邁向頂尖大學計畫-尖端光電科技中心

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國立成功大學「邁向頂尖大學計畫」

延攬優秀人才工作報告表

NCKU’s “Aim for the Top University Project”

Work Report Form for Distinguished Scholars

□續聘continuation of employment ■離職resignation

受聘者姓名

Name of the Employee

林俊佑

Male Female

聘 期 Period of Employment

From 2018 年(y) 1 月(m) 1 日(d) to 2018 年(y) 7 月(m) 31 日(d) 研究或教學或科技研發與

管理計畫名稱 The project title of research,

teaching, technology development and management

邁向頂尖大學計畫-尖端光電 科技中心

計畫主持人

（申請單位主管）

Project Investigator (Head of Department/Center)

許渭州

補助延聘編號

Grant Number D107-F1702

一、 研究、教學、科技研發與管理工作全程經過概述。（由受聘人填寫）

Please summarize the entire research, teaching, or science and technology R&D and management work process (To be completed by the employee)

利用超快雷射進行多光子激發技術之應用非常廣泛，包含: 觀察細胞與生物組織之三維螢光 影像、二倍頻訊號(second harmonic generation)影像、螢光生命週期訊號影像(fluorescence lifetime imaging microscopy)甚至奈微米製程等。尤其此技術在微奈米結構加工與製作上具很重要的地 位，而且相較於其他三維製作與加工技術中提供更佳的空間解析率(spatial resolution)。藉由飛秒 (femtosecond)雷射其超短脈衝寬度和高峰值功率進行多光子激發大多機率只在聚焦點上可誘發 並產生雙光子吸收效應，此吸收效應進而啟動光化學反應(photochemistry)。研發具有即時分子影 像輔助之新穎飛秒雷射微加工技術平台，並且試圖整合微加工、顯微影像、細胞支架導管生醫材 料、光電半導體等技術，以利製作適合之 3D 組織支架，用於神經元細胞觀測、操控與神經網路 之引導，以及後續細胞生物學應用。

在生醫影像的研究當中，活體細胞的互動、細胞的遷移、以及神經細胞的訊號傳遞等皆須要 即時的成像系統，例如觀測細胞的鞭毛運動需要幀速度 100 fps 以上，而胚胎斑馬魚的心跳甚至 需要幀速度高於 200 fps 以上才能夠準確地觀察到，為了了解更複雜的生物系統中之多尺度訊號 動態(multiscale signaling dynamics)與細胞間交互作用(cell-cell interactions)，必需要即時(real-time) 觀查在感興趣區域內細胞群的變化情況，因此，能夠提升體積成像(volumetric imaging)系統之時 間空間解析度(spatiotemporal resolution)是個重要的研究題目；近年來的研究發展出許多廣視域的 並行成像(parallel imaging)技術來提供快速的體積成像，例如光片照明式顯微技術(light-sheet microscopy) 與 時 域 聚 焦 多 光 子 激 發 顯 微 術 (temporal focusing-based multiphoton excitation microscopy) ，其能夠提供的體積成像速度約數個 fps，然而，在不透明(turbid)的生物系統中，並 行成像技術會受到生物組織之光學像差(optical aberration)與散射作用的影響產生不同空間點 (spatial points)的串擾，進而限制了並行成像系統的探測深度。經由高度的平行化或超高速的掃描 影像方式可以增加成像速度，但是每個像素間幾乎沒有串擾的問題而保持具有單點的高 SNR，因 此，藉由單點或多點超高速掃描以減少串擾之顯微術亦有開發的價值。

在超高速的掃瞄機制中，由於影像各取樣點的位置停留時間非常短暫，以 RG mirror 的共振 掃描取樣點數為例，可以推算出每個像素點的積分時間約為1 ÷ 16 kHz ÷ 512 pixels ≈ 0.122 μs 左 右，所以每個像素點約只有被 11 根雷射脈衝照射(假若脈衝重覆率為 95 MHz 的條件下)，在如此 嚴苛的激發條件下，如何取得足夠的螢光訊號是個很重要的問題，所以在光偵測器的選擇上需要 求在觀測光波段範圍內具有高偵測效率、高反應時間與低雜訊的光電倍增管(photomultiplier tube，PMT)以求能在極短的積分時間下，得到訊躁比(signal-to-noise ratio，SNR)最高的訊號。目 前系統設計上採用之 PMT (H7422-40，Hamamatsu，Japan)，其量子效率為 0.4，在 550 nm 波段

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具有高達 176 mA/W 的效率，1.0 ns 的陽極脈衝上升時間(anode pulse rise time)，在搭配散熱器 (A7423，Hamamatsu，Japan)與溫度控制器(M9012，Hamamatsu，Japan)可將其工作溫度設定在 0

℃下，使其陽極暗電流(anode dark current)進一步降低至 1 nA 以提升訊號 SNR，緊接著 PMT 的 電流訊號經由一高頻寬的電流放大器(C6438-01，Hamamatsu，Japan)轉換成電壓訊號，而為了能 夠準確地擷取此高速的電壓訊號，系統需要一高速的資料擷取卡，目前設計上是採用基於 FPGA 的高速介面卡(PXI-7952R，National Instruments，USA)，此卡具有 128 MB 的動態隨機存取記憶 體(dynamic random access memory，DRAM)以供快速暫時的資料讀存，且支援高達 125 MB/sec 的高速資料傳遞。而外接此高速介面卡的資料擷取模組則選用高速的類比數位轉換模組(5761，

National Instruments，USA)使之能高速轉換類比訊號至數位訊號，並提供四通道同時擷取，14 位 元解析度，高達 250 MS/s 的取樣率，500 MHz 的類比頻寬。當光強度訊號經由光偵測系統轉換 成電壓類比訊號後再經由資料擷取模組轉換成數位訊號，傳送至高速介面卡的 FPGA 做初步的訊 號處理後，透過一 PXI 介面的機箱(PXI-1033，National Instruments，USA)將資料傳回至電腦本端 硬碟儲存以供後端資料分析，此機箱的溝通控制與高速介面卡的 FPGA 硬體程式撰寫都可由 LabVIEW 統一進行編寫。

原本共振掃描 MPEF 顯微鏡系統光偵測系統為 PMT (H10721P-110，Hamamatsu，Japan)加上 實驗室自製鑑別器(discriminator)，並且採用單光子計數技術(single-photon counting，SPC)來偵測 微弱的螢光訊號。然而，此光偵測系統並不合適於用在共振掃描 MPEF 顯微鏡系統，因此，我們 升級光偵測系統的 PMT (H7422-40，Hamamatsu，Japan)，並搭配散熱器將其工作溫度設定在 0 ℃ 下，使其陽極暗電流(anode dark current)進一步降低至 1 nA 以提升訊號 SNR，緊接著光電流訊號 經由一高頻寬的電流放大器(C6438-01，Hamamatsu，Japan)轉換成電壓訊號，最後由一高速的資 料擷取卡擷取電壓訊號。升級完成之共振掃描 MPEF 顯微鏡系統，利用 FPGA 模組系統整合 RG mirror、震鏡掃描器與 z 軸 ETL 作三維的聚焦定位並且同步觸發 PMT 偵測模組取得螢光或二倍 頻訊號，基於 RG mirror 的 pixel clock 電路路板所提供的參考信號，我們可以透過 LabVIEW 控 制程式的撰寫，以及與雷射的同步信號取樣，並在每個 pixel 累積 6 發脈衝的激發信號，做數位 積分，有效地在 8 kHz 的 RG mirror 下，一個週期內取得兩條 512 pixels 的信號，並且取得 512 條線的信號組成一張完整的影像，完成一張約 30 fps 的影像時，我們接續透過程式的撰寫，給予 ETL 一個步階的信號，改變聚焦深度而繼續掃描下一個 x-y 平面影像(y 軸的震鏡掃描器反向掃 描)，依序地將三維的影像建構出來，基於目前的光路的設計，能夠掃描 150 × 150 μm² (512 × 512 pixels)的 30 fps 快速的 x-y 平面，目前系統測試所使用的生物組織為透過蘇木紫–伊紅 (hematoxylin and eosin，H&E)染色的紐西蘭實驗白兔之背部皮膚組織，此染色方法是組織學內較 常用的染色方法，其透過雷射激發可誘發出極高的螢光強度，左圖表示為固定深度下之 x-y 平面 的螢光影像，右圖為由 63 層不同的 x-y 平面組成的三維影像，深度大約 20 μm，然而，因為 y 軸的震鏡掃描器正反的響應不同，因此，目前在我們改良升級之共振掃描 MPEF 顯微鏡系統中僅 只能使用單一方向掃描下所擷取到的資料點來組合成影像，換句話說，在組合螢光體積影像時，

只會使用 z 軸層數中的奇數或偶數張的 x-y 平面影像，所以使得共振掃描 MPEF 顯微鏡系統之體 積成像速度只能達到預期之一半約0.24 vps(30 fps ÷ 63 ÷ 2 ≈ 0.24 vps，512 × 512 × 63 pixels)。

透過 H&E 染色之紐西蘭實驗白兔的背部皮膚組織之螢光影像；左圖：固定掃描深度下，由共振 掃描 MPEF 顯微鏡系統擷取到的單張螢光影像；右圖：63 張不同深度之螢光影像組合重建結果。

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了解飛秒雷射在加工鎳薄膜成長石墨烯的溫度分佈，在此我們將上述的模型簡化，由於電 子與聲子的耦合時間，相對於熱擴散時間來說是非常地短暫，因此在下面的模擬中，我們就直 接假設鎳薄膜中的電子與聲子的耦合速度是一瞬間就達到熱平衡，所以鎳薄膜所吸收飛秒雷射 脈衝的能量就直接轉化成在鎳薄膜上的溫度分佈，經由將上述模型簡化，可以降低我們的計算 時間，方便我們來評估飛秒雷射脈衝轟擊在鎳薄膜上熱累積的程度與隨著時間的變化情況，模 擬出利用飛秒雷射加工鎳薄膜之熱效應。在模擬參數設定上，我們假定初始環境溫度300 K、鎳 薄膜厚度100 nm、飛秒雷射平均功率為100 mW、脈衝重複率為80 MHz及物鏡數值孔徑為0.75。

由於在我們使用飛秒雷射加工鎳薄膜時，會在鎳薄膜上滴上折射率匹配油來保護飛秒雷射加工 區域，來避免成長出來的石墨烯薄膜被氧化，在這樣的三層結構(油、鎳薄膜、玻璃)，我們可以 利用Fresnel equation來計算出在飛秒雷射激發波長下鎳薄膜的吸收度(Absorbance)，評估出鎳薄 膜吸收了多少的飛秒雷射脈衝之能量，經由計算結果，鎳薄膜的吸收度約為0.22。一般來說，飛 秒雷射光束之光強度是呈現高斯分佈(Gaussian distribution)，經由物鏡聚焦後可得到在焦平面上 的光強分佈也是呈現高斯分佈，由於物鏡的軸向解析度(2 × 1.515 × 800 nm ÷ (0.75)² ≈ 4.3 μm)遠 大於鎳薄膜厚度，且鎳薄膜中的電子與聲子的耦合速度非常快速，因此我們可以假設鎳薄膜吸 收能量是均分佈在薄膜上，所以在鎳薄膜上的熱擴散被簡化成一個維度的問題，大大地降低了 我們所需要的計算量。在計算鎳薄膜的初始溫度時，我們已經考慮到雷射聚焦點是高斯分佈，

因此我們可以得到鎳薄膜所儲存的能量也是高斯分佈，最後，將鎳之熱容量(specific heat capacity) 與密度參數代入，即可得到單一飛秒雷射脈衝所造成在鎳薄膜的溫度分佈。圖8(a)為模擬鎳薄膜 瞬間吸收飛秒雷射脈衝能量後的溫度分佈，模擬結果顯示，鎳薄膜的溫度在焦點中心瞬間提升 至4000 K以上，且瞬間溫度在聚焦點半徑400 nm的圓內的區域範圍約在大於600 K以上；隨著時 間的增加，聚焦點處的能量開始藉由聲子與聲子之耦合傳遞出去，使得溫度開始快速地下降，

圖8(b)為當時間經過12.5 ns後，鎳薄膜的溫度分佈，可以很清楚地看到在聚焦點中心的溫度從原 來4000 K以上非常快速地下降至約480 K左右，在極短時間內其溫度下降速度非常快速，所以飛 秒雷射所引起的熱效應的影響範圍也開始向外擴散，從模擬的結果中得到單發飛秒雷射的加熱 範圍約為2.5 μm左右。另外，在此簡化模型模擬中，我們並未考慮鎳薄膜與外部環境的能量交換，

換句話說，我們假設能量僅僅在於鎳薄膜上傳遞擴散，因此，此模擬結果會與實際實驗結果有 些差異性，然而，我們可藉由此簡化條件即可提供超快雷射單一脈衝於加工物體上快速升溫與 降溫的特性做出一個具有實質上參考性的模擬。

(a) (b)

飛秒雷射激發波長為800 nm、平均功率100 mW與鎳薄膜的吸收度為0.22下，飛秒雷射脈衝照射 入鎳薄膜所引起其溫度變化情況：(a) 單發超快雷射脈衝加熱鎳薄膜上之瞬間溫度分佈圖；(b) 經 過12.5 ns後之溫度分佈圖。

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二、研究或教學或科技研發與管理成效評估（由計畫主持人或單位主管填寫）

Please evaluate the performance of research, teaching or science and technology R&D and management Work: (To be completed by Project Investigator or Head of Department/Center)

(1)是否達到延攬預期目標？

Has the expected goal of recruitment been achieved?

是。為了解超快雷射與物質間的交互作用，進而達到對於不同材料來進行加工，為了達到此 一目的，本人利用先進的光電影像技術來分析超快雷射與物質間的交互作用，以期達到計劃之最 終目標。本人延攬林俊佑研究員後，借重該員在電漿子及非線性光學影像觀測上的專長，改善了 本實驗室之非線性光學影像之技術，協助本人探討超快雷射與物質之間的作用機制，使超快雷射 的加工機制更清楚明瞭，讓計畫的執行更加順利。此外，由於林姓研究員亦擁有建構 3D 材料之 專長，讓原計劃可以延伸地往 chip 及生醫材料方面發展，使研究不僅限制於 2D 平面系統，且往 更接近活體結構的 3D 系統方面進行，讓計劃研究更透徹、更具應用性。

(2)研究或教學或科技研發與管理的方法、專業知識及進度如何？

What are the methods, professional knowledge, and progress of the research, teaching, or R&D and management work?

在細胞培養過程中，細胞是處在二維平面的環境，例如一般的培養皿或是載玻片上。如此一 來該方法會有細胞的表現和當其存在於生物體內時差異較大的疑慮，自然情況下細胞的成長環境 是個三維的空間，所以我們觀察於三維培養支架下的細胞，使細胞生長培養的過程更接近自然環 境一些，以利得到的資訊更接近其原本的現象。對於細胞分子影像，除了直接量測得到細胞螢光 強度變化的資訊，還可以搭配 TCSPC 模組量測 FLIM，從 FLIM 影像中螢光生命週期的不同，可 分辨出細胞中不同的螢光分子，而從螢光生命週期的變化可顯示出周遭環境如 pH 值、離子濃度 及氧氣飽和度(oxygen saturation)等對螢光分子的影響或反映出生物分子之間的交互作用，所以 FLIM 影像提供了系統本身另一個觀測細胞變化的參考工具。在觀測螢光共振能量轉移(Förster resonance energy transfer，FRET)方面的運用上，由於螢光生命週期為分子本身的特性，並不隨著 光強和濃度變化而改變，故搭配 FLIM 的技術在觀測 FRET 影像即可避免光強度量測 SBT(spectral bleed-through)的影響。

(3)受延攬人之研究或教學或科技研發與管理成果對該計畫(或貴單位)助益如何？

How have the research, teaching, or R&D and management results of the employed person given benefit to the project (or your unit)?

林俊佑博士具備的相關能力，如：1）光學顯微術之理論基礎；2）三維生醫微米加工儀之光 機電系統整合、CAD 3D 輔助設計、雙光子激發高分子光化學作用機制、3D 影像處理與提升；3）

3D 生醫微米元件之設計與製作。林博士之工作項目包括實驗室工作、學生之引導、實驗室管理 及工作之協調。林博士為能幹之人選，其對本計畫之執行效率提昇極為關鍵。

(4)受延攬人於補助期間對貴單位或國內相關學術科技領域助益如何？

How has the employed person, during his or her term of employment, benefited your unit or the relevant domestic academic field?

跨領域的人才結合，往往能夠突破許多以往無法跨越之瓶頸，且更能激盪出創意，拓展出新的一片天 地。本人所屬的分子醫學研究所以及生物化學領域，由於加入光電工程背景的林俊佑研究員，不僅提升傳 統研究上影像觀測的技術，且其所擁有之 3D 材料方面的專長可提升研究之層次，跳脫二維平面的思考，

且使生物醫學之研究成果更進一步地應用於開發新的生醫材料產品上，讓基礎研究成果可以對人類更有貢 獻及發展。

(5)具體工作績效或研究或教學或科技研發與管理成果：

Please describe the specific work performance, or the results of research, teaching, or R&D and management work:

林博士除了具有光電技術外，還有相關生物醫學之基礎，以及工程與醫學之協調結合。因此，

除了專業期刊論文發表外，還可對對生醫光電的診斷做出貢獻。此外，林博士也護得科技部一般 型 研 究 計 畫 MOST 103 － 2221 － E － 006 － 104 、 MOST 104-2221-E-006-211 、 MOST 105-2221-E-006-147、MOST 106-2221-E-006-124 與 104 成大/臺綜大與工研院聯合學研計畫(具即 時監測之多波長飛秒雷射加工系統之開發與雷射波長調變，01/2015~12/2015)。

(6)是否續聘受聘人? Will you continue hiring the employed person? □續聘Yes ■不續聘No

※ 此報告表篇幅以三～四頁為原則。This report form should be limited to 3-4 pages in principle.

※ 此表格可上延攬優秀人才成果報告繳交說明網頁下載。

This report form can be downloaded in http://scholar.lib.ncku.edu.tw/explain/