龐貝氏症:新生兒篩檢發現個案之突變分析及治療成果

國立臺灣大學醫學院臨床醫學研究所 博士論文

Graduate Institute of Clinical Medicine College of Medicine

National Taiwan University Doctoral Dissertation

龐貝氏症:新生兒篩檢發現個案之突變分析及治療成果 Pompe disease: novel mutations and treatment outcome

through newborn screening 簡穎秀

Yin-Hsiu Chien

指導教授：胡務亮 博士

Advisor: Wuh-Liang Hwu, M.D., Ph.D.

中華民國 98 年 6 月

June, 2009

致 謝

感謝胡務亮副教授，蔣書娟小姐一路以來的堅持與指導，使得這個全 球首創的新生兒篩檢得以在台灣發展，生根，並徹底改變了患者的治 療成果。感謝黃愛珠諮詢師及陳曉玲小姐，有了他們盡力與家長溝通，

追蹤個案的狀況，我們的篩檢結果才得以有一個完整的全貌。感謝新 生兒篩檢室的陳麗珠醫檢師，徐儷文醫檢師，陳秀珍醫檢師，魏明麗 醫檢師，劉蓁珍醫檢師，陳麗新醫檢師，胡閔慧小姐，邱麗燕小姐，

林靖潔小姐，曾士娟小姐，吳淑姿小姐，及其他同仁，沒有他們的投 入，篩檢工作難以完成。感謝所有參與新生兒篩檢的醫師，護理人員，

及公衛人員，有了大家的全力配合，我們才能創造這個”世界第一”的 成績。

感謝這些年來協助我的實驗室同仁及助理: 李妮鍾醫師，葉慧英醫檢 師，李安孺小姐，黃筱芸小姐，施竣賀先生，許惠雯小姐，張凱玲小 姐，謝易達先生。感謝你們給我這麼融洽的研究環境，並且一起完成

這份工作。

感謝余家利主任與繆希椿副教授一直以來的關心與指導，感謝論文指 導委員會的楊偉勛副教授，陳垣崇教授，鄔哲源教授，及蔡世峰教授，

在百忙之中與會，給予我許多研究上的意見與指導。

最重要的是要感謝一路上父母，外子與兒女們的支持與陪伴，讓我可 以全心投入在工作上，尤其是外子，在臨床工作與研究工作兩忙中，

還能支持我的工作。感謝寶貝宗鈞和媛婷，要忍受媽媽去上班，不能 親自接你們下課，陪你們做功課。不過，媽媽的這個功課終於做完了!

誌於 2009.7.5

1

目 錄

口試委員會審定書

………

… i

誌謝…

……….

ii

中文摘要…

………

5

英文摘要

………

6

論文本文 第壹章、

 

緒論 ... 8

 

壹.1.  龐貝氏症Pompe disease ... 8 

壹.2.  酵素替代療法(Enzyme Replacement Therapy, ERT)... 9 

壹.3.  診斷方法... 10 

壹.4.  GAA 基因與蛋白... 11 

壹.5.  新生兒篩檢... 12 

壹.6.  本研究的目的... 13 

第貳章、

 

方法 ...14

 

貳.1.  大眾篩檢：新生兒篩檢方法學之建立... 14 

貳.2.  台灣地區龐貝氏症患者的現狀... 16 

貳.3.  嬰兒型龐貝氏症患者治療後之免疫反應... 18 

貳.4.  由大眾篩檢所得之的龐貝氏症分子病理機轉... 19 

第參章、

 

結果 ...22

 

參.1.  新生兒篩檢方法學之建立... 22 

參.2.  台灣地區龐貝氏症患者的現狀... 24 

參.3.  嬰兒型龐貝氏症患者治療後之免疫反應... 25 

參.4.  嬰兒型龐貝氏症患者治療後之腦部發展... 26 

參.5.  經由新生兒篩檢檢出的嬰兒型龐貝氏症患者治療的現狀... 27 

參.6.  由大眾篩檢所得之的龐貝氏症分子病理機轉... 28 

第肆章、

 

討論 ...34

 

肆.1.  酵素補充療法... 34 

肆.2.  大眾篩檢... 35 

肆.3.  突變型式... 36 

肆.4.  Pseudodeficiency... 37 

肆.5.  Splicing defect ... 38 

肆.6.  Wrong diagnosis? ... 39 

第伍章、

 

結論與展望 ...41

 

第陸章、

 

論文英文簡述 ...42

 

第柒章、

 

參考文獻 ...46

 

第捌章、

 

圖表 ...54

 

第玖章、

 

相關論文 ...97

 

         

3 圖目錄 

圖1.  篩檢流程... 54 

圖2.  本研究使用的RT-PCR 引子與 GAA 基因關係示意圖... 55 

圖3.  新生兒的GAA 活性數值分布呈現常態分布... 56 

圖4.  篩檢成果... 57 

圖5.  新生兒時期患者的胸部X 光及肌肉切片 ... 58 

圖6.  新生兒篩檢陽性個案與陰性個案的數值分布圖... 59 

圖7.  台灣地區嬰兒型龐貝氏症患者治療後之體內抗體濃度... 60 

圖8.  西方墨點法顯示所有患者體內尚有殘存蛋白... 61 

圖9.  嬰兒型龐貝氏症患者治療後之腦部發展... 62 

圖10.  新生兒篩檢檢出嬰兒型龐貝氏症患者治療後的心臟變化... 62 

圖11.  比較不同治療對患者存活及運動功能的影響... 64 

圖12.  GAA 活性部分缺乏及患者之酵素活性分析... 66 

圖13.  GAA 活性部分缺乏及患者之蛋白質含量及 mRNA 含量 ... 67 

圖14.  嬰兒型龐貝氏症患者家族之單倍體分析... 68 

圖15.  c.1194+2t>c 影響... 69 

圖16.  晚發型龐貝氏症患者c.546+5g>t 之分析... 70 

圖17.  晚發型龐貝氏症患者c.955+167 c>t 之分析... 73 

圖18.  帶有IVS5+167 t 變化的患者皆有 delta E6 之不正常 RNA 表現... 76 

圖19.  帶有IVS5+167 t 患者皆有數量不一的不正常的 RNA 表現... 77 

圖20.  IVS5+167 c 患者偶可表現少量的不正常 RNA ... 78 

圖21.  IVS5+167c>t 會影響 RNA 接合... 79 

圖22.  預測的影響... 80 

表目錄 

表一.  GAA 基因突變 DNA 分析使用的引子序列... 81 

表二.  GAA 基因突變 DNA 分析使用的 PCR 條件 ... 82 

表三.  GAA 基因突變 RNA 分析所使用的引子序列 ... 83 

表四.  血片檢體檢驗GAA 活性與血液淋巴球檢體之結果比較... 84 

表五.  嬰兒型龐貝氏症患者的臨床症狀與檢驗數值... 85 

表六.  嬰兒型龐貝氏症患者基因突變與酵素檢驗數值... 86 

表七.  以臨床表現而診斷的台灣嬰兒型龐貝氏症患者治療現狀... 87 

表八.  新生兒篩檢檢出嬰兒型龐貝氏症患者之治療效果... 88 

表九.  新生兒篩檢檢出嬰兒型龐貝氏症患者之基因變化... 89 

表十.  新生兒篩檢檢出GAA 部分缺乏或缺乏患者之基因突變分析... 90 

表十一.  新生兒篩檢檢出GAA 部分缺乏或缺乏患者之基因突變分布頻率.. 92 

表十二.  GAA 活性部分缺乏患者之酵素活性受其他 GAA 基因多型性影響 93  表十三.  GAA 基因 p.G576S 與酵素活性高低有關 ... 93 

表十四.  新生兒篩檢檢出GAA 活性部分缺乏者基因之單倍體分析... 94 

表十五.  預測為晚發型龐貝氏症患者之基因突變分析... 94 

表十六.  此家族基因突變與deltaE6 RNA 之整理 ... 95 

表十七.  c.955+167 c>t 的盛行率... 95 

表十八.  台灣地區晚發型龐貝氏症患者的基因突變... 96 

5 中文摘要 

背景: 龐貝氏症是一種因為溶小體缺乏酸性醣苷酶無法分解肝醣所引起之疾病。最 近針對龐貝氏症，已有酵素補充療法可以使用。嬰兒型龐貝氏症患者經由酵素補 充療法，可有效延長性命，恢復心臟正常大小，但是大部分患者的運動及呼吸功 能無法恢復正常；晚發型龐貝氏症治療後，其症狀之可逆性也很有限。本研究的 目的在探求新生兒篩檢可以早期診斷龐貝氏症，給予患者早期治療的機會。

方法: 我們首先分析台灣龐貝氏症患者之表現型、基因型、以及個案之分佈，以及 是否有導致治療失敗之因子。我們接著開發龐貝氏症新生兒篩檢之方法，並且進 行前導篩檢作業。篩檢結果之分析，包括篩檢個案之表現型及基因型分析，以及 嬰兒型龐貝氏症早期治療之成果。經由比較臨床個案及篩檢結果，試圖去預測台 灣族群龐貝氏症之分佈，以及台灣未來關於龐貝氏症之診斷與治療之策略。

結果: 臨床個案分析顯示嬰兒型龐貝氏症患者接受酵素治療後，其肌肉對治療之反 應不一，但是並沒有證據顯示患者之腦部會有不可逆之變化。經由新生兒篩檢檢 出之嬰兒型患者，因為治療開始時間較早，其預後明顯比臨床個案要好。這些患 者的基因型與臨床發現個案相類似，主要為 p.D645E 突變。新生兒篩檢同時檢出 部分患者酵素活性缺乏，懷疑為晚發型龐貝氏症患者。這些患者的基因型與臨床 發現的晚發型龐貝氏症患者部分類似，但是其發生率以及突變位置未確定的比例 均較臨床個案為高。經由族群篩檢我們發現了高比例之龐貝氏症基因變異型。這 些變異型會使得酸性醣苷酶活性偏低，我們目前不能排除這些基因變異型是否參 與龐貝氏症臨床表現之決定。

結論與展望: 新生兒篩檢可以達到早期診斷龐貝氏症之目的，並改善嬰兒型龐貝氏 症之預後。台灣族群中帶有相當高比例之龐貝氏症基因變異型，可能引起龐貝氏 症診斷之困難或混淆。新生兒篩檢疑似晚發型龐貝氏症之發生率尚待進一步證 實，但結果也暗示臨床上可能有部分晚發型龐貝氏症患者沒有被診斷出來。

關鍵詞: 龐貝氏症，新生兒篩檢，溶小體

英文摘要 

Background: Pompe disease is due to a deficiency of lysosomal acid alpha glucosidase

(GAA), and currently an enzyme replacement therapy has been developed. In infantile-onset Pompe disease, enzyme replacement therapy can prolong survival and reverse cardiomegaly, however, some patients cannot regain motor or respiratory function. In late-onset Pompe disease, most of the symptoms cannot be reversed by treatment. In this study, we hypothesis that newborn screening for Pompe disease can offer an opportunity for early treatment of Pompe disease.

Methods: We first analyzed phenotype and genotypes of Pompe disease in Taiwan, and

explored factors which may affect the outcome. We then developed a method of newborn screening for Pompe disease, and started a pilot screening program. We analyzed the genotypes, aiming at predicting phenotypes and comparing outcomes between early treatment and late treatment.

Results: Patients diagnosed clinical during infancy have poor responses to the treatment

in view of skeletal muscle function. However, there was no irreversible changes in their brains. Patients with infantile-onset pompe disease identified by newborn screen could have an earlier onset of treatment and better outcomes in comparism to those identified by clinical symptoms. GAA gene mutations were similar between the two groups, and p.D645E is the most common one. We also identified babies with GAA deficiency but may have late-onset Pompe disease. They had GAA gene mutations previously seen in patients with late-onset Pompe disease, but the babies tended to have a higher incidence of mutations with unknown significance. Through newborn screening, we also identified prominent GAA gene variations in our population, including the

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“pseudodeficiency” allele and alleles which may modify the clinical manifestations of Pompe disease.

Conclusion: Results from this study highlight the benefits of early diagnosis, which can

be achieved only by newborn screening. of the intense gene variations in the population can confuse the diagnosis. The high incidence of late-onset Pompe disease from the screening program needs further confirmation, but our results do suggest the possibility of under diagnosis of Pompe disease in current clinical practice.

Key words: Pompe disease, newborn screening, lysosome

論文正文

第壹章、 緒論

壹.1. 龐貝氏症 Pompe disease

龐 貝 氏 症(Pompe disease)，又稱為肝醣儲積症第二型(glycogen storage disorder type II) ， 是 由 於 患 者 缺 乏 酸 性α- 葡 萄 糖 苷 酶 (acid α-glucosidase, GAA)所引起之疾病。GAA 是一種溶小體酵素，此酵素在細 胞中，負責分解溶小體中多餘的肝醣。由於龐貝氏症患者缺乏GAA 酵素，

使得進入溶小體的肝醣無法被分解而持續堆積，因而影響到細胞的功能，

主要的症狀是因為肌肉功能受損，而導致肌肉無力，並進而影響生命。龐

貝氏症可依其發病年齡、體內 GAA 活性及臨床表徵粗分為嬰兒型龐貝氏

症和晚發型龐貝氏症（late-onset Pompe disease）兩種。其中，嬰兒型龐貝 氏症又可分成典型和非典型（non-classic）兩種，非典型嬰兒型龐貝氏症的 患者多在六個月大之前發病，雖一樣有肌肉無力的情形，但不同於典型嬰 兒型龐貝氏症，沒有心臟肥大的症狀，且有些患者可以存活超過兩年。晚 發型龐貝氏症又可分為孩童型（childhood-onset）、少年型（juvenile-onset）

與成人型（adult-onset），通常病程的進展較慢，且多以肌肉無力的症狀為 主，呼吸衰竭是此型患者最常見的死因(Hirschhorn and Reuser, 2001)。嬰兒 型龐貝氏症患者，其體內GAA 活性約只有正常人的 1%或更少，少年型及 成人型患者其體內GAA 活性較高，約為正常人的 1%到 40% (Hirschhorn and Reuser, 2001; Kallwass, et al., 2007; Kishnani, et al., 2006c)。臨床上，嬰兒型 患者最明顯的特徵是肝醣貯積在心臟而使得心室肥大，導致心臟迅速擴 大，最終造成主動脈血流受阻。肝醣儲積在骨骼肌肉則導致肌肉低張力及 肌肉無力，之後呼吸肌也會受影響，造成換氣不足及急速呼吸代償。少年 型與成人型之患者會有肌肉及呼吸系統受損的症狀，但不會有心臟受損的 症狀(Hirschhorn and Reuser, 2001; Kishnani, et al., 2006c)。嬰兒型患者通常 於2 個月大時開始表現臨床症狀，在 4.7 個月時確定診斷，而在 8.7 個月大 時即因龐貝氏症引起的心臟或呼吸衰竭而死亡，可見此病進行之快速 (Kishnani, et al., 2006a)。但是，文獻報告於人類之羊膜細胞及 18 周大胚胎

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的肌肉中即可見到肝醣儲積(de Barsy, et al., 1973)，心臟肥大最早見於一 23 天大的新生兒(Raben, et al., 2002b)，可見肝醣的堆積在患者出生前即已開 始。

推估各類型龐貝氏症的平均發生率約為1/40,000。但是不同類型龐 貝氏症的發生率因地區與種族而有所不同。嬰兒型龐貝氏症的發生率於非 裔美國人（1/14,000）、中國大陸南方地區和台灣（1/40,000 到 1/50,000）

較高；而在高加索人種則較低（1/100,000 到 1/200,000）(Hirschhorn and Reuser, 2001)。晚發型龐貝氏症的發生率則在歐洲裔或荷蘭較高(Hirschhorn and Reuser, 2001)。在荷蘭，包括嬰兒型及晚發型的發生率據估為 50,000 分 之一(Poorthuis, et al., 1999)，在紐約進行的一項基因篩檢計畫，使用 7 個常 見基因突變點篩選的結果顯示，發生率約為40,000 分之一 (Martiniuk, et al., 1998)。臨床上的經驗顯示，在台灣(Lin and Shieh, 1996)及以色列(Bashan, et al., 1988) 的發生率應該更高。

壹.2. 酵素替代療法(Enzyme Replacement Therapy, ERT)

在過去，龐貝氏症被視為無法治療的疾病，因此僅能提供支持性的 療法，包括高蛋白飲食、物理治療、和呼吸器支持（ventilatory support）(Bembi, et al., 2003; Hirschhorn and Reuser, 2001; Kishnani and Howell, 2004)。目前除 這些支持性療法外，亦可採用酵素替代療法(Enzyme Replacement Therapy, ERT)，將患者所缺乏的 GAA 酵素利用基因重組工程大量產生(Bijvoet, et al., 1999; Yang, et al., 1998)，提煉後定時注射至血液中，使儲積於細胞內的肝 醣能正常代謝分解。此治療已被證實可以有效延長患者壽命，改善心臟肥 大(Kishnani, et al., 2006a; Van den Hout, et al., 2004)。在臨床試驗中，在開 始治療年紀小於6 個月那組，18 名典型嬰兒型患者存活皆超過 18 個月大，

在經過一年酵素補充治療後，約有 1/3 的患者，治療效果良好，其肌肉細 胞內的肝醣含量可以從25–58% 大幅降低(Thurberg, et al., 2006)，且有 15 (83%)名患者在 18 個月大時不須使用侵入式呼吸器(Sun, et al., 2007)，而在 開始治療年紀介於6-36 個月大的那組，雖然患者的存活率有改善，但是使

用呼吸器的狀況並未得到改善(Nicolino, et al., 2009)，顯示愈早開始治療的 患者，其治療效果愈好(Amalfitano, et al., 2001; Kishnani, et al., 2007)。然而 嬰兒型龐貝氏症由於開始表現的症狀不具特異性，而且疾病進程極快，患 者極少能夠得到早期診斷早期治療，因而影響治療效果。

除了治療開始時間會影響患者治療效果外，其他因素亦可能造成患 者治療成效不一。部分患者甚至產生大量抗體干擾藥物的療效(Amalfitano, et al., 2001; Kishnani, et al., 2007; Kishnani, et al., 2006b)，可能是因為這些患 者體內毫無殘存GAA 蛋白，屬於 cross-reacting immunologic material(CRIM) 陰性患者，因而造成免疫系統在接觸大量外來重組蛋白質時，產生大量抗 體來中和這些外來蛋白質的活性(Sun, et al., 2007)。

目前只有零星文獻報告患者經過長期治療的成果，其存活時間可以 延長至約58 個月(Klinge, et al., 2005a; Klinge, et al., 2005b; van Capelle, et al., 2008)。而且因為龐貝氏症屬全身性的疾病，儲積的肝醣已被證實可以 在神經系統堆積，造成腦幹細胞核及脊髓前角灰質細胞功能失常而造成自 主神經系統的功能異常，酵素療法並未被提到可以改善這些症狀。

對於晚發型龐貝氏症的治療成效，目前只有零星的報告(Case, et al., 2008; van Capelle, et al., 2008; Winkel, et al., 2004)。大致說來，在治療的前 6 個月，可以見到酵素治療之後，患者的呼吸症狀可有部分改善，肌肉酵 素(creatine kinase)及其他生化數值( lactic dehydrogenase, transaminases)也可 同步下降(Merk, et al., 2009)。但患者的呼吸及行走功能並無法完全恢復正 常(Merk, et al., 2009; van Capelle, et al., 2008)。在肌肉受損前及早給與治療 應該能得到最佳的治療效果(van der Beek, et al., 2006)。

壹.3. 診斷方法

龐貝氏症是因為缺乏酸性α-葡萄糖苷酶(acid α-glucosidase, GAA) 所引起之疾病。因此確認診斷的方式為證實患者血液淋巴球，皮膚纖維芽 細胞，或是肌肉細胞等組織缺乏 GAA 酵素活性(Hirschhorn and Reuser, 2001)。皮膚纖維芽細胞通常需先經由 2-4 周的培養後才可進行酵素檢驗，

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肌肉細胞取得不易，因此患者血液淋巴球酵素定量檢驗成為第一線準確且 快速的檢驗。然而血液淋巴球分離如果不徹底，則此酵素檢驗會受到血液 中性球中所含有的同功酵素(isoenzyme) maltase glucoamylase (MGA)的干 擾，而造成檢驗結果假性偏高(Hirschhorn, 2001; Shin, et al., 1985; Taniguchi, et al., 1978)。加入此同功酵素 MGA 的抑制物如 maltose 或 acarbose 可以有 效抑制 MGA 的干擾，以準確測定血中或是乾燥血片中 GAA 之酵素活性 (Chamoles, et al., 2004; Kallwass, et al., 2007; Li, et al., 2004; Zhang, et al., 2006)。這樣的檢驗方法已經經由小規模的實驗證實，可以快速檢驗患者是 否具有酵素缺乏的狀態，包括嬰兒型龐貝氏症患者 (Chamoles, et al., 2004;

Zhang, et al., 2006) 以及成年型龐貝氏症患者(Kallwass, et al., 2007)。但是 這種檢驗並無法區分患者罹患的是嬰兒型或是晚發型龐貝氏症(Kemper, et al., 2007)。

壹.4.

GAA 基因與蛋白

龐貝氏症是由於GAA 缺乏所導致，這是一種體染色體隱性遺傳疾 病，致病基因 GAA 位於第十七號染色體上(17q23-25)，全長涵蓋約 28kb 的長度，共含有 20 個外顯子(exon)，將會轉錄出一條全長約 3847bp 的 mRNA，再轉譯成含有 952 胺基酸的多肽鏈。其轉譯起始點(ATG)位在第二 個外顯子上。在 GAA 基因的啟動子(promoter)上，帶有 2 個可能的 AP-2 位點，及4 個可能的 Sp-1 結合處，而且為 GC-rich，為典型”house-keeping”

基因的特徵(Raben, et al., 2002a)。因此 GAA 酵素在全身細胞皆有表現 (Ponce, et al., 1999)，但是在不同組織的表現量不同，甚至在同一組織的表 現量也不同，顯示此基因可能在轉錄階段另外受到目前未之因素的調節而 影響表現。

目前為止，已知有超過 300 種以上的突變，包括點突變(point mutation)，小片段或大片段的缺失(deletion)等。這些突變遍布全基因，但 是在exon 14 的演化保留區上的 CpG dinucleotides 似乎是點突變的好發位 置(Huie, et al., 1998)。在特定族群中可能有好發的突變，如高加索人的 c.-32-13T>G 以及中國人的 c.1935C>A(p.D645E)(Lin and Shieh, 1996)。突變

的 方 式 可 以 解 釋 患 者 殘 存 的 酵 素 活 性 ， 進 而 預 測 患 者 的 罹 病 表 現 (phenotype)。通常說來，GAA 基因突變可依照突變株在 COS 細胞表現酵 素活性的情形，將突變分為嚴重型(severe)，較不嚴重型(less severe)，以及 輕型(mild)等(Hermans, et al., 2004)。然而，越來越多的研究報告指出，這 些基因突變分析無法預測表現型(Kroos, et al., 2004; Kroos, et al., 2007;

Raben, et al., 2002b)。甚至，龐貝氏症的表現型也日趨複雜，例如曾有報告 指出一罹患典型龐貝氏症的嬰兒可以較其他典型龐貝氏症患者有較佳的預 後，存活超過12 個月(Slonim, et al., 2000)。顯見在龐貝氏症之基因型與表 現型不一致之處。

GAA 蛋白質有三個主要的型式，分別為 110kDa、95 kDa 及 76kDa。

其中110kDa 為 GAA 蛋白質的前驅物，95 kDa 為 GAA 蛋白質的中間產物，

而76kDa 為經過修飾的成熟的 GAA 蛋白質。GAA 蛋白質的前驅物在 ER 中經過醣化作用後，配置有mannose 6-phosphate (M6P)，大部分的 GAA 酵 素因此可已經由M6P receptor 運送到溶小體中，經過修飾後成為有活性的 76 及 70 kDa 的酵素(Wisselaar, et al., 1993)。目前已知 GAA 酵素的作用點 位於Phe5l2 到 Glu521 之間(Hermans, et al., 1991)。

壹.5. 新生兒篩檢

使用濾紙血片做大規模新生兒篩檢以求早期診斷相關疾病並開始 治療的概念於1960 年代初期最先由 Dr Guthrie 發表(Guthrie, 1992)，他首先 成功的以濾紙血片檢驗新生兒是否罹患苯酮尿症(phenylketonuria)，搭配及 時開始的飲食治療，成功的改變苯酮尿症患者的預後，證明新生兒篩檢的 價值。自此，新生兒篩檢成為一種重要之公共衛生政策，美國麻州自1963 年開始全面施行新生兒篩檢，我國也自民國73 年 5 月 15 日全面推展，自 74 年 7 月正式開始全國性的篩檢服務。新生兒篩檢的項目也隨著技術的發 展，由最早的苯酮尿症，逐漸增加到包括先天性甲狀腺低能症，及其他項 目。自從串聯質譜儀技術引進之後，可以檢測的疾病項目迅速成長，美國 the American College of Medical Genetics (ACMG)於 2006 年建議了 29 種疾

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病應該被包括於新生兒篩檢，並且另外建議了25 種在檢驗時可同時檢測的 疾病應該被告知(2006)。但是龐貝氏症並未被列入其中，主要原因是因為 尚未有良好可靠的篩檢方法，以及篩檢後早期治療的成效尚未明朗。

壹.6. 本研究的目的

本研究的假設是，嬰兒型龐貝氏症患者，可以經由新生兒篩檢，達 到早期診斷早期治療的目的，因而改善治療效果。但是經由新生兒篩檢，

檢驗血中 GAA 酵素活性，在沒有臨床症狀的輔助判斷下，就需要搭配基

因突變分析，以協助判斷其表現型，決定開始治療的最佳時機。然而GAA

基因突變多屬私密突變(private mutation)，而且許多 GAA 基因的多型性亦 可能導致判斷上的困難，因此本研究需了解台灣地區龐貝氏症患者經由新 生兒篩檢檢出者的基因變化，以協助新生兒篩檢的進行。

第貳章、 方法

貳.1. 大眾篩檢：新生兒篩檢方法學之建立

貳.1.1.

新生兒篩檢檢體來源

臺大醫院新生兒篩檢中心為台灣地區3 家新生兒篩檢中心之一，每

年篩檢全台約45%的出生新生兒。本計畫經由台大醫院研究倫理委員會同

意後進行，本研究的進行符合赫爾辛基宣言的準則。新生兒出生滿 48 小

時，即會接受新生兒篩檢檢驗之採血。如果父母同意參與本先驅研究計畫，

檢附同意書後，本中心即可利用原本的檢體，額外檢驗龐貝氏症。本先驅 篩檢計畫自2005 年 10 起進行至 2008 年 6 月止。

貳.1.2.

新生兒篩檢檢驗方法

本先驅篩檢之檢驗方法包含 3 種酵素活性之測定，包括(1) nGAA 活性: 須在 pH 3.8 的環境下並加入 acarbose 抑制物後測定; (2) total GAA (tGAA) 活性: 須在 pH 3.8 的環境下不含 acarbose 抑制物的測定; (3) total neutral glucosidase (NAG)活性: 須在 pH 7.0 的環境下不含 acarbose 抑制物 的測定。tGAA 活性包括同功酵素 MGA 以及 GAA 活性，因此可以計算出 抑制率: (tGAA –GAA)/tGAA 以作為篩檢結果判定之參考。NAG 活性測定 是用作檢定檢體品質，測定NAG 活性可以得出比例參數(ratio): NAG/nGAA 作為篩檢結果判定之參考。

所 有 酵 素 活 性 測 定 皆 採 用 產 螢 光 的 受 質 (substrate) 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside (4-MUG)進行。本方法是改良自 Chamoles 等人(Chamoles, et al., 2004; Kallwass, et al., 2007)的方法進行。收 到新生兒篩檢檢體濾紙血片後，檢驗人員剪下一直徑3.2-mm 之濾紙盤，置 放於一96 孔黑色過濾盤之檢體槽中，加入萃取溶液後，以微量盤搖盪器，

以使濾紙盤中的血液可以被萃取出來後，以離心方式將血點檢體萃取液移 至新的96 孔塑膠萃取盤(96-well PS Plate)的檢體槽，進行酵素反應。

酵素反應中需加入 nGAA 反應溶液(nGAA Substrate Solution)及

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NAG 反應溶液(NAG Substrate Solution)，以微量盤震盪器震盪混勻後，密 封閉光，在37 度烘箱靜置 20 小時以待反應完成後，加入 EDTA Stop Buffer 將反應停止並以微量盤螢光光譜儀偵測螢光值。

貳.1.3.

新生兒篩檢參考值建立

在篩檢開始時，我們先測量5000 個匿名新生兒檢體，建立正常值，

當方法做小幅修正時，另檢驗2000 個匿名新生兒檢體作為方法確認。

在篩檢階段，我們使用2 階段篩檢(圖 1)，檢體之 GAA 活性若小於 正常均值的55%，則進入第二階段的檢驗，同時測定 GAA 以及 NAG 的活 性。若是 GAA 活性確定小於正常均值的 25%，而且 NAG/GAA 比值大於 25，則通知此新生兒的家長，請寄送第二次檢體檢驗。若是 NAG/GAA 比

值大於 100，則通知此新生兒的家長，須盡速帶此新生兒接受確認檢查。

第二次檢體檢驗結果若符合: 檢體之 GAA 活性若小於正常均值的 8%，

tGAA 抑制率大於 80%，以及 NAG/GAA 比值大於 60，則通知此新生兒的 家長，須盡速帶此新生兒接受確認檢查。

貳.1.4.

新生兒篩檢結果驗證

新生兒如因為篩檢結果異常，須接受確認檢查，確認檢查包括理學 檢查及病史詢問，肌肉酵素creatine kinase 檢驗，血液淋巴球 GAA 活性分 析，胸部X 光及心電圖檢驗，如懷疑有心臟肥大，則加排心臟超音波檢查。

若證實此新生兒有 GAA 酵素活性缺乏(定義為小於正常均值的 5%)且已出 現心臟肥大現象，則立即給予人類重組酵素補充治療，並進行後續的皮膚 纖維芽細胞培養及基因分析，以免因為等待而錯失治療良機。

貳.2. 台灣地區龐貝氏症患者的現狀

貳.2.1.

患者來源

自1994 年起，本院建立了龐貝氏症酵素檢驗方法，因此成為台灣 地區少數可以檢驗龐貝氏症的中心之一。我們回顧了自1994 年到 2008 年 曾送至本院檢驗並確認為龐貝氏症患者的資料，包括發病年紀，酵素檢驗 數值，以及基因突變分析結果。

貳.2.2.

酵素檢驗方法

我們利用Ficoll 分離患者的血液淋巴球細胞，或是使用患者的皮膚 纖維芽細胞來檢驗 GAA 酵素活性是否有缺乏。細胞將置放於反應液 (40 mM Na2HPO4, 30mM Nacitrate, pH 4.0) 中，被震碎後以離心方式(41C, 13 000 rpm for 15 min)取得上清液，一部分作蛋白質定量(BCA protein assay regent; Pierce, Rockford, IL, USA)。另取一部分作酵素反應。反應液包括 100 mg 蛋白質與 25 mM 4-methylunbelliferyl-α- D-glucopyroside (4-MUG) (Fluka Chemical Corp, Ronkonkona, NY, USA)，一起在 37C 度烘箱中反應 2 h 後加入 1 ml 0.4 M glycine-NaOH buffer, pH 10.6)停止反應，並以螢光光譜 儀偵測螢光值(excitation at 365 nm and emission at 450 nm).

貳.2.3.

基因突變分析

我們利用QIAampTM DNA Blood Mini kit (QIAGEN, Valencia, CA) 自患者的周邊血液細胞中萃取 DNA。GAA 基因的第 2-20 外顯子含 exon-intron 交界分別以 PCR 放大後(表一，表二)，以直接定序方法檢測基 因序列是否有變化。所使用的參考序列為 NC_000017.9; GI:51511734。命 名則以cDNA 序列(NM_000152.3; GI:119393890) 為準，轉譯起始點 ATG 的A 定為此序列之+1 位置。

17

貳.2.4.

酵素治療

自2002 年開始，本院即開始治療嬰兒型龐貝氏症患者，這些患者 接受人類重組酵素 alglucosidase alpha(Myozyme [Genzyme, Cambridge,

MA])治療，每兩周劑量為 20mg/kg BW，皆經由靜脈注射給予。我們分析 患者的發病年紀，目前年紀，以及基因與酵素檢驗結果。患者的運動功能，

心臟功能，進食功能等則定期評估，以了解治療成效。

貳.3. 嬰兒型龐貝氏症患者治療後之免疫反應

貳.3.1.

患者治療

自2002 年開始，本院即開始治療嬰兒型龐貝氏症患者，這些患者 接受人類重組酵素 alglucosidase alpha(Myozyme [Genzyme, Cambridge,

MA])治療，每兩周劑量為 20mg/kg BW，皆經由靜脈注射給予。這些患者 在接受注射前，接受注射後每4 周抽血檢驗血中抗 GAA IgG 抗體檢驗。

貳.3.2.

CRIM status 分析

我們使用西方墨點法，檢驗患者體內是否有殘存之GAA 蛋白，以 確認患者是否為CRIM negative 狀態。患者的皮膚纖維芽細胞(或是淋巴球 細胞)經由音波震碎後，離心取得上清液以供分析。在上清液中的全細胞蛋 白 質 ， 經 由 10% SDS 平 板 膠 片 (polyacrylamide gels) 進 行 膠 體 電 泳 (SDS-PAGE)分離後，將蛋白質轉印到 PVDF 膜上 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)後進行免疫染色。本實驗使用 monoclonal anti-GAA antibody(由 Genzyme 公司提供(Genzyme, Boston, MA, USA)作為一級抗體，以及 HRP-conjugated anti-mouse Ig 作 為 二 級 抗 體 。 最 後 以 冷 光 chemiluminescence (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)法呈色。另以 tubulin 抗體偵測細胞內tubulin 量做為細胞內蛋白質含量的參考控制。

貳.3.3.

嬰兒型龐貝氏症患者治療後之腦部發展

自2002 年 12 月至 2004 年 12 月止，共有 5 名嬰兒型龐貝氏症患者 於本院接受酵素補充療法，所有患者皆接受腦部核磁共振檢查，包括核磁 共振成像(Nuclear Magnetic Resonance Imaging, NMRI)，及活體磁共振頻譜 (in vivo MR spectroscopy, MRS)。髓鞘化 (myelination)的成熟度則參考文獻 所敘(Barkovich and Kjos, 1988; Barkovich, et al., 1988)。

19

貳.4. 由大眾篩檢所得之的龐貝氏症分子病理機轉

貳.4.1.

患者來源

經由新生兒篩檢檢驗確認有GAA 活性缺乏或部分缺乏患者，以及 曾在台大醫院就醫之龐貝氏症患者及其父母，在取得基因檢查同意書後，

進行後續基因突變分析。對照組則包括43 名正常人，325 個匿名的新生兒 篩檢血片檢體，以及98 個由中央研究院 Taiwan Han Chinese cell and genome bank (http://ncc.sinica.edu.tw/han-chinese_genomebank/) 釋出的正常對照組 檢體。

貳.4.2.

RNA 萃取及分析

我們利用Trizole (invitrogen-Gibco, Grand Island)自患者的周邊血液 細胞或是皮膚纖維芽細胞中萃取RNA。細胞加入 1ml Trizole 試劑將細胞打 碎後，加入0.2 ml chloroform 混勻後離心，取出上層水相部分，加入 0.6 ml isopropyl alcohol，離心所得之 RNA 以 75% ice-cold ethanol 洗後晾乾，但 不過度乾燥。之後溶解於20ul 的 DEPC H2O 中，於 60℃下，靜置十分鐘。

繼續後續的RT-PCR 或是保存於-70℃以供日後使用。

貳.4.3.

RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)

我們將抽取到的RNA 樣品以 AMV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI)或 SuperScript kit (Invitrogen Corp.) 進行反轉錄，並以 oligo dT primers 或是特定的 GAA RT primers 進行 RNA 的反轉錄，製備出 cDNA，

續以不同的GAA RT primers 放大 GAA 基因的 RNA，RT-PCR 與 GAA 基 因之間的關係如圖示(圖 2)。GAA RT primers 詳情請見表所示(表三)。放大 RNA 後，再送基因定序以了解 RNA 的序列是否正確，是否含有不正常的 RNA，以及是否有特定 RNA 減少的狀況。

在定量方面，我們以跨過 GAA 內顯子的引子(Left: 5’-GTC CCA GAA ATC CTG CAG TT, Right: 5’-CAA GGG GAA GTA GCC AGT CA)作 為PCR 的引子。並同時以 PCR 放大β-actin mRNA 作為半定量的參考。PCR 產物最後經由電泳攝影，再由影像處理軟體 Kodak 1D software (Eastman Kodak)由濃度深淺來定量。

貳.4.4.

單倍體分析

我們藉由分析 5 個 GAA 基因多型性標記 p.R199H (c.596G>A, rs1042393G>A), p.H223R (c.668A>G, rs1042395 A>G), p.G576S (c.1726G>A, rs1800307G>A), p.E689K(c.2056G>A, rs1800309G>A), and p.I780V(c.2338A>G, rs1126690A>G)，由 21 個嬰兒型龐貝氏症患者的家族 資料中建立單倍體，使用軟體為Haploview (Barrett, et al., 2005)。

由於單倍體分析在族群研究中極為重要，尤其是單倍體分析可以回 答這些多型性標誌與突變究竟是處於 cis/trans 的狀況。因此，我們也分析 了這103 個 GAA 酵素活性低下或缺乏的新生兒的 72 個 SNPs。之前的研 究已經訂出主要的單倍體型(Kroos, et al., 2007)。在此我們選用其中具代表 性的10 個 SNP 來表示主要的單倍體型，來決定這些新生兒 GAA 基因的單 倍體型。

貳.4.5.

體外轉錄表現 (in vitro transcription assay)

我們先建構GAA 的 minigene，將病人和正常人的 GAA 基因片段 如 圖 示 部 分 ， 分 別 以 PCR 放大，放進 plasmid 中，再對 E. coli 作 transformation，在 LB medium 中培養後，以 QIAprep Miniprep kit 抽取 plasmid。取得之 plasmid 以 CaCl2 transfection 的方式送入 HEK 293T 或 HeLa cell lines，在 DMEM medium 中培養一天後以 TRIZOL reagent 抽取 RNA，

加上DNase 作用後，作 RT-PCR，產物作膠體電泳觀察。

21

貳.4.6.

統計分析

對於連續性變項，我們使用描敘性統計表示這些變項分佈的狀況。

在 不 同 組 別 中 的 GAA 平 均 酵 素 活 性 的 比 較 使 用 Kruskal-Wallis 或 Mann-Whitney tests。使用 chi-square test 比較不同組別中的對偶基因頻率 (Allele frequency)。 P 值小於 0.05 視為統計學上有意義的差別。

第參章、 結果

參.1. 新生兒篩檢方法學之建立

我們首先檢驗 5000 名新生兒的 GAA 活性數值，可以發現此數值 在族群中呈現常態分布的狀況(圖 2)。大部分的新生兒(84.4%)的 GAA 酵素 活性介於平均值的55% ~200% 之間，另外，有 13.3%的新生兒活性小於平 均值的55%，有 2.3%的新生兒活性大於平均值的 200%。值得注意的是，

約有0.2%的新生兒之數值偏低，小於正常均值的 10%，因此這些新生兒需 要接受第二次檢驗，以確定這些寶寶體內GAA 的狀況。

自2005 年 10 月至 2007 年 3 月 (18 個月)，本中心共檢驗 132,538 名新生兒(圖 4)，其中 1101(0.83%)名新生兒因第一次檢驗結果有異常，而 被要求做第二次檢驗或作確認檢查。最後共有121 (0.9‰)名新生兒被要求 至 本 院 接 受 確 認 檢 查 。 這 些 孩 子 第 一 次 血 片 中 的 平 均 GAA 活性為 1.45μmol/L Wb per hour (range: 0.18–3.24 μmol/L Wb per hour)，此較現行一 般新生兒的平均 GAA 活性 16.52μmol/L Wb per hour (range: 1.78–40.76 μmol/L Wb per hour) 較低，而且這些孩子的 GAA 酵素活性與現行已知的 龐貝氏症患者的酵素活性 (0.38–2.34 μmol/L Wb per hour) 無法有效區別。

在這121 名新生兒中，8 名新生兒的父母拒絕進一步檢查，9 名新 生兒的GAA 活性確認小於正常均值的 3%，另外 101 名新生兒的 GAA 活

性大於正常均值的3%，暫時歸於偽陽性個案。本研究期間並未發現有偽陰

性的嬰兒型龐貝氏症患者，因此龐貝氏症新生兒篩檢的偽陰性率為0%。而

偽陽性率為97%，檢驗敏感性為 3%。

在 GAA 活性確認小於正常均值的 3%的新生兒中，有 3 名在接受 確認檢查時，即已出現心臟肥大現象(NBS2, NBS3, NBS4)(圖 5)，因此立即 開始人類重組酵素補充治療，另有一名患者(NBS1)，於 7 個月大時出現肌 肉無力症狀，因此也於14 個月大時開始接受人類重組酵素補充治療。這些 患者在開始治療時，皆已有明顯肌肉肝醣儲積的現象(圖 5)。

我們並檢驗臨床上已發病的個案之新生兒篩檢血片檢體，是否可以 用來早期診斷這些患者罹患有龐貝氏症。這些患者的血片檢驗結果與血液

23

淋巴球檢體之結果比較於表四(表四)。結果顯示，不論是新生兒篩檢檢出 的個案，或是因為臨床表現而被診斷的個案，這些患者的新生兒篩檢血片

檢體，的確有 GAA 活性缺乏的表現。因此用新生兒血片可以正確快速檢

驗嬰兒型龐貝氏症患者。

另外，比較這些患者的臨床症狀，與經由新生兒篩檢檢出的患者並 無不同，皆有心臟肥大，肌肉酵素大幅升高的現象(表五)。除了 NBS1 外，

NBS2,3,4 分別於 19, 22,及 9 天大時即獲得診斷，其中 NBS4 因為 NAG/GAA 比值 >100，因此在得知第一次血片結果後立即被通知到醫院確 認。當時這些新生兒皆未出現明顯異常症狀，但肌肉切片顯示已有空泡狀 肌病變，範圍由15%~ 85%不等。 因此確認此篩檢方法可以檢出嬰兒型龐 貝氏症患者，而且顯示嬰兒型龐貝氏症患者在出生後即有心臟肥大和肌肉 肝醣儲積的現象，應須立即給予治療。

我們最後檢討現行篩檢所使用界限值(cut-off)的合理性。比對這些 確認為患者的檢驗數值 (圖 6)，現行使用 2-tier 篩檢，在 GAA 活性小於 10%，NAG/GAA 比值超過 25 即為異常，但因為確認為龐貝氏症患者的比 值皆大於60，因此我們可以合理的將此界限值提高到 60，在不影響篩檢特

異性的條件下，減少篩檢偽陽性的發生。在使用活性≤ 6.39%均值與

NAG/GAA 比值 ≥60 的條件下，不會有偽陰性的產生，而偽陽性率可以從 97%減少到 50%，檢驗敏感性(sensitivity) 可以從 3%大幅提高到 86.7%。

參.2. 台灣地區龐貝氏症患者的現狀

參.2.1.

嬰兒型龐貝氏症基因突變分析

自1994 年開始，共有 37 名患者於本院接受酵素診斷確認為嬰兒型 龐貝氏症。另外有 2 人只寄送 DNA 檢驗但沒有酵素活性的資料。這些患 者的血球GAA 酵素活性為 0-7.36，但是皮膚纖維芽細胞的 GAA 酵素活性 為0-1.23，確認為龐貝氏症患者。其中共 25 人接受基因檢驗(表六)，結果 顯示c.1935C>A (p.D645E)為最常見的基因突變，占了 56%，其他的突變包 括 c.872T>C (p.L291P)，c.1411_1414del (p.E471PfsX5)較為常見 (表六)。

c.1843G>A (p.G615R)則只出現一次。

參.2.2.

嬰兒型龐貝氏症患者治療成果

本院於 2002 年起即開始治療嬰兒型龐貝氏症患者，至 2008 年為

止，共有 9 名患者因為產生了臨床症狀因而至本院接受人類重組酵素

alglucosidase alpha (Myozyme [Genzyme, Cambridge, MA])治療，每兩周劑量 為 20mg 每公斤體重，皆經由靜脈注射給予。其症狀表現年紀，開始治療 年紀，與治療結果如表(表七)。由於早期藥物上處於臨床試驗階段，病患 1-5 取得治療藥物不易，因此在診斷後皆經歷約 1-3 個月的延遲後才開始治 療，治療開始年紀為5.4-6.1 個月。相對而言，病患 6-9 則因為當時藥物已 有健保給付，相對取得容易，因此治療開始的時間較早，治療年紀為2 -4.4 個月。

在這9 名患者中，目前有 2 名患者死亡，另外有 3 名患者需要使用 長時間呼吸器，有2 名患者可以跑步，行動正常。現有 3 人可以口進食，

另外4 人則因為吞嚥困難，須依靠鼻胃管或胃造廔管進食(表七)。

25

參.3. 嬰兒型龐貝氏症患者治療後之免疫反應

本院於2002 年起即開始治療嬰兒型龐貝氏症患者，患者在接受酵 素補充療法前，及治療後皆會定期抽血檢驗其血中抗體濃度。這些患者的 體內抗GAA IgG 抗體，在接受治療後 2 個月內迅速生成並達到頂點(圖 7)，

維持約 6 個月之後會逐漸下降，顯示體內對人類重組酵素已產生耐受性。

最高的抗體濃度僅為1:12 000，與國外患者有很大的差距(Amalfitano, et al., 2001)。抗體濃度在因有臨床症狀而被診斷的個案(臨床個案組)與新生兒篩 檢檢出的個案(新生兒篩檢組)兩組之間並無差別，不因臨床個案組較晚開 始治療而導致抗體濃度較高的表現。

我們進一步以西方墨點法檢驗患者體內是否有殘存的蛋白質。過去 的研究文獻結果顯示，GAA 蛋白質有三個主要的型式，分別為 110kDa、

95 kDa 及 76kDa。其中 110kDa 為 GAA 蛋白質的前驅物，95 kDa 為 GAA 蛋白質的中間產物，而76kDa 為經過修飾的成熟的 GAA 蛋白質(圖 8, lane N)。以此方法檢視發現這些患者體內有少數殘餘蛋白質，主要為 110kDa 的型式，為 CRIM 陽性個案(圖 8)。因此推測其免疫系統已經過教育，較 可以容忍外來蛋白質的挑戰，不易產生持續性大量抗體干擾藥物療效。已 知台灣地區患者常見的突變p.D645E 仍能產生完整的蛋白(Hermans, et al., 1993)，因此患者體內仍可見到殘餘蛋白質的存在是合理的推測。

參.4. 嬰兒型龐貝氏症患者治療後之腦部發展  

先前文獻中的病理切片顯示患者的肝醣可以堆積在大腦皮質及腦 幹的膠狀細胞(glial cells)，以及前角細胞(anterior horn cells)(Araoz, et al., 1974)。而且以腦部核磁共振檢驗這些患者的腦部結構時，曾有兩個個案報 告有側腦室擴大(widening of the anterior horns of the lateral ventricles)及中 心皮質層失養(central cortical atrophy)等變化(van den Hout, et al., 2003)。另 一篇回顧亦顯示有腦室擴大，1 位的白質構造出現改變，及局部或廣泛的 腦萎縮情形(Kishnani, et al., 2006a)。這些都是回溯性個案報告，至於經過 酵素治療後的情況，並未有報告。

我們使用影像學檢查來定期追蹤嬰兒型龐貝氏症嬰兒的腦部發育 情形。共追蹤了5 名(Case 1-5, 表七)患者。這些患者出生體重皆正常，平 均於3 個月大開始出現症狀，於 6 個月大時開始接受治療，接受治療時皆 已出現心臟肥大及肌肉無力等典型嬰兒型龐貝氏症的症狀。接受酵素治療 1 年後，其心臟肥大現象皆已消失，Case 5 可以自行移動及行走，但是 Case 2-4 的治療對肌肉症狀改善不大，這些患者只能有少數動作如平行移動腳，

不能坐，且無法控制頭部。Case 1 只能眨眼，沒有手部或腿部的運動功能，

但是並未出現僵直(spasticity,rigidity, dystonia, or choreoathetosis)等不正常 動作。

我們發現，在我們這5 個於六個月大開始接受治療的患者，接受治 療前，皆顯示有延遲髓鞘化 (myelination)的現象(圖 9)，在追蹤到約一歲大 時所有患者的髓鞘化程度皆有進步，但是有3 位(cases 1–3)出現腦室擴大的 情形。但是在Case 1，髓鞘化程度在一開始的 6 個月有進步，但是之後的 進步不大，而且開始出現輕微腦部結構異常如側腦室擴大及白質病變等現 象。由於重組酵素無法通過血腦屏障，因而我們推斷這些髓鞘化程度改善 應歸功於身體狀況的改善。而且從這些患者的追蹤影像可以推論，龐貝氏 症的肝醣儲積於部分神經前角細胞或史旺細胞可能不至於對患者腦部功能 造成重大影響。

27

參.5. 經由新生兒篩檢檢出的嬰兒型龐貝氏症患者治療的現 狀

我們自20 萬個新生兒檢出 5 名典型嬰兒型龐貝氏症患者，並於 12 天-34 天內開始給予治療(表八)。另有一名非典型嬰兒型龐貝氏症患者，則 於14 個月大時開始治療。5 名典型嬰兒型龐貝氏症患者在治療前皆有心臟 肥大的現象，LVMI 左心室質量比(left ventricular index) 皆超過正常 (正常 值47.4 ±6.2 g/m²)。治療後約 4-6 個月 LVMI 即有顯著減少，但仍較正常心 臟為大(圖 10)。目前所有患者皆可自由行走，自行以口進食。

我們以存活曲線分析未經治療，晚期治療，以及因為新生兒篩檢確 認因而早期治療的三組患者，發現其中經過治療的兩組患者之存活曲線類 似(圖 11 A)，顯示酵素治療可以大幅延長患者壽命。在新生兒篩檢組存活 率與未治療組相比，有大幅改善 (p=0.0011)， 與晚期治療組比較則相距不 大(p=0.4795)。

另 外 我 們 分 析 患 者 不 使 用 呼 吸 器 的 存 活 曲 線(ventilator-free survival)， 可以看出早期治療的患者治療效果最好(圖 11 B)。在新生兒篩 檢組不使用呼吸器的存活率與未治療組相比，有大幅改善 (p=0.0084)， 與 晚期治療組比較亦有改善(p=0.0640)。然而因為新生兒篩檢組的患者追蹤時 間不夠長，與晚期治療的患者並未能顯示明顯差異。

然而，我們嘗試比較不同組別患者可以行走的年紀，可以發現早期 治療的患者治療效果最好(圖 11 C)。在新生兒篩檢組可以行走的年紀與未 治 療 組 相 比 ， 有 大 幅 改 善 (p=0.0090) ， 與 晚 期 治 療 組 比 較 亦 有 改 善 (p=0.0063)。這是因為在未治療組，患者未達到能行走的年紀以前即已死 亡，而在晚期治療組，許多患者雖然可以存活，但是運動功能改善不盡理 想，患者無法行走甚至無法自行坐立，因此可以明顯看出，早期治療(新生 兒篩檢組)不但可以對患者的存活有大幅改善，對患者的運動功能也有長足 的改善，使得這些患者可以擁有近乎正常的生活。

參.6. 由大眾篩檢所得之的龐貝氏症分子病理機轉

參.6.1.

新生兒篩檢檢出之嬰兒型龐貝氏症患者之基因突

變與已知臨床個案相似

我們自 20 萬個新生兒檢出 6 名罹患(典型及非典型)嬰兒型龐貝氏 症患者。預估發生率約為1 in 33 333。這 6 名患者的基因突變如表所示(表 九)，這些患者的基因突變仍以 p.D645E 為主，佔 50% (6/12 alleles)，與臨 床個案(表六)相似。除了 NBS1 外，這些患者的另一個 Allele 多為 frameshift mutation (p.E471PfsX5，p. L948SfsX70， p.Y354X)， 可以呼應這些患者的 表現，為嚴重的典型嬰兒型龐貝氏症。

參.6.2.

GAA 酵素活性部分缺乏個案的基因分析

在檢驗 13 萬名新生兒後發現的 121 名 GAA 酵素活性部分缺乏或 酵素缺陷的個案(包括 4 名嬰兒型龐貝氏症患者)，我們對其中同意進行基 因檢驗的107 名進行了全基因掃描(表十)。共有 72 人(67.3%)帶有一已知的 致病性突變(48/107)或是帶有一未知臨床意義的突變(31/107)。其中有 8 人 (7.5%, 8/107)同時帶有一已知的致病性突變及一未知臨床意義的突變。在已 知致病性突變方面，我們發現仍以 D645E 突變為主(表十, 表十一)，占 24.3% (26/107)，顯示此突變為華人常見，可能是因為方舟效應所導致。第 二 常 見 者 為 p.E888X (6.5% or 7/107) 。 但 是 之 前 報 告 中 常 見 的 c.1411_1414del (p.E471fsX5)出現 2 次，c.1843G>A (p.G615R) (Ko, et al., 1999)出現一次，c.872T>C (p.L291P) 則出現兩次。值得注意的是，有很大 比例的個案是找不到基因有致病性突變或是未知臨床意義的突變(31.4%，

35/107)(表十)，其中有 33 人(33/107, 30.8%)為 [p.G576S + p.E689K]同型 子。我們之前也觀察到，部分罹病的家長雖帶有相同的基因突變，但是酵 素活性卻有很大的不同(圖 12, carriers)，甚至部分罹病家長，雖然為帶因 者，其酵素活性與罹病者相似(圖 12A, B, carriers and patients)。顯示除了致 病性突變外，應該有其他原因會導致GAA 酵素表現的高低。

29

參.6.3.

相同帶因者間具有不同酵素活性原因的分析

為了釐清這些帶有相同突變的帶因者，為何有不同酵素活性表現的 原因，我們從歷史資料中，找出帶有相同突變的帶因者。先分析這些帶因 者的蛋白質表現量及RNA 量與酵素活性的關係(圖 13)，發現酵素活性愈低 者 ， 蛋 白 質 表 現 量 愈 低(R²=0.6599) ， 而 且 其 mRNA 表 現 量 也 較 少 (R²=0.4067)。我們進一步分析其基因上不同多型性標記的狀況(表十二)，

發現帶有特定 GAA 基因的多型性會影響酵素活性的表現。以 p.G576S 的 影響效果最大，在同為p.D645E 的帶因者身上，可以發現帶有 p.G576S 的 帶因者平均酵素活性為17.73，約為不具有 p.G576S 的帶因者平均酵素活性 32.92 的一半。

因此我們使用新生兒篩檢檢體，進一步分析具有p.G576S 的人是否 會有較低的酵素活性。結果顯示，在325 個新生兒中，p.G576/p.G576 同型 子的酵素活性平均為16.96±5.64 mmol/L/h (n=243)，p.G576/p.S576 異型子 的酵素活性平均為9.55±3.86 mmol/L/h (n=70)，而 p.S576/p.S576 同型子的 酵素活性平均為5.84±3.68 mmol/L/h (n=12)，明顯不同(表十三)。在這些檢 體中，p.G576S 對偶基因頻率為 14.5%，有 12 個檢體為 p.G576S 同型子 (3.69%)，其 GAA 酵素活性為 1.43 到 11.86 mmol/L/h，為正常均值的 8.81 到72.85%。

在新生兒篩檢檢出酵素活性偏低的121 個檢體中，我們對其中接受 全基因分析的 107 個檢體進行進一步分析，將檢體分成找到一個致病性突 變的個案(48/107)，以及找不到致病性突變或是其他未知臨床意義突變的個 案(35/107)。這些找不到突變的個案中有 33 人屬於 p.[G576S; E689K] 同型 子突變。在93 個正常對照組中，只有 2 人屬於 p.[G576S; E689K] 同型子 突變(2.15%; P<0.000001; χ2 test)。比較找到一個致病性突變組與找不到突 變組之間的酵素活性，發現這兩組的酵素活性相似(表十)，顯示 p.[G576S;

E689K]可能導致酵素活性表現低下。

為了解 p.G576S 與 p.D645E 乃至於其他的基因多型性標誌是否存

在有連鎖不平衡的情形，我們利用現有完整的21 個家族，進行 trio 分析，

結果顯示，p.199 與 p.223 標誌存在有最強的連鎖性，而 p.576，p.645， p.689 及 p.780 間的連鎖性不強(圖 14)。但是此結果由於個案數太少，解讀時須 特別留意。

參.6.4.

台灣地區的個案帶有特殊的單倍型 (Haplotype)

為了克服連鎖分析個案數太少的缺點，我們使用了93 個正常對照 組，以及103 個經由新生兒篩檢檢出酵素活性偏低的新生兒，利用 10 個基

因多型性標記，進行單倍型重組分析。結果顯示，台灣地區人民 GAA 的

單倍體與西方高加索人相比，單倍體3 號，8，9 及 11 號皆較多(表十四)，

但是其中只有2 人為 GAA*03 之同型子(homozygotes)。而在酵素活性偏低 的這 103 個經由新生兒篩檢檢出的新生兒族群中，GAA*03 單倍體出現比 例高達81%，其中單倍體 3 號同型子出現的比例更達到 64%，此單倍體包 括了 p.S576/p.K689，所謂 pseudodeficiency 基因型，以及 p.D645E，台灣 地區最常見的突變點。至於其他的突變，如p.S251L/p.S254L 則發生在單倍 體9 號上，p.E888X 在 GAA*09 上，p.W746C 及 c.546+5G>T 都在 GAA*03 上。

參.6.5.

新生兒篩檢檢出之晚發型龐貝氏症患者之基因突

變分析

至於新生兒篩檢中，檢出酵素活性低下但是臨床上並未出現肌肉酵 素升高或是心臟肥大的個案，我們懷疑這些個案是晚發型龐貝氏症患者。

經由 GAA 全基因掃描，發現帶有已知的致病性突變包括常見的 p.D645E (2/22, 9%), p.G615R (1/22, 4.5%), p.E888X (2/22, 9%)等，共占 22.7%; 帶有 一未知臨床意義的突變包括p.W746C (2/22, 9%), p.S142LfsX29 (1/22, 4.5%) 及c.546+5t>g (3/22, 13.6%)等共占 50%。總偵測率只有 82% (18/22)(表十 五)。可能原因是以現行 GAA 全基因掃描的方式，不足以偵測如大片段缺

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失，轉位，或是 RNA 接合(splicing)問題等，因此我們首先用定量 PCR 的 方式，試圖偵測這些患者是否有些外顯子基因不等量的狀況，但是並未有 所發現。我們因此使用大片段反轉錄PCR 的方式，試圖偵測患者是否具有 不正常RNA 的表現。

參.6.6.

嬰兒型龐貝氏症患者基因突變 c.1194+2t>c 之分析

我們之前在嬰兒型龐貝氏症患者曾檢出一未曾被確認過的突變 c.1194+2c>t (表七， No 5)。 此突變預計位在 RNA 接合 donor site，應該 會影響到RNA 接合。之前此突變曾在義大利的晚發型患者出現過，但是並 未有進一步的研究證實此變化會影響接合(Montalvo, et al., 2006)。為了瞭解 此突變所造成的影響，我們從患者的皮膚纖維芽細胞的RNA 中，的確找到 不正常的RNA (圖 15)，經由定序比對後發現，此不正常的 RNA 包括 exon6 尾端4bp 缺失以及 exon7 缺失(圖 15)。此產物預期會造成 41 個胺基酸的缺 失蛋白(p.V358_L398del 41)。另一研究(Wan, et al., 2008)使用此患者父親的 血球萃取RNA，發現此變化會造成 RNA 在 exon7 後無法切割，因此造成 一含intron7 的異常 RNA，預測蛋白質產生 p.L398fsX71 的變化。

參.6.7.

新生兒篩檢檢出之晚發型龐貝氏症患者

c.546+5g>t 突變分析

我們在NBSL7 患者的 RNA 中，找到不正常的 RNA(圖 16 A)，經 由定序比對後發現，此不正常的RNA 包括 3bp 添加在 exon2 與 exon3 之間，

以及 exon2 缺失。比對基因定序結果發現，c.546+5g>t 可能造成此不正常 RNA splicing 的結果，因此我們建立一質體，表現 c.546+5g>t，在體外轉 錄表現(圖 16 B)。結果顯示，在 c.546+5g 的質體(圖 16 C, lane 1 及 2)，可 以產生正常的產物; 但在 c.546+5t 的質體(圖 16 C, lane 3)，則會產生不正常 的 RNA。經由序列比對發現，在 c.546+5t 的質體會產生 3 種 RNA，包括 增添 184bp 及 3bp 的產物(圖 16 D)。 因此確認 c.546+5g>t 會造成不正常

RNA，產生結果包括 p.T182_I183 insV 以及一刪除 578bp 並且無 ATG 轉譯 起始點的RNA，導致 GAA 酵素活性缺乏，為一致病性突變(圖 16 E)。

參.6.8.

新生兒篩檢檢出之晚發型龐貝氏症患者 c.955+167 c>t 突變分析

另外，我們在 NBSL9 患者的血液細胞 RNA 中，找到不正常的 RNA(圖 17A)，經由定序比對後發現，此不正常的 RNA 主要為 exon6 缺失 的產物(圖 17B)，另外也可見到 exon6-7 缺失的產物。總計在患者及其家屬 的血球細胞中，共可以看到 3 種不正常的 RNA(圖 17C)。但是在患者的皮 膚纖維芽細胞中，卻看不到這些不正常RNA 的表現(圖 17 A)。由於 exon6 缺失會造成40 個胺基酸缺失(圖 17 C，D)，導致 GAA 活性喪失(圖 17 E, D6)，因而此變化極可能是這些患者的致病性突變。我們將此家族基因突變 與血液中RNA 量的比較整理於下( 表十六)。

經由比對基因定序結果發現，c.955+167 c>t 極有可能造成此不正常 RNA splicing 的結果。由於包括 exon6-8 之間的序列附近不易被 splicing factor 辨識，以質體於體外轉錄表現並無法重建此缺失，因此我們分析所有 具有此突變的患者的RNA，以建立此突變與不正常 RNA 產物的關聯性。

結果顯示，在龐貝氏症病人及其父母的族群，此突變的盛行率大約 70%；但在一般人的盛行率為 9~10%，其中有一位兩個同源基因都帶有此 突變，但臨床上沒有出現症狀。詳細基因型及盛行率請見表(表十七)。所 有具此基因變化的患者(圖 18A)皆有 delta E6 之不正常 RNA 表現(圖 18 B)，但是表現強度不一致(圖 19)。甚至在不具有此基因變化的患者，也可 看到此不正常RNA(0)。總結的結果如圖 22(圖 21). 推論此種 RNA 可能是 因為IVS5+167 c>t 突變會加大對 GAA pre-mRNA splicing 的影響(圖 22)，

但是仍有其他modifying factors 共同造成 splicing 異常的現象。因此在同一 家族中，可以見到有不同的變化(圖 17 A)。

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參.6.9.

新生兒篩檢檢出之晚發型龐貝氏症患者之基因突

變與已知臨床個案相似

在我們回溯性研究中，本研究室共分析診斷了13 位晚發型龐貝氏 症患者，包括一對兄弟。其結果顯示(表十八)，突變總偵測率為 100%。在 已知致病性突變中，p.D645E 突變仍為最常見，但只占了 29% (7/24)，其他 已 知 致 病 性 突 變 包 括 c.1843G>A (p.G615R) ， c.872T>C (p.L291P) ， c.1375G>A (p.D459N)，c.1798 C>T (p.R600C)，及 c.2014C>T (p.R672W)各 出現一次，共占 50%。其他未知意義的變異共出現 12 次，占 50%，但是 其中c.2238G>C (p.W746C)則出現 8 次，占 33%。甚至在患者 LOPD12，為 p.W746C 同型子，顯示 p.W746C 可以造成龐貝氏症。

總結而言，在疑似晚發型龐貝氏症患者的基因突變(表十五)，與臨 床上台灣地區的晚發型個案(表十八)相似，主要以 p.D645E 及 p.W746C 突 變為主，顯示這些新生兒篩檢異常的患者，的確需要定期追蹤以及早偵測 病症的表現如肌肉無力，肌肉酵素升高的狀況，以及早治療避免肌肉細胞 產生不可逆的傷害。

第肆章、 討論

肆.1. 酵素補充療法

針對嬰兒型龐貝氏症的酵素補充療法，在進行臨床階段時的成果顯 著，在小於6 個月前就開始治療的總人數為 18 名試驗者中，所有患者皆存 活超過1 歲，與未治療組有極大的差別(Kishnani, et al., 2007)。到試驗結束 時，存活的 15 名患者中，有 3 人須使用呼吸器，5 人須使用管灌飲食，5 人運動功能沒有改善。此成果相較於另一個較晚治療的試驗有明顯差距，

顯示愈早開始治療，治療效果愈好。本研究更大幅將治療時間由小於 6 個

月提升至小於1 個月，經篩檢檢出的嬰兒型龐貝氏症患者，即使只有 1 周 大，即已顯示有心臟肥大，肌肉酵素(CK)升高的現象，若延遲治療至 2-4

個月大時，也可能無法挽救已受損的組織。本研究證實，若能於小於 1 個

月就開始治療，治療成效可以更加改進，因此新生兒篩檢可以協助患者得 到更佳的預後。

治療的成果，可能還受到其他因素影響，如CRIM 狀態，或是是否 已受感染刺激細胞 autophage 過程等。目前已知 CRIM 狀態因為對產生抗 體有影響，所以若為CRIM 陰性患者，則需要控制免疫反應，以免產生抑 制性抗體而抵銷藥物治療效果(Sun, et al., 2007)。但是在台灣地區，由於患 者多含有p.D645E 突變，因此皆屬 CRIM 陽性患者，較不需擔心免疫反應 的問題。

相較於之前的研究認為龐貝氏症患者的心智功能應屬正常發展，

Kishnani 等人在 2007 年的報告發現若使用「貝萊氏嬰兒發展量表第二版」

對17 名龐貝氏症個案進行測試，其中有 4 人的智力發展指數顯示有嚴重遲 緩。造成此一歧異結果的原因可能和「貝萊氏嬰兒發展量表」的特性有關，

因為此量表在評估智力分量表時需要手部操作的動作，嬰兒型龐貝氏症個 案可能因為上肢無力，而無法通過這部份的題目，另一個可能的原因則有 可能來自於長久的肌肉無力、較差的呼吸功能以及聽覺受損，使得這些嬰 幼兒較少有和外界互動、獲得刺激的機會，因而有遲緩的情形。本研究針 對腦部影像學的研究發現患有嬰兒型龐貝氏症的嬰兒在腦部神經元的髓鞘

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化程度比正常發展的嬰兒要慢(Chien, Lee et al., 2006)，因此可能有部份兒 童在心智功能的發展上的確有較為遲緩的現象，但過去由於此類患者大多 無法活過一年，因此無法長期追蹤其認知功能的發展。因此在未來的研究 中，仍需對心智功能長期的發展進行追蹤。

肆.2. 大眾篩檢

本篩檢著眼於偵測嬰兒型龐貝氏症患者，以期及早給予治療，避免 患者，家長及社會成本的負擔。由此研究發現，台灣地區的嬰兒型龐貝氏 症患者發生率約為1: 1 in 33 333 (95%信賴區間為 1:12 048 to 1:100 000)。

一般而言，龐貝氏症的發生率依種族與地區不同而有不同，發生率約為1 in 40 000 到 1 in 300 000(Hirschhorn and Reuser, 2001)。在荷蘭及紐約的發生 率約為1 in 40 000(Poorthuis, et al., 1999) (Martiniuk, et al., 1998)，而之前的 臨床經驗顯示，在中國大陸南方和台灣地區發生率約為1 in 50 000 (Lin, et al., 1987; Lin and Shieh, 1996)。因此，本研究所得到的嬰兒型龐貝氏症患者 的發生率與文獻報告類似，可能是因為嬰兒型龐貝氏症的症狀如心臟肥 大，肌肉無力等極具有特異性，因此臨床醫師容易辨識此病，本篩檢的意 義在於提早診斷時間，以及早給予治療，不至於等到嬰兒型龐貝氏症的症 狀如心臟肥大，肌肉無力等症狀出現後才被診斷，影響治療效果。

至於篩檢偽陽性的問題，由於可能造成家屬承受不必要的壓力，及 引起親子關係的緊張，我們已著手研究此部分對台灣地區家長所造成的影 響。龐貝氏症的再檢檢率在本研究中為0.8%，此與其他篩檢相似(Kwon and Farrell, 2000)，如 cystic fibrosis 為 0.6%(Sontag, et al., 2005)，congenital adrenal hyperplasia 為 0.74%(Olgemoller, et al., 2003)。然而，我們在經過先 趨篩檢後，已經了解確認患者數值分佈。目前我們可以合理的提高界限值，

在不影響篩檢特異性的條件下，減少篩檢偽陽性的發生。在使用活性≤

6.39%均值與 NAG/GAA 比值 ≥60 的條件下，不會有偽陰性的產生，而偽 陽性率可以從97%減少到 50%，檢驗敏感性可以從 3%大幅提高到 86.7%。

這樣的篩檢效能，與一般新生兒篩檢項目相比，與 G6PD 缺乏症相似，而

較先天性甲狀腺低能症的檢驗為優。未來我們希望可以再改進檢驗方法，

以避免不必需的檢驗。

本研究期間並未發現有偽陰性的嬰兒型龐貝氏症患者，因此龐貝氏 症新生兒篩檢的偽陰性率為0%。

但是由於本新生兒篩檢的方法檢驗的是酵素活性，因此有可能檢驗 到晚發型龐貝氏症患者。根據之前流行病學的推估，在西方人，嬰兒型龐 貝氏症比晚發型患者的比例約是1:2(Kemper, et al., 2007)。但是在台灣地 區，晚發型患者的發生率遠低於嬰兒型患者，此可能是因為台灣地區患者 突變型式與西方人不同，或是因為晚發型患者尚未被廣泛診斷所致。雖然 迄今，我們仍無法決定晚發型患者何時會發病，或是應該於何時開始給予 他們治療，但是由之前的研究顯示，經由臨床診斷的晚發型患者，治療效 果不佳。因此需要更早給予治療。目前，對於這些經由篩檢檢出的疑似晚 發性患者，我們不但已經由突變分析確認他的罹病狀態，並且定期追蹤他 們的運動功能及肌肉酵素等狀態，期能在最早時間偵測出肌肉受損的警 訊，以及早給予治療。

肆.3. 突變型式

一般說來，用基因型可以大致預測表現型(Kroos, et al., 2004; Kroos, et al., 2007; Raben, et al., 2002b)。尤其在高加索人常見的 c.-45T>G 突變 (Kroos, et al., 1995)，由於會造成 RNA 接合上的缺陷，形成無功能的 RNA，

但正常與不正常的比例可能具有組織特異性(Raben, et al., 2002b)，因此大 致說來，帶有此突變的患者表現較輕微，多屬於晚發型患者，但是若另一 對偶基因為嚴重突變型，則發病年紀就有可能提前 (Kroos, et al., 2007;

Kroos, et al., 1995)。在台灣地區，雖然 p.D645E 為常見的突變，但由本研 究結果顯示，不論嬰兒型或晚發型患者，皆以p.D645E 突變最常見，先前 文獻也報告過，具有p.D645E 突變可以有不同嚴重度的表現(Ko, et al., 1999;

Lin and Shieh, 1996; Tsujino, et al., 2000)，甚至在非裔美人同樣具有 p.D645E 突變的患者，也可以見到以晚發型表現的症狀(Hermans, et al.,

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1993)，因此具有 p.D645E 突變，不必然就可以預測其表現型。但在台灣地 區，由於p.D645E 突變位於 GAA*03 單倍體上，可以預測多數 p.D645E 皆 與[p.S576, p.K689] pseudodeficiency 一起出現，因此在台灣族群的 p.D645E 為嚴重的突變。

另外在我們的研究中，有一部分的晚發型患者帶有 p.W746C 突 變。此突變原認為是一已知的基因多型性標誌(Huie, et al., 1994)，但是後續 研究指出，p.W746C 突變只能殘存約 12%的酵素活性(Huie, et al., 1998)，

而且此突變並不常見(Wan, et al., 2008)，在我們的研究結果顯示，帶有 p.W746C 的 6 名晚發型患者，4 名帶有[p.G576S,p.E689K]Ho，1 名帶有 p.G576S He，因此 p.W746C 可能在 p.G576S 的影響下，造成患者較輕微的 症狀，為一晚發型的突變(Wan, et al., 2008)。

我們的結果顯示，嬰兒型龐貝氏症患者，不論經由臨床症狀診斷，

或是經由新生兒篩檢，皆以p.D645E 突變占最大比例，而且突變偵測率可 達 98%-100%。而在晚發型龐貝氏症患者，臨床診斷的個案仍以 p.D645E 突變最常見，但是比例較嬰兒型為低。而在新生兒篩檢檢出疑似晚發型龐 貝氏症患者，p.D645 突變只占 9%，而且突變偵測率只達 82%，其中有 13.6%

屬於 splicing 缺陷，顯示新生兒篩檢檢出疑似晚發型龐貝氏症患者基因突 變型式與臨床上晚發型患者不盡相同，可能是因為新生兒篩檢檢出疑陽性 的個案，或是臨床上對於晚發型患者的辨識度不足，因此無法顯示晚發型 患者基因突變的全貌。

肆.4.

Pseudodeficiency

一般認為，嬰兒型龐貝氏症才會有心臟肥大的表現，而晚發型龐貝 氏症則不會有心臟的問題。但曾有零星的個案報告，龐貝氏症的臨床表現 可能與我們所熟知的不一樣。如有一個案於14 歲死於心臟衰竭(Suzuki, et al., 1988)，其表現有 GAA 酵素活性缺乏，GAA 基因突變為 p.G576S (c.1726G>A)和.E689K (c.2065G>A)同型子突變。然而 p.E689K 為一已知的 基因多型性標誌 (Huie, et al., 1996; Shieh and Lin, 1998)，並不會造成 GAA

酵素活性表現的變化。這個男孩的肌肉細胞並未見到有肝醣儲積。由於此 病患的皮膚纖維芽細胞仍有11-15% 之殘存酵素活性，因此 p.G576S 突變 被稱為“pseudodeficiency”突變 (Tajima, et al., 2007)。這種患者似乎在正常 東方人即可見到，在歐洲的發生率約為1%，但在亞洲人的發生率高達 20%

(Kroos, et al., 2008)。已知具有 p.G576S 短暫轉殖的 COS-7 細胞可以表現約 20%-50%的 GA 酵素活性，這可能是因為 glycine 變成 serine 後，影響蛋白 質的穩定度(Yue, et al., 2005; Yue and Moult, 2006)，因而影響酵素活性。在 我們的篩檢檢出低酵素活性的個案中，有66 人為這種 p.[G576S; E689K] 同 型子突變，其中33 人找不到其他致病性的突變，顯示 p.G576S 會導致酵素 活性低下，以至於這些即便沒有其他致病性突變但是為 p.[G576S; E689K]

同型子突變的個案，會造成新生兒篩檢偽陽性的發生。

雖然p.G576S 與 p.E689K 不一定要同時出現，在 Kroos2008 的報告 中，發現有16 名個案為 p.G576S He, p.E689K Ho，但是並未發現有 p.G576S Ho, p.E689K He 的個案(Kroos, et al., 2008)，顯示 p.G576S 應該發生在已有 p.E689K 變化的單倍體上。既然 p.G576S 的發生率在亞洲可高達 20%，配 合臨床經驗來看，p.G576S 本身為 pseudodeficiency 而非真正的致病性突 變。但是 p.G576S 的存在，可能導致晚發型龐貝氏症患者酵素表現低下，

而造成較嚴重的臨床表現。

肆.5.

Splicing defect

在我們的研究顯示，新生兒篩檢疑似晚發型患者有13.6%為 splicing 缺陷的突變。從資料庫搜尋可知，目前已知 splicing 缺陷的突變約占總突 變種類的8%，著名的例子包括在高加索人常見的 c.-45T>G 突變(Kroos, et al., 1995)。本研究新增 3 個關於 splicing 缺陷的突變，包括 c.546+5t>g，

c.1194+2t>c 以及 c.955+167c>t。c.546+5t>g 目前只見於新生兒篩檢個案，

此變化會造成 exon2 後方加上 3bp 才被裁切，或是 exon2 缺失的 RNA(圖 16)，此種 RNA 因為不含轉譯起始的 ATG，預期不會有蛋白質的產生。另 一種產物預測會轉譯出p.T182_I183insV 蛋白，可能仍有殘存酵素活性，因