細胞學實驗細胞學實驗細胞學實驗細胞學實驗

(1)

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細胞學實驗細胞學實驗細胞學實驗細胞學實驗

請尊重智慧財產權請尊重智慧財產權請尊重智慧財產權請尊重智慧財產權

禁止複製或拷貝

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禁止複製或拷貝

(2)

細細細

細胞之繼代培養胞之繼代培養胞之繼代培養胞之繼代培養 Subculture of Cells

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細胞學實驗細胞學實驗細胞學實驗細胞學實驗

實驗步驟與示範教學

實驗步驟與示範教學實驗步驟與示範教學

實驗步驟與示範教學

(3)

3

目的目的目的

目的：：：使學生瞭解貼附性細胞之繼代培養方法：使學生瞭解貼附性細胞之繼代培養方法使學生瞭解貼附性細胞之繼代培養方法使學生瞭解貼附性細胞之繼代培養方法

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細胞之繼代培養

(4)

原理：

• 本實驗使用3T3細胞為實驗材料，3T3細胞是貼附性生長的細胞，當細胞生長至佔滿整個培養皿時，細胞會停止生長進入平穩期，若繼續培養，細胞會因營養物耗盡，代謝物增加，生長環境惡化而進入死亡期。

• 若要維持細胞的存活，即須進行繼代培養。

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細胞之繼代培養

(5)

• 3T3細胞生長至 25T-培養盤7-8分滿，即需進行繼代培養。右下圖為利用倒立式顯微鏡，以 10倍目鏡及10倍物鏡下觀察之3T3細胞。

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貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

(6)

• 先將trypsin-EDTA回溫至37℃。

• 於無菌操作台內，將 25T-培養盤內的培養液取出至廢液桶。

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貼附性細胞之繼代培養

(7)

7

• 再以5 ml PBS輕輕清洗細胞。

• 將PBS取出至廢液桶。

• 重複上述步驟，以PBS再清洗一次。

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貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養

PBS

(8)

• 加入1 ml已回溫之 trypsin-EDTA 溶液。

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Trypsin-EDTA (in PBS), pH 7.4 Trypsin (1:250) 0.125 % EDTA 2.7 mM Glucose 5.6 mM

藥品：

貼附性細胞之繼代培養

(9)

9

• 輕搖25T-培養盤，並且用手指頭輕敲底部，讓貼附之3T3細胞懸浮。

• 在倒立顯微鏡下觀察，

確定細胞完全懸浮。

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貼附性細胞之繼代培養

(10)

• 立即加入10 ml冰冷之DMEM培養液(內含10% BCS) 。

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貼附性細胞之繼代培養

(11)

11

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• 以玻璃吸管反覆吸放數次，使細胞與培養液充份混合，以達到完全抑制trypsin作用之目的。

貼附性細胞之繼代培養

(12)

• 將細胞懸浮液全移至 15 ml離心管。

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貼附性細胞之繼代培養

(13)

13

• 於4℃，以1800 rpm 離心10分鐘 (TONY-X 100)，使細胞沉澱。

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• 注意：離心管放置時須注意平衡。

貼附性細胞之繼代培養

(14)

• 以玻璃吸管吸去上清液，

要注意避免擾動到沉澱之細胞。

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貼附性細胞之繼代培養

(15)

15

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• 立即加入 5 ml DMEM培養液(含 10% BCS)，並反覆吸放使沉澱之細胞完全懸浮。

• 重複上述離心步驟清洗細胞兩次，以達完全將

trypsin去除之目的。

貼附性細胞之繼代培養

(16)

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• 離心去上清液後，加入1 ml(或適量)DMEM培養液

(含 10% BCS)，使細胞懸浮，

注意應將細胞打散成單一細胞，以提高細胞計數的準確度。

• 取出0.1 ml的細胞混合液，

放入1.5 ml小管，準備進行細胞計數。

貼附性細胞之繼代培養

(17)

17

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• 加入0.1 ml之0.5%錐蟲藍染劑充分混合 (此時細胞濃度為1:1稀釋)。

貼附性細胞之繼代培養

(18)

• 細胞計數器使用前，先將計數盤及蓋玻片以二次水清洗，再用無塵紙將水份按壓乾淨，切記勿用力擦拭。

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• 注意：細胞計數器所使用的蓋玻片，長寬高分別為22 x 22 x 0.4 mm，

與一般蓋玻片不同(18 x 18 x 0.2 mm)。

貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

(19)

• 使用前，先將蓋玻片放在細胞計數器上，且須蓋到上下計算室的凹槽尖端處，

如右圖所示。

• 將細胞混合液分別由計數器兩邊的凹槽加入。

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• 注意：加入時勿移動到蓋玻片，否則會影響到細胞計數的準確度。

上計算室上計算室上計算室上計算室下計算室下計算室下計算室下計算室

凹槽尖端凹槽尖端凹槽尖端凹槽尖端

貼附性細胞之繼代培養

(20)

• 在倒立式顯微鏡下，計算細胞計數盤九宮格中的細胞數目，並帶入公式以求得細胞濃度。

• 細胞總數較多時，使用公式 1；細胞總數較少時，使用公式2。

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貼附性細胞之繼代培養

(21)

21

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• 公式公式公式1：公式：：：

Cells/ml (每ml之細胞數)

= [上、下計算室九宮格之中間一大格

^(編號5)

細胞總和] /2 x 細胞稀釋倍數 x 10

⁴

• 舉例：

小明於上、下計算室九宮格之中間一大格

(編號5)

，分別為237及245個細胞，

而稀釋倍數為兩倍，所以計算結果如下：

[(237+245) / 2] x 2 x 10

⁴

=482 x 10

⁴

cells/ml

=4.82 x 10

⁶

cells/ml

九宮格九宮格九宮格九宮格之中間之中間之中間之中間一大格一大格一大格一大格

上計算室上計算室上計算室上計算室

下計算室下計算室下計算室下計算室

貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養

1 2 3

4 5 6

7 8 9

A. 細胞計數器細胞計數器細胞計數器細胞計數器

B. 細胞計數器上計算室或下計算室顯示之九宮格細胞計數器上計算室或下計算室顯示之九宮格細胞計數器上計算室或下計算室顯示之九宮格細胞計數器上計算室或下計算室顯示之九宮格 A.

B.

(22)

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• 公式公式公式公式2：：：：

Cells/ml(每ml之細胞數)

＝[上、下計算室

^(編號1-9)

九宮格之細胞總和]/ 18 x 細胞稀釋倍數 x 10

⁴

• 舉例：

小花於上、下計算室九宮格

(編號1-9)

，分別數到936及1080個細胞，並且稀釋倍數為兩倍，所以計算結果如下：

[(936+1080) / 18] x 2 x 10

⁴

= 224x 10

⁴

cells/ml

= 2.24x 10

⁶

cells/ml

九宮格九宮格九宮格九宮格

上計算室上計算室上計算室上計算室

下計算室下計算室下計算室下計算室

1 2 3

4 5 6

7 8 9

貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養

A.

B. A. 細胞計數器細胞計數器細胞計數器細胞計數器

B. 細胞計數器上計算室或下計算室顯示之九宮格細胞計數器上計算室或下計算室顯示之九宮格細胞計數器上計算室或下計算室顯示之九宮格細胞計數器上計算室或下計算室顯示之九宮格

(23)

23

• 顯微鏡下，上或下計算室九宮格之中間一大格 ^(編號5) 細胞數應計數至少超過200個以上的細胞。

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上上上

上、、、下九宮格之中間一大格、下九宮格之中間一大格下九宮格之中間一大格下九宮格之中間一大格上計算室上計算室上計算室上計算室

下計算室下計算室下計算室下計算室

貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養

1 2 3

4 5 6

7 8 9

(24)

• 若此時細胞少於200個，應將細胞原液再離心一次，將細胞重新懸浮在少量體積之培養液，以達濃縮細胞數的目的，再重新計算細胞數。

• 或直接計數上下計算室共18 宮格之細胞數，再代入公式 2計算細胞濃度。

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上上上

上、、、、下共下共下共下共18宮格之細胞全數宮格之細胞全數宮格之細胞全數宮格之細胞全數上計算室上計算室上計算室上計算室

下計算室下計算室下計算室下計算室

貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養

1 2 3

4 5 6

7 8 9

(25)

25

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• 於無菌操作台內加入應回種之細胞數及5 ml含10%

BCS之DMEM培養液至新的培養皿。

• 將細胞靜置於37℃之5%

CO

₂

培養箱中。

貼附性細胞之繼代培養

(26)

• 使用37℃之5% CO

₂

培養箱前，需先使用70%酒精噴灑過的擦手紙，先擦拭培養箱門板之後再開啟。

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• 注意：勿將酒精直接噴在CO2細胞培養箱上，

而造成儀器受損。

貼附性細胞之繼代培養

(27)

27

• 細胞靜置於37℃之5%

CO

₂

培養箱中，待細胞緊貼於25T-培養盤後，隔天更換新鮮培養液。

• 若細胞7-8分滿即需要繼代培養。

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• 注意：細胞培養盤應避免放置在門邊，以免反覆開啟培養箱時造成細胞污染。

貼附性細胞之繼代培養

(28)

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細胞學實驗 細胞學實驗 細胞學實驗 細胞學實驗

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細胞學實驗 細胞學實驗 細胞學實驗 細胞學實驗

請尊重智慧財產權 請尊重智慧財產權 請尊重智慧財產權 請尊重智慧財產權

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細 細 細

細胞之繼代培養 胞之繼代培養 胞之繼代培養 胞之繼代培養 Subculture of Cells

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細胞學實驗 細胞學實驗 細胞學實驗 細胞學實驗

實驗步驟與示範教學

實驗步驟與示範教學 實驗步驟與示範教學

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目的 目的 目的

目的： ： ：使學生瞭解貼附性細胞之繼代培養方法 ： 使學生瞭解貼附性細胞之繼代培養方法 使學生瞭解貼附性細胞之繼代培養方法 使學生瞭解貼附性細胞之繼代培養方法

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細胞之繼代培養

細胞之繼代培養

細胞之繼代培養

細胞之繼代培養

原理：

• 本實驗使用3T3細胞為實驗材料，3T3細胞是貼附性生長的 細胞，當細胞生長至佔滿整個培養皿時，細胞會停止生長 進入平穩期，若繼續培養，細胞會因營養物耗盡，代謝物 增加，生長環境惡化而進入死亡期。

• 若要維持細胞的存活，即須進行繼代培養。

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細胞之繼代培養

細胞之繼代培養

細胞之繼代培養

細胞之繼代培養

• 3T3細胞生長至 25T-培 養盤7-8分滿，即需進 行繼代培養。右下圖為 利用倒立式顯微鏡，以 10倍目鏡及10倍物鏡下 觀察之3T3細胞。

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貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養 貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

• 先將trypsin-EDTA回溫 至37℃。

• 於無菌操作台內，將 25T-培養盤內的培養液 取出至廢液桶。

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貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

• 再以5 ml PBS輕輕清洗細胞。

• 將PBS取出至廢液桶。

• 重複上述步驟，以PBS再清洗 一次。

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貼附性細胞之繼代培養 貼附性細胞之繼代培養 貼附性細胞之繼代培養 貼附性細胞之繼代培養

• 加入1 ml已回溫之 trypsin-EDTA 溶液。

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Trypsin-EDTA (in PBS), pH 7.4 Trypsin (1:250) 0.125 % EDTA 2.7 mM Glucose 5.6 mM

貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

• 輕搖25T-培養盤，並且 用手指頭輕敲底部，讓 貼附之3T3細胞懸浮。

• 在倒立顯微鏡下觀察，

確定細胞完全懸浮。

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貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

• 立即加入10 ml冰冷 之DMEM培養液(內 含10% BCS) 。

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貼附性細胞之繼代培養

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• 以玻璃吸管反覆吸放 數次，使細胞與培養 液充份混合，以達到 完全抑制trypsin作用 之目的。

貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

• 將細胞懸浮液全移至 15 ml離心管。

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貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

貼附性細胞之繼代培養

• 於4℃，以1800 rpm 離 心10分鐘 (TONY-X 100)，使細胞沉澱。

細胞學實驗細胞學實驗細胞學實驗細胞學實驗

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細胞學實驗細胞學實驗細胞學實驗細胞學實驗

請尊重智慧財產權請尊重智慧財產權請尊重智慧財產權請尊重智慧財產權

禁止複製或拷貝禁止複製或拷貝

細細細

細胞之繼代培養胞之繼代培養胞之繼代培養胞之繼代培養 Subculture of Cells

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細胞學實驗細胞學實驗細胞學實驗細胞學實驗

實驗步驟與示範教學實驗步驟與示範教學

目的目的目的

目的：：：使學生瞭解貼附性細胞之繼代培養方法：使學生瞭解貼附性細胞之繼代培養方法使學生瞭解貼附性細胞之繼代培養方法使學生瞭解貼附性細胞之繼代培養方法

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• 本實驗使用3T3細胞為實驗材料，3T3細胞是貼附性生長的細胞，當細胞生長至佔滿整個培養皿時，細胞會停止生長進入平穩期，若繼續培養，細胞會因營養物耗盡，代謝物增加，生長環境惡化而進入死亡期。

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• 3T3細胞生長至 25T-培養盤7-8分滿，即需進行繼代培養。右下圖為利用倒立式顯微鏡，以 10倍目鏡及10倍物鏡下觀察之3T3細胞。

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• 先將trypsin-EDTA回溫至37℃。

• 於無菌操作台內，將 25T-培養盤內的培養液取出至廢液桶。

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• 重複上述步驟，以PBS再清洗一次。

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• 輕搖25T-培養盤，並且用手指頭輕敲底部，讓貼附之3T3細胞懸浮。

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• 立即加入10 ml冰冷之DMEM培養液(內含10% BCS) 。

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• 以玻璃吸管反覆吸放數次，使細胞與培養液充份混合，以達到完全抑制trypsin作用之目的。

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• 於4℃，以1800 rpm 離心10分鐘 (TONY-X 100)，使細胞沉澱。

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• 注意：離心管放置時須注意平衡。

要注意避免擾動到沉澱之細胞。

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• 立即加入 5 ml DMEM培養液(含 10% BCS)，並反覆吸放使沉澱之細胞完全懸浮。

• 重複上述離心步驟清洗細胞兩次，以達完全將

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注意應將細胞打散成單一細胞，以提高細胞計數的準確度。

放入1.5 ml小管，準備進行細胞計數。

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• 加入0.1 ml之0.5%錐蟲藍染劑充分混合 (此時細胞濃度為1:1稀釋)。

• 細胞計數器使用前，先將計數盤及蓋玻片以二次水清洗，再用無塵紙將水份按壓乾淨，切記勿用力擦拭。

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• 注意：細胞計數器所使用的蓋玻片，長寬高分別為22 x 22 x 0.4 mm，

貼附性細胞之繼代培養貼附性細胞之繼代培養

• 使用前，先將蓋玻片放在細胞計數器上，且須蓋到上下計算室的凹槽尖端處，

• 將細胞混合液分別由計數器兩邊的凹槽加入。

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• 注意：加入時勿移動到蓋玻片，否則會影響到細胞計數的準確度。

上計算室上計算室上計算室上計算室下計算室下計算室下計算室下計算室

凹槽尖端凹槽尖端凹槽尖端凹槽尖端

• 在倒立式顯微鏡下，計算細胞計數盤九宮格中的細胞數目，並帶入公式以求得細胞濃度。

• 細胞總數較多時，使用公式 1；細胞總數較少時，使用公式2。

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• 公式公式公式1：公式：：：

= [上、下計算室九宮格之中間一大格

細胞總和] /2 x 細胞稀釋倍數 x 10

小明於上、下計算室九宮格之中間一大格

，分別為237及245個細胞，