行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
軟骨組織工程的生體外及生體內軟骨細胞生成機轉之研究
計畫類別： 個別型計畫
計畫編號： NSC93-2314-B-006-044-
執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 國立成功大學醫學系外科
計畫主持人： 謝式洲 共同主持人： 邱浩遠
報告類型： 精簡報告
處理方式： 本計畫可公開查詢
中 華 民 國 94 年 10 月 31 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 # 成 果 報 告
□期中進度報告
（計畫名稱）
軟骨組織工程的生體外及生體內軟骨細胞 生成機轉之研究
計畫類別：ˇ 個別型計畫 □ 整合型計畫 計畫編號：NSC 93－2314－B－006－044
執行期間： 2004 年 08 月 01 日至 2005 年 07 月 31 日
計畫主持人：謝式洲 共同主持人：邱浩遠 計畫參與人員：
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□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢 執行單位：國立成功大學醫學系外科
中 華 民 國 九十四 年 十 月 三十一 日
中文摘要
如何利用適當的體外培養模式，製備出不同種類的新生軟骨，是目前組織工程學上 的一大考驗。雖然現今有關軟骨細胞分離與培養的技術不斷在進步，但由於軟骨細胞在 培養過程容易消失專一的表現型，而影響細胞外間質的形成和累積；因此本計畫即以探 討軟骨生成機制為目標，希望瞭解適當培養環境的組成條件。
首先自兔子耳朵取得軟骨細胞後經大量培養的工作，繼而利用多種可分解性之生醫 材料作為培養基材，其組成包括PGA（polyglycolic acid）、PCL（poly ε-caprolactone）
以及P-4HB（poly-4-hydrobutyrate）等；將高密度的軟骨細胞添加至不同基材上，分別 培養四週與八週的時間。由組織切片的結果顯示，雖然生醫材料於四週後仍然存在，但 軟骨細胞已可均勻分佈在其內部，其中以PGA 的情況最為顯著。而隨著培養時間的延 長，細胞外間質的生成亦逐漸地累積增加，進而使培養基材被新生的軟骨組成所取代。
在不影響軟骨細胞增生的情況下，其於生醫材料中的多醣類含量與正常軟骨大多無 異，但培養八週的PGA 內則可偵測到兩倍的濃度。然而不同類型的生醫材料，均無法 使得軟骨細胞製造同等於正常軟骨的細胞外間質成分，如第二型膠原蛋白以及彈性蛋白 等，顯示該培養基材仍有改進的空間。觀察活體內移植的情況，發現軟骨新生作用可穩 定的進行，而基材也有降解的情況產生。本計畫的研究成果，已提供有關培養基材研發 上的重要資訊；相信未來我們可以克服目前技術的瓶頸，找出最適合組織工程軟骨生成 的最佳生醫材質◦
關鍵詞：軟骨細胞、生醫材料、軟骨新生。
Abstract
How to utilize a proper in vitro cultural system to create the different kinds of neocartilage is an unsolved problem in tissue engineering at present. Although the techniques of separation and expansion of chondrocytes were well established, but the phenotype of chondrocytes was easily disappered during the cultural period, then the synthesis and deposition of extracellular matrix were influenced. Because of above-mentioned issues, the goal of this project was to investigate the chondrogenesis and understand the optimal culture conditions of chondrocytes.
The rabbit ear chondrocytes were isolated and cultured for several passages, and then we prepared the porous scaffold by using several degradable biomaterals including PGA (polyglycolic acid), PCL (poly ε-caprolactone) and P-4HB (poly-4 -hydrobutyrate) etc. The chondrocytes were seeded at high density upon these scaffolds and cultured for four and eight weeks in vitro. The results of histological analysis showed that the chondrocytes were spreaded at the periphery of the scaffold, and more evenly distributed for the PGA construct, although the biomaterials still remained in all scaffolds for 4 weeks. With the extension of cultural time, the accumulation of extracellular matrix was increased gradually, and the scaffold was replaced by neocartilage tissue.
Comparison to the native cartilage, the data depicted that the proliferation of chondrocytes in scaffolds were not affected and the contents of glycosaminoglycans were also no significantly changed, even though the content of GAGs in PGA scaffold was reached two fold after 8 weeks. However, the cultural environments were unsuitable for chondrocytes to make up the normal compostions of extracellular matrix likes type II collagen and elastin, indicated that the scaffolds needed to improve. We also observed that the neocartilage were formatted ex vivo, and the scaffolds were almost degraded completely. The results of this project already offered the important infomations on the development of tissue scaffold. It is believed that we may overcome the bottleneck of technology and find out the most applicable tissue scaffold for tissue engineering neocartilage in the future.
Key words: chondrocytes, biomedical material, chondrogenesis.
前言
組織缺損的重建，是整形外科醫師最常面對的問題，由於患者通常必須提供 自體組織或是利用人造合成的替代品，來作為修復必須的材料，因此極可能產生 其他併發症的情形；然而隨著組織工程學的研究進展，這樣的手術瓶頸已逐漸透 露出治療的曙光。有鑑於此，我們致力於軟骨新生的研發工作，嘗試在體外培養 出具正常結構與生理活性的軟骨組織，作為臨床疾病治療的應用。然而不論是細 胞類型的選擇或是組織支架的製備條件，均牽涉了許多複雜的變因，而直接影響 了實驗結果；例如細胞的分化程度，以及細胞與基材之間的交互作用等。因此欲 使軟骨新生的研發成果未來能夠實際應用，我們將深入探討軟骨新生作用的機 轉，藉由評估各種特定細胞外間質的合成情況，瞭解體外培養軟骨組織形成的最 佳環境；同時評估含軟骨細胞之組織基材，進行活體內移植後的變化情況，觀察 軟骨新生是否可持續進行。透過本計畫所獲得的研究資訊，預期將建立一適當的 軟骨再生平台技術，加速推動未來實際於臨床疾病治療的速度。
研究目的與文獻探討
軟骨屬於結締組織的一種，其結構是由膠原蛋白纖維和彈性蛋白所組成的緻 密網絡，因具有維持彈性與緩衝壓力的特性，故可提供物理性的架構，來維持身 體內某些器官或組織的外觀形狀。軟骨主要存在於關節的硬骨末端、鼻子與外耳 之中；而由於軟骨發育不全、受損或關節退化等問題，一直對人們造成很大的困 擾，使患者飽受疼痛與生活不便之苦。傳統對於上述問題的治療策略，多是利用 自體軟骨作為移植的材料[1]；然而這種挖東牆補西牆的移植方式，極容易對病 人的生理狀態造成另一種壓力，因此亟需其他的方式取而代之。近年來有關組織 工程學的發展，無異是提供一個更好的治療方式；利用適當的組織模版作為細胞 培養的基材，產生一具有功能性的軟骨組織，已非我們遙不可及的夢想。
軟骨組織大致可分成三種類型，包括透明軟骨(hyaline cartilage)、彈性軟骨 (elastic cartilage)，以及纖維軟骨(fibrous cartilage)等；而其主要差異乃在於彼此的 細胞外間質成分含量不同[2]。因此欲透過組織工程創造一新生軟骨時，培養環 境是否具有適當細胞外間質的比例，將是一個相當重要的關鍵[3]。然而以人工 合成的可降解聚合物，作為細胞移植的載體支架，卻是組織工程中最常應用的模 式；其原因是材料本身沒有天然結構的限制。現階段較常應用的化學性材料，包 括PGA、PLA、PLGA、PLLA等[4]，其高可塑性使研究人員可隨意製備出不同 形式的組織支架；而其主要的缺點乃在於必須考量其降解的趨勢，和降解產物在 活體內的代謝情況，所以仍有改善的空間。至於在天然性材料部分，如膠原蛋白 與海藻酸等[4]，也同樣被認為適合作為組織支架的材料。
除了基質的架構之外，細胞來源則是軟骨組織新生過程另一項要素。由於成 體幹細胞經適當誘導後，可分化成間質系的細胞類型(mesenchymal lineage)，包 括脂肪細胞、肌肉細胞和軟骨細胞等，因此被認為十分適合應用在組織工程的研 究上[5, 6]。以骨髓幹細胞為例，其優勢包括萃取分離的步驟簡易、所需的細胞 數少，而且捐贈對象的生理條件對細胞活性的影響較小。本實驗室亦嘗試由兔子 體內分離得到間質幹細胞，試驗其軟骨新生的能力；但受限於培養條件未臻完 美，所得到之細胞數目無法符合需求，所以本計畫中主要將利用已分化的軟骨細 胞。
正因為需要足夠數量的軟骨細胞，以應用在軟骨新生的組織工程上，所以研
究者必須在體外進行軟骨細胞的培養工作。軟骨細胞在體外以平面方式大量擴增 細胞數目時，很容易失去其表現型，而產生去分化的現象(de-differentiation)[7, 8]，失去其正常特徵與生理功能；例如外型產生改變、分泌的膠原蛋白由第二型 轉變成第一型，以及蛋白多醣(proteoglycans)生成減少等等[9]。因此如何找出適 當條件，使軟骨細胞大量培養時可保有正常型態與功能，是首要面臨的課題。許 多科學家針對軟骨細胞去分化之後，如何誘使其再分化(re-differentiation)的情況 進行探討，希望藉此掌握調控軟骨細胞特性的影響因子。相關研究顯示，此去分 化之軟骨細胞，若改以立體方式培養，則可維持或甚至恢復其軟骨細胞的特性[9, 10]；惟如何在大量擴增培養以及立體培養之間取得平衡，目前仍缺乏確切的結 論。
除了細胞與基材之外，目前有關利用不同生長因子來誘導軟骨新生的研究亦 蓬勃發展中。TGF-β和IGF-1，是大量擴增軟骨細胞時必須添加的刺激因子[11]，
其能夠維持軟骨細胞生成特殊細胞外間質的活性；而FGF-18與BMP蛋白，則分 別具有加速軟骨修復和調控軟骨細胞分化的作用[12, 13]。研究顯示，這些生長 因子亦可能藉由彼此相互影響的方式[12]，來達成促進軟骨新生的目的。本計畫 雖然預定探討軟骨新生的機轉，但考量生長因子牽涉的層面太廣，若一併分析將 勢必影響執行的進度，因此將此變數先行省略，留待後續更深入的評估。
本研究主要從細胞與組織支架之間的相互關係切入，來瞭解此培養環境對軟 骨新生的影響情形。由兔子耳朵軟骨分離出細胞後，經數代的擴增培養，再植入 特定孔洞大小的降解性生醫材質，其組成包括PGA (polyglycolic acid)、PCL (poly ε-caprolactone)以及P-4HB (poly-4-hydrobutyrate)三種。待體外培養一定時間後，
定性分析其組織學變化，及利用生化方法定量此組織工程軟骨內之DNA、細胞 外間質如第二型膠原蛋白、多醣胺聚醣和彈性蛋白的含量。此外亦觀察此組織工 程軟骨基材經活體移植數月後，整體軟骨新生的情況。本計畫的研究資訊，相信 將可用作建立軟骨修復與治療的技術平台；包括軟骨軟化症、受損、退化性關節 炎，或是需要進行整型手術的病人，都可直接受惠，而不再需要依賴藥物或自體 移植的治療模式。
研究方法
1. Fabrication of polymeric scaffolds
Scaffold sheets (1.0°1.0°0.2 cm) are made by a solvent casting/particulate leaching prefabricated technique. The experimental groups are divided into three according to the different biodegradable biomaterials: PGA (polyglycolic acid), P-4HB (poly-4-hydrobutyrate), and PCL (poly ε-caprolactone).
2. Cell isolation and culture
Ear cartilage specimens are harvested from rabbit ears. The chondrocytes are isolated by using a similar technique described by Klagsbrun. Minced cartilage fragments are digested with type II collagenase for eight hours in a 37°C warm shaker.
After filtration through a mesh, the cells are spun down, counted, and plated. The proliferation medium consists of Ham’sF-12 (Gibco, BRL/Life Technologies, Grand Island, NY), with the addition of 10% fetal bovine serum, 5 µg/mL ascorbic acid 2-phosphate, and an antibiotic/antimicotic solution containing 10,000 U/mL penicillin, 10 mg/mL streptomycin, and 25 µg/mL amphotericin B. The rabbit chondrocytes are expanded in vitro for four to five passages to get adequate cell numbers for seeding.
3. Construct assembly
Before cell seeding, the scaffolds are pretreated with 1N NaOH. The seeding density is 5°107cells/cm3. The scaffold sheets are seeded with 5°106cells each.
Seeded constructs are cultured in rotating bioreactors (1 rpm) under dynamic conditions at 37°C, 5% CO2 incubator for eight weeks. The culture medium consists of serum free DMEM/F12, with the addition of 5ng/ml TGF-β2 (Pepro Tech, Rocky Hill, NJ), 5 ng/ml des (1-3) IGF-1(GroPep, Australia), ITS+premix, 110mM pyruvate, 10-7 M dexamethasone, and 5µg /mL ascorbic acid 2-phosphate.
4. Histological analysis
After 4 and 8 weeks, the sheet constructs are harvested for histological analysis.
The specimens are fixed with 10% phosphate buffered formalin for 24 hours, and then embedded in paraffin and sectioned using the standard histochemical techniques.
Serial slide sections are stained with hematoxylin and eosin.
5. Biological analysis
After 4 and 8 weeks, the sheet constructs are also harvested for quantitative biochemical analysis, including DNA assay and extracellular matrix analysis. Both constructs and native ear cartilage are lyophilized, weighed, and minced. For the DNA assay, samples were digested and incubated in a proteinase K solution (Sigma) at 55°C for 16 hours. Hoechst 33258 dye solution (Sigma) is used to measure the total DNA content under a spectrofluorometer (Turner Designs, Sunnyvale, CA) by the bisbenzimidazol fluorescent dye method. For quantification of the amount of glycosaminoglycan (GAG), each sample is mixed and shaked with 4M guanidine solution (Sigma) for 48 hours at 4°C. Digested samples are dialyzed using a 3.5 kDa cut-off cullulose membrane against a bath of deionized distilled water for 12 hours for removing acid. The amount of GAG is quantified using the dimethylmethylene blue dye in the Blyscan assay kit, with a chondroitin sulfate standard provided, by a spectrophotometer. For type II collagen, the samples are digested with 1% (w/v) pepsin in 0.5 M acetic acid on a shaker for 24 hours at 4°C. The content of type II collagen is measured by a spectrophotometer at 540 nm using direct red in the Sircol assay kit, with a collagen standard containing 1 µg/µl provided. For measuring elastin content, the samples were also extracted with 4M guanidine solution (Sigma), and then dialyzed using a 3.5 kDa cut-off cellulose membrane against a bath of deionized distilled water for 12 hours for removing acid. The amount of elastin was measured using the Fastin assay kit spectrophotometrically.
6. In vivo chondrogenesis study
The cartilage specimens were harvested from rabbit ears and processed to create a sheet tissue-engineeed construct by the aforementioned protocols. Under intraperitoneal anesthesia with ketamine hydrochloride and xylazine hydrochloride, a transverse incision was made on the dorsum of each mouse to create a subcutaneous pocket with sterile surgical technique. Each animal received one sheet tissue-engineered cell-polymer construct on the back. The studied groups were as follows: Group 1 implanted with cell-polymer construct PGA, Group 2 implanted with cell-polymer construct PCL, and Group 3 implanted with cellpolymer construct P-4HB. After 6 months follow-up, the architectures of the tissue-engineered construct were evaluated and the animals were sacrificed by an overdose of inhalation anesthesia. The tissue-engineered constructs were harvested for histological analysis.
7. Statistical analysis
Average DNA and extracellular matrix data were recorded and calculated as mean±standard deviation. The significance of difference between groups was analyzed with one-way analysis-of-variance (ANOVA).
實驗結果
軟骨細胞於基材中經過四週或八週的培養後，利用組織切片染色技術評估細 胞的生長分佈以及材料降解的情形。結果發現細胞在四週時可佈滿基材的周圍，
其中以PGA 組成的模版分佈最為均勻，如圖一所示；而隨著培養時間的延長，
軟骨細胞則逐漸移入基材的中央部位，並且生合成更多的細胞外間質。在八週的 體外培養過程中，基材均有分解的情形，但至實驗終點時仍然存在。
進一步以動物的軟骨組織作為對照，比較各種含軟骨細胞之生醫基材經四週 或八週體外培養後，其內部所具有之 DNA、多醣胺聚醣、第二型膠原蛋白以及 彈力蛋白等成分的含量多寡，作為判斷軟骨新生程度的依據。圖三的數據顯示，
各組 DNA 含量與對照組均無顯著的差異存在，僅 PGA 組成的基材，在四週的 時有增加的趨勢。在多醣胺聚醣的分析上，實驗發現四週後的體外培養，軟骨細 胞已可生成同等於天然軟骨中多醣胺聚醣的含量；甚至在培養八週之後，以PGA 或 PCL 組成的基材，其中的多醣胺聚醣仍繼續增加，特別是前者可達到對照組 的兩倍以上，結果如圖四所示。至於第二型膠原蛋白的形成，在四週後各組基材 僅分別達到對照組的37% (PGA)、PCL 和 P-4HB 各約 20%。隨著時間的延長，
只有PGA 組成的基材，可於培養八週後增加至約七成，而其餘兩組仍低於一半 的含量（圖五）。有關彈性蛋白的分析結果，亦出現類似的情況，各組培養基材 中的彈性蛋白含量均明顯低於對照組。雖然彈性蛋白的生成偏低，但是在 PCL 或 4-PHB 組成的基材中，其含量仍隨著培養時間增加而有略微上昇的情形，但 在PGA 組成的基材中卻沒有此現象。
為了評估軟骨新生在活體內的情況，以及瞭解各種生醫材料是否適合作為組 織支架，本實驗室利用無胸腺小鼠(athymic mice)為動物模式，將體外培養八週的 含軟骨細胞之基材移植到其背部，分析其經過六個月後的情況。圖六、七、八分 別表示以PGA、PCL 與 P-4HB 組成之基材的實驗結果。
當自小鼠背部取出經活體培養六個月的基材時，其周圍外觀均包覆了一層纖 維狀結構。以組織切片分析內部細胞外間質的累積與軟骨細胞的增生情形，結果 證實軟骨新生作用在各種基材中皆可以順利進行；此外以PGA 和 P-4HB 為組成 成分的基材亦幾近完全降解，但PCL 的組成則速率較為緩慢。
討論
本計畫以PGA、PCL 和 P-4HB 三種生醫材料作為基材來培養軟骨細胞，分 析體外培養數週後，其產生各種細胞外間質組成如多醣胺聚醣、第二型膠原蛋白 和彈力蛋白的情況，以及基材內部的DNA 含量，來探討其進行軟骨新生的狀態。
根據本研究的實驗結果顯示，多孔性的立體組織支架確實可讓軟骨細胞浸滲到內 部，並且生合成細胞外間質，產生新生軟骨組織。雖然該組織工程軟骨中的多醣 胺聚醣含量與一般軟骨無異，可是其他細胞外間質的成分則略嫌不足，推測此培 養另外需要適當的誘導因子促使軟骨細胞能夠穩定分泌第二型膠原蛋白和彈力
蛋白。
欲營造一適當的軟骨新生環境，需要審慎考量諸多因素；包括生醫材料的特 性、軟骨細胞的生理活性，或是上述所提及之生長因子的添加等。本研究所使用 的三種生醫材料成分中，已知 PCL 的降解速率最慢，在活體內約達 1-2 年；而 PGA 與 P-4HB 則有較快的降解速率，此點亦由實驗結果可獲得證實。由於 PCL 的緩慢降解，因此在組織新生的過程，其可維持原始所塑造的大致型態，而該特 性將較有利於整型外科手術所需的軟骨材料；不過必須注意化學材料的長期存 在，是否引起移植後的排斥反應。
可應用於軟骨新生的細胞類型，包括已分化的軟骨細胞、軟骨前驅細胞 (progenitor cells)，或幹細胞等。本研究之所以利用已分化軟骨細胞的主要原因，
即是其來源容易取得且具有高再現性。由於軟骨膜(perichordrium)亦可能是一具 潛力的細胞來源[14, 15]，雖然其會因為年齡或培養條件的影響而有所差異[16]；
我們仍在分離軟骨細胞的同時，亦嘗試自軟骨膜中萃取出前驅細胞。實驗證實該 細胞可持續增生，且當其受到TGF-β2 與 IGF-1 的誘導下，將分化成軟骨細胞。
然而此部分的實驗結果，目前尚無法有效地重複，推測原因是分離時容易受到其 他細胞類型的污染，而使得其純度不佳所導致，我們將在以後的計畫中，繼續此 研究。
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附表及附圖
(A)
(B)
(C)
圖一：含軟骨細胞之基材經過四週的培養工作，以H&E staining 處理後取像；圖 形均為40 倍的放大倍率。基材之組成分別為(A) PGA、(B) PCL 與(C) P-4HB。
(A)
(B)
(C)
圖二：含軟骨細胞之基材經過八週的培養工作，以H&E staining 處理後取像；圖 形均為40 倍的放大倍率。基材之組成分別為(A) PGA、(B) PCL 與(C) P-4HB。
DNA
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ARC-PGA ARC-PCL ARC-P4HB
4WK 8WK
圖三：含軟骨細胞之不同成分基材經四週與八週的體外培養後，其所具有之DNA 含量的比較結果。藍色柱狀數據代表培養四週後，紫色柱狀數據代表培養八週 後。ARC 則代表 adult rabbit chondrocyte。
GAG
0 20 40 60 80 100 120 140
ARC-PGA ARC-PCL ARC-P4HB
4WK 8WK
圖四：含軟骨細胞之不同成分基材經四週與八週的體外培養後，比較其所生成之 多醣胺聚醣的含量。藍色柱狀數據代表培養四週後，紫色柱狀數據代表培養八週 後。ARC 則代表 adult rabbit chondrocyte。
Type II Collagen
0 50 100 150 200 250
ARC-PGA ARC-PCL ARC-P4HB
4WK 8WK
圖五：含軟骨細胞之不同成分基材經四週與八週的體外培養後，比較其所生成之 第二型膠原蛋白的含量。藍色柱狀數據代表培養四週後，紫色柱狀數據代表培養 八週後。ARC 則代表 adult rabbit chondrocyte
圖六：以PGA, PCL,P4-HB 組成之基材經活體移植培養的結果。基材經活體培養 六個月，以H&E staining 處理組織切片來評估軟骨新生作用，圖片放大倍率為 40 倍。
圖七：以 PCL 組成之基材經活體移植培養的結果。基材經活體培養六個月後，
以H&E staining 處理組織切片來評估軟骨新生作用的程度，圖片放大倍率為 40 倍。
圖八：以P-4HB 組成之基材經活體移植培養的結果。基材經活體培養六個月後，
以H&E staining 處理組織切片來評估軟骨新生作用的程度，圖片放大倍率為 40 倍。
計畫成果自評
茲將本計畫所列出之預期目摽與實際達成情況歸納於下表所示：
預期目標 達成情況
建立軟骨細胞的體外培養技術。 可大量增殖培養軟骨細胞，並穩定繼
代。
評 估 不 同 可 分 解 性 生 醫 材 料 包 括 PGA、P-4HB 以及 PCL 等，對於軟骨 細胞生長和分化特性的影響。
分析不同生醫材料對影響軟骨細胞在 分化與增生上的程度，並整理比較其 中的差異性。
找出最適於軟骨細胞生長之培養基材 的組成條件。
綜合歸納實驗結果後，提出最佳培養 基材的必要因素。
本計畫的研究目的，在於探討軟骨細胞與培養基材間的作用關係，以瞭解其 個別影響細胞特定生化特性的情況；並經由多種實驗項目的分析工作，建立最佳 之軟骨組織工程培養及製作條件的平台技術。綜觀本年度的執行成果，本實驗室 已能夠於體外大量培養軟骨細胞，並利用可分解性生醫材料，塑造出不同形式的 基質模版，進一步將細胞培養於其中，而誘導使其形成類似正常軟骨組織的構 造。除此之外，我們也熟捻如何調整體外培養的條件，讓軟骨細胞能夠保持特殊 的表現型，不至於失去分化的特性；因此更加提高了軟骨新生的效率。本計畫的 研究結果，相信將可提供軟骨組織工程領域重要的資訊，以協助研究人員研發出 更好的新生軟骨，加速未來實際應用在臨床疾病治療的可行性。
