第一章 前言
第一節 研究背景
針灸是傳統的中醫治療體系裏重要之一環，自從一九七 0 年代傳入 歐美以後，西醫界便展開許多的研究。至今針灸的治療效果雖有爭議，
但針刺止痛(Acupuncture analgesia)的效果已被大家廣為接受
1，2，3，4，5。 除了傳統上將鋼針以捻轉插入穴位之機械性刺激方式外，利用鋼針通電 (即所謂的 Electroacupuncture，以下簡稱 EA)刺激穴位，也可獲得同樣或 更有效的止痛效果。
.然而，在西方醫學研究針刺止痛的試驗過程中，穴位的刺激方式和 強弱，一直是研究者極大的困擾。其中，針灸師所特別強調的“得氣”現 象(De Qi)
6，7，更是在操作過程中扮演者極為重要的角色。臨床經驗顯示:
針刺”得氣”感愈強，止痛效果愈明顯;反之，針刺”得氣”感不明確，則針 刺鎮痛往往失敗。甚至，許多研究學者認為:針刺穴位所引發的”酸麻脹 重”之所謂”得氣感”，其實就是一種深部組織的痛覺。不過雖然臨床上觀 察到此種眾所週知的現象，然而對於電針刺激強度是否需要達到傷害性 反應(nociceptive response)方能達到止痛效果，大部份看法仍是不明確且 存疑的。
第二節 目前電針動物模型研究方向
在動物模型中顯示電針止痛效果來自於去極化(depolarizing)週圍神
經的傳入性受体並活化脊髓內或高於脊髓層次(supra spinal level)的內源
性疼痛抑制系統
8。在此種動物模型的基礎上，許多的研究利用不同的
電針刺激參數探討”得氣”現象。目前已發現電針刺激頻率與止痛效果的
關聯性，那就是低頻刺激(少於 10Hz)，引發類嗎啡止痛系統
9。而高頻
刺激則導致非類嗎啡止痛系統的活化
10，11，12，13，14，15。相對於刺激頻率
對於電針止痛的定論。究竟如何方是電針止痛的最低刺激強度仍是充滿
爭議。到目前為止，只有少數的實驗探討刺激強度的止痛效果
16，17。另
外，究竟是傳導非傷害性知覺的較粗之傳入性神經，亦或是傳導痛覺的 較細之傳入性神經，在電針刺激下引發中樞神經之止痛作用?一般雖較 偏向前者，然而亦有研究者主張後者是電針止痛的必要條件。在電針止 痛的領域，這些都需要再作更深入研究，以獲得更進一步的暸解。
第三節 c-fos 細胞致癌基因與疼痛研究之背景介紹
世界疼痛醫學會(IASP)於 1986 年對” 疼痛”下了一定義，那就是”
疼痛是種在感覺及情緒上令人不愉快的經驗，伴隨有實際的或潛在的組 織傷害，或以此類言詞所描述的傷害”， 就此定義來看，如何在疼痛的 研究裏，忠實且客觀地反映出造成不愉快經驗的組織傷害之程度，以期 能顯示出疼痛之指數強度，就成為許多研究者探索之目標，因此尋找此 種疼痛指標(pain marker)即成為熱門的課題。幸運的是，由於分子生物 學研究的進步，進一步瞭解疼痛現象是一連串訊號傳遞的綜合結果。而 c-fos 細胞致癌基因(proto-oncogene)的表現則是當時研究早發性迅速基 因(immediate early gene，IEG)的熱門話題，於 1987 年 Hunt 等人首先將 這兩件事情連接起來，從此開啟了疼痛研究的嶄新紀元。他們利用不同 種類的刺激(疼痛/非疼痛)來誘發大白鼠脊髓背角區 Fos 蛋白的形成，以 免疫染色法將含有 Fos 蛋白的細胞核標示出來。結果証實有 Fos 標記的 神經細胞對於疼痛刺激是有選擇性的
18。不久之後，Bullitt 和 Basbaum 也分別使用不同的方式驗証了相同的結論。在麻醉及清醒狀態下，老鼠 脊髓背角的 Fos 活動度因傷害刺激(noxious stimulation)而大幅增加
19，20
。而在清醒狀態下，注射嗎啡不但減輕老鼠的疼痛反應。更降低 Fos-like 免疫染色度
21，22。
第四節 c-fos 細胞致癌基因於疼痛訊號傳遞所扮演之角色 分子生物學的研究証據顯示， 疼痛刺激從初級神經去極化開始，
透過突觸間傳遞及自由擴散的方式，將訊號送入中樞神經系統之神經細
胞核內，必須經過三級制訊號傳遞系統。其中初級訊號傳遞者負責訊號
的產生，次級訊號傳遞者誘導訊號放大，而三級訊號傳遞者則完成訊號 的維持與執行。最近的研究指出持續而強烈的疼痛刺激(特別是 c 型纖維 興奮)，釋放多種興奮性介質(如:substance P， CGRP， glutamate，
aspartate)---此即初級疼痛訊號傳遞者。開啟脊髓背角 NMDA 受器，湧 入大量鈣離子，並誘導 PKC 活化---典型的次級訊號傳遞者，它不僅啟 動許多本來沈息中的細胞質內酵素，製造一氧化氮和前列腺素等擴散性 介質，影響鄰近的神經元，提供興奮性修飾造成疼痛受區擴大(expansion of receptive field);更可經由一連串的調節因子，進入細胞核內誘導 c-fos 細胞致癌基因，轉錄為所屬的 Fos 蛋白(圖 1.1)。
Fost RM Am J Psychiatry 1992
圖 1.1 Fos 蛋白之誘導圖示
Fos 蛋白和另一種早已存在的 Jun 蛋白結合形成 AP-1-like 的物質(圖 1.2)，AP-1 在功能上是屬於誘發性轉錄因子，作用在 DNA 的特定區域 (AP-1 site)，AP-1 site 是啟動一些常用基因的必備基因(promoter gene)，
平常處於靜止狀態，一旦和 AP-1 結合後，可以很輕易地啟動轉錄後繼
基因(如 proenkephalin， prodynophin gene)。在此疼痛訊號傳遞過程中，
Fos 蛋白和其他同類型的早發性迅速基因，一起被稱為三級訊號傳遞者
23，24，25
。因而 Fos 蛋白是正常細胞核內的轉錄因子(transcriptional factor)，
在胞內訊號傳遞(signal transduction)中扮演著極為重要的角色，藉著 c-fos 致癌基因的激活，神經細胞核可以啟發一連串之蛋白質合成及細胞膜電 位改變的反應。
C-fos Cascade
c c--FosFos
AP-AP-11 c-c-JunJun-pp
AP-AP-1 site1 site LRGLRG c-c-fosfosgenegene
CRECRE c-c-JunJun-ppp
p
CREBCREB
圖 1.2 Fos 蛋白作用於 AP-1 site 圖示
第五節 c-fos 細胞致癌基因何以是理想的疼痛指標
c-fos 細胞致癌基因在疼痛刺激出現 5 分鐘就開始轉錄作用，30 分
鐘後在細胞核內便可出現其活化後產物 Fos 蛋白，約兩小時達到最高
峰，四小時後逐漸消失。而以 c-fos 細胞致癌基因的活動度來做為實驗
動物疼痛的指標，是近年來疼痛學研究中嶄新的方向
26，和傳統的疼痛
測驗最大的不同點: Fos 蛋白在神經核中的活動度可以用型態學的方法
固定，量化和比較，其精確性，可重覆程度及穩定性遠比傳統的行為觀
察法更為優異。以 c-fos 做為實驗動物疼痛指標有下列好處: (1)沒有接受
疼痛刺激的情況下，正常活動的清醒大白鼠其背角區幾乎完全沒有 c-fos
的表現，給予疼痛刺激後，在刺激同側背角負責痛覺的區域: lamina I/II/V，會出現大量的 Fos 蛋白，而在未受疼痛刺激的對側背角區則完全 沒有出現。顯示 Fos 對痛覺具有高度專一性
27，28，29。(2) Fos 蛋白平時含 量甚低幾乎無法測得，然而一旦經誘導出現後，含量大增，毋需再經過 其它強化程序，用標準的免疫染色法就可以染出，操作簡便，可信度極 高
30。(3)計算染有 Fos 標記的細胞核數目可以反應出刺激的強弱，具有 半定量的效果
29。(4)可以參考其分佈情形具有極佳的定位性(somatopical presentation)
31。(5)Fos 是核蛋白，所得到染色反應全部發生在細胞核內。
利用雙重染色法 (double labeling technique)，可以同時染出細胞質內其 它蛋白的活動，提供強烈的神經細胞 Fos 轉譯後訊息
32。(6)更重要的是，
Fos 的轉譯與調節機制已經在分子生物學的研究中得到強烈的佐証，與 細胞內訊息傳遞息息相關
33。因此，最近的研究一致推崇 Fos 免疫染色 法，是用來探索疼痛的神經活動方法中。極為理想的工具
34。
第六節 研究目的
綜合以上研究背景的認識，本實驗採用大白鼠動物模型。希望以電
針穴位止痛的方式探討”得氣”現象對止痛效果之影響。正如臨床上觀察
到氣感愈強，止痛效果愈明顯。我們將此”氣感之強弱”類推為刺激強度
參數，以不同之刺激強度，觀察大白鼠對傷害性傳入性訊號(疼痛訊號)
之行為反應，及脊髓背角神經核中 c-fos 活性表現之分子生物學上之証
據，以期探討刺激強度(氣感強度)與止痛效果之關連性。
第二章 文獻探討
一、 1993 林昭庚 新針灸大成 “針灸止痛機轉之探討”
1p991 林教授在本文中提及，在幾千年的發展過程中，針灸在疼痛性 疾病的應用，一直是相當重要的一環。像「內經」 、 「素問」裏 面就有「剌腰痛篇」專論各種腰痛的針灸療法。自從近三十年 來的研究結果可以發現，所有的證據都顯示針剌鎮痛主要藉由 內在抗痛系統之活化，進而調節體內痛覺之傳導與反應，消除 痛的感受與不適反應。這種神經系統內的活化和調節過程，必 須靠中樞神經系統不同層次的構造和許多傳導物質的整體統合 作用來完成。
二、 1979 Richards 等人在”Electroacupuncture analgesia could be mediated by at least two pain-relieving mechanisms;endorphine and non-endorphine systems”
11一文中，以 0.2，4 及 200Hz 不同之頻 率操作電針，並以 opioid antagonist(naloxone)及 serotonin
antagonist(parachlorophenylaline)作用，結果發現 Noloxone 能抑 制低頻電針作用，對高頻電針卻無作用。反之
parachlorophenylaline 作用於高頻電針，對低頻電針則無作用。
因此推斷電針針灸作用，可能至少有兩種疼痛緩解系統。
三、 1997 V.V. Romita 等人在”Parametric studies on
electroacupuncture-like stimulation in a rat model; effects of intensity， frequency， and duration of stimulation on evoked antinociception”
17一文中，提到不同的電刺激參數(譬如頻率，強 弱，時間)對是否達到合適的止痛效果是相當重要的。
四、 1987 Stephen P.Hunt 等人在“Induction of c-fos-like protein in
spinal cord neurons following sensory stimulation”
18一文中， 提到
傷害性熱源或化學刺激可造成較細的傳入性感覺神經纖維活
化，並使大白鼠脊髓背角淺層快速出現蛋白質免疫反應，他推論
經由突觸訊號的傳輸，也許可以快速誘導突觸後神經元之 gene 表現。
五、 1990 R.W. Presley 等人在“Systemic morphine suppresses noxious stimulus-evoked fos protein-like immunoreactivity in the rat spinal cord”
21一文中，他們的研究顯示， morphine 可同時抑 制大白鼠福馬林注射疼痛反應及脊髓背角 Fos 蛋白質免疫反應 度。
六、 1991 James I. Morgan 及 Tom Curran 等人
在”Stimulus-transcription coupling in the nervous system:
involvement of the inducible pro-oncogenes fos and jun”
24一文 中，詳細介紹 immediate early gene-fos 之發現背景，如何誘導 c-fos gene 之表現，其產物 Fos protein 如何在神經訊號傳遞中扮 演 transcription factor 之角色，以及 Fos protein 在神經系統中之 定位和其在神經生理上之功能。
七、 1990 Morgan Sheng 等人在 “The regulation and function of c-fos and other immediate early genes in the nervous system”
25一 文中，review 許多文獻，整理出清晰的架構，詳細介紹何謂 immediate early gene。 在神經細胞中，如何誘導出 IEG 之作用，
IGE 的調節作用，在分子生物學上如何由 neurotransmitters 及 membrane depolarization 調節轉譯作用之机轉，以及 IEG 在神經 系統上之作用。
八、 1998 Justin A. Harris 在”Usiing c-fos as a neural maker of pain”
26一文中 review 85 篇文獻，詳細介紹 c-fos 成為 pain maker 之經過，並且提出 c-fos 在研究應用上可能的限制，而這 種限制容易被忽略，影響研究的成果。
九、 1990 Elizabeth Bullitt 在“Expression of c-fos-like protein as a
maker for neuronal activity following noxious stimulation in the
rat ”
31一文中，提到 c-fos protein 雖然是很好的 noxious
stimulation maker。 然而，少數神經元在沒有傷害性刺激狀況
下，亦會有 Fos protein 免疫反應，譬如麻醉深度或沒有麻醉而被 束縛的老鼠。因此，為避免這些干擾因子，實驗設計必須十分小 心。
十、 1996 W.Z. Sun 等人在 “Nitrous oxide or halothane， or both，
fail to suppress c-fos expression in rat spinal dorsal horn neurons after subcutaneous formalin”
40一文中，其研究結果顯示全身麻醉 沒有前瞻止痛作用 (pre-emptive analgesia)，其無法改變福馬林注 射之大白鼠脊髓背角 c-fos 表現。此與 fentanyl 所得之降低結果 是有不同的，這個結果顯示大白鼠福馬林注射行為反應之抑制作 用，可能有止痛及非止痛雙重作用存在，因此利用全身麻醉之動 物模型，觀察其對疼痛之行為反應，無論在麻醉中或是麻醉結束 不久，都必須小心地評估。而 c-fos 活性表現是相當有用的相佐 方法。
十一、 1996 W.D. McCall 等人在 “Formalin induces biphasic activity in c-fibers in the rat”
42一文中，顯示其研究大白鼠單獨分離之
c-fiber，利用 formalin 予以刺激，記錄其電位變化，其結果呈現 與行為反應相似之雙相反應，這種結果與” c-fiber 活性增加導致 行為反應之雙相性”之假說是相符合。
十二、 1992 Odd-Geir Berge 等人在“The formalin test: an evaluation of the method”
44一文中，詳細介紹福馬林注射實驗雙相性之機轉，
其早期反應 (early phase)主要由 c-fiber 活化造成，其晚期反應 (late phase)則是因為週邊組織之發炎反應及脊髓背角，由於一連 串 c-fiber 訊號之刺激形成功能性改變之聯合效果所致。
十三、 1992 S.L. Jones 在 “Noradrenergic modulation of noxious heat-evoked fos-like immunoreactivity in the dorsal horn of the rat sacral spinal cord”
46之研究，其結果顯示，由熱刺激引起之 Fos 免疫染色度上升可被椎內給予 norepinephine(NE)所抑制，且與 施予劑量大小有關，其抑制效果可被 phentolamine—an
nonselective alph adrenoceptor antagonist， yohim6bine—an
alpha-2 adrenoceptor antagonist 及 prazosin—an alpha-1
adrenoceptor antagonist 所減弱，因此 NE 之抑制效果是透過脊椎 內 alpha-1 及 alpha-2 adreoceptor 運作。
十四、 1994 M.M. Morgarn 等人在 “Diffuse noxious inhibitory controls reduce the expression of noxious stimulus-evoked Fos-like
immunoreactivity in the superifical and deep laminae of the rat
spinal cord”
47之研究，以夾子重覆夾大白鼠之後肢，可使腰椎脊 髓內 Fos 免疫染色度上升，但若之前將其尾巴放置在 50
oC 熱水 中其 Fos 免疫染色度會明顯降低，顯示遠處傷害性制約刺激可抑 制神經元傷害性反應。
十五、 1986 Bruce Pomeranz 於 “Relation of stress-induced analgesia to acupuncture analgesia “
52一文中，詳細列舉六大理由証明壓力性 止痛作用與針灸作用是兩種不同現象。然而在針灸研究時，壓力 性止痛作用卻是必需考慮的干擾因子。
十六、 1997 Vito V. Romita 等人在 “Intense peripheral electrical
stimulation evokes brief and persistent inhibition of the nociceptive
tail withdrawal reflex in the rat”
54之研究，其結果顯示以低頻電針
強刺激穴位方式，大白鼠閃尾實驗，可觀察到兩種抗傷害性反
應。一種是電刺激中的短暫反應(20 分鍾)，此種反應由連續性突
觸活化所致。另一種效果則可持續超過一小時，其作用為透過脊
髓上位及脊髓內中樞神經可塑性變化所致。
第三章 材料與方法
第一節 動物準備及動物麻醉
在前導實驗(pilot study)中，我們比較四種麻醉濃度對閃尾時間之影 響，發現 1%的 Halothane 濃度及 30 分鐘的誘導期可以達到穩定的閃尾 時間曲線。(圖 3-1)
Effect of Anesthetic Concentration on Tail-flick Latency
Tail-flick latency (0.75% Hal), n=9
-0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
-30 -10 10 30 50 70 90Time
Tail-Flick Latency (1% Hal), n= 10
-0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
-30 -10 10 30 50 70 90 110
min
Tail-flick Latency (1.25% Hal), n= 8
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100min Tail-flick Latency (0.5% Hal), n=4
-0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
-30 -10 10 30 50 70 90 min
圖 3.1 四種 Halothane 濃度對大白鼠閃尾時間影響之曲線
1-1 動物準備
雄性 Sprague-Dawley 大白鼠，每隻體重約 250~300 克。
每三至五隻一組飼養於籠內，光照與熄燈各 12 小時，自由進
食。光照與熄燈各 12 小時﹐保持在安靜環境及最小的外界壓
力刺激。實驗室溫度維持恆溫 25℃﹐無噪音干擾﹐操作均由
固定人員並選擇上午 10;00 至下午 4;00 進行實驗。
1-2 動物麻醉
大白鼠先在透明壓克力箱內，以 2% 高濃度麻醉氣體 Halothane 昏迷後﹐改由面罩繼續吸入 1% Halothane 30min 以 達到穩定麻醉深度。在後肢足三里穴插針作電針刺激。麻醉 時間共 60 min (Time 60)，包括前面 30 分鐘的「誘導期」(使 麻醉深度穩定)，及後 30 分鐘的電針或無電針「實驗期」。大 白鼠呼氣端以氣體偵測器監視﹐維持恆定麻醉深度在 1%
Halothane。尾巴及後腳可自然露出管外。
第二節 電針模型(Electroacupuncture Model)
直徑 0.25 毫米的不銹鋼針，，插入大白鼠右側後肢足三里穴（S36）
的位置(圖 3.2)。
圖 3.2 大白鼠足三里穴位圖
傳統上許多電針研究利用此穴位來探討止痛機轉
35，36，37，38。 定位
方法為一對不銹鋼針﹐一根插入脛骨粗隆（tibial anterior tuberosity）和
腓骨頭（fibular head）間，距脛骨粗隆外下方約 5mm 處，另一根針插入
穴位下方約 5mm 處。電針刺激器(Grass model S88 dual channel stimulator)
連接在針頭裸露出皮膚的部份，輸出波寬 0.5mS，方形波，刺激頻率低
頻（4Hz） ；強度調整由零驗起增加至局部肌肉收縮(大約為 0.5V)，定義 此刻強度為電針閥值(Electroacupuncture analgesia threshold; EAT)。電針 刺激開始強度由電針閥值起，在大白鼠可忍受的範圍內(不因刺激而扭動 身體)﹐緩慢遞增至 10 倍或 20 倍 EAT 值﹐並維持此強度刺激 30 分鐘。
第三節 大白鼠閃尾實驗 3-1 實驗設計 (圖 3.3)
Tail Flick Test
Halothane 1% EA Stop anesthesia
-10 50
min
10 20
0 40 60 70
-30 30 80
TFT
TFT TFT TFT TFT TFT TFT TFT TFT TFT TFT
90
-15 100
Morphine Morphine
圖 3.3 大白鼠閃尾實驗步驟簡圖
120 分鐘的吸入性全身麻醉分成三段時期。(1)誘導期 (0~30 分鐘)。(2)電針(EA)處理期(30 ~60 分鐘)。(3)電針結束 後期(60 ~120 分鐘)。
將 25 隻大白鼠隨意分成四組(1)控制組(n=7)，僅麻醉 120
分鐘，沒有電針處理。(2)弱刺激組(10xEAT，n=6)，電針處理
期以 10 倍基礎疼痛閾值(basal latency)之強度刺激大白鼠。(3)
強刺激組(20xEAT，n=6)，以 20 倍基礎疼痛閾值之強度刺激
大白鼠。(4)Morphine 組(n=6)，電針處理期前大白鼠先以
2.5mg/kg 劑量之 Morphine 皮下注射。
3-2 閃尾實驗施行方式
熱源來自一紅外線發射器（功率可調整）照射於尾部尖端 1/3 一固定處。尾巴受熱刺激後因疼痛而移開的時間記錄為閃尾 時間(tail flick latency; TFL)，可由自動計時器記錄下來（自動計 時器為利用光的反射原理，所以不能將鼠尾完全塗黑） 。實驗期 前 10 分鐘先記錄三次 TFL，每次間隔 3 分鐘，平均三次時間，
定義為基礎疼痛閥值(basal latency)，調整功率使其約在 3~5 秒 間。經電針刺激開始後每隔 10 分鐘做三次，每次間隔 3 分鐘，
求三次的平均 TFL 作為此時段的 test latency，整個過程室溫維持 23±1°C。另定義 BL 的 2 倍為最長照射極限(cut-off limit)，約為 10 秒，超過這個時間則移開鼠尾，以避免不必要的組織傷害。
以下列公式求出最大可能效果(Maximal possible effect， MPE)。
(MPE)% = test latency - basal latency
cutoff limit - basal latency × 100%
第四節 大白鼠福馬林注射實驗及 c-fos 免疫生物化學分析 4-1 實驗設計 (圖 3.4)
Formalin Test
EA
-10 50
min
10 20
0 40 60 70
-30 -15 30 80 90 100
Formalin test Formalin test
Halothane 1% Stop anesthesia Sacrifice, c-fos
Morphine Morphine
0 1 2 3
Pain Score
圖 3.4 大白鼠福馬林注射實驗步驟簡圖
所有實驗組別之大白鼠麻醉 60 分鐘，保持 1%Halothane 濃度。前 30 分鐘為誘導期，接著 30 分鐘處理期。麻醉結束 後 5 分鐘，以福馬林注射有些組別之大白鼠左後腳底。所有 大白鼠於麻醉結束後 65 分鐘，予以犧牲(sacrificed)供作 c-fos 免疫細胞化學分析(Immunocytochemical study)。41 隻大白鼠 隨意分成六組(表 3.1)。
表 3.1 大白鼠福馬林注射實驗及脊髓背角 c-fos 活性表現實驗分組表 No. Group Halothane EA Formalin c-fos 1 C (Control) n=6 + − − + 2 EC (EA 20×EAT control) n=7 + + − + 3 FC (Formalin 1%) n=7 + − + + 4 E
1F (EA 10×EAT) n=7 + + + + 5 E
2F (EA 20×EAT) n=7 + + + + 6 Msc(Morphine 2.5mg/kg sc.) n=7 + − + +
( 1)控制組(C 組)，n=6。 (2)電針刺激-控制組(EC 組)，n=7。 (3) 福馬林-控制組(FC 組)，n=7。 (4)電針刺激-福馬林組(E
1F 10xEAT 組)，n=7。 (5)電針刺激-福馬林組(E
2F 20xEAT 組)，
n=7。 (6)Morphine 組(MF 組)，2.5mg/kg 劑量之 Morphine 於 處理期皮下注射，n=7。
4-2 電針刺激對大白鼠福馬林注射後行為變化及脊髓背角的 c-fos 表現之實驗步驟 :
I. 福馬林腳底注射方法(Subcutaneous Formalin Injection in the Plantar Surface of the Hindfoot)
準備 1.
濃度 1% 福馬林 5% 福馬林 飽和福馬林
(37%)
10 ìl 50 ìl
蒸餾水 990 ìl 950 ìl 總量 1000 ìl 1000 ìl
2.使用前配製，裝盛於4×6反應槽內 3. 1 ml注射空針
4. 布袋
劑量 50 ìl (=0.05 ml)
(注意！需將空氣排除乾淨)
注射 1. 將老鼠自尾部提起，以頭低腳高的方式讓老鼠自行爬入布袋 內。靜置一分鐘後，以左手手掌握住鼠體，輕微壓制在桌面 上，同手之食指及拇指握住小腿。
2. 針面朝上，以30度斜角(和足掌的夾角)由足底墊肉之間刺 入。
3. 自皮下往腳跟方向前進，在腳跟和墊肉間1/2處將藥水緩緩 推入，可看到水泡鼓起。
II. 福馬林疼痛行為加權評分法(由 Dubuisson 及 Dennis 提出
39，經 Sun 等人修飾
40。)
在注射後一小時內觀察老鼠的行為，不同的動作有不同的分
數。(表 3.2)將老鼠的分數乘上時間，每一分鐘統計一次，可得
老鼠的疼痛指數對時間關係圖。(圖 3.5)
表 3.2 福馬林疼痛行為加權評分法
加權分數 肢體 靜止時 行動中
(探索、直立、爬行)
０ 無痛
→fanning：腳趾完全張開，從下
方可看到腳趾露出於網外。
１ 半抬
→腳掌碰觸地面但小腿並未抬 起。
→
腳掌捲起用外緣觸地，由下方 看不到腳趾露出，但是腳跟仍 有觸地。
→
不敢施力
→
不敢將重量置於 該足
→
跛行 ２ 全抬
→腳掌懸空。
→
腳趾雖有接觸，但是膝關節彎 曲抬起，腳跟完全不觸地。
→
完全抬起
３ 舔、咬
→licking:舔舐該足
→
biting:咬
→
(flinch:該腳不斷顫抖)
→
irritable:極端不 安，反覆移動軀體
Pain Behavior in Formalin Test
0 1 2 3
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 m in
Pain Score
late phase late phase early phase
early phase
Tonic pain Tonic pain phasic pain
phasic pain
圖 3.5 大白鼠福馬林注射疼痛指數對時間關係圖
III. 固定液之灌流程序(Transcardial Perfusion)
麻醉 準備 rat 並稱其重量。
Pentobarbital(50mg/ml)之量(ml)=BW(gm) × 0.001
用 1ml 注射針抽取 pentobarbital 之量注入腹腔，如果沒有昏迷，
可再追加一次劑量。
準備器械 等待 rat 在昏迷狀態時，準備 perfuse 時所需的用具如：
(1)大剪、小剪各一支 (2)大中止血鉗各一支
(3)perfuse 用針頭一支(18G 鈍面注射針) (4)0.9% saline 以 1L 燒杯裝盛
(5)3.8%paraformaldehyde 500ml 以 1L 燒杯裝盛 (6)大鋁盤二個
(7)調整 pump：速度調整為 999 ml/hr，檢查兩條灌流管路是 否已沖滿液體，空氣是否已排除
步驟 陷入昏迷狀態後，仰臥姿態下使用大剪從腹部剪開，露出胸骨
下端之劍突軟骨，用大止血鉗來固定，沿著胸骨兩側向腋窩方
向剪開至看得到心臟為止。再用小剪將覆蓋於心臟上的胸腺從
中間剪開，便可看到 ascending aorta。先啟動 pump 確定輸液有
進入後，保持輸液流動狀態，將 18G 鈍面注射針從左心室插入
至 aorta 內 0.5cm，而後用中止血鉗夾住左心室心肌和針，以便
固定針頭在 aorta 內，再將右心房剪個洞以便構成一個循環。開
胸後鼠心很快產生心室震顫(ventricular fasciculation)，血循停
止，灌流必須在兩、三分鐘內完成，否則易形成小血管的血栓
及微血管滯留。然後將 0.9%NS 500ml 完成沖血，再將 pump 管
路轉換至 3.8% paraformaldehyde 以 500ml 半小時的速完成
fixation。
觀察 開始 perfuse 生理食鹽水及 paraformaldehyde 時都可以看到四肢 抽搐，手舞足蹈(fasciculation)的現象。沖血完全的鼠肝呈淺土 黃色，perfuse 完全的鼠肝質地堅硬。四肢及鼠尾僵硬完全沒有 彈性，右心房流出的液體清澈不帶血色。
IV. 取出大白鼠脊髓之程序(Spinal Cord Dissection) 準備器械
(1) 中小骨剪各一支
(2) 圓頭解剖刀及尖頭小解剖刀各一支 (3) 小尖剪一支
(4) 平頭小鑷一支 (5) 30% sucrose 50ml
(6) 3.8% paraformaldehyde 50ml (7) 5 ml 密閉玻璃罐
解剖 將 rat 腹部朝下，用圓頭解剖刀沿著背部脊柱中間將皮劃 開，再將脊柱兩旁肌肉劃開，而後用中骨剪將脊柱邊的肉處 理乾淨，而露出 T10-L6 的 transverse process。先從 L6 起，將 兩側 spinous process，transverse process 和 pars interarticularis 部份剪斷，再用小骨剪小心剪開 lamina，覆蓋在 spinal cord 上方的 lamina 及兩旁的 pedicle 剪斷，在此過程中應保留 dura matter 之完整。待全部的脊椎完全打開後再剪開 dura，取出 spinal cord cauda equina 部份用平頭小鑷夾住上翻，spinal nerves 及 T10 spinal cord 用小尖剪剪斷，用小尖刀在其腹部(實 驗側的對側)劃一道淺溝做記號以便認左右。
固定 所取出來的 spinal cord 置於 3.8% formaldehyde 約 4 小時，
而後置於 30% sucrose overnight。
V。 免疫組織染色操作法(Fos-Like Immunoreactivity)
－ 綱要 －
一、冷凍切片：-20℃， 40ìm 二、洗淨：
三、消除內源性過氧化氫酵素 四、洗淨：
五、前阻斷反應
六、初級抗體反應：1:600 rabbit anti-c-Fos polyclonal antibody， 室 溫下2小時
七、洗淨：
八、次級抗體反應：1:200， biotinylated goat anti-rabbit IgG 九、洗淨
十、聚鏈反應：1:50， ABC polymerization
1十一、洗淨：
十二、呈色反應：0.1%DAB＋0。01%H2O2 ＋0.2% nickel reaction 十三、洗淨：
十四、展片：0.4% gelatin + alcohol 十五、脫水、乾燥：
一、冷凍切片
(1)準備用具:
1.戴玻片一片 2.切片刀 3.雙面刮鬍刀 4.紗布
5.PBS約100ml 6.鑷子一把 7.毛筆一枝 8.快速冷媒劑
9.冷媒(Frozen specimen embedding medium，
Cryomatrix ， Shandon)
(非常重要！！)
(1)步驟:
(使用前)
1.先調溫度至攝氏-20℃降低廂內溫 度，約一小時。
2.切片刀用Acetone將油退掉 3.冷刀子
4.先用雙面刮鬍刀將spinal cord切成 二段約各0.5公分
5.切片台先鋪上冷媒讓其底部隆起，
置入冷凍，待其完全硬透。
6.各小段用快速冷媒劑豎立於切片台 上，冷凍至Tissue變硬，約半小時。
7.拉上捍子保護刀鋒
8.將台子放置固定台，台子放置lock 要先壓下調整
9.motor調整
*按至紅燈亮表示已到盡頭，需再往前 一些
10.盛片之盒子放入box裏面
11.培養皿分別label A、B、C、D分別 加入PBS約20ml
12.**將厚度設定為40 μm！
13.切時可用毛筆取出Tissue放入PBS
中
注意事項！！
→
將厚度設為40ìm
→
motor退至底部會亮起紅 燈，需再往前移一點
(使用後)
1.退刀(放置於擦手紙上等退溫至室 溫，保持乾燥，噴上機油，放置於 盒內
2.將motor退至後面
3.清理台子和box用清水清洗乾淨 4.調回溫度：box(-10℃)object(-10℃) 二、洗淨
(1)準備用具:
Wash Buffer
過程:
1. 用玻璃吸管將tube中Wash Buffer 吸乾，再加入新的W。B。如此重 覆三次，每次5mins
2. shaking(＋) 三、消除內源性過氧化氫酵素：
(1)準備用具 1. Wash Buffer 2. 30% H
2O
2(1)配製方法
W.B. 2.97 ml 30% H
2O
20.03 ml (30ìl)
(2)時間：10分鐘 (3)shaking：(+) (4)溫度：室溫
四、洗淨 (如步驟二)
五、前阻斷反應 (Blocking) (1)準備用具
1.NGS
2.Wash Buffer
(1)配製方法
Wash Buffer 2.7 ml NGS 0.3ml (6滴) (2)時間:20分鐘
(3)shaking:(+)
(4)溫度:室溫
六、初級抗體反應：
(1)準備用具：
1. rabbit anti-c-Fos antibody (1:600)
2. NGS
3. Wash Buffer
(1)配製方法：
W.B. 2.95 ml NGS 1滴 c-Fos Antibody 5 μl (2)時間:2小時
(3)溫度:室溫 (4)Shaking:(+)
七、洗淨 (如步驟二)
八、次級抗體反應:
(1)準備用具:
1.goat anti-rabbit (1:200) 2.NGS
3.W.B。
(1)配製方法:
NGS 2滴 secondary 1滴 W.B。 10 ml (2)時間: 1小時
(3)溫度: 室溫 (4)shaking:(+)
九、洗淨 (如步驟二)
十、聚鏈反應 (1)準備用具：
1.elite ABC complex (1:50，
Vectastain) 2.W。B。
注意！請 30分鐘前mix均勻！
(1)配製方法：
W.B. 10ml A 4滴 B 4滴 (2)時間:1小時 (3)溫度:室溫 (4)shaking:(+)
十一、洗淨: (如步驟二)
十二、呈色反應 (1)配製方法
(1)準備用具:
1.0.1% DAB 2.0.01% H2O2
3.nickel 6 mg/ml (0.2%) 4.Tris buffer
30mins前泡好 (6)注意事項
2。DAB需放置冷凍庫冷藏，
且因致癌度甚高，故取用時 需帶口罩及手套。反應完之 反應液及容器均需加入漂 白水浸泡並放置一天，之後 將此溶液倒入毒液收集瓶 中。
見Appendix I-9 (2)時間：6-10分鐘 (3)溫度：室溫 (4)shaking：(+)
A.試片
1.為防止組織染壞，先挑數片於(4※
6)反應槽進行先前之反應。
2.請先取用13μl 30% H2O2加入1ml Tris中，再抽其中50µl加入已製備妥 之 2 ml (DAB +Tris)溶液。
3.若呈色正常：
10×10倍數顯微鏡下可以清晰看出 深黑色顆粒的Fos-L4細胞核
背景可以清晰分辨出灰質和白質的 界限
B.正式反應。
十三、洗淨： 十次以上!!!
※千萬不可置入 4%
Paraformaldehyde！
十四、展片:
(1)準備用具：
1.slides 2.gelatin 3.毛筆
(1)配製方法：
1.gelatin 0.8 g加入112 c.c.之水 最後加入95%酒精100ml綜合 3.以1:1or1:2對水稀釋使用(因為不對
水使用則太黏稠) (2)注意事項:
1.挑選無破損之組織
2。挑選L4之組織 十五、脫水、乾躁：
(1)準備用具：
1.組織放入乾躁箱一天即可 2.準備alcohol 50%、75%、
95%、100%
xylene I，xylene II 3.mounting medium
(Entellen ， Merck or Permount ， )
4.蓋玻片 (30※40) 5.針頭一支
(2)過程：
1. 50% 酒精 3 分鐘 75% 酒精 3 分鐘 95% 酒精 3 分鐘 100% 酒精 6 分鐘 xylene I 6 分鐘
*注意此過程之溶液需2~3星期換新的 溶液使用過之xylene溶液請勿倒入 水糟中需收回入空玻璃瓶內 2.滴入mounting medium於戴玻片上 3.趁xylene未乾時蓋入蓋玻片，注意勿
讓氣泡存留於標本上
4.用指甲油塗抹於蓋玻片邊緣，防止
mounting medium之溶劑流失
VI. 切片觀察及記錄。(Inspection and Counting)
（一）準備工作 (Preparation)
封片： 將透明指甲油塗在蓋玻片與載玻片交接的邊緣以避免空氣 進入。
（二）選取適當的切片(Identification)
（1）辨識節片(identification of segment)：
在5×10之低倍率下，
逐一看過玻片上之切片並記錄出L4節片之位置
（2）篩選數量(screening for Fos-LI )：
10×10＋前聚焦鏡
逐一觀察切片中L4之節片之c-fos數量
記錄其約略數量為－－多、中等、少等三類
（3）挑選數量(maximal Fos-LI )：
依（2）記錄結果選擇出最多量之Fos-L4(10片)
（4）坐標的記錄(location)：
將切片的中央放置於顯微鏡中"＋"
記錄顯微鏡平台上縱軸及橫軸刻度（縱軸×橫軸）。
（三）攝影 (Photocopy)
（1）
坐標(Location)：
依坐標找出所需之切片
在5×10之低倍率下找出記錄中c-fos量最多的切片，按print一 次。
（2）
調整(Adjustment)：
10×10之中倍率，帶上前聚焦鏡 光度調至適當且調好焦距
若segment有傾斜則調整CCD，以利圖形之美觀度 找到segment之S＋NP部位
按print二次(暗，亮)
（3）螢幕上之影像往下移至下方D部位。
按print二次(暗，亮)
（四）分層計數法
（1）坐標(Location)：
在系列5張照片標明segment之坐標。
（2）分層(Lamination)：
根據2)S＋NP區(暗)和5)D區(暗)分界 用紅筆標出S及NP之界線。
（3）計數(Countings)：
以紅筆點出全部之深色細胞核
依照S區、NP區、D區記錄在照片上
（五）輸入電腦
（1）程式(Program)：
執行excel
開啟c-fos檔中間啟c-fos data（如圖所附）
SP no. L S NP D Total Page
（2）鍵入(Key in)：
將各組數據鍵入電腦中，若為12則存檔為 12.xls，依此類推 並依序編上頁數於表格及照片上。
（3）排列(Sort)：
總和依降冪排列
（4）列印出報表。
（六）建檔
（1）抄錄(Booking)：
在記錄本之前頁抄錄已計算出的數據及頁數，如圖所示：
Sp.No
座標位 置
L4 S NP D Page 其 他 data 125×15 IV
data 90×10 IV
（3）
黏貼(Attachment)：
照片依記載頁數在工作記錄本中。
第五節 統計分析
所有數據用 ANOVA(one way analysis of variance)分析，若有比較意
義，接著利用 Dunnett’s post-hoc test 比較閃尾時間，Fos-LI 標示神經元
數目，福馬林注疼痛加權評分等數據。p 值若小於 0.05 視為有統計上的
差異。
第四章 結果
第一節行為反應
所有大白鼠在麻醉中及麻醉結束後，都被仔細地觀察及評估其對電 針刺激之行為反應。在 1%濃度 Halothane 吸入性麻醉藥物作用下，大部 份大白鼠的角膜反射(corneal reflex)及耳翼反射(ear pinna reflex)並未消 失，而且在電針刺激過程中，沒有躁動及軀体移動的狀況發生，鋼針插 入處亦沒有血腫或局部組織水腫的現象，麻醉結束五分鐘內，老鼠行動 即恢復正常，沒有行走困難或舔後肢的情形。
第二節閃尾實驗
min
-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
MPE (100%)
-0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
C (n=7) E1(n=5) E2 (n=7)
EA
* * *
* *
*
**
** **
** **
** **
**
+ + + +
+
Analgesia produced by different EA intensities
<20×; 610×; =control
圖 4.1 大白鼠閃尾實驗結果曲線圖(一)
如圖 4.1 及圖 4.2 所顯示，控制組大白鼠的閃尾時間保持相當穩定，
不受 2 小時吸入性全身麻醉的影響。電針刺激不論弱刺激或強刺激相對
於控制組皆明顯地增加閃尾時間。兩組的止痛效果逐漸增加，在電針刺
激 20 分鐘後呈現較明顯的變化(P<0.05)。在 10xEAT 那組，兩個 MPE
高峰出現在電針刺激後 50 分鐘(31.74 ±8.4%)及 70 鐘(28.58±2.55%)，
然而 20xEAT 組則出現在電針刺激後 60 鐘(72.50±16.87%)及 90 鐘(71.04
±15.25%)，這種止痛效果遠遠超過電針刺激期間，而兩組皆可觀察到 MPE 值在個體間呈現頗大之差異。
將電針強弱刺激組予以比較，20xEAT 組相較於 10xEAT 組於電針 刺激停止後 30 分鐘，產生更強之止痛效果(P<0.05)，值得注意的是 20xEAT 組，在觀察期間(電針刺激停止後 60 分鐘)其止痛效果並沒減退，
相反地卻呈現穩定地上升。
EA min
-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
MPE (100%)
-0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
C (n=7) E2 (n=7)
Mor (n=5) +
+ + + Analgesic effect between EA and Morphine
<morphine; 620×;
圖 4.2 大白鼠閃尾實驗結果曲線圖(二)
第三節 福馬林疼痛反應實驗
EF，MF 及控制組皆呈現典型的雙相反應(biphasic response)(圖
4.3)。首先，強烈的機械性刺激，造成一連串初級傳入性神經纖維之活
動性提高，持續大約 5 分鍾(早期 early phase)，之後大約 10 分鐘短暫的
靜止間期，接著 40 分鐘，由於持續性的傷害受體(nociceptors)發炎性刺
激，導致初級傳入性神經纖維活動性上升(晚期 late phase)，這與許多報
告相似
41，42，43，44。無論 EF 或 MF 組相較於控制組於雙相反應晚期，皆
呈現較低的福馬林疼痛行為加權評分(P<0.05)，不過 EF 及 MF 組間沒有
統計學上的差異(P>0.05)。由於兩組於福馬林注射疼痛實驗中皆能表現
明顯的抗痛性效果(antinociceptive effect)，我們推論 EF 組其止痛效果相 當於 2.5mg/kg 劑量 morphine 的效力。除此之外，早期疼痛行為加權評 分沒有明顯下降，顯示出 EA 無法抑制短暫而強烈的機械性疼痛。(圖 4.3)由於在閃尾實驗中，我們觀察到於電針刺激結束後，EA 展現出超過 60 分鐘的後止痛效果(after-effect)。因此我們相信 EF 於晚期疼痛加權評 分明顯降低是由於電針刺激的影響。
min 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Weighted Score
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
* * *
* *
* * *
* * Formalin (n=6) E1 (n=7) E2 (n=7) M (n=7)
Comparison of Nociceptive Score at late phase
FC EA M
Weighted pain score
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
∗ ∗
圖 4.3 大白鼠福馬林注射實驗結果曲線圖
第四節 Fos 免疫染色度(Fos-like immunoreactivity)
無論 control 組及 EA-control 組在脊髓背角都僅呈現稀疏的免疫染色 反應(圖 4.4)。
圖 4.4 大白鼠 EC 組脊髓背角免疫染色反應圖
右側的背角神經元，也就是 EA 刺激同側，Fos-LI 細胞沒有呈現統 計上明顯的增加(P>0.05)(圖 4.5)。
C-fos Expression after EA Stimulation
Layers
S NP D T S NP D T
# FLI neurons / section
0 10 20 30 40 50
C EC
Control (Lt) Side EA (Rt) Side
No difference in c-fos expression between the EC group and Control group as well as EA stimulus side and non-stimulus side
圖 4.5 大白鼠 C 組及 EC 組脊髓背角 c-fos 活性表現柱狀圖 雖然過去推測 EA 強度若要獲致止痛效應，就要達到傷害性刺激的 程度。我們的結果顯示沒有活化背角中傷害接受神經元(nociceptive neurons)的表現。至於在 FC 組，於 1%formalin 注射左後肢後，同側背 角神經元明顯表現出 c-fos 的典型反應(圖 4.6)，
圖 4.6 大白鼠 EF 組脊髓背角免疫染色反應圖
尤其是在淺層(superfield layer)及深層(deep layer)，右側背角則少很 多。若 EA 或 2.5mg/kg 劑量 morphine 先前處理過，與 FC 組比較，則由 福馬林刺激造成的傷害性反應，呈現在 Fos-LI 細胞分別減少 25%及 20%，均較控制組有明顯差異(P<0.05)。若以解剖位置檢視，其降低主要 表現在深層(deep layer)(圖 4.7)。
Laminae
S NP D T S NP D T
# FLI neurons / section
0 20 40 60 80 100 120 140
FC EF MF
Formalin (Lt) Side EA (Rt) Side
* *
*
*
Both EA and morphine treatment could significantly attenuate the c-fos expression in deep layer of dorsal horn but have no effect on the superficial layer (* p <0.05 )
圖 4.7 大白鼠 FC 組 EF 組及 MF 組 c-fos 活性表現柱狀圖
EA 及 MF 組間其降低程度，在統計學上則無差異(P>0.05)。而在右
側背角 EF 組及 MF 組與 FC 組比較其 Fos-LI 細胞之表現則均無明顯差
異(P>0.05)。EC 組，左右兩側背角之 Fos-LI 細胞表現則亦無差異
(P>0.05)。
第五章 討論
第一節 電針刺激強度與止痛效果
我們的數據顯示，低頻電針穴位刺激在大白鼠閃尾實驗，可延長閃 尾時間，並且延長程度與刺激強度呈現正向關連性，亦就是說較強之電 針刺激對大白鼠之閃尾反射有較強之抑制作用。另外，我們的數據亦顯 示電針之強刺激亦可降低福馬林疼痛行為加權評分及減少脊髓中之 Fos-LI 神經元。然而，背角神經元之 Fos 免疫染色亦顯示，這些強刺激 並不致引起感覺接受區神經元 c-fos 表現的明顯上升。這些數據似乎暗 喻電針之止痛效果，在刺激強度沒有超過週圍神經傷害受體活化閾值，
其止痛效果是與其刺激強度成正向關係。
第二節 止痛機轉之探討
最近的研究已經証實脊髓背角神經元在接受傷害性刺激 (nociceptive stimulation)後，其 Fos 活性表現在與刺激區同皮節
(dermatome)之 脊髓神經 lamina I，II，V。並且其表現活性，可被一些 止痛效果所抑制，例如給予 morphine
45，noradrenalin
46，甚至不同皮節 區的傷害刺激
47。一般來說，在發炎組織(例如大白鼠後腳之福馬林注 射)，周邊的傷害性神經訊號首先主要經由非髓鞘性 C 纖維
(non-myelinated C fiber)傳遞至脊髓神經之 lamina I-II
48，接著經由一連 串的疼痛輸入訊號或是藉由中間神經元(interneuron)之活化，將深部神經 元敏感化(sensitization)
49，藉由此種中樞致敏化作用(central
sensitization)，可激化許多原本在脊髓傷害接受區沈息(silence)之神經 元，造成疼痛訊號時間上的延長及疼痛感覺區的擴大
50。而我們的發現 顯示電針刺激可以抑制大白鼠脊髓背角深部(lamina V，VI)的 Fos 活性表 現，但是在淺層部位(lamina I，II)則沒有此種抑制作用。這些結果，我 們認為可能是福馬林注射肢對側之電針刺激經由下行性抑制調節
(descending inhibitory modulation)起了對中樞致敏化作用之抑制。造成注
射邊深部神經元超極化(hyperpolarization)之間接止痛效果。當然，這僅 是推論而已，我們需要更深入的研究來証實我們的推論。
第三節 吸入性全身麻醉優點之探討
為了避免強烈的電針刺激或清醒時的束縛感使大白鼠產生壓力性 止痛(stress analgesia)作用
51，以致強化了針灸止痛效果
52，53。我們對大 白鼠施行全身麻醉以避免這些干擾因素，而且這是目前就我們所知第一 例以吸入性全身麻醉之動物模型閃尾實驗。在我們的前置研究(pilot study)中，我們發現 1%的 Halothane 濃度，在長達 120 分鐘的麻醉過程 中閃尾時間沒有改變而呈現穩定的線型。0.5%及 0.75%的 Halothane 濃 度則呈現不穩定的波動線型，可能是淺麻醉狀態下，仍無法避免壓力性 止痛效應。至於 1.25%的 Halothane 濃度則呈現強烈的閃尾時間延長效 果，表示其麻醉止痛作用明顯，這會形成干擾因子。所以我們認為 1%
的 Halothane 濃度對此動物模型是合宜的，而吸入性全身麻醉更具有穩 定的麻醉深度(避免壓力性止痛效應)，及容易恢復清醒(較不易干擾福馬 林注射行為反應的觀察結果)的優點。相反，無論靜脈，腹腔或皮下注射，
均無法保持穩定的麻醉深度(無法保持穩定的藥物血中濃度)，更由於藥 物容易累積在脂肪組織不易代謝，造成較長的麻醉後恢復時間(吸入性麻 醉藥物，易 wash in 及 wash out)。綜觀之，由於具有較佳的麻醉深度控 制，及較易麻醉恢復的優點，因此我們推荐在電針止痛的動物模型中，
採用吸入性全身麻醉方式代替注射性全身麻醉。
第四節 止痛高峰延遲效應之探討
止痛高峰延遲效應(delay peak analgesic effect)是另一個明顯的發
現。我們注意到無論 20xEAT 或 10xEAT 組的止痛高峰皆出現在電針刺
激期外，甚至 20xEAT 組出現持續性疼痛閾值昇高效應。大部份以往的
電針研究顯示閃尾實驗最大的抑制作用出現在電針刺激時間終點，或是
靠近電針刺激時間終點，通常刺激停止後其抑制作用會隨著時間逐漸消
退
54，55，56，57。為什麼有如此的差異性呢?可能是不同的實驗設計所致，
吸入性麻醉藥物可能改變了針灸止痛機轉的中樞神經整合作用，以致延 遲了對傷害性刺激的抑制反應高峰。另外，我們僅電針刺激單側後肢，
相對於雙側後肢刺激，也許較少的能量總量導致電針刺激期的最大止痛 效果被降低及延長，不過這僅是推測，我們需要更多的研究來証實或解 釋我們的觀察結果。
第五節 電針刺激強度是否類同藥物學上之劑量
強刺激的電針止痛效果無論在閃尾實驗或福馬林注射實驗均與 morphine 為 2.5mg/kg 劑量皮下注射效果相當。(弱到中等強度的止痛效 果)。另外，電針刺激或 2.5mg/kg 劑量的 morphine 均無法抑制福馬林注 射實驗中由於機械性刺激造成的第一陣疼痛(phasic pain)，而其後由於發 炎反應造成的隱痛(tonic pain)，則有明顯的止痛效果，這個結果與 Ren 及 Han
58(3mg/kg)的發現差不多，但是比 Takeshige(0.5mg/kg)等人
59的發 現明顯較強。原因大概是 Takeshige 的研究使用僅足以使老鼠後肢肌肉 收縮之弱刺激電針，從我們的觀察結果及他人的研究報告，我們可以合 理的推論，電針刺激的強度(劑量與止痛效果)，和藥物學上劑量與藥效 的關連性大致是相當的。
第六節 實驗之條件控制是否合宜
在活體(in vivo)的動物實驗中，強光
60，噪音
61，驚嚇
62等非疼痛刺 激都可以誘導腦幹及大腦皮質區 Fos 蛋白的形成。在細胞培養皿(in vitro) 中，它對多種藥物都有反應，差別只是反應強弱不同而已
63。因此，需 要克服這些可能干擾實驗品質的因素。克服的方法就是控制環境變數。
利用良好的對照組設計，內在的也好(非刺激的對側)，外在的也好(其他 條件完全相同的對照組)，就可擺脫這個問題的糾纏。C 組及 FC 組顯示，
大白鼠脊髓背角 Fos 活性無論左側或右側皆沒有明顯改變。顯示我們的
實驗條件控制是合宜的，並沒有產生干擾因素。
第六章 結論
我們的研究結果顯示低頻電針刺激在閃尾實驗的止痛效果是與刺 激強度成正向關係，也就是說較強的刺激可產生較強及較長的止痛效 果。c-fos 染色觀察顯示 20xEAT 的電刺激大約與 2.5 mg/kg morphine 的 止痛效果相當。另外，我們也推荐吸入性全身麻醉，其優點具有較佳的 麻醉深度及迅速的麻醉後恢復，可減少大白鼠電針止痛模型的干擾因 素。
