5.1 前言
上肢與下肢的解剖構造與功能基本相似，都分為伸側與屈側。為維持正常的 肢體動作，伸側與屈側的肌肉群互為拮抗。身體各部位的血流量會因應功能需求 自動調整，當肌肉收縮時，其交感神經張力會自動下降，使肌肉血流量增加。此 時拮抗肌會放鬆，其交感神經張力則會上升，使肌肉血流量降低（Boushel, 2010） 。為了達成上下肢之間的動作協調，此種不同肌群的交感神經協同
（synergistic）或拮抗（antagonistic）作用，在解剖對稱部位可能存在著特 異性的對應關係。但是，到目前為止，很少研究針對這個問題加以探討。
本研究擬採用電刺激來觀察前後肢之間的刺激反應關聯性，並以體表血流量 的改變狀況作為反應的指標。先前的研究發現除了直接接受電刺激的部位會產生 血流量的變化外，有些特定位置的血流量亦會改變，這些電刺激的部位和血流變 化的部位有特異性的關係（Uchida and Hotta, 2008）。刺激大鼠的小腿肌肉可 以使其胃部血流上升（Dong et al., 2011），刺激大鼠前腳掌背側則可使其腎臟、
腦部和心臟的血流上升（Tsuru and Kawakita, 2009）。電刺激在後腳掌可增加 腸 繫 小 動 脈 （ mesenteric arterioles ） 的 動 脈 壓 與 紅 血 球 流 動 速 度 （ RBC velocity），但是電刺激在軀幹背部，則會降低其動脈壓與紅血球流動速度
（Takagi et al., 2005）。因此本研究假設如果前後肢之間有特異性的刺激反應 關聯，則前肢特定部位的電刺激會在後肢的特定區域產生血流的改變。
過去的研究結果顯示，不同頻率與強度的電刺激，都會影響其所產生的效 果。在麻醉狀態下，在大鼠後腳掌以 0.1-10.0 mA 的強度及 1-20 Hz 的頻率電刺 激，則其股二頭肌（biceps femoris muscle）的血流量會產生不同程度的反應
（Noguchi et al., 1999）。電刺激造成肌肉血流量與動脈壓改變的反應型態與 不同強度電刺激興奮不同族群的肌肉傳入神經纖維有關，後腳掌足夠強度的電刺
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激可刺激 group III and IV 傳入神經纖維，再透過交感神經反射降低肌肉的血 流。在大鼠大腿部位施予 2 Hz 和 80 Hz 的電刺激，並分別使用 1.5 mA、3 mA 和 6 mA 三種刺激強度，來觀察卵巢的血流變化，結果顯示 2 Hz 的電刺激能夠引 起顯著的血流上升，且強度越強，上升的幅度越大（Stener-Victorin et al., 2003）。
為了模擬臨床上缺血的病理狀況，並以此模式探討前後肢之間的刺激反應關 係，本實驗於大鼠後肢給予缺血傷害後，再於其前肢進行電刺激，並以雷射杜普 勒影像儀觀察後肢血流量是否會產生特異性的變化。本研究除了探討前後肢之間 是否存在特異性的的體表刺激與交感神經反射作用外，也分析不同電刺激頻率是 否會產生不同的效應。
5.2 材料與方法 5.2.1 實驗動物
本實驗所使用的動物品系為 Wistar 雄鼠，體重介於 250-300 公克（BioLASCO Co., Ltd., Taiwan），飼養於動物房，每三隻養於一個鼠籠（47×25×21 cm3），
日夜光照週期為 12-12 小時（燈亮時間為上午 8 點），室溫維持 23±2℃，濕度控 制在 55±10%。飼養期間動物用飼料與飲用水供應充足，並定時更換墊料。本研 究所有實驗程序都符合動物保護法之規範，且獲得台灣大學醫學院實驗動物管理 使用委員會之核准，並遵守美國國家衛生研究院（National Institutes of Health）實驗動物之管理與使用守則（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）。
5.2.2 後肢缺血
所有動物於第一天剃除前後肢的鼠毛，以便實施電刺激及測量血流。方式為 給予 3.5% pentobarbital sodium （Sigma-Aldrich, USA）腹腔注射麻醉，劑
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量為 50 mg/kg（3.5 gm pentobarbital sodium 溶解在 100 ml normal saline 中）。剃毛範圍包括雙側前肢與後肢的鼠毛，於背側塗上除毛膏（New touch, Fast Removal Hair Cream, Tien Liang Biotech Co. Ltd., Taiwan），10 分鐘後洗 去脫毛膏，並置於保溫墊上避免失溫，待實驗動物恢復意識後放回鼠籠。
除毛後隔一天，實驗動物給予 3.5% pentobarbital sodium 腹腔注射麻醉，
劑量為 50 mg/kg，雙側後肢各以兩條橡皮筋（直徑 10 mm, 寬 1 mm, Gendai Pharmaceutical Co. Ltd., Japan）綁上使其造成缺血的狀態，並且儘量綁在髖
關節以上的位置，時間維持 60 分鐘，並置於保溫墊上避免失溫。以雷射杜普勒 影像儀測量此加壓缺血模式下的血流量變化，缺血過程中其血流下降至剩下 20-30%，符合缺血需使血流量低於 35%的定義。接著鬆開橡皮筋，待大鼠清醒後，
放回鼠籠，使其正常活動。
5.2.3 前肢電刺激
後肢缺血與再充血 24 小時後，將動物分成對照組與電刺激組，電刺激組分 為 3 Hz、45 Hz 及 125 Hz 三種頻率的電刺激，每種頻率各再分為電刺激右前肢 與左前肢。總共有對照組 1 組、電刺激 6 組，每組動物皆為 6 隻。
實驗動物接受電刺激當天以 0.5% urethane（Sigma-Aldrich, USA）腹腔注 射麻醉，劑量為 1.5 mg/kg（10 gm urethane 溶解在 20 ml normal saline 中）， 接著置於體溫維持墊（TC-1000 Rat Temperature Controller, CWE, Inc. USA）
上，將偵測肛溫的探針置入肛門，溫度設定在 37℃，用以維持體溫於 37℃，休 息 20 分鐘後開始記錄體表血流。
本研究採用雷射杜普勒影像儀（Laser Doppler Line Scanner, LDLS, Moor Instruments Ltd., UK）測量體表血流，雷射光波長 785 nm，最大輸出功率為 30 mW。以雷射杜普勒影像儀掃描全身，每次掃描時間花費 5 秒。在基礎（baseline）
測量時間的 20 分鐘期間，雷射掃描記錄共三次，分別在第 0、17 及 20 分鐘各記
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錄一次（圖 1）。
電刺激的作用電極（active electrode）採用直徑 0.19 mm 的不鏽鋼針灸針
（J.D. Instrument Co. Ltd., Taiwan），以 5 mm 的深度斜扎進前肢左側或右側 伸側肱三頭肌下方四分之一處，參考電極（reference electrode）則採用自黏 性貼片（self-adhesive electrode），大小為 20x25 mm （P-20x25, Gel A, Wandy Rubber Industrial Co. Ltd., Taiwan ），貼於剃毛後的胸口位置（圖 2）。電 刺激採用低週波電針治療機（TOKKI III M180-B, Japan），刺激頻率設定為 3、
45 或 125 Hz，波寬為 1 msec，電流強度為 3 mA，刺激時間週期為通電 2.2 秒，
休息 1.2 秒，施予前肢單側（左側或右側），電刺激持續 30 分鐘，此期間每 3 分鐘以雷射杜普勒影像記錄一次血流，共 10 次；停止電刺激後，再持續每 3 分 鐘記錄一次血流 30 分鐘，共 10 次（圖 1）。對照組不施以電刺激，血流量記錄 時間長度、間隔與電刺激組完全相同。實驗過程中大鼠全程俯臥，並使用體溫維 持墊維持體溫（圖 2）。
5.2.4 血流測量與計算
為了解雷射杜普勒影像儀測量過程的雷射照射是否會影響血流，本研究先進 行了前導性實驗，結果顯示每分鐘掃描測量一次，則在第 58 分鐘起血流量會開 始明顯上升（資料未顯示）。因此本實驗採用每 3 分鐘測量一次的方式，以避免 雷射光可能對血流測量的影響。為了避免插管對動物造成刺激而影響實驗結果，
本研究先進行前導性實驗評估電刺激對心跳與血壓的影響，結果顯示本實驗參考 電極貼於胸前的電刺激模式不會影響電刺激期間及電刺激之後的心跳與血壓（資 料未顯示）。
數據分析以軟體 MoorLDLS v2.2 進行，將兩側後肢伸側股二頭肌下方二分之 一的範圍設定為資料擷取區（ROI，region of interest），也就是以坐骨粗隆與 外踝連線中點、膝關節髕骨和外踝所構成的三角形範圍（圖 3）。
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為了分析各時間點血流對應基礎測量血流的變化情形，以各動物進行基礎測 量的最後 6 分鐘的兩個資料平均值作為基礎血流量，以便對電刺激與電刺激後共 60 分鐘的 20 個時間點的資料做標準化處理，即將各時間點之血流量減去基礎血 流量，再除以基礎血流量，乘以 100%。
針對前肢電刺激可使後肢血流量顯著上升的組別，將進一步在後肢缺血區域 選取較小的範圍，來探討此種血流量上升現象是否只在特定部位產生。選取的範 圍包括四個大小為直徑 1 cm 的圓形區域，如圖 6 所標示：（1）m（muscle）為以 肌 肉 長度 為依 據， 在股 二頭 肌 下 方四分 之 一處， 約小腿正中 央。（ 2 ）o-i
（origin–insertion）為以肌肉起始點為依據，於坐骨粗隆到脛骨二分之一處 連線的下方四分之一處。（3）j（joint）為以關節相對位置為依據，在坐骨粗隆 到膝關節的下四分之一處。以及（4）nc（non-corresponding）為股二頭肌外的 位置，取坐骨粗隆與踝關節連線二分之一之內側。
5.2.5 數據分析與統計
所有的數據都以相對血流變化的平均值 ± 標準誤（SEM）呈現。利用 Statistic 6.1（StatSoft, Inc.）套裝軟體進行統計分析，並以 SigmaPlot 10.0
（Systat Software, Inc.）進行圖表繪製。各頻率左側或右側前肢電刺激對雙 側後肢血流改變量的影響，與對照組數據作比較，採 one-way ANOVA 進行檢定；
若 F 檢定具有顯著差異，則以 Student t-test 進行各時間點血流改變量的檢定。
電刺激左側或右側前肢，左右後肢之間的血流改變量比較採用 one-way repeated measure ANOVA 檢定法進行；若 F 檢定具有顯著差異，則以 paired t-test 進行 各時間點血流改變量的檢定。統計結果 P 值小於 0.05 時被認定具有顯著的統計 差異。
5.3 結果
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實驗過程中之血流改變從雷射掃描圖觀察，圖 4 以對照組及左前肢 125 Hz 電刺激組其中各一隻動物分別呈現電刺激前、電刺激時與電刺激後之血流掃描 圖；baseline 採第 17 及 20 分鐘平均，電刺激中採第 27 及 30 分鐘平均，電刺 激結束後採第 27 及 30 分鐘平均。結果顯示對照組動物的後肢血流變化量較小，
而左前肢 125 Hz 電刺激組動物的後肢血流變化量較大。
以後肢股二頭肌下方二分之一範圍的皮表區域計算血流量時，給予前肢 3 Hz
（圖 5AB）或 45 Hz（圖 5CD）電刺激，無論電刺激在左側或右側，其兩側後肢 血流量都與對照組無差異。但給予前肢 125 Hz 電刺激時，則電刺激在左側可顯 著提升兩側後肢血流量（圖 5E），左側上升幅度較右側高，但兩者在統計上未達 顯著差異。自電刺激第 9 分鐘起左後肢的血流量已顯著上升，而右後肢則在第 24 分鐘才達到顯著上升的程度，此種血流上升現象一直持續到電刺激結束 30 分 鐘後仍維持。電刺激在右側則後肢血流量與對照組比較無差異（圖 5F）。
（圖 5AB）或 45 Hz（圖 5CD）電刺激，無論電刺激在左側或右側，其兩側後肢 血流量都與對照組無差異。但給予前肢 125 Hz 電刺激時，則電刺激在左側可顯 著提升兩側後肢血流量（圖 5E），左側上升幅度較右側高，但兩者在統計上未達 顯著差異。自電刺激第 9 分鐘起左後肢的血流量已顯著上升，而右後肢則在第 24 分鐘才達到顯著上升的程度，此種血流上升現象一直持續到電刺激結束 30 分 鐘後仍維持。電刺激在右側則後肢血流量與對照組比較無差異（圖 5F）。