關，最後發現抗凋亡蛋白zfBcl-XL的使用能減緩病毒導致之細胞壞死與病毒複製並 且提升細胞存活率。
結果：
神經壞死病毒蛋白α表現誘發石斑魚背鰭細胞株發生後凋亡細胞壞死
赤點石斑神經壞死病毒(RGNNV)中之小片段基因RNA2會轉譯出病毒外殼蛋白α，實驗中於GF-1細胞株中 大量表現RGNNV的RNA2基因，相較於轉染pcDNA3.1載體作為對照組之細胞，轉染pcDNA3.1-RNA2後 24小時即可表現出42 kDa的外殼蛋白α(圖1A:a, Lane4)，隨著時間增加蛋白α表現增多(圖1A:a, Lane5-6)；
實驗中以β-actin作為internal control(圖1A:b)。
RGNNV的病毒蛋白α能誘發GF-1細胞株發生凋亡，我們進一步證實病毒蛋白α能誘發後凋亡細胞壞死。轉 染EGNNV基因RNA2進入細胞後有以下幾個特徵：早期凋亡細胞(early apoptotic cells；EA)，中期凋亡細 胞(middle apoptotic cells；MA)以及後凋亡細胞壞死細胞(post-apoptotic necrosis cells；PN)，利用 Acridine orange (AO)和Ethidium bromide (EtBr)進行雙重染色來辨別各個時期之凋亡細胞。結果發現轉 染pcDNA3.1-RNA2的細胞因細胞膜結構崩解而染上EtBr而使細胞呈現橙紅色(圖1B: c與d；長箭頭所指 處)，呈現明顯後凋亡細胞壞死特徵；若細胞處於中期凋亡的細胞，細胞形態呈現圓化浮起，並且因為染上 AO而呈現綠色螢光(圖1B: c與d；短箭頭所指處)。如圖2E所示，轉染pcDNA3.1載體之細胞，僅有極少數 之細胞發生後凋亡細胞壞死而被染上EtBr (0小時0.7%；48小時2.7%；72小時3.7%)；轉染pcDNA3.1- RNA2 之細胞，隨著時間點增加，AO/EtBr double positive 的細胞數大幅增加(0小時佔1%；48小時佔 8%；72小時佔22%)。由上述實驗結果可證明：蛋白α大量表現可誘發GF-1細胞發生後凋亡細胞壞死。
圖一、赤點神經壞死病毒蛋白α誘發石斑魚細胞株GF-1發生細胞凋亡
(A)轉染RGNNV的RNA2基因第24小時、48小時與72小時後，於GF-1細胞株內表現蛋白α。(A:a) lane 1~lane 3為轉染pcDNA3.1後第24小時(lane1)，48小時(lane2)與72小時(lane3)的細胞樣本；lane 4~lane 6 為轉染pcDNA3.1-RNA2後第24小時(lane4)，48小時(lane5)與72小時(lane6)的細胞樣本。(A:b) internal control為actin。
(B )轉染RGNNV的RNA2基因第72小時，以AO/EtBr染色偵測細胞株壞死情形。AO和EtBr染色程度皆很 強的細胞，代表細胞走向後凋亡細胞壞死。(B:a) GF-1細胞轉染pcDNA3.1載體之位相差圖。(B:b) GF-1細 胞轉染pcDNA3.1載體之綠色螢光圖。(B:c) GF-1細胞轉染pcDNA3.1-RNA2基因之位相差圖。(B:d) GF-1細 胞轉染pcDNA3.1-RNA2基因之綠色螢光圖。短箭頭所指處為以MA表示細胞膜圓化浮起之中期凋亡細胞 (middle apoptotic cells)；長箭頭所指處為以PN表示細胞膜與細胞染色質呈現崩解之後凋亡壞死細胞 (post-apoptotic necrosis cells)。Scale Bar為10μm。
(C)每次針對兩百顆凋亡後壞死細胞進行量化分析，以t-tests進行檢定，*表示p < 0.02具有顯著性差異。
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蛋白α誘發GF-1細胞株發生粒線體膜電位失衡導致cytochrome c釋放
粒線體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)發生去極化時表示細胞將要走向粒線體所調控之 凋亡路徑。我們利用Mitocapture assay Kit偵測RGNNV的蛋白α在GF-1細胞株中表現後是否有粒線體膜電 位改變的情形，當細胞健康時粒線體膜電位正常，因此可以看到JC-1染劑聚集於粒線體上，形成橘紅色螢 光亮點；但是當細胞走向凋亡，粒線體膜電位流失，JC-1染劑就會擴散到整個細胞質並且發出綠色螢光。
實驗中將GF-1細胞分別轉染pcDNA3.1載體及pcDNA3.1-RNA2基因，轉染後第48小時以JC-1 dye進行染 色，轉染pcDNA3.1載體之細胞粒線體膜電位無明顯改變(圖2A, panel a為綠色螢光圖；panel b為紅色螢光 圖)；而轉染pcDNA3.1-RNA2之細胞在綠色螢光視野下，因橘紅色螢光亮點減弱而呈現明顯之亮綠色(圖 2A, panel c為綠色螢光圖；箭頭所指處為粒線體膜電位改變之細胞)，紅色螢光視野下紅色螢光亮點亮度明 顯減弱，(圖2A, panel d為紅色螢光圖；箭頭所指處為粒線體膜電位改變之細胞)。如圖2B所顯示，轉染 pcDNA3.1載體之細胞在轉染後24到72小時，都僅有極少數之細胞的粒線體膜電位產生改變(24小時佔 2%，48小時佔2%，72小時佔3%)；倘若轉染pcDNA3.1-VP5的細胞，也僅有少數細胞的粒線體膜電位改變 (24小時佔2%，48小時佔2%，72小時佔2%)；而轉染pcDNA3.1-RNA2之細胞，24小時有15%的細胞粒線 體膜電位改變，轉染後48小時有20 %的細胞粒線體膜電位流失，到第72小時已經有45 %的細胞有粒線體 膜電位產生改變，和對照組細胞與轉染pcDNA3.1-VP5的細胞皆有顯著差異。
為了進一步觀察粒線體內的蛋白cytochrome c釋放是否和蛋白α誘發膜電位改變有關。西方墨點法的結果 顯示，轉染pcDNA3.1-RNA2基因的細胞其粒線體中的cytochrome c會由粒線體(圖2C:a, lane2)釋放到細胞 質中(圖2C:a, lane4)；而轉染pcDNA3.1載體之細胞內的cytochrome c則仍存在於粒線體內(圖2C:a, lane1與 lane3)；實驗中以cytochrome c oxidase I作為internal control(圖2C:b, lane1-4)。由上述實驗結果可證明蛋 白α大量表現會誘發GF-1細胞粒線體膜電位失衡並且釋放cytochrome c至細胞質而參與粒線體調控之凋亡 機制。
圖二、赤點神經壞死病毒RNA2基因誘發GF-1細胞發生粒線體膜電位失衡
(A)轉染RGNNV的RNA2基因至GF-1細胞，以帶正電荷染劑偵測粒線體膜電位，當粒線體膜電位流失將以 紅色視野下螢光將減弱，而綠色螢光視野下螢光將增強。(A:a) 為轉染pcDNA3.1載體並以染劑染色後之綠 色螢光圖。(A:b) 為轉染pcDNA3.1載體並以染劑染色後之紅色螢光圖。(A:c) 為轉染pcDNA3.1-RNA2並以 染劑染色後之綠色螢光圖。(A:d) 為轉染pcDNA3.1載體並以染劑染色後之紅色螢光圖，箭頭所指處為粒線 體膜電位改變之細胞。
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(B )轉染pcDNA3.1載體、pcDNA3.1-VP5基因及pcDNA3.1-RNA2基因至GF-1細胞，以帶正電荷染劑偵測粒 線體膜電位流失之量化圖。以t-tests進行檢定，*表示p < 0.02具有顯著性差異。
(C) 轉染pcDNA3.1載體及pcDNA3.1-RNA2基因至GF-1細胞，轉染後48小時，cytochrome c從粒線體中釋 放至細胞質中。(圖C: a)西方點墨法使用之抗體為mouse-anti-cytochrome c之多株抗體；(圖C: b) internal control 為cytochrome c oxidase I。
Bcl-2家族抗凋亡蛋白zfBcl-xL抑制蛋白α所誘發之粒線體膜電位失衡
將RGNNV的RNA2基因轉染至GF-1細胞內進行大量表現，在第24與48小時可偵測到大小約42k Da的蛋白 α產生(圖3A:a, lane2-5)。大量表現zfBcl-xL轉染後第24與48小時可以在約60 kDa大小的位置偵測到zfBcl- xL的表現，相較於沒有轉染的細胞在第24小時有持續增加的表現；實驗中以actin作為internal control(圖 3c)。在圖3B內可以發現zfBcl-xL能有效防止粒線體膜電位流失，在轉染pcDNA3.1-RNA2基因的GF-1細胞 株內，轉染後第48小時，紅色螢光減少綠色螢光增加的細胞數目明顯增加(圖 3B；panels c；箭頭所指 處)，另一方面，在pcDNA3.1載體對照組及pcDNA3.1-RNA2共轉染zfBcl-xL的細胞株內，螢光則無顯著的 變化(圖 3B；panels c；箭頭所指處)。如圖3C所顯示，相較於轉染pcDNA31.載體對照組與轉染pcDNA3.1- RNA2，不論在第24小時或48小時，共轉染zfBcl-xL將有效阻止粒線體膜電位流失。
圖三、抗凋亡蛋白zfBcl-xL抑制RNA2基因所誘發之粒線體膜電位失衡
(A) (A: a, b)蛋白α與抗凋亡蛋白zfBcl-xL於GF-1細胞株內表現情形。於GF-1細胞株內表現蛋白α與抗凋亡蛋 白zfBcl-xL，收取總蛋白質後以西方點墨法分析，使用抗體為專一性辨認蛋白α之多株抗體，以及利用辨認 EGFP-zfBcl-xL融合蛋白的形式來確認zfBcl-xL的表現情形。lane1-3為轉染pcDNA31.-RNA2基因，於不同 時間點(第0小時、24小時及48小時)收取之總蛋白質樣本。Lane4-5為轉染pcDNA31.-RNA2基因並共轉染
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EGFP-zfBcl-xL基因，於不同時間點(第0小時、24小時及48小時)收取之總蛋白質樣本。(A:c) internal control為actin。
(B)(B: a, c, e)轉染pcDNA3.1(a)、pcDNA3.1-RNA2(b)及pcDNA3.1-RNA2+zfBcl-xL(e)至GF-1細胞株內之 綠色螢光圖。(B: b, d, f)轉染pcDNA3.1(b)、pcDNA3.1-RNA2(d)及pcDNA3.1-RNA2+zfBcl-xL(f)至GF-1細 胞株內之紅色螢光圖。
(C)轉染pcDNA3.1、pcDNA3.1-RNA2及pcDNA3.1-RNA2+zfBcl-xL至GF-1細胞株造成細腺體膜電位流失之 量化圖。以t-tests進行檢定，*表示p>0.01或p < 0.02具有顯著性差異。
結論：
在RGNNV在病毒感染早期則會出現下列症狀，大量死亡、泳鰾過度膨脹、腹部朝上、無力的掙扎漂浮、
體色改變（體色蒼白或體色變黑依魚種而定）、厭食伴隨螺旋狀或翻轉游泳、直線狂奔等神經症狀，組織 切片的結果可以發現在腦組織中形成空泡，並且在病魚的脊髓、視網膜及腦部均可以發現壞死的現象。目 前還無法解答betanodaviruses感染海水魚類所造成神經性退化的機制是否就是使魚隻無法正常游泳的原 因，過去的研究顯示RGNNV的感染過程將引發post-apoptotic necrotic cell death，並且使用ANT抑制劑 BKA將可抑制感染造成的粒線體膜電位流失，但是其中的詳細機制與粒線體受損後的下游路徑仍未被發 現。
在相關的研究中，我們首次發現蛋白α可以造成粒線體膜電位流失進促使粒線體cytochrome c的釋放，而 造成石斑魚細胞株發生第二型細胞壞死，除此之外，我們首次發表在魚類系統中大量表現抗凋亡蛋白 zfBcl-xL能夠阻止粒線體膜電位的流失，因此這個抗凋亡蛋白在於病毒治療的感染上具有一定的潛力。
