國立臺灣大學醫學院生理學研究所 博士論文
Graduate Institute of Physiology College of Medicine
National Taiwan University Doctoral Dissertation
肢體刺激誘發神經反射所引起之特異性血流變化 Neural reflex-mediated specific blood flow change
after limb stimulation
黃忠信
Chung-Shin Huang
指導教授：蔡元奮 博士 王淑芬 博士 Advisor: Yuan-Feen Tsai, Ph.D.
Shwu-Fen Wang, Ph.D.
中華民國 102 年 1 月 January, 2013
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國立臺灣大學博士學位論文
口試委員會審定書
肢體刺激誘發神經反射所引起之特異性血流變化 Neural reflex-mediated specific blood flow change
after limb stimulation
本論文係黃忠信君（D95441002）在國立臺灣大學醫學院 生理學研究所完成之博士學位論文，於民國一百零二年一月二 十四日承下列考試委員審查通過及口試及格，特此證明
口試委員：
（指導教授）
所長：
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誌 謝
畢業是另一個新階段的開始，最要感謝的是七年前的自己；如果沒有當時的 堅持不放棄，就不會有這一天的到來。當年為了想利用科學方法驗證臨床觀察的 新發現，而參加生理所碩士班甄試。口試過程雖已知錄取無望，試後毅然厚顏寫 信給所上幾位老師，野人再現曝一番，沒想到一生中最大的貴人就出現了，蔡元 奮老師來電告知，與林仁壽教授有興趣來診所了解療法。如果沒有蔡老師，絕不 可能進入台大，也不可能透過這六年半的學習，為下階段研究打下扎實的基礎。
因為離開學校及從事臨床工作太久，一開始許多思維及做法與科學研究的精 神落差頗大，雖然造成實驗過程與進度不如預期順利，但始終深信學習與研究是 嘗試錯誤的歷程，如此才能從中獲得寶貴的經驗。這過程中除了感謝蔡老師的懇 切教誨外，物理治療所王淑芬教授指導頗多，尤其人體試驗的部分，無論是倫委 會的許可申請、實驗設計與統計分析方法，或是研究方法學與研究精神的指導，
都受益良多，謝謝您。所上各位老師在課業上多所指導與協助，李鳳珠小姐、林 郁政先生、陳香君小姐及陳怡文助教的幫忙，在此一併致謝。最為遺憾的是林仁 壽教授殷殷期許，卻因病辭世未能目睹此刻的到來。
早期從零開始摸索，最辛苦也最不可能立見成果，感謝威穎與書枰分別在人 體試驗與動物實驗的投入。後續人體試驗有章伊、至中、昱慶、淑萍、玲綸及郁 芬的幫忙，動物實驗有戴美雲小姐、彥陞、淑萍、依婷及雅慧的協助，謝謝你們。
最後這個階段能順利突破，最需要謝謝的是俞宏、雅慧與依婷的通力合作。當然 每天都有門診工作，在工時已超過一般上班族，又要每週南下台中及高雄看診，
還能撥空修課及進行實驗與論文寫作，這都要感謝診所所有同仁的協助，尤其是 陳惟華醫師幫忙分擔門診工作，讓我無後顧之憂，不致分身乏術。
最後需感謝將我生活照顧得無微不至的妻子美齡，沒有妳，我絕對無法完成 這個目標，也要感謝兒子建文女兒琬婷的打氣。同時要將這份榮耀與父親、岳父、
岳母、妹妹們及家族親友分享，謝謝您們多年來的關懷與支持。
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摘 要
動物為了生存所需，會經由神經系統的作用不斷對內外環境的變動進行監控 與調適。其對於外來刺激所產生的反應有很大的部分與血流量的改變有關。這些 反應有些是廣泛性的，有些則具有局部特異性。如能釐清各神經系統之間刺激反 應的對應關係，以及其所產生的特異性血流量改變，就有可能藉由人為施予物理 性的刺激，來產生預期的反應，以達到調控神經功能與改善生理功能的目的。
本研究嘗試建構此種刺激反應研究所需的方法學，並利用其驗證某些刺激反 應 關 聯 性 的 規 則 。 研 究 的 檢 測 方 法 係 採 用 局 部 熱 充 血 反 應 （ local thermal hyperemia）測試來觀察加熱後的局部血流增加現象，此反應被認為與感覺神經的 功能有關，且受到交感神經活性與一氧化氮基礎濃度所調控。治療的方法則採用 目前已廣泛應用於臨床與研究的電刺激（electrical stimulation），觀察電刺激對目標 部位所產生的血流量改變情形。
以往運用的局部熱充血反應測試採用隨機選取的測量部位來進行，其加熱時 間需超過 30 分鐘。雖然採用最大血管擴張量（maximal dilatation）來校正各部 位微血管密度的差異性，但採用單點式雷射杜普勒血流計（single-point laser Doppler flowmetry）量測的再測信度（reproducibility）不佳。本研究改良上 述之缺點，使用單點式雷射杜普勒血流計，在同一個部位進行測試，且加熱時間 縮短為 5 分鐘。結果顯示，在只間隔 45 分鐘的同一測期裡，針對前臂背面同一個 部位進行重複測試，其軸突反射熱充血反應具有良好的再測信度。此外，本研究 進一步發現，如測試部位以預先界定的規則來重新定位，在間隔一至三日後重複 再測試，則短時間局部加熱所引發的軸突反射充血反應仍具有良好的再測信度。
但在其右前臂與左前臂的局部熱充血反應具有不同的再測信度，而延長環境適應 的時間則可提高再測信度。
上下肢的解剖結構具有對稱性，為了維持肢體的正常移動，上下肢之間有非
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常即時而良好的互動協調。因此，本研究第二部份係採用此種具有再測信度而使 用方便的測試方法，以上下肢之間的刺激反應，來探討是否兩者之間存在特異性 的刺激與反應關聯性，以及其對應的規則為何。方法是利用辣椒素紗布敷貼於人 體單側小腿皮膚來誘發局部發炎反應，並使用雷射杜普勒血流計測量兩側前臂解 剖上的對應部位與非對應部位兩處的局部熱充血反應。結果顯示右小腿的辣椒素 刺激會增強右前臂對應部位的局部熱充血反應，而左小腿的辣椒素刺激則對左右 兩側前臂的局部熱充血反應都不影響。推測此種反應可能是經由體交感神經反 射，使交感神經活性提高，進而影響軸突反射強度。此結果顯示上下肢之間可能 存在特異性的刺激反應作用，其作用不僅具有解剖上特異性之對應關係，且左右 側的反應並不相同。
為探討人為施加刺激可否在上下肢對應部位產生調整生理功能的作用，本研 究的第三部份採用大鼠兩側後肢缺血 60 分鐘，於 24 小時之後在單側前肢進行 30 分鐘不同頻率的電刺激（3、45 或 45 Hz），以雷射杜普勒影像儀觀察兩側後肢體 表血流的變化。結果發現前肢電刺激可以造成後肢特定部位的血流量產生特異性 的改變。以 125 Hz 電刺激左前肢可改善兩側後肢血流，而電刺激右前肢則對兩側 後肢的血流量都無作用。不同頻率電刺激與電刺激在不同側前肢所產生的後肢血 流改變效應不同。推測其效應可能來自體交感神經反射，使後肢特定部位的交感 神經張力下降，進而增加血流。
綜合以上實驗結果，本研究改良了局部熱充血反應測試方法，不但大幅減少 檢測所需之時間，亦提高其再測信度，可用來評估單純由神經媒介的軸突反射。
此方法也藉由辣椒素體表刺激後，於上下肢之間的解剖對應部位得到局部熱充血 反應量的顯著改變。因此，今後在進一步研究確認此種改變是經由體交感神經反 射的作用後，此方法未來可針對有興趣的目標部位進行測試，以了解該部位的交 感神經活性之變化。本研究也發現上肢電刺激可以在下肢產生特異性血流改變，
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故亦有機會應用在分析體交感神經反射之刺激反應部位的關聯性。
經由發現局部熱充血反應與電刺激之較佳參數，本研究結果顯示這兩項技術 可以用來檢測與驗證特異性的體表刺激與反應規則。在進一步探究以確認其刺激 反應是經由體交感神經反射的作用後，可利用此等技術繼續探討與建立刺激反應 的對應規則，進而發展實用的標靶神經調節（targeted neuromodulation）技術，
臨床上有潛力可運用於治療各種與神經與血液循環系統功能失調有關的疾病。
關鍵詞：軸突反射、局部熱充血反應、電刺激、皮膚血流、交感神經反射
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Abstract
Animals adjust their physiological conditions through the nervous systems to accommodate the internal and external environmental challenges, and their stimuli-responses act according to certain mechanisms. The responses are majorly related to the changes of blood flow which are either generalized or specific. If the mechanisms of stimuli-responses could be clarified, we can use certain artificial physical stimuli to regulate the physiological functions through neural modulation.
The previously used protocols of LTH tested the randomly selected recording sites and the heating time was longer than 30 min. Although the axon reflex (AR) flare has been normalized by maximal vasodilatation to adjust the spatial heterogeneity of capillary density, the reproducibility of previous method using single-point laser Doppler flowmetry (LDF) was poor. The results of this study demonstrated that single-point LDF is a reproducible technique of assessing AR flare on dorsal surface of the forearm twice with 45 min apart when the heating period is reduced to as short as 5 min and the recording sites are fixed. In addition, the AR flare induced by short local heating is reproducible with 1-3 days apart when the recording sites are relocated by a predefined rule. The reproducibility of LTH on the right forearm is different from that on the left forearm, and the increase of acclimation period can improve the reproducibility.
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The anatomical structures of upper and lower limb are symmetrical. There is timely and good coordination between upper and lower limbs to keep the free motion of limbs.
In this study, the stimuli-responses between upper and lower limbs were investigated.
Capsaicin epidermal stimulation was applied on the unilateral leg and LTH was measured by LDF on the corresponding and non-corresponding position of bilateral forearm. The results demonstrated that stimulation on the right leg enhanced the LTH response on the corresponding position of right forearm. Stimulation on the left leg did not affect the LTH response of bilateral forearm. This effect may be attributed to that the LTH response was enhanced by increased sympathetic tone which was mediated by somato-sympathetic reflex. These results showed that an anatomically specific stimulus-response may exist between upper and lower limbs.
Electrical stimulation (ES) with 3, 45 or 125 Hz for 30 min was applied to unilateral forelimb 24 hrs after bilateral hindlimb ischemia for 60 min to explore whether this stimulation could adjust the physiological condition on the corresponding region of hindlimb. Laser Doppler imager was used to measure the blood flow change on bilateral hindlimb during and after ES. The results showed that ES on forelimb may induce specific blood flow change on specific region of hindlimb. ES with 125 Hz on left but not right forelimb could induce significant blood flow increase on bilateral hindlimb. It may infer that the blood flow increase may be attributed to the decreased sympathetic
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tone which was mediated by somato-sympathetic reflex.
These results showed that short-heatng LTH method can be reproducible and be used to evaluate the simple nerve-mediated AR. Capsaicin stimulation induced a specific LTH change of the anatomical corresponding positions between upper and lower limb. Hence, after further verifying the response was mediated through somato-sympathetic reflex, this method can be used to evaluate the change of sympathetic activity on the region of interest. Finally, these results indicated that ES on forelimb may induce a specific blood flow change on hindlimb. Therefore, after further verifying the blood flow change is mediated through somato-sympathetic reflex, the topographical relationship of somato-sympathetic reflex may be established.
These results suggested that the techniques of both LTH and ES can be used to investigate the specific rule of stimuli-responses after adopting better parameters.
Therefore, they can be applied to further explore and establish the corresponding rules of stimuli-responses and to develop a targeted neuromodulation therapy with a potential to treat the disorders of nervous and blood circulatory system.
Keywords: axon reflex, local thermal hyperemia, electrical stimulation, skin blood flow,
somato-sympathetic reflex
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目 錄
口試委員會審定書………i
誌謝………ii
中文摘要………iii
英文摘要………vi
目錄………ix
圖目錄………xi
表目錄………xiii
第一章 導論………1
1.1 肢體刺激誘發神經反射………2
1.2 神經反射媒介之血流變化………4
1.3 上下肢之間的神經反射作用………6
1.4 研究動機及目的 ………7
第二章 短時間加熱誘發局部熱充血反應之同測期再測信度 ………10
2.1 前言………10
2.2 材料與方法………12
2.3 結果………15
2.4 討論………16
2.5 圖表………19
第三章 環境適應期間延長對短時間加熱誘發局部熱充血反應不同測期再測信度 之影響………22
3.1 前言………22
3.2 材料與方法………24
3.3 結果………25
3.4 討論………26
x
3.5 圖表………31
第四章 以辣椒素刺激下肢體表對上肢皮膚局部熱充血反應之影響………34
4.1 前言………34
4.2 材料與方法………35
4.3 結果………38
4.4 討論………38
4.5 圖表………41
第五章 電刺激大鼠前肢對後肢缺血所產生之特異性血流量改變………44
5.1 前言………44
5.2 材料與方法………45
5.3 結果………48
5.4 討論………50
5.5 圖表………54
第六章 結論………61
參考文獻………66
xi
圖 目 錄
第二章 短時間加熱誘發局部熱充血反應之同測期再測信度
圖 1 實驗進行程序………19
圖 2 測量部位的解剖位置標記………19
圖 3 五分鐘體表加熱程序的血流與溫度變化情形………20
圖4 五分鐘體表加熱程序的血流改變代表值………20
第三章 環境適應期間延長對短時間加熱誘發局部熱充血反應不同測期再測信度 之影響 圖1 五分鐘體表加熱程序的血流改變代表值………31
第四章 以辣椒素刺激下肢體表對上肢皮膚局部熱充血反應之影響 圖 1 實驗進行程序………41
圖 2 下肢辣椒素刺激部位與上肢測量局部熱充血反應的對應部位及非對應部位示 意圖 ………42
圖3 以辣椒素刺激單側下肢後，刺激前與刺激後上肢各測量部位之熱充血反應量 比較 ………43
第五章 電刺激大鼠前肢對後肢缺血所產生之特異性血流量改變 圖 1 動物實驗進行程序………54
圖 2 動物施行電刺激與血流測量的照片………55
圖 3 後肢血流量分析範圍………55
圖 4 實驗過程中之血流分佈掃描圖………56
圖 5 前肢電刺激造成後肢血流量改變之情形………57
圖 6 四個小範圍血流量分析區域位置示意圖………58
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圖 7 左前肢 125 Hz 電刺激造成左後肢各區域血流量之改變………59 圖 8 左前肢 125 Hz 電刺激造成右後肢各區域血流量之改變………60
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表 目 錄
第二章 短時間加熱誘發局部熱充血反應之同測期再測信度
表1 男性與女性受試者基本資料………21 表2 不同數據呈現方式的局部熱充血反應再測信度………21 第三章 環境適應期間延長對短時間加熱誘發局部熱充血反應不同測期再測信度 之影響
表1 30分鐘與60分鐘環境適應組受試者基本資料………32 表2 不同數據呈現方式的局部熱充血反應之再測信度………32 表 3 再測信度良好的短期間加熱局部熱充血反應數據摘要………33
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第一章 導論
動物為了生存所需，經由感覺神經系統監控環境的變化，並透過運動神經與 自律神經系統採取立即的應變措施；這幾種神經系統之間持續保持著動態性的互 相協調。當外來的刺激達到傷害性（noxious）的程度或外來的非傷害性刺激
（non-noxious）持續過久或過大，導致動物無法在短期間內恢復正常的生理功 能，將會使身體的機能逐漸出現失調的狀態，甚至造成永久性的功能受損（McEwen and Wingfield, 2003; Romero et al., 2009）。此種刺激－反應有一定的作用 機轉，身體調適的過程也有一定的運作規則。如能釐清各神經系統之間此種互動 調適的對應關係，就可能藉由施予物理性的人為刺激，來產生可預期的反應，以 達到調控神經功能的目的。這種神經調節技術如果應用在臨床上，將可治療許多 與神經功能失調有關的疾病，例如自律神經失調或感覺神經異常等。
藉由長期的經驗累積，在臨床上已知可經由刺激體表的特定部位來治療某些 疾病，其中使用最普遍的是肌筋膜疼痛治療的激痛點（trigger point）（Simons and Travell, 1981; 1999）與針灸治療所使用的經驗穴（Choi et al., 2012）。 當身體的器官或組織出現發炎反應時，在與它相對應的身體部位就會出現某種組 織反應;這些反應包括：組織的色澤變化、產生條索狀物、硬結、皮膚脫屑、凹 凸不平等一系列型態上的變化。此外，還有壓痛閾值（pressure pain threshold）
降 低 及 導 電 度 （ electric conductivity ） 增 加 等 現 象 ， 其 性 質 為 前 發 炎
（proinflammatory）或發炎（inflammatory）反應（Dubin and Patapoutian, 2010;
Ge and Arendt-Nielsen, 2011; Shah and Gilliams, 2008）。隋唐時代傑出的 醫學家孫思邈（公元 581-682 年）所發現的阿是穴，就是此種刺激反應的典型表 現。阿是穴是一個具有深部壓痛、壓痛閾值降低、皮膚電阻下降等特性的狹小區 域，按壓該處常使病人表現出畏縮或閃避的反應，稱為「退避徵候」（withdrawl sign）。透過阿是穴給予針灸、按壓或電刺激等治療，可對誘發該阿是穴反應的
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原病灶產生療效（鍾傑, 1986）。
這些刺激反應之間的對應規則大都來自經驗的累積，其作用機轉與反應路徑 迄今並未釐清。由於系統性的通則尚未形成，故療效奠基於醫師個人的經驗而無 法一致。因此，如能發展出一套客觀而無侵入性的檢測方法，用來檢測對應各疾 病可能的反應部位，再針對這些反應部位施予治療來觀察療效，將有助於建立完 整可預測且再現性良好的療法。為達到上述目的，檢測方法可採用透過體表給予 刺激來觀察生理現象的改變量，其中局部熱充血測試（local thermal hyperemia, LTH）為可行的方式之一。此方法的原理是在皮膚局部加熱來觀察血流的增加量，
過去被認為是評估血管內皮功能（endothelial function）的指標（Cracowski et al., 2006; Johnson and Kellogg, 2010; Kellogg, 2006; Minson, 2010），也 被認為與感覺神經的功能有關（Bickel et al., 2009; Krishnan and Rayman, 2004; Krishnan et al., 2009）。測試療效則可採用目前已廣泛應用於臨床與實 驗研究的電刺激（Dubinsky and Miyasaki, 2010; Kagitani et al., 2010）。
在預測的反應部位施予電刺激，來觀察原病理部位已失衡的生理現象是否產生改 變，則可以反過來進一步確認兩者之間的對應關係。因此本研究的目的乃探討有 關研究此種刺激反應所需的方法學，並嘗試利用此種方法學技術進行刺激反應關 聯性規則的驗證。
1.1 肢體刺激誘發神經反射
肢體受刺激時，可經由神經反射在局部與遠部組織產生反應，包括體體神經 反射（somato-somatic reflex）、體內臟神經反射（somato-visceral reflex）
及體交感神經反射（somato-sympathetic reflex）等反射作用（Sandrini et al., 2005; Sato, 1997; Sato and Schmidt, 1973）。對於傷害性刺激則會誘發逆向 神經反射（antidromic reflex），經由軸突反射（axon reflex）產生局部血管 的擴張（Magerl and Treede, 1996; Schmelz et al., 2000; Wong and Fieger,
3
2010）。這些反射有些是廣泛性的，而有些則具有特異性，也就是只在特定相關 部位產生反應；此種特異性的刺激反應關係是本研究擬探討的標的，其中又以體 交感神經反射為主軸。
人體四肢與軀幹對傷害性刺激會產生自然的防衛動作，退縮遠離傷害性刺激 的來源（Sandrini et al., 2005）。傷害性刺激會引起防衛警告的反應，對人體 產生許多生理調控，如：血壓增高、心跳加速、換氣增加、胃腸與膀胱的活動性 減少以及肌肉血管擴張等（Morrison and Reis, 1989）。研究顯示自四肢肌肉及 關節的深部組織所傳入的體感覺神經訊息（somatosensory input）會引發體交 感神經反射。切除貓的大腦之後，於其左後肢給予傷害性刺激，結果發現受刺激 的肢段呈現血管擴張及血流量增加的反應，而在其餘的肢段（左前肢與右後肢）
則呈現血管收縮及血管阻抗增加的現象（Cravo et al., 1995）。如果在貓的大 腦與脊髓間進行截斷手術，則發現上述傷害性刺激造成的血管擴張反應隨之消失
（Cravo et al., 2003）。推論此種體交感神經反應是利用腦幹進行整合，藉由 交感神經的活動來調節血管阻抗，進而影響血流的變化。Cravo 等人整理過去的 研究，發現腦幹中的延腦吻端腹外側核（rostral ventrolateral medulla, RVLM）
的交感神經興奮神經元對身體各肢段有特殊的神經路徑來調節血管收縮張力，進 而分別影響各肢段的血流量變化（Cravo et al., 2003)。
肢體受到刺激所產生的體交感神經反射，是屬於一種交感神經反射弧的作用
（Morrison and Reis, 1989; Sato and Schmidt, 1973）。神經衝動從皮膚或肌 肉藉由脊髓內背角神經元（dorsal horn neuron）傳遞刺激訊號，經由感覺系統 上升傳遞路徑脊髓網狀徑（spinoreticular tract），到達延腦吻端腹外側核
（Morrison and Reis, 1989）。再自此核啟動交感神經系統的調控機制，將調控 訊號經由網狀脊髓徑（reticulospinal tract）向下傳遞到脊髓胸腰椎 T1-L2 的中間側柱（intermediolateral column）的交感神經節前神經元，進而經由交 感神經系統調節心血管系統的反應（Morrison and Reis, 1989; 1991）。
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過去的研究著重於體表刺激所造成的內臟交感神經反射作用（Raimondi et al., 1991; Sato and Schmidt, 1973 ）， 以 及 四 肢 肌 肉 反 射 作 用
（Piesiur-Strehlow and Meinck, 1980; Zehr, 2001）；而有關於體表刺激產生 體表及肌肉交感神經反射的研究亦僅限於局部或廣泛性的反應（Cravo et al., 1995; 2003）。至於肢體受到刺激後對遠部的器官組織是否可以產生特異性的交 感神經反射作用，則甚少研究予以探討。
1.2 神經反射媒介之血流變化
血液循環系統是維持正常生理狀態非常重要的系統，會即時而動態性提供組 織器官所需的養分與移除局部組織所產生的廢物。許多病理狀態往往起因於局部 組織的血液循環不良，或伴隨著血液循環的異常（den Uil et al., 2008;
Lockhart et al., 2009; Strain et al., 2012; Struijker-Boudier et al., 2012）。血液循環的調控有很大的部分來自神經系統（尤其是交感神經），因此從 血液循環的調控切入來探討刺激反應的關聯是一個可行的研究模式。
軸突反射會造成其所支配區域的血管擴張性神經胜肽（neuropeptide）之釋 放（Houghton et al., 2006; Magerl and Treede, 1996; Schmelz et al., 2000）， 其中以 calcitonin gene-related peptide（CGRP）與 substance P 最為重要
（Kellogg et al., 1999; Wallengren and Hakanson, 1987; Weidner, 2000）。 軸突反射被認為是純週邊的作用（Groetzne and Weidner, 2010）。軸突反射主 要與感覺神經的功能有關，且會受到交感神經活性（Drummond, 2009; Drummond and Lipnicki, 1999; Hodges et al., 2008; Houghton et al., 2006）以及一 氧化氮基礎濃度的影響（Houghton et al., 2006; Kellogg et al., 1999）。 血管的張力與血流量主要是由交感神經所調控。過去的研究發現降低血管收 縮張力（vasoconstrictor tone）可增加皮膚的血流，因此血管的擴張與收縮與 交感神經有密切的關係（Izumi, 1999）。在貓腰椎的交感神經幹進行電刺激，結
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果會造成其同側腳部血流量明顯的增加（Bell et al., 1985）。電刺激於人體腰 椎的交感神經節，經由交感神經的調節作用，亦可使腳部血管擴張及血流量增加
（Lundberg et al., 1989）。
許多研究都顯示交感神經會受到局部組織器官的功能需求而改變活性，進而 調控血流供應局部組織，而此活性的改變也受到體表刺激後所誘發的體交感神經 反射所調控。無論是交感神經活性的調控或體交感神經反射都具有組織及功能的 特異性（Huang and Tsai, 2009; Kerman and Yates, 1999; Morrison, 2001）。 在體表某特定部位給予刺激，可興奮支配某些部位與器官的交感神經，但也同時 會抑制支配其他部位與器官的交感神經（Chau et al., 1997）；因此，選擇特定 的刺激部位，來對相對應部位與器官的交感神經活性進行標靶選擇性調控是可行 的概念。
單一的血管運動神經元（vasomotor neuron）會支配特定範圍內的血管，而 不同功能群（functional pool）的血管運動神經元會支配不同節段的血管，血 管運動神經元係以此種方式對支配近端與遠端血管的神經進行不同程度的調控
（Gibbins et al., 2003）。Gibbins 等人認為交感神經調控血管的方式與運動 神經控制肌肉的運動神經單元（motor units）的概念相似，因此提出「血管運 動單元」（vasomotor units）或「神經血管運動單元」（neurovascular motor units）的概念（Binder and Mendell, 1994; Gibbins et al., 2003）。在調 控血管張力時，選擇性募集適量的血管運動單元可以對血管平滑肌產生不同強度 的調控。需增強血管運動輸出（vasomotor output）時，是靠著增加募集血管運 動單元的數量，而不是增加每個神經元的放電速率（firing rate）（Jänig, 1988;
Macefield et al., 2002）。
體感覺神經受到刺激後會對身體各部位交感神經產生興奮性或抑制性的作 用（Kimura and Sato, 1997）。貓的體表傷害性刺激如捏痛皮膚（skin pinching），
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會誘發肌肉與內臟血管收縮性交感神經的興奮，但會抑制皮膚收縮性交感神經的 傳出（Jänig and Szulczyk, 1981）。然而，卻在麻醉狀態下的兔子發現完全相 反的結果；當在三叉神經所支配的臉部給予傷害性刺激時，支配內臟神經、腎神 經及肌肉的交感神經的活性是下降的，支配皮膚血管的活性卻是增高的（Kumada et al., 1978; Yu and Blessing, 1998）。
因此，從體表給予某種刺激產生體交感神經反射時，訊息經由感覺神經傳 入，再經由交感神經傳出，來調節特定部位的血流量，不但可以達到特異性的調 控，也可以依照刺激量與刺激時間來產生預期的反應量。
1.3 上下肢之間的神經反射作用
上下肢的解剖結構具有對稱性，且在功能上需互相協調，兩者之間的神經關 聯性非常密切，相當適合用來探討刺激反應的關係。身體結構除了依照神經皮節
（dermatome）、肌節（myotome）、骨節（sclerotome）劃分外，許多部位還具有 對稱性的分佈關係，例如四肢及軀幹都可分為伸側與屈側。上肢與下肢也有對稱 性的結構，上肢分為上臂、前臂及手，下肢也分為大腿、小腿及腳。手有五根手 指，腳也有五根腳趾。因此，本研究採用上肢（前肢）或下肢（後肢）進行刺激，
觀察相對應的解剖位置是否可以產生預期的反應。
四肢活動需要相互之間非常即時而緊密的資訊溝通，包括感覺神經（尤其是 本體感受覺）、運動神經及交感神經（與血流之調控有關）的相互連繫，以便維 持有效而正常的肢體運動（Zehr and Duysens, 2004）。過去的研究著重於上下 肢之間的神經路徑關聯性與運動協調作用方面（Juvin et al., 2005），對於體 交 感 神 經 反 射 較 為 缺 乏 。 Sherrington 與 Laslett 首 先 提 出 肢 體 間 反 射
（interlimb reflexes）的概念；他們利用貓進行實驗，發現頸部與腰部脊髓有 反射互相連結（Sherrington and Laslett, 1903）。Miller 與 van der Meche 提出肢體間反射的主要功能是用來協助動物在行走時前後肢體的協調性（Miller
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and van der Meche, 1976）。接下來有研究將對象轉換到四肢獨立運作的人體身 上，發現當刺激腳部皮膚後，可觀察到手臂肌肉的反射（Piesiur-Strehlow and Meinck, 1980）。Zehr 等人利用電刺激分別刺激手腕的橈神經（superficial radial nerve）與足踝的腓骨神經（superficial peroneal nerve），觀察身體 上下肢肌肉的肌電圖（EMG）變化，結果發現人體頸部與腰部脊髓間及肢體兩側 間有明顯的肢體間反射（Zehr et al., 2001）。
關於上下（前後）肢之間的解剖對稱部位的關聯性，過去的實驗將大鼠後肢 腳踝扭傷，再於前肢對應部位進行電刺激，可顯著改善扭傷所引起的疼痛與水腫
（Koo et al., 2002）。以針灸治療肢體疼痛在上下肢解剖對稱位置也有治療的 規則，稱為同名經療法。其對應規則為手腳三條陽經與三條陰經各自依肩關節對 髖關節、肘關節對膝關節、腕關節對踝關節，治療位置在痛點之手腳對應的穴位；
即上肢痛治療在下肢，下肢痛則治療在上肢（楊維傑, 2005）。此療法是針灸治 療中最具有規則性的針法，非常值得採用其規則來探討針灸的作用機轉，尤其是 其與神經系統的關係。
雖然過去的研究已經指出四肢之間存在著包括運動神經與交感神經的反射 作用，但上肢與下肢之間的解剖構造與功能相似，而為了達成上下肢之間的動作 協調，在解剖對稱部位之間的體交感神經反射，極可能存在著特異性的對應關 係。但是，迄今並無任何研究針對此問題加以探討。因此，本研究將探討上下肢 之間是否存在特異性的體交感神經反射作用，以及其對應的規則為何。
1.4 研究動機及目的
雖然近年來人們對於致痛物質（nociceptive substances）、疼痛的訊息處 理以及疼痛相關神經系統的功能與結構的了解都有長足的進展（Vadivelu and Sinatra, 2005），然而對疼痛治療方面卻仍無很大的改善。疼痛問題仍舊是當今 健康與生活品質上的一大課題，根據世界衛生組織（WHO）及國際疼痛學會（the
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International Association for the Study of Pain）的數據顯示，全世界有 五分之一的人口受到慢性疼痛的困擾（Lipman, 2004）。
組織受傷後會合成與釋放致痛物質，誘發一系列的組織反應，包括體液性與 神經性的反應（humoral and neural reactions）（Holzer, 1992; Jenelle and Michael, 2002）。這些疼痛反應是一種組織修復與危險警報的訊號（Julius and Basbaum, 2001）。許多急性與慢性疼痛都與致痛物質的產生有關，而致痛物質是 動物體內自身產生的物質，也可以透過自身的酵素系統予以代謝清除。致痛物質 如持續累積在局部組織內，不但產生疼痛的不適感，也會不利於健康。但是，除 了採用藥物抑制致痛物質產生或阻斷疼痛訊息的傳遞外（Chou and Huffman, 2007），並無藥物用於清除致痛物質。然而，改善局部血液循環可有效使局部組 織堆積的致痛物質濃度降低，加速致痛物質的自體代謝，是治療疼痛的另一種有 效策略（Goats, 1994; Tiidus, 1999）。
以藥物治療疼痛會產生許多副作用（Hippisley-Cox et al., 2005; Sanghi et al., 2006; Zhang et al., 2006），受傷組織的局部血液循環不良，也會使 藥物無法有效到達受傷的組織，因而需使用較大劑量的藥物，使副作用發生機率 提高。因此，較無副作用的物理性治療，就成為疼痛治療的另種選擇（Allen, 2006）。然而物理治療雖較無副作用，但也被認為其療效不如藥物治療。既然許 多疼痛與致痛物質的堆積與血液循環不良有關，如能透過體表特定部位的刺激，
經由調整交感神經活性來改善血流，則可降低受傷部位致痛物質的濃度，並促進 受傷組織的修復。此種特異性類似標靶治療之方式，可針對疼痛與機能失調的部 位作調整，而不影響其他部位的功能，不但可降低副作用，效果也可以更為迅速。
一個非常有趣的實驗採用切斷脊髓的大鼠（spinalized rats）來探討體表 傷害性刺激所誘發的交感神經相關的脊髓中間帶（intermediate zone）及背角
（dorsal horn）的神經元活性改變，其結果顯示相同的刺激對不同身體部位的
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交感神經傳出路徑造成不同的影響；即對某些部位產生興奮作用，但卻對其他部 位產生抑制作用（Chau et al, 1997; 2000）。在切斷脊髓與大腦的連結後，刺 激 的 訊 息 不 經 過 大 腦 的 路 徑 與 處 理 ， 在 傳 入 背 角 神 經 元 後 ， 經 由 脊 髓 下
（infraspinal）體交感神經反射即可傳出交感神經訊息，而且刺激與反應的部 位間存在著特異性的部位關聯（topographic relationship），有些是興奮性，
有些則是抑制性。
如果體表對體表之間也有特異性部位對部位的刺激反應關聯，而且此種關聯 性反應也包括興奮性及抑制性兩種作用機轉，則發展出一套檢測工具，來針對 某病理部位可能的對應部位進行檢測，以判斷預測的區域是否發生神經功能改 變（被興奮或被抑制），將可應用於臨床上尋找疾病的反應與治療部位。反之，
透過被檢測確認的對應部位施予物理性的刺激，如可以反向對原病理部位進行 調控，則亦可發展出一套特異性的標靶神經調節技術，應用於臨床上治療各種 與神經失調相關的疾病。因此，本研究的主要目標為開發自體表刺激用以評估 神經功能的方法，並建立探討特異性神經調節方法之研究模型。研究方法係採 用肢體刺激誘發神經反射，經由特異性的血流改變，來探討刺激反應的關聯性。
在人體試驗部分，先進行皮膚局部熱充血反應的方法改良，以作為評估交感神 經活性變化的非侵入性方法。接著於下肢給予傷害性刺激後，在上肢對應部位 以局部熱充血反應測量加熱後血流之改變量，代表軸突反射量的變化；主要目 的在於驗證身體上下肢之間是否存在特異性的部位對部位的體交感神經反射作 用。此外，以動物實驗經由前肢電刺激誘發體交感神經反射，來觀察後肢缺血 的血流變化。因此，本研究結合兩種工具，以人體試驗及動物實驗來探討神經 調控的規則，作為未來發展新的神經調節技術之基礎。
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第二章 短時間加熱誘發局部熱充血反應之同測期再測信度
2.1 前言
軸突反射是由感覺傳入神經的致敏作用（sensitization)所誘發（Cracowski et al., 2006; Kramer et al., 2004; Tesselaar and Sjöberg, 2011），經由 觸發 calcitonin gene-related peptide（CGRP）和 substance P 的釋放，進而 使血管擴張，並使被激活神經元所支配範圍內的血管通透性增加（Wallengren and Hakanson, 1987; Weidner et al., 2000）。在過去的局部熱充血測試方法 中，軸突反射充血反應（亦即在體表局部加熱經由軸突反射所媒介之血管擴張）
經常與最大血管擴張量一併使用於評估整體血管的內皮功能（Cracowski et al., 2006; Johnson and Kellogg, 2010; Kellogg, 2006; Minson, 2010）。然而，
迄今只有少數的實驗針對由軸突反射所引發特異性（specific）之充血反應進行 研究（Bonelli and Költringer, 2000; Stansberry et al., 1999）。
在局部熱充血反應裡，血流的變化包含兩大獨立階段：初始高峰（initial peak）期及在出現最低點（nadir）之後所呈現延長的高原期（plateau）（Minson et al., 2001）。文獻指出初始高峰期的產生是受到軸突反射藉由傳入的 C 型神 經纖維逆向神經傳導活化所造成的（Magerl and Treede, 1996; Wong and Fieger, 2010）。軸突反射充血反應受到微血管密度（capillary density）空間異質性的 影響（Braverman et al., 1990; Cracowski et al., 2006; Wårdell et al., 1994）。因此，當隨機選取測量位置進行測試時，一般須加熱 30 分鐘以上，以便 從高原期或是最大血管擴張階段取得皮膚血管傳導率（cutaneous vascular conductance, CVC）的高峰值，並將初始高峰期皮膚血管傳導率標準化成為高原 期高峰（plateau peak）之百分比或是最大擴張量（maximal dilatation）之百 分比，以進行比較（Minson et al., 2001; Roustit et al., 2010a, 2010b; Tew et al., 2011）。
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經過兩小時的間隔後，比較第二次與第一次的測試結果，發現初始高峰值會 被增強，而高原高峰值則會受到抑制（Ciplak et al., 2009; Frantz et al., 2012）。再者，此類實驗通常須費時 1-1.5 小時以上，因此若要於短時間內在同 一測試者的相同測量位置進行兩次測試，以評估兩次測試間介入的影響是不可行 的（Carter and Hodges, 2011; Caseli et al., 2003; Hodges et al., 2008, 2009; Houghton et al., 2006; Kellogg et al., 1999, 2009; Shastry and Joyner, 2002）。
局部皮膚的微血管密度和感覺神經支配（sensory innervation）是局部熱充 血反應測試中的兩項關鍵因子。但是在不同測量位置取得的初始高峰值採用最大 血管擴張血流值進行標準化，可能只能調整微血管密度的差異，而無法調整皮膚 神經密度的差異。Minson 等人（2001）採用局部麻醉劑測試了感覺神經對於加 熱誘發軸突反射的影響，結果顯示初始高峰值下降了 60%，高於其他因子的影 響。基於此一因素，我們提出一個假說；若在同一測試期裡採用固定的測量位置，
或將可以同時控制微血管密度和感覺神經支配的差異，因而改善測量的再測信 度。由於軸突反射充血反應可於 5 分鐘內誘發出來，較為節省時間，且可降低兩 次測試間的順序效應（order effect）（Ciplak et al., 2009; Frantz et al., 2012）。因此，短時間加熱的測試方法可被運用在探討急性介入或短期治療對同 一測試期內於同一測量位置上的軸突反射充血反應的影響。
本研究提出一個修正方法，將加熱時間縮短來對軸突反射充血反應進行評 估，並固定測量位置以降低微血管密度和感覺神經支配的差異度。一旦此方法建 構完成，將可應用於探討加熱誘發軸突反射的相關因子，亦可檢測兩次局部熱充 血測試之間，給予急性物理性與化學性介入的影響。
總而言之，本實驗的目的在於檢測在同一測量位置上，短時間加熱所誘發的 軸突反射充血反應是否能在 5 分鐘內的加熱即達到可接受的同測期再測信度，同
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時探討短時間加熱局部熱充血測試中，最具再測信度的數據截取與表示方式。
2.2 材料與方法 2.2.1 受試者
本研究於民國民國 99 年 12 月 15 日起至 100 年 12 月 14 日期間透過網站的 廣告招募健康的志願者（男女各 10 名），年齡為 20-40 歲。排除有任何明確的神 經、心血管、皮膚、精神上的病史、糖尿病、吸煙、懷孕或生產後未滿一個月的 受試者，以摒除以上任何影響因素可能造成的偏差。所有的女性志願者皆在非月 經來潮時參加此實驗。本實驗獲得台大醫院研究倫理委員會的核准（案件編號：
201102005RC），所有受試者在參加實驗前皆填寫了同意書。
2.2.2 實驗設計
實驗當日，所有受試者被要求禁止飲用咖啡、茶、服用藥物、或接受經皮神 經電刺激、按摩及針灸，並在實驗開始之前禁食一個小時以上。到達實驗室後，
受試者被安排坐在有溫濕度控制的實驗室（濕度 40-60%、溫度 25±1˚C）。經過 30 分鐘的環境適應期後，開始進行局部熱充血反應測試共兩次，兩次之間間隔 為 45 分鐘（圖 1）。實驗期間的外界氣溫在 12-23˚C 之間。
2.2.3 熱充血反應實驗
實驗進行中，受試者全程仰臥於檢查床。皮膚血流量採用雷射杜普勒血流計 測量（Moor DRT4, Moor Instruments Ltd., Axminster, Devon, UK）。DRT4 為 二極體雷射，有兩個頻道，發射出 780-820 nm 波長的雷射光，紀錄頻寬為 20 Hz。
在每一次測試前，先用血壓計測量受試者慣用手的血壓，重覆 3 次。以其平均值 當作實驗中一直扣著慣用手中指的持續非侵入性血壓監視器 （CareTaker, Empirical Technologies Corporation, Charlottesville, Virginia, USA）之 參考值，用以連續記錄實驗過程的血壓值。
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測試的位置以預先界定的規則，選定於前臂背面橈側。記錄的位置位於延著 肱骨外上髁（lateral epicondyle of the humerus）以及橈骨莖突（styloid process of the radius）側面兩者之間連線的上四分之一處（圖 2），避開有明 顯靜脈或是紅斑（eryrhema）的區域。在以塑膠固定器（holder）支撐的皮膚加 熱探頭（SHP2 probe, Moor Instruments Ltd., Axminster, Devon, UK）中央，
我們放置了 1 mm 量測深度的單點式探頭（DP12-V2 probe）來記錄血流量。固定 器以雙面膠固定於皮膚。每天開始實驗前，雷射探頭都會採用製造商所提供的校 正液及校正方法進行校正。體表溫度採用加熱器 SHO2（Moor Instruments Ltd.）
控制在 33˚C 的常溫（Minson et al., 2001），以 5 分鐘的時間測量基礎血流量，
接著每 10 秒溫度提升一度，從 33˚C 上升到 42˚C，持續 5 分鐘。檢測完畢之後，
固定器保留在原位置，45 分鐘後再重覆一次相同的檢測程序。
2.2.4 資料分析
局部皮膚血流量採用皮膚紅血球流量（red blood cell flux, RBCF），以流 量單位 PU（perfusion unit）表示來計算。血流量的變化則以 CVC（PU/mmHg）
作評估。考慮到血流會受到血壓的影響，因此 CVC 採用紅血球流量除以平均動脈 壓來校正血壓的影響（O'Leary, 1991）。
MoorSOFT 軟體（Moor Instruments Ltd.）提供了定時定值的低通濾波器
（14.9 kHz, 0.1 sec），可以即時監控所記錄血流量訊號的趨勢（圖 3）。未經 處 理 的 血 流 量 訊 號 輸 出 至 Microsoft Office Excel 2007 （ Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA），接著進行後續離線分析，利用內 建函數與試算表來計算統計分析所需的數據。
為了選出最適合用於分析和使方法最佳化的數據期間，本研究針對不同期間 的血流量數據分別進行計算與分析。在測量基礎血流（baseline CVC）的 5 分鐘 期間，評估了兩個期間的血流量，包括 1.5-3.0 分鐘的平均 CVC 及加熱前最後兩
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分鐘的平均 CVC（圖 4）。在加熱期間則分析了兩個 peak CVC 值，包括在高峰前 後 30 秒和 60 秒的平均 CVC 值，還有評估 4 分鐘與 5 分鐘曲線下面積（area under the curve，AUC）。
baseline CVC、peak CVC、peak CVC 改變量、peak CVC 改變百分比、AUC 及 time to peak（到達高峰流量的時間）均用來作為加熱時熱充血反應的指標。
peak CVC 改變量定義為 peak CVC 減 baseline CVC，peak CVC 改變百分比等於 peak CVC 改變量除以 baseline CVC 乘以 100%。AUC 是加熱時期血流量的總累積，
time to peak 是從加熱到高峰值所花費的時間。
2.2.5 統計分析
所有數據都以平均值 ± 標準差（mean ± SD）表示，數據分析採用 SPSS 17.0 套裝軟體（SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA）。本研究採用個案內變異係數
（within-subject coefficient variation, CV）和組內相關係數（Intraclass correlation coefficient, ICC[2,1] ） 來 評 估 熱 充 血 反 應 數 據 的 再 測 信 度
（Agarwal et al., 2010; Bland,2000; Roustit et al.,2010a, 2010b; Tew et al., 2011）。
CV 值採用均方根法（root mean square method）計算，而 CV 值小於 10%、
介於 10-25%及大於 25%分別表示良好、中等及不良的再測信度（Iellamo et al., 1996）。CV 值計算公式如下：
個別受測者 CV 值：
其中 y 為血流參數， 為血流參數平均，受測者個數j =1…m，測量次數 i =1…n。
整體 CV 值：
ICC 值則採用 two way random effect model approach 來計算，而 ICC 值 大於 0.75、介於 0.40-0.75 及小於 0.40 分別表示良好、中等及不良的同意度
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（agreement）（Landis and Koch, 1977）。ICC 值計算公式如下：
ICC = 個案變異量/總變異量 = 個案變異量/(組內變異量 + 個案變異量) = (MSbetween - MSwithin)/( MSbetween + [k - 1] MSwithin)。
其中 MSbtween 為組內變異量的均方估計（mean square estimate），MSwithin 為個案變異量的均方估計，k 為受測者人數。
先前我們以 8 名志願受試者於兩天內進行了在兩個測試位置檢測兩次的前 導性研究。結果顯示，以 peak CVC 分析的 ICC 值為 0.54-0.90，平均為 0.78。
如果將估計 ICC 值定為 0.78，而可接受 ICC 值設定至少達 0.4 以上，則計算出 來的樣本大小，估計需要的人數是 18 人（α=0.05, β=0.2）（Walter et al., 1998）。在考慮可能有缺漏數據（missing data）的風險後，本研究共收錄受試 者 10 名男性及 10 名女性。
2.3 結果 2.3.1 受試者
受試者的基本資料如表 1。所有受試者血壓均正常，男性的身高較女性為 高，體重亦較重（P < 0.05），男女性的年齡和平均動脈壓均無顯著差異。
2.3.2 CVC 數據
從 1.5-3.0 分鐘取得的 baseline CVC 數據平均與 3.0-5.0 分鐘的數據平均 並無差異，從血流高峰值 30 秒範圍內的平均值計算所得的 peak CVC 與 60 秒 的 平均值也沒有差異（資料未顯示）。因此在後續的分析中，我們只使用 1.5-3.0 分 baseline CVC 平均值和血流高峰值 30 秒範圍內的 peak CVC 平均值來進行分 析。結果顯示，第一次與第二次測試的各種 CVC 數據在任何測量點均無不同（表 2），但是第二次測試的 baseline CVC 值較低，其 SD 也較第一次者略小。在第一 次與第二次測試中，各測量點到達高峰血流量所花費的時間為 90-209 秒，平均
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151.1 ± 36.8 到 167.2 ± 33.4 秒。因為所有的高峰血流量皆在加熱 4 分鐘前 達到，因此同測期再測信度採用 4 min AUC 作為計算的基準。
2.3.3 再測信度
同測期再測信度的數據如表 2 所列。數據顯示 baseline CVC、peak CVC 改 變百分比以及 time to peak 的再測信度不佳。同時採用 CV 和 ICC 來評估，peak CVC（CV = 16.02-17.31%, ICC = 0.77-0.78）、peak CVC 改變量（CV = 14.30-18.12%, ICC = 0.80-0.86），還有 4 min AUC（CV = 18.37-18.70%, ICC = 0.60-0.78）
的再測信度是可以接受的。男性和女性在再測信度上並無差異（資料未顯示）
2.4 討論
本研究的目的在於探討短時間加熱誘發軸突反射充血反應的再測信度。我們 的研究發現短時間 5 分鐘加熱，以單點式雷射杜普勒血流計進行局部熱充血測試 的 peak CVC、peak CVC 改變量、及 4 min AUC 的同測期再測信度達到可接受的 程度。同時結果也顯示達到高峰血流量的時間皆少於 210 秒。因此，2-3 分鐘的 基礎測量與 4 分鐘的加熱已可取得足夠的數據作分析。此方法中，加熱溫度保持 在 42˚C 的時間只有 2.5 分鐘（也就是加熱期的第 90-240 秒），因此所誘發的熱 充血時間較短，且較快恢復。在我們的實驗方法裡，加熱僅有 5 分鐘，initial peak 的測量可能可以防止第一次和第二次加熱的順序效應（Ciplak et al., 2009;
Frantz et al., 2012）。每個測量位置的測試時間只需 6-7 分鐘，此省時之方法 可以讓測試者無需增加儀器數量，亦可依序檢測較多的部位。
因為固定器和探頭都放在固定位置，在兩次的測試裡血管密度的空間差異度 和感覺神經的支配分佈並無改變。除了受到血管密度和感覺神經支配的影響之 外，軸突反射充血反應還會受到交感神經的活性（Drummond, 2009; Drummond and Lipnicki, 1999; Hodges et al., 2008; Houghton et al., 2006）以及一氧化
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氮基礎濃度（Houghton et al., 2006; Kellogg et al., 1999）的影響。根據 本研究的再測信度分析結果顯示，在兩次測試中，30 分鐘的環境適應配合 45 分 鐘的間隔時間，就可以控制交感神經與一氧化氮對此測試的影響。就我們所知，
本研究是第一個證明使用單點式雷射杜普勒血流計進行單純軸突反射充血反應 的測量中可獲得足夠的再測信度，而且無需收集與使用以往長時間加熱方法的數 據。
雖然局部熱充血反應測試是在定點進行檢測，皮膚的溫度也保持在 33˚C，
但 baseline CVC 還是有較大的變異性（表 2）。此表示 baseline CVC 容易受到 生理狀態的影響，而不完全歸因於血管密度的空間變異。baseline CVC 和 peak CVC 改變百分比的再測信度在此研究中未達可接受的程度，此結果與之前發表的 報告相吻合，過去的研究顯示當數據以 baseline CVC 或者與 baseline CVC 相關 的如 peak CVC 改變量與 peak CVC 改變百分比（Agarwal et al., 2010; Roustit et al., 2010a, 2010b;Tew et al., 2011）表示時，再測信度都不佳。
在隨機的檢測位置以單點式雷射杜普勒血流計施行局部熱充血反應測試的 再測信度不佳（Roustit et al., 2010a），如果改用整合式探頭（integrated probe）（Tew et al., 2011）、雷射杜普勒影像儀（Laser Doppler Imager, LDI）
或是雷射光斑對比成像儀（Laser speckle contrast imager, LSCI）（Roustit et al., 2010b），則可以提升再測信度，其原因為加大測量範圍可降低測量數據的 變異性。但是整合式探頭加上加熱探頭（PeriMed PH13 為 34 mm）或者 LDI/LSCI 加熱探頭（Moor SHP3 為 35 mm），其面積比單點式探頭搭配加熱探頭（Moor PH1-V2 為 22 mm）大得多，因此在頭部、軀幹及四肢上的一些不平整區域，及小面積的 位置如手指、腳趾，會造成使用上的限制。因此，單點式探頭因為其較小的尺寸，
依然有其佔優勢之處。
以往使用的方法在不同的測量部位檢測整體血管內皮功能，而在數據分析時
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會調整血管密度的空間差異，但感覺神經支配的差異性往往被忽略（Caseli et al., 2003; Hodges et al., 2008, 2009; Houghton et al., 2006; Kellogg et al.,1999, 2006; Shastry and Joyner, 2002）。所以，當對同一受試者進行單 純軸突反射充血反應測試時，短時間加熱方法較為合適，原因在於此方法對於血 管密度與感覺神經支配皆有良好的控制。本實驗的兩次測試是在同一天使用固定 器固定測量位置，此方法能否適用於移除固定器後，經過一段時間再重覆測試，
尚需進一步實驗來探討。
在實驗的限制考量方面，17β-estradiol 與 progesterone 皆有可能單獨加 強皮膚的熱充血反應（Brunt et al., 2011; Charkoudian et al., 1999），研 究結果也顯示從少年到老年時期，最大血管擴張量會隨著年齡增加而逐漸減少
（Martin et al., 1995）。但本研究在短時間對同一個受試者進行固定位置的檢 測，並且只採用 initial peak 的數據，因此女性生殖荷爾蒙和老化因素較不可 能影響到本研究的結果。
總結而言，在兩側前臂的背側以單點式雷射杜普勒血流計進行短時間加熱誘 發軸突反射的同測期再測信度，已達到可接受的範圍。同一時段的測試與再測試 時間間隔可縮短至 45 分鐘，因此有機會用於評估急性物理性或化學性介入對皮 膚局部加熱誘發軸突反射的影響。此方法可能有助於探討在局部加熱誘發軸突反 射充血反應之生理病理意義，或許亦可應用於日後研究或者臨床上。
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2.5 圖表
圖 1 實驗進行程序。實驗設計為環境適應（acclimation）30 分鐘後進行兩次測 試，兩次之間休息（resting）45 分鐘。每次測試包括以加熱器維持 33˚C 測量 基礎血流量 5 分鐘（B），以及從 33˚C 快速加熱到 42˚C 共 5 分鐘（H）。
圖 2 測量部位的解剖位置標記。測量位置位於兩側前臂肱骨外上髁（1）與橈骨 莖突外側（2）連線的上四分之一處。
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圖 3 五分鐘體表加熱程序的血流與溫度變化情形。FLUX 1 及 TEMP 1 為左側測量 部位的血流及溫度，FLUX 2 及 TEMP 2 為右側測量部位的血流及溫度。
圖 4 五分鐘體表加熱程序的血流改變代表值。A-G 分別代表各數據分析的期間。
（A）1.5-3.0 分鐘 baseline CVC，（B）3.0-5.0 分鐘（加熱前 2 分鐘）baseline CVC，（C）高峰血流值（peak flux），（D）30 秒平均之 peak CVC，（E）60 秒平 均之 peak CVC，（F）到達高峰血流之時間（time to peak），（G）4 分鐘曲線下 面積（4 min AUC），（H）加熱期間。
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表1 男性與女性受試者基本資料
男性 （n=10） 女性 （n=10）
年齡 （years） 24.7±4.1 26.1±3.4 身高 （cm） 171.8±6.2 160.8±4.4*
體重 （kg） 66.8±9.2 53.8±9.0*
平均動脈壓 （mm Hg） 80.9±5.2 75.5±5.5 數據以means ± SD表示。*表示男性與女性比較p < 0.05。
表2 不同數據呈現方式的局部熱充血反應再測信度
數據 測量位置 第一次測試 第二次測試 CV （%） ICC
Baseline CVC 右側 0.27 ± 0.20 0.20 ± 0.08 41.38 -0.04
左側 0.25 ± 0.18 0.21 ± 0.11 31.59 0.48
Peak CVC 右側 2.13 ± 0.54 2.10 ± 0.53 16.02 0.77
左側 1.89 ± 0.55 1.85 ± 0.63 17.31 0.78
Peak CVC change 右側 1.87 ± 0.56 1.90 ± 0.51 14.30 0.86
左側 1.64 ± 0.55 1.64 ± 0.62 18.12 0.80
% peak CVC change 右側 973 ± 535 1037 ± 395 41.74 0.56
左側 819 ± 347 888 ± 342 34.84 0.75
4 min AUC 右側 30.7 ± 7.5 29.2 ± 7.2 18.70 0.60
左側 26.0 ± 8.0 25.5 ± 9.4 18.37 0.78
Time to peak 右側 167.2 ± 33.4 163.7 ± 44.6 21.38 0.31
左側 165.5 ± 38.8 151.1 ± 36.8 17.51 0.43
peak CVC 的單位為 AU/mmHg。4 min AUC 的值需乘以 1000。Time to peak 的單位為 sec。
CV 為 coefficient of variation（%），ICC 為 intra-class correlation coefficient。
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第三章 環境適應期間延長對短時間加熱誘發局部熱充血反應 不同測期再測信度之影響
3.1 前言
在遭受傷害性刺激時，軸突反射會因傳入性的 C 型神經纖維被活化而引發
（Magerl and Treede, 1996; Schmelz et al., 2000; Wong and Fieger, 2010）
。
同時軸突反射一般也被認為是客觀評估感覺神經功能的工具（Bickel et al., 2009; Krishnan and Rayman, 2004; Krishnan et al., 2009）。軸突反射充血 反應可由局部皮膚加熱引發（Krishnan and Rayman, 2004; Minson et al., 2001）。在不同部位中，微血管密度有相當大的變異性（Braverman et al., 1990;
Cracowski et al., 2006; Wårdell et al., 1994），而且要精確地在相同的皮 膚部位進行測試亦相當困難。所以，先前所使用的長時間加熱程序都採用最大血 管擴張量來作初始高峰值的標準化，以便進行比較（Cracowski et al., 2006;
Johnson and Kellogg, 2010; Minson, 2010; Minson et al., 2001）。 使用單點式雷射杜普勒血流計測試隨機選取的部位時，在調整微血管密度變 異性之後，局部熱充血反應於指腹（finger pad）獲得可接受的再測信度，然而，
於前臂的再測信度則不足（Roustit et al., 2010a）。此種再測信度的變異性可 以歸因於隨機選取測試部位時，並未考量另一個軸突反射充血反應的重要決定因 素，也就是感覺神經纖維之密度。採用局部麻醉劑阻斷感覺神經，可使快速加熱 誘發軸突反射之反應降低 60%（Minson et al., 2001）。此顯示相較於其他因素，
感覺神經纖維之密度對於軸突反射充血反應具有更大的影響。
在局部熱充血反應測試開始之前，環境適應期長度對於生理狀態的穩定與否 扮演了相當重要的角色（Agarwal et al., 2010; Roustit et al., 2010a,b; Tew et al., 2011）。影響熱誘發軸突反射反應的主要生理因素包括了交感神經活性
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（Drummond 2009; Drummond and Lipnicki, 1999; Hodges et al., 2008; Hodges et al., 2009; Hornyak et al., 1990）與一氧化氮的基礎濃度（Houghton et al., 2006; Kellogg et al., 1999; Kellogg et al., 2009）。然而，迄今我們仍不 了解若要控制這些因素，適切的環境適應時間需多長。一些再測信度研究曾採用 短如 20-30 分鐘的環境適應期（Agarwal et al., 2010; Roustit et al., 2010a,b），但在其他的研究，卻採用了長達 90 分鐘的環境適應期（Tew et al., 2011）。我們的同測期實驗進行了五分鐘的短時間加熱，當測試部位以固定器固 定，且兩次測試之間距 45 分鐘，則給予 30 分鐘的環境適應期即可使軸突反射充 血反應具有好的再測信度（Huang et al., 2012）。然而，若給予 30 分鐘的環境 適應期、延長測試間距、且每次將測試部位重新定位，短時間加熱局部熱充血反 應測試是否仍具有好的再測信度，則仍不清楚。我們假設增長環境適應期間，由 於減少生理變化，應可呈現更好的再測信度。
雖然相較於使用單點式雷射杜普勒血流計（Roustit et al., 2010a），使用 整合式探頭（Tew et al.,2010）、雷射杜普勒影像儀或雷射光斑對比成像儀
（Roustit et al., 2010b）可增大測試範圍來提升再測信度，但這些儀器的探 頭過大，不適於應用在不平整的部位，如臉部、關節、手指、和腳趾。
為了改善上述的缺點，此研究使用相同的測試部位，使感覺神經變異性降至 最低，同時我們採用不同長度的環境適應期，並使用單點式雷射杜普勒血流計來 探討短時間加熱誘發軸突反射充血反應的再測信度。總而言之，本研究的主要目 的為檢視若採用相同的測試部位、僅加熱五分鐘、且給予不同長度的環境適應 期，軸突反射充血反應（也就是局部熱充血反應的初始高峰值）的不同測期再測 信度是否能達到可接受的標準。此外，對於測試短時間加熱局部熱充血反應，我 們亦探究再測信度最佳的資料收集與資料呈現形式。
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3.2 材料與方法 3.2.1 受試者
透過網站廣告，本研究於民國 99 年 12 月 15 日起至 100 年 12 月 14 日期間 招募年齡 20-40 歲、不吸菸的健康受試者（男女各 24 名）。受試者條件與第二章 所述相同（頁數 12）。本研究獲得台大醫院研究倫理委員會的核准（案件編號：
201102005RC），所有受試者於參與試驗前皆填寫同意書。
3.2.2 實驗程序
實驗當天，我們要求所有受試者不可攝取茶葉、咖啡、服用藥物，或進行經 皮神經電刺激、按摩、和針灸，受試者亦須於實驗開始一小時前禁食。受試者抵 達實驗室後，進入有溫濕度控制的房間裡（濕度40-60%、溫度25 ± 1˚C）。受試 者隨機分配至30或60分鐘環境適應組（每一組n=24，男女比例平均）。經過30或 60分鐘的環境適應後，開始進行局部熱充血反應測試（此為測試第一天）。一至 三天後，重複相同測試（此為測試第二天）。實驗期間，室外氣溫大約為12-23˚
C。
測試進行時，皮膚加熱、血流量測量位置與方式與使用的儀器都與第二章先 前所述之實驗相同，每次測試中，血壓值都依照前一章所描述的方法量測。為模 擬實際使用情況，我們於第一天實驗結束後移除固定器。一至三天後相同時間，
依照預先界定的相同規則重新選定測試部位，我們重複與第一天相同的步驟進行 實驗。
3.2.3 資料分析
皮膚血流資料的擷取、計算與分析都和前一個實驗相同。在為期五分鐘的基 礎血流測量中，我們採用開始加熱前兩分鐘的平均 CVC（圖 1）。血流量高峰值定 義為開始加熱起 90-210 秒中的最大值。peak CVC 定義為高峰血流量前後共 60
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秒的 CVC 平均值。
本實驗分析的局部熱充血反應測試指標包括 baseline CVC、peak CVC、peak CVC 改變量、peak CVC 改變百分比、以及 4 min AUC。
3.2.4 統計分析
本研究所有數據皆以平均值 ± 標準差表示，且皆採用 SPSS 17.0 套裝軟體 分析（SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA）。局部熱充血反應再測信度評估與 前一實驗相同，採用個案內 CV 與 ICC[2,1]進行評估（Agarwal et al., 2010;
Bland, 2000; Donald et al., 2008; Roustit et al., 2010 a,b; Tew et al., 2011），再測信度標準也相同。除此之外，針對具有好的再測信度的數據，我們 進一步計算了測量的標準誤（standard error of measurement, SEM）與最小可 偵測改變量（minimal detectable change, MDC）。SEM 為 pooled SD 乘以（1-ICC）
的平方根，因為 n = 24，MDC 為 SEM 乘以 2 的平方根再乘以 1.96（Guyatt et al., 1987）。
根據我們的同測期研究數據，使用peak CVC的變化進行分析，得出ICC值為 0.80-0.86，平均為0.83（Huang et al., 2012）。我們期望ICC的不同測期再測 信度可達0.75、且可接受的ICC至少須為0.40，因此各組需要的受試者預估數量 為22人（α=0.05, β=0.2; Walter et al., 1998）。在考慮可能有缺漏數據的 風險後，本研究的30分鐘及60分鐘環境適應期兩組各收錄了24位受試者（12名男 性及12名女性）。
3.3 結果 3.3.1 受試者
受試者基本資料分析如表1。所有受試者血壓均正常。30分鐘及60分鐘環境 適應期兩組比較，無論是年齡、身高、體重、及休息時平均動脈壓皆無顯著的差
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異（P > 0.05）。
3.3.2 CVC數據
CVC數據中，無論在測試第一天和第二天之間、或30分鐘及60分鐘環境適應 期兩組之間，包括baseline CVC、peak CVC、4 min AUC等皆無顯著差異（資料 未顯示）。在測試第一天和第二天加熱實驗中，各測試部位的time to peak介於 92-209秒，且平均值介於143.8 ± 35.7到165.3 ± 30.1秒。所有的高峰血流量皆 在加熱4分鐘前達到，因此採用4 min AUC進行再測信度分析。
3.3.3 再測信度
表2為30分鐘及60分鐘環境適應期組的不同測期之再測信度。結果顯示，對 於30分鐘環境適應期組，右前臂的peak CVC和peak CVC改變量以及左前臂time to peak的再測信度皆可接受。對於60分鐘環境適應期組，無論是右或左前臂數據皆 達到可接受的標準。無論在30或60分鐘環境適應組中，4 min AUC在右側都有良 好再測信度，左側再測信度都不佳。Baseline CVC與peak CVC改變百分比無論在 30或60分環境適應組中再測信度都不好。
表3為兩次測試中測試部位具有可接受再測信度的資料表示方式，資料包括 在30或60分鐘環境適應組的peak CVC、peak CVC改變量、time to peak、及4 min AUC。此表也同時呈現了各測試部位參數的平均差異、SEM、及MDC。
3.4 討論
本研究的目的為探討短時間加熱誘發軸突反射充血反應在不同長短環境適 應期下的不同測期之再測信度。研究結果顯示，使用單點式雷射杜普勒血流計對 相同測試部位加熱五分鐘，其短時間加熱局部熱充血反應的不同測期再測信度達 到可接受之標準，且無須如同先前採用的長時間加熱程序一般，對最大血管擴張 量進行標準化處理（Cracowski et al., 2006; Johnson and Kellogg, 2010;
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Minson, 2010; Minson et al., 2001）。給予 30 分鐘的環境適應期後，右前臂 的 peak CVC、peak CVC 改變量、及 4 min AUC，與左前臂的 time to peak 皆達 到可接受之再測信度。此外，除了發現左右前臂的再測信度不同，我們進一步證 明了給予較長的環境適應期（60 分鐘）可提高其再測信度。
3.4.1 測試部位與感覺神經支配
軸突反射會受到感覺傳入纖維的活化而引發，但在過去的研究所採用的程序 中，隨機選取測試部位時的感覺神經傳入支配變異性卻未予以控制，反而是採用 最大血管擴張量將初始反應進行標準化處理（Cracowski et al., 2006; Johnson and Kellogg, 2010; Minson, 2010; Minson et al., 2001）。引發軸突反射充 血反應的傳入性 C 型神經纖維是屬於機械不敏感性（mechano-insensitive）C 型纖維，因而被稱為沉默的傷害性受體（silent nociceptors）（Schmidt et al., 2002; Stansberry et al., 1999）。CGRP 與 substance P 的釋出會活化軸突反 射充血反應，並擴張血管、提升活化神經元支配範圍的血管通透性（Wallengren and Hakanson, 1987; Weidner et al., 2000）。小腿上單一機械不敏感性感覺 神經元的支配範圍大小的中值大約是 5.34 cm2（Schmidt et al., 2002）。對於 前臂上每一根毛髮，因毛髮摘除而誘發的軸突反射充血反應面積平均為 1.76 ± 1.76 cm2（Wallinetal.,2001）。根據此數據，感覺神經的支配範圍可能延伸到 相當廣泛的區域，但是機械不敏感性纖維的支配範圍顯得不規律，且分佈不均勻
（Schmidt et al., 2002）。因此 Roustit 等人從左前臂上部內側隨機選取了兩 處相隔五公分的皮膚測試部位，發現在同一測期實驗中，此二測試部位的 peak CVC 再測信度不佳（CV = 53%, ICC = 0.34; Roustit et al., 2010a）。而且他 們隨機選取測試部位的不同測期再測信度，以 peak CVC 表示仍然不佳（CV = 57%, ICC = 0.72）。採用局部麻醉劑阻斷感覺神經後，peak CVC 佔最大血管擴張量的 百分比從 75 ± 3%降至 32 ± 2%（Minson et al., 2001）。這代表加熱誘發 peak CVC 的影響因素中，感覺神經可能是主要的因素，然而也不能排除如微血管密度
