科技部補助專題研究計畫報告
利用微型核糖核酸區分無蒂鋸齒狀腺瘤及增生性息肉病理診斷 之研究
報 告 類 別 ： 成果報告 計 畫 類 別 ： 個別型計畫
計 畫 編 號 ： MOST 108-2314-B-006-091- 執 行 期 間 ： 108年08月01日至109年07月31日 執 行 單 位 ： 國立成功大學醫學系內科學科
計 畫 主 持 人 ： 陳威穎 共 同 主 持 人 ： 曾大千
計畫參與人員： 碩士級-專任助理：郭雅竫
本研究具有政策應用參考價值：■否 □是，建議提供機關
（勾選「是」者，請列舉建議可提供施政參考之業務主管機關）
本研究具影響公共利益之重大發現：□否 □是
中 華 民 國 109 年 10 月 30 日
中 文 摘 要 ： 背景：結直腸癌是台灣癌症發生率的第一位，也是第三大癌症死因
。研究顯示篩檢計畫可以早期診斷結直腸癌加以治療，並於大腸鏡 檢查時移除息肉，能降低死亡率與發生率。於常規篩檢大腸鏡檢查 中，12-36％的患者可發現無蒂鋸齒狀腺瘤(sessile serrated adenoma, SSA)，然而，因重疊的形態和病理學特徵，透過大腸鏡檢 查或組織病理，仍難以區分無蒂鋸齒狀腺瘤與增生性息肉
(hyperplastic polyp, HP)，造成監測大腸鏡時間無法有效施行。
微型核糖核酸(microRNA)，在癌化的過程中具有關鍵地位，且在無 蒂鋸齒狀腺瘤與增生性息肉的微型核糖核酸表現不同，故有機會用 以區分此二者，作為診斷的生物指標。
方法：本研究回溯性收集2015年7月1日至2016年12月31日的本院接 受大腸鏡檢查者且病理報告為SSA或HP。經由具經驗的病理科醫師再 判讀，做為黃金標準。之後分析每一位病患切下來的息肉石蠟包埋 標本中的微型核糖核酸，用以測試診斷SSA的準確度，作為測試階段
。
結果: 73位鋸齒狀腺瘤患者及114位增生性息肉之患者進入本研究
，經過有經驗之病理科醫師再判讀，SSA皆無改診斷；增生性息肉之 患者，有34位改診斷為鋸齒狀腺瘤，剩下80位無改診斷。兩組案例 比較 (SSA v.s. HP)，明顯的SSA組hsa-miR-30e-5p 及hsa-miR- 140-5p的表現高過HP組(具統計上的差異)。
結論: hsa-miR-30e-5p 及hsa-miR-140-5p二者未來有機會成為有用 的生物標的(biomarker)，用以區分鋸齒狀腺瘤與增生性息肉。
中 文 關 鍵 詞 ： 無蒂鋸齒狀腺瘤、增生性息肉、石蠟包埋標本、微型核糖核酸 英 文 摘 要 ： Background: The colorectal cancer is the first leading
incidence and ranks the third for cancer death in Taiwan.
Based on the Taiwan-national colon cancer screening program, early colorectal cancer detection rate and the survival are markedly improved. However, among patients who underwent routine screening for colonoscopy, 12% to 36% of patients had sessile serrated adenoma (SSA). Moreover, due to overlapping morphological and pathological features, it is still difficult to distinguish SSA from hyperplastic polyps (HP) by colonoscopy or histopathology, resulting in ineffective implementation of surveillance colonoscopy time. MicroRNAs are thought to have an impact on cell proliferation, apoptosis, stress responses, maintenance of stem cell potency, and metabolism and are, therefore, important in the carcinogenic process. Previous studies have indicated that microRNAs are different between SSA and HP. Therefore, it has the opportunity to be used as a
biomarker for clinical diagnosis of SSA.
Methods: We aim to test whether the expression of microRNAs from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue, can serve as biomarkers and improve the SSA diagnosis. The study was conducted to enroll the cases who underwent
Cheng Kung University Hospital from 2015/07/01 to
2016/12/31. The diagnosis was re-interpreted by experienced pathologists as the gold standard. MicroRNA was analyzed from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) specimens of each patient to predict the accuracy of SSA diagnosis and to serve as a test set.
Results: The study enrolled 73 cases with SSA and 114 cases with HP. After reviewed by a pathologist, all the SSA cases persisted with the same diagnosed. But 34 cases was changed to the diagnosis of SSA and 80 cases remained the diagnosis of HP in the 114 cases. Comparing to HP group, SSA had higher expression of hsa-miR-30e-5p and hsa-miR-140-5p (P<0.05).
Conclusion: hsa-miR-30e-5p and hsa-miR-140-5p, served as biomarkers, had the potential to differentiate SSA and HP.
英 文 關 鍵 詞 ： sessile serrated adenoma (SSA) , hyperplastic polyps (HP), formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue, microRNAs
科技部補助專題研究計畫成果報告
（□期中進度報告/▓期末報告）
（計畫名稱）
利用微型核糖核酸區分無蒂鋸齒狀腺瘤及增生性息肉 病理診斷之研究
計畫類別：▓個別型計畫 □整合型計畫
計畫編號：MOST 108－2314－B－006－091－
執行期間： 108 年 8 月 1 日至 109 年 7 月 31 日 執行機構及系所：國立成功大學醫學系內科學科
計畫主持人：陳威穎 共同主持人：曾大千
計畫參與人員：鄭維鈞、楊曉白、鄭修琦、陳柏潤
本計畫除繳交成果報告外，另含下列出國報告，共 ___ 份：
□執行國際合作與移地研究心得報告
□出席國際學術會議心得報告
□出國參訪及考察心得報告
本研究 具有政策應用參考價值： ▓否 □是，建議提供機關_______
(勾選「是」者，請列舉建議可提供施政參考之業務主管機關)
本研究具影響公共利益之重大發現：▓否 □是
中文摘要
背景：結直腸癌是台灣癌症發生率的第一位，也是第三大癌症死因。研究顯示篩檢計畫 可以早期診斷結直腸癌加以治療，並於大腸鏡檢查時移除息肉，能降低死亡率與發生率。
於常規篩檢大 腸鏡檢 查中， 12-36％ 的患者 可發現無蒂鋸 齒狀腺 瘤 (sessile serrated adenoma, SSA)，然而，因重疊的形態和病理學特徵，透過大腸鏡檢查或組織病理，仍難 以區分無蒂鋸齒狀腺瘤與增生性息肉(hyperplastic polyp, HP)，造成監測大腸鏡時間無法 有效施行。微型核糖核酸(microRNA)，在癌化的過程中具有關鍵地位，且在無蒂鋸齒狀 腺瘤與增生性息肉的微型核糖核酸表現不同，故有機會用以區分此二者，作為診斷的生 物指標。
方法：本研究回溯性收集 2015 年 7 月 1 日至 2016 年 12 月 31 日的本院接受大腸鏡檢查 者且病理報告為 SSA 或 HP。經由具經驗的病理科醫師再判讀，做為黃金標準。之後分 析每一位病患切下來的息肉石蠟包埋標本中的微型核糖核酸，用以測試診斷 SSA 的準 確度，作為測試階段。
結果: 73 位鋸齒狀腺瘤患者及 114 位增生性息肉之患者進入本研究，經過有經驗之病理 科醫師再判讀，SSA 皆無改診斷；增生性息肉之患者，有 34 位改診斷為鋸齒狀腺瘤，
剩下 80 位無改診斷。兩組案例比較 (SSA v.s. HP)，明顯的 SSA 組 hsa-miR-30e-5p 及 hsa-miR-140-5p 的表現高過 HP 組(具統計上的差異)。
結 論 : hsa-miR-30e-5p 及 hsa-miR-140-5p 二 者 未 來 有 機 會 成 為 有 用 的 生 物 標 的 (biomarker)，用以區分鋸齒狀腺瘤與增生性息肉。
關鍵詞：無蒂鋸齒狀腺瘤、增生性息肉、石蠟包埋標本、微型核糖核酸
英文摘要
Background: The colorectal cancer is the first leading incidence and ranks the third for cancer death in Taiwan. Based on the Taiwan-national colon cancer screening program, early colorectal cancer detection rate and the survival are markedly improved. However, among patients who underwent routine screening for colonoscopy, 12% to 36% of patients had sessile serrated adenoma (SSA). Moreover, due to overlapping morphological and pathological features, it is still difficult to distinguish SSA from hyperplastic polyps (HP) by colonoscopy or histopathology, resulting in ineffective implementation of surveillance colonoscopy time. MicroRNAs are thought to have an impact on cell proliferation, apoptosis, stress responses, maintenance of stem cell potency, and metabolism and are, therefore, important in the carcinogenic process. Previous studies have indicated that microRNAs are different between SSA and HP. Therefore, it has the opportunity to be used as a biomarker for clinical diagnosis of SSA.
Methods: We aim to test whether the expression of microRNAs from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue, can serve as biomarkers and improve the SSA diagnosis.
The study was conducted to enroll the cases who underwent colonoscopy with the diagnosis of SSA or HP in National Cheng Kung University Hospital from 2015/07/01 to 2016/12/31.
The diagnosis was re-interpreted by experienced pathologists as the gold standard. MicroRNA was analyzed from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) specimens of each patient to predict the accuracy of SSA diagnosis and to serve as a test set.
Results: The study enrolled 73 cases with SSA and 114 cases with HP. After reviewed by a pathologist, all the SSA cases persisted with the same diagnosed. But 34 cases was changed to the diagnosis of SSA and 80 cases remained the diagnosis of HP in the 114 cases. Comparing to HP group, SSA had higher expression of hsa-miR-30e-5p and hsa-miR-140-5p (P<0.05).
Conclusion: hsa-miR-30e-5p and hsa-miR-140-5p, served as biomarkers, had the potential to differentiate SSA and HP.
Keywords: sessile serrated adenoma (SSA) , hyperplastic polyps (HP), formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue, microRNAs
一、研究計畫之背景 1.前言
在 台 灣 結 直 腸 癌 已 居 所 有 癌 症 發 生 人 數 的 第 一 位(1 )，且 呈 現 每 年 快 速 增 加 的 趨 勢，民 國 105 年 有 一 萬 多 人 罹 患 此 癌 症 ， 並 有 超 過 五 千 人 因 大 腸 癌 死 亡 ， 占 所 有 癌 症 死 亡 之 第 三 位(2 )。 大 腸 癌 早 期 並 無 症 狀 ， 但 可 以 藉 由 定 期 接 受 篩 檢 而 早 期 發 現 早 期 治 療 ， 為 治 癒 率 很 高 的 癌 症(3 )，衛 生 福 利 部 國 民 健 康 署 從 民 國 93 年 起 開 始 推 動 50-69 歲 大 腸 直 腸 癌 篩 檢 服 務 ， 並 於 102 年 6 月 起 將 篩 檢 年 齡 調 整 為 50-74 歲 ， 若 是 糞 便 潛 血 陽 性 反 應 ， 應 進 一 步 接 受 大 腸 鏡 檢 查 ， 檢 查 時 如 有 發 現 病 兆 或 息 肉 時 ， 可 以 直 接 取 樣 做 切 片 或 是 切 除 息 肉。在 篩 檢 計 畫 每 30 人 可 以 發 現 1 人 檢查出息肉，每 300 人 可 以 發 現 1 人 檢出結腸直腸癌；
更有甚者，據 統 計 ， 糞 便 潛 血 檢 查 結 果 為 陽 性 者 ， 每 2 人 就 有 1 人 有 大 腸 息 肉 ， 每 22 人 就 有 1 人 為 結腸直腸癌。一般認為大部分的結直腸癌從早期的良性腺瘤性息肉（adenomatous polyp）
發展約 5~10 年後轉變為惡性。在結 直 腸 癌 篩 檢 計 畫 可 以 早 期 診 斷 發 現 約 三 成 以 上 的 第 零 期 或 第 一 期 大 腸 直 腸 癌 的 個 案(4 )， 當 在 施 行 大 腸 鏡 檢 查 時 如 發 現 息 肉 時 ， 可 以 直 接 切 除 ， 因 此 可 以 降 低 結 直 腸 癌 死 亡 率 ， 並 且 可 以 減 少 結 直 腸 癌 的 發 生(5 -6 )。
然而在接受常規篩查結腸鏡檢查的患者中，12％至 36％的患者發現有鋸齒狀結腸息肉（7-9）。 鋸齒狀息肉分為三種：增生性息肉（Hyperplastic polyp, HP），無柄鋸齒狀腺瘤（Sessile serrated adenoma, SSA ）和傳統鋸齒狀腺瘤（Traditional serrated adenoma, TSA）(10)。 SSA 和相對罕見的 TSA 都具有惡性潛力。 組織學上，SSA 通常具有基底隱窩擴張，其可呈現為 L 形或倒 T 形形態。
增生性息肉缺乏這些特定特徵（11）。 然而，由於重疊的形態學和病理學特徵，透過結大腸鏡檢查或 組織病理學將 SSA 與 HP 區分開來仍然很困難（12-13）。更有病例報告描述了由 SSA 引起的癌症，而 間期癌症更可能來自鋸齒狀途徑(14)。由之前的研究可知，病理科醫師診斷無柄鋸齒狀腺瘤的準確度 只為約七成(15)( Table 1)；甚至根據 Payne et al 的報導，有些醫院無 SSA 的診斷(16)。而指標大腸鏡 發現 SSA 的病患，多久應施行監測大腸鏡，目前的共識是大於 1 公分，具有異生(dysplasia)的特徵，
或為傳統鋸齒狀腺瘤，應於 3 年追蹤(17) (Figure 1)。若病理診斷不能區分出 SSA 或 HP，將造成監 測大腸鏡無法如實的施行，反而讓 HP 患者頻繁追蹤，而風險度較大之 SSA 未在三年施行監測大腸 鏡，而增加罹癌或進行性息肉的風險度。
Table 1. Community pathologists ’performance to diagnose hyperplactistic polyp and sessile serrated adenoma
Figure 1. The recommendation of surveillance colonoscopy for sessile serrated adenoma (SSA)
微型核糖核酸為 small noncoding RNA species，藉由與目標訊息核糖核酸 (target messenger RNAs)結合，微型核糖核酸可以調控訊息核糖核酸的穩定度及轉錄的效益(18)，其中有一些在細胞的 分化、增生、凋亡、對壓力的反應、維持幹細胞的能力及代謝扮演重要角色，故在癌化的過程中具 有關鍵地位(19-20)。文獻指出在特定的癌症，微型核糖核酸的表現失調，使目標基因(tumor suppressor gene)功能失效或目標基因 (oncogene)過於表現而促進癌症的形成，而提供了發展利用微型核糖核酸 作為偵測癌症的非侵襲性生物標的 (biomarker)(21)的機會。
根據 Kanth P 的研究指出，在 SSA 與 HP 息肉的微型核糖核酸表現不同，miR-31-5p、miR-135b-5p、
miR-378a-5p 經 RT-PCR 驗證後，其表現於 SSA 與 HP 或正常大腸黏膜確實不同 (22)，有機會用於 臨床 SSA 的診斷，然而實際的運用尚未有報導。另外，吾等亦以次世代定序的技術，分析 SSA 與 HP 息肉的微型核糖核酸表現，發現 miR-335-3p、miR-30e-5p、miR-140-5p 三個微型核糖核酸，在 SSA 與 HP 組織息肉表現不同(Figure 2)，診斷的準確度可以大於九成(AUC 分別為 0.914、0.914、
0.943，如 Table 2)。故本研究著眼於這六個微型核糖核酸是否有助於 SSA 的診斷，並以此分野不同 的病理型態，驗證於 3 年之監測大腸鏡之息肉檢出率，是否能區分出高風險與低風險息肉復發之病 患。
先前與此六個微型核糖核酸的研究如下: miR-31-5p 的表現與 BRAF 及 KRAS mutation 有關聯，
並與 cancer-specific mortality 有關，抑制 miR-31-5p 可降低癌細胞的侵犯與增殖(23)。miR-135b-5p, -373-3p, 183-5p, 142-5p, 200c-3p, 及 19a-3p 的表現 ，透過 MTUS1 (腫瘤抑制因子)而影響大腸癌的 生成(24)。而 miR-135b-5p，miR-1244，miR-3196 和 miR-628-3p 的表現與胃癌分化有關，存活分析 更進一步顯示 miR-135b-5p 的表現與胃癌存活相關(25)。miR-378a-3p 和 miR-378a-5p 在大腸癌細胞 系中表現顯著降低且於組織的表現顯著低於相鄰的正常結腸直腸粘膜組織。 miR-378a-3p 和 miR-378a-5p 與組織學分化和 TNM 分期顯著相關，也與大腸癌存活有關(26)。
miR-335-3p，miR-20a-3p，miR-23b-5p， miR-423-5p 和 miR-455-3p 通常於 Wnt/beta-catenin 胃 癌路徑中表現變弱(27)。又在潰瘍性大腸炎患者，於直腸乙狀結腸交界之處的六個微型核醣核酸 miR-335-3p，miR-146b-5p，miR-342-3p，miR-644b-3p，miR-491-3p，miR-4732，表現下降。這些 微型核醣核酸可能與在直腸乙狀結腸區域，潰瘍性大腸炎患者發展為大腸癌相關(28)。miR-30e 在人 類 P53 基因敲除大腸癌細胞中，是最顯著失調的微型核糖核酸。而 miR-30e-5p 亦是 P53 的新型直 接轉錄靶點，是腫瘤細胞遷移，侵襲和體內轉移的重要調節因子，部分經由 intergrin α-6 和 beta-1 作為新目標。MiR-30e-5p 通過誘導 G1 / S 細胞週期停滯顯著降低腫瘤細胞增殖，並經由誘導 P21 和 P27 表達而達成(29)。miR-140-5p 在大腸癌組織和細胞中顯著下降，miR-140-5p 的下調與晚期大腸 癌和較差的總體存活顯著相關。功能獲得和功能喪失研究均證明 miR-140-5p 透過抑制細胞增殖，
遷移和侵襲而充當腫瘤抑制因子。並藉由靶向 VEGFA 在大腸癌腫瘤發生和進展中具有腫瘤抑製作 用(30)。這些六個與相關的胃腸道癌化的機轉相關的微型核糖核酸，實在是有潛力成為區分 SSA 與 HP 的生物指標。
Table 2. The accuracy of miR-335-3p, 30e-5p and 140-5p, by NGS analysis, to differentiate Sessile serrated adenoma and Hyperplastic polyp
AUC Sensitivity Specificity
miR-335-3p 0.914 100% 80%
miR-30e-5p
0.914 85.7% 100%
miR-140-5p
0.943 100% 80%
Figure 2. Different microRNAs can differentiate SSA and HP
2. 目的
本計畫的特定目的(Specific aims) 如下：
第一年
1.1 重新檢視無蒂鋸齒狀腺瘤(sessile serrated adenoma, SSA)的診斷準確率
1.2 利用從福馬林固定石蠟包埋 formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE)標本切片中，測定 微型核糖核酸的表現(miR-31-5p、 miR-135b-5p、miR-378a-5p、miR-335-3p、miR-30e-5p、
miR-140-5p)，是否能協助分別無蒂鋸齒狀腺瘤(SSA)或增生性息肉(hyperplastic polyp, HP)的病理診斷
第二年
2.1 依據 FFPE 標本切片微型核糖核酸(miR-31-5p、 miR-135b-5p、
miR-378a-5p、miR-335-3p、miR-30e-5p、miR-140-5p)的診斷，比較二組 不同風險的病患於三年後監測大腸鏡息肉的偵測率
2.2 以 ROC 曲線，檢測在監測大腸鏡時，微型核糖核酸預測息肉再發的 風險
2.3 比較在息肉切除的前後，血清微型核糖核酸(miR-31-5p、
miR-135b-5p、miR-378a-5p、miR-335-3p、miR-30e-5p、miR-140-5p) 的變動
3. 重要性及國內外有關本計畫之研究情況：
(1).英國消化道醫學會指出未來關於 SSA 的研究，如何運用生物指標提升 SSA 的診斷及 減少病理科醫師間判讀的差異 (inter-observer variability )將是重要的課題(20) (Box 1)。
(2). 根據 Kanth P 的研究指出，在 SSA 與 HP 息肉的微型核糖核酸表現不同(19)，有機會 用於臨床 SSA 的診斷，然而實際的運用尚未有報導，本研究實為本國相當前衛的研 究。
Box 1. The research questions suggested by British Society of Gastroenterology (BSG)
4. 重要參考文獻之評述：
英國醫學會指出未來關於 SSA 的研究，如何運用生物指標提升 SSA 的診斷及減少病理 科醫師間判讀的差異 (inter-observer variability )將是重要的課題(16)。而指標大腸鏡發現 SSA 的病患，多久應施行監測大腸鏡，目前的共識是大於 1 公分，具有異生(dysplasia)的特徵，
或為傳統鋸齒狀腺瘤，應於 3 年追蹤(17)。然而未具備此特徵的 SSA，則未有十足的證據，
以資遵循。在 SSA 與 HP 息肉的微型核糖核酸 miR-31-5p, miR-135b-5p, miR-378a-5p 表現不 同(22)，相當有潛力成為診斷 SSA 的生物指標。
二、研究方法
1.本計畫採用之研究方法與原因 第一年
研究目的：
1.1 重新檢視無蒂鋸齒狀腺瘤(sessile serrated adenoma, SSA)的診斷準確率
1.2 利用從福馬林固定石蠟包埋 formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE)標本切片中，
分析微型核糖核酸的表現 miR-31-5p、 miR-135b-5p、miR-378a-5p、miR-335-3p、
miR-30e-5p、miR-140-5p)，是否能協助分別無蒂鋸齒狀腺瘤(SSA)或增生性息肉 (hyperplastic polyp, HP)的病理診斷
1.1 Patients inclusion and exclusion:
1.1.1 病患收案條件：本研究將回溯性收集 2015 年 1 月至 2017 年 12 月二年於成大醫院內 視鏡室施行大腸鏡且有施行息肉切除術，同時病理切片報告為無蒂鋸齒狀腺瘤(SSA)或增生 性息肉(HP)病理診斷。
1.1.2 病患排除條款：若病人小於 20 歲、有發炎性腸疾病(inflammatory bowel disease)、腸 結核、接受過非腫瘤切除之大腸直腸手術、鋸齒狀瘜肉症候群(serrated polyposis syndrome)、
或惡性腫瘤接受過系統性治療(包含全身性口服或注射之化學治療，但不包含局部性放射治 療)，即予以排除。
1.2 Study design:
1.2.1 病患基本背景記錄： 每一位納入本研究的病患，根據病歷加以收集基本資料：如年 齡、性別、身高、體重等，並儘量紀錄是否有高血壓或高血脂等病史，尤其是否使用阿斯 匹靈(aspirin)或非類固醇抗消炎劑 (non-steriod anti-iflammatory agents , NSAID)。
1.2.2 病理切片報告及指標大腸鏡為本研究的根本：搜尋病人的大腸鏡報告，若病人於三個 月內接受重覆大腸鏡，以完成之前鏡檢未完成的處置，則此兩次大腸鏡結果合併記錄作為 指標大腸鏡(index colonoscopy)。腸道準備情形、所發現之息肉大小、息肉位置、息肉數量 及病理診斷，都予以記錄。
1.2.3 由具經驗的病理科醫師重新讀片為本研究之根本：由具經驗的病理科醫師，依據 WHO 的定義(10)，將所收集的石蠟包埋(FFPE)標本重新判讀作為診斷的黃金標準，計算於此段時間 例行檢查病理報告，無蒂鋸齒狀腺瘤(SSA)的診斷準確率。
1.2.4 對收集的石蠟包埋(FFPE)標本進行微型核糖核酸檢驗：檢測每位病患石蠟包埋(FFPE)標 本 之 微 型 核 糖 核 酸 (miR-31-5p 、 miR-135b-5p 、 miR-378a-5p 、 miR-335-3p 、 miR-30e-5p 、 miR-140-5p)的強度。
1.2.5 病人分組： 根據 WHO 的定義，由具經驗的病理科醫師重新分類，區分為以下二組：
S. 無蒂鋸齒狀腺瘤(SSA)組(S group) P. 增生性息肉(HP)組(P group)
1.2.6 不同息肉復發風險，病人之個案數：S 組病人帶有大腸息肉(癌症)復發風險，為本研究 主要研究對象;而 P 組則作為對照組。本研究預計每一組納入 50 位病人，檢測每位病患石蠟 包 埋 (FFPE) 標 本 之 微 型 核 糖 核 酸 (miR-31-5p 、 miR-135b-5p 、 miR-378a-5p 、 miR-335-3p 、 miR-30e-5p、miR-140-5p)的表現，並且比較在 2 組不同風險的病患，其石蠟包埋(FFPE)標本 之微型核糖核酸表現是否不同?。並用每一石蠟包埋(FFPE)標本之微型核糖核(miR-31-5p、
miR-135b-5p、miR-378a-5p、miR-335-3p、miR-30e-5p、miR-140-5p)表現，預測 SSA 的準確 度，以 ROC 曲線表示，此階段為測試階段 (test set)。
1.3 測定石蠟包埋(FFPE)標本之微型核糖核酸
1.3.1 miR-31-5p 等的測定：將每位病患指標息肉組織以市售套組(Applied Biosystems, Foster City, CA) & (Qiagen, Valencia, CA, USA) 加以萃取 RNA，隨後拿取 50ng RNA 以市售套組 (Qiagen)與 miR-31 的引子合成 cDNA。最後用 StepOne™ Real Time PCR System for PCR of
1.3.3 miR-31 等的比較：由於現今微型核糖核酸並無絕對標準檢驗值，故用 C.elegans miRNA(cel-miR-39)的比較值為其表現(31-33)。
1.4 統計方法：
2 組之間的背景資料，屬於連續變項，如年紀，身高，體重等，之間的比較以 Student’s t 來 計算。組織微型核糖核酸表現則以 Mann-Whitney U test 比較。而屬於類型變項如性別等項目，
利用Pearson’s chi-square test，employing Yates’ correction for continuity 或是 Fisher’s exact test 來計算在各組病患的差異。所有的統計皆是雙邊檢定，P 值< 0.05 視為有統計上的意義。
第二年 研究目的:
2.1依據 FFPE 標本切片微型核糖核酸(miR-31-5p、 miR-135b-5p、
miR-378a-5p、miR-335-3p、miR-30e-5p、miR-140-5p)的診斷，比 較二組不同風險的病患於三年後監測大腸鏡息肉的偵測率是否不同 2.2 以 ROC 曲線，檢測在監測大腸鏡時，微型核糖核酸預測息肉再發 的風險
2.3 比 較 在 息 肉 切 除 的 前 後 ， 血 清 微 型 核 糖 核 酸 (miR-31-5p 、 miR-135b-5p 、 miR-378a-5p、miR-335-3p、miR-30e-5p、miR-140-5p)的變動
2.1 Patients and study design:
2.1.1 根據微型核糖核酸診斷的病理分型分為息肉復發高風險組(H 組)及息肉復發低風險組(L 組)2 組，擴充至每組 200 位病患：
經重新判讀病理報告可能有下列四種狀況:
A 組:SSA to SSA；B 組:SSA to HP；C 組:HP to SSA；D 組: HP to HP。
AC 二組為息肉復發高風險組(H 組)，而 BD 二組為息肉復發低風險組(L 組)，擴充至每組(H & L ) 各 200 位病患。於施行指標大腸鏡 3 年後，邀集病患施行監測大腸鏡(surveillance colonoscopy)，
取得病人告知同意書之後，抽血 10cc 並收集所切除的息肉，以測定息肉組織及血清微型核糖核 酸的表現。
2.1.2 在施行監測大腸鏡時，息肉的檢出，各組的比較：AC 二組為息肉復發高風險組(H 組)，
BD 二組為息肉復發低風險組(L 組)。比較 H & L 二組息肉的檢出比率。
2.1.3 血清微型核糖核酸與息肉復發是否相關聯：探討息肉組織與血清微型核糖核酸 (miR-31-5p、 miR-135b-5p、miR-378a-5p、miR-335-3p、miR-30e-5p、miR-140-5p)的表現，
在息肉復發高風險組(H 組)及息肉復發低風險組(L 組) 2 組病患是否相關聯。
2.1.4 比較息肉檢出後施以息肉切除術，各組內的比較：比較息肉切除術的前後，息肉復發 高風險組(H 組)及息肉復發低風險組(L 組)，各組的血清微型核糖酸(如 miR-31 等)，在息肉 切除後是否明顯下降或(上升) 。
2.2 組織及血清 MicroRNAs 的測定：
組織息肉及血清測定微型核糖酸 (miR-31-5p…)：將病患息肉組織以市售套組(Applied
之微型核糖酸的引子合成 cDNA。最後用 StepOne™ Real Time PCR System for PCR of cDNA 測定微型核糖核酸的表現。
2.2.2數據處理方法為△△ Ct 法(2-△△ Ct)：Ct 設為反應達到域值時的循環數。
2.2.3 miR-31 等 的 比較 ： 由 於 現 今 微 型 核糖 核 酸 並 無 絕 對 標 準檢 驗 值 ， 故 用 C.elegans miRNA(cel-miR-39)的比較值為其表現(31-33)。
2.2 統計方法：
2 組之間的背景資料，屬於連續變項，如年紀，身高，體重等，之間的比較以 Student’s t 來計 算。組織微型核糖核酸表現則以 Mann-Whitney U test 比較。而屬於類型變項如性別等項目，
利用Pearson’s chi-square test，employing Yates’ correction for continuity 或是 Fisher’s exact test 來計算在各組病患的差異。每一組不同大腸侵襲性息肉復發風險組的病患，其指標息肉組織 及血清微型核糖核酸相關的比較，則由Pearson’s correlation 分析。切除息肉前後的血清微型 核糖核酸比較則用 Wilcoxon test。所有的統計皆是雙邊檢定，P 值< 0.05 視為有統計上的意 義。利用 Mann-Whitney
三、結果與討論
從 2015/07/01 至 2016/12/31，本院內視鏡室總共有 107 位鋸齒狀腺瘤患者(sessile serrated adenoma, SSA)，2019 位增生性息肉(hyperplastic polyp, HP)，84 位二者皆有之診斷。我們從中 去除有癌症史，大腸開刀史，潰瘍性大腸炎，或 traditional sessile adenoma (TSA)者，總共有 73 位鋸齒狀腺瘤患者進入本研究。而在 2019 位增生性息肉(HP)患者中，我們挑選息肉大小
≥0.7 公分者，總共有 114 位進入本研究。在 73 位鋸齒狀腺瘤患者，經過有經驗之病理科醫師 再判讀，皆無改診斷者；在 114 位增生性息肉之患者，經過有經驗之病理科醫師判讀，有 34 位改診斷為鋸齒狀腺瘤，剩下 80 位無改診斷，仍為增生性息肉之診斷 (Figure 3.)。 兩組案 例比較 (SSA v.s. HP)，明顯的 SSA 組 hsa-miR-30e-5p 及 hsa-miR-140-5p 的表現高過 HP 組(具 統計上的差異)；而 hsa-miR-10a-5p 及 hsa-miR-335-3p 的表現則無統計上的差異(Figure 4.)。
增生性息肉之患者，其監測 (追蹤)時間根據 US multi-society task force on colorectal cancer 建議，10 年即可，然而若是為鋸齒狀腺瘤則應縮短監測 (追蹤)時間為 3 年(< 1 公分，5-10 顆)；
3 至 5 年(< 1 公分，3-4 顆) 或 5 至 10 年(< 1 公分，1-2 顆)。透過本研究可知增生性息肉者有 29.8% (=34/114)改診斷，以本研究區間總共有 2019 位病患為增生性息肉診斷，估計將有 601 位病患將改診斷。本研究利用 NGS 找出之 hsa-miR-30e-5p 及 hsa-miR-140-5p，驗證區分鋸 齒狀腺瘤與增生性息肉，有好的鑑別度。可以幫助病理科醫師對鋸齒狀腺瘤與增生性息肉之 診斷，可以正確區分，讓臨床監測大腸鏡能法如實的施行，並且讓增生性息肉患者降低頻繁 追蹤。甚至對風險度較大之 SSA 患者在三年、三至五年、或五至十年施行監測大腸鏡，以減 少罹癌或進行性息肉的風險度。hsa-miR-30e-5p 及 hsa-miR-140-5p 二者未來實在有機會成為 有用的生物標的(biomarker)，對於臨床將有大大的助益。
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Figure 3. 本研究之研究架構
Figure 4. 四種不同之微型核糖核酸於鋸齒狀腺瘤及增生性息肉之患者二組之比較
108年度專題研究計畫成果彙整表
計畫主持人：陳威穎 計畫編號：108-2314-B-006-091-
計畫名稱：利用微型核糖核酸區分無蒂鋸齒狀腺瘤及增生性息肉病理診斷之研究
成果項目 量化 單位
質化
（說明：各成果項目請附佐證資料或細 項說明，如期刊名稱、年份、卷期、起 訖頁數、證號...等）
國
內 學術性論文
期刊論文 0
研討會論文 0 篇
專書 0 本
專書論文 0 章
技術報告 0 篇
其他 0 篇
國
外 學術性論文
期刊論文 0
研討會論文 0 篇
專書 0 本
專書論文 0 章
技術報告 0 篇
其他 0 篇 整理資料投稿中
參 與 計 畫 人 力
本國籍
大專生 0
人次
碩士生 0
博士生 0
博士級研究人員 0
專任人員 0
非本國籍
大專生 0
碩士生 0
博士生 0
博士級研究人員 0
專任人員 0
其他成果
（無法以量化表達之成果如辦理學術活動
、獲得獎項、重要國際合作、研究成果國 際影響力及其他協助產業技術發展之具體 效益事項等，請以文字敘述填列。）
科技部補助研究計畫涉及臨床試驗之性別分析報告
日期：109 年 10 月 30 日
