市售水產品中動物用藥孔雀綠及其代謝物殘留量調查

及乙醇。其由苯甲醛（benzaldehyde）和N,N- dimethylaniline縮合後，在鹽酸混和下氧化而得

(1)，結構式如圖一(a)所示。孔雀綠一般作為合成 染料，用於絲綢、羊毛、黃麻、皮革、棉及紙等 不同物料⁽²⁾。由於其抗菌效果佳、價格便宜且易 取得，因此早在1930年代起即被廣泛使用於水產

前　言

孔 雀 綠 （ m a l a c h i t e g r e e n , M G , 4 - [ ( 4 - dimethylaminophenyl)-phenyl- methyl]-N,N- dimethyl-aniline）是一種三苯甲烷類染料，具 有 綠 色 金 屬 光 澤 ， 易 溶 於 水 ， 亦 易 溶 於 甲 醇

市售水產品中動物用藥孔雀綠及其代謝物殘留量調查

周珮如　古遠丰　蘇淑珠　施養志

第四組

摘　要

96年度針對市售水產品，包括石斑魚9件、吳郭魚14件、虱目魚11件、香魚10件、鰻魚 5件、鱒魚5件、土虱2件、牛蛙2件、田雞2件及甲魚4件等共64件，進行動物用藥孔雀綠及 其代謝物之殘留量調查。檢體由各縣市衛生局進行採樣，檢體均質後以乙腈萃取，經Oasis MCX 陽離子交換萃取匣進行淨化，再以Symmetry®C8層析管柱，搭配5 mM醋酸銨溶液

（pH 4.5）及含0.1%甲酸之乙腈溶液所組成之梯度移動相，以液相層析串聯質譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry）利用電灑游離法（electrospray ionization）配合多 重反應偵測模式（multiple reaction monitoring）進行檢驗，結果均未檢出。本檢驗方法之檢 出限量為0.5 ppb。

關鍵詞：孔雀綠、還原型孔雀綠、水產品、液相層析串聯質譜法

N

N CH3

CH3 C

CH₃ H₃C

N

N CH3

CH₃ CH

CH₃ H₃C

(a)

Malachite green (MG)

(b)

Leucomalachite green (LMG)

圖一、孔雀綠(a)及還原型孔雀綠(b)之化學結構式

養殖生產過程，預防魚卵感染病菌或治療魚體的 寄生蟲、真菌及原蟲等疾病^(3,4)。孔雀綠容易被 魚組織吸收，並快速代謝為無色的還原型孔雀綠

（leucomalachite green, LMG），結構如圖一(b)

所示^(5-8)。Bauer等⁽⁹⁾發現鱒魚會快速排泄孔雀綠，

但還原型孔雀綠在鱒魚肌肉組織之半衰期約為 40天。Law⁽¹⁰⁾將鱒魚曝露在2 ppm之孔雀綠中1小 時，7天後魚組織殘留孔雀綠約為0.2 ppm，但還 原型孔雀綠於魚體濃度在24小時增加至3.5 ppm且 可穩定存在7天。由前述文獻可知還原型孔雀綠較 孔雀綠更能長時間殘留魚體中，為魚體中主要殘 留物。

依 據 美 國 N a t i o n a l To x i c o l o g y P r o g r a m

（NTP）以老鼠進行毒性及致癌性試驗顯示，

malachite green chloride 對雌性大鼠（F344/N）

疑似有致癌性，但對雌性小鼠（B6C3F1）則無 證據，另代謝產物還原型孔雀綠對雄性及雌性 大鼠（F344/N）皆疑似有致癌性，而雌性小鼠

（B6C3F1）則有些有致癌性。囓齒動物實驗顯示 孔雀綠會危害肝臟，引起貧血和甲狀腺異常^(1,11)。 聯合國糧農組織/世界衛生組織聯合食品添加物 專家委員會（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA）及國際癌症研究組 織（International Agency for Research on Cancer, IARC）等國際食品安全組織，均未評估孔雀綠之 食用安全問題。歐盟（European Union）將孔雀 綠類列為R22（微毒物質，吸入吞食或通過皮膚 吸收引起有限健康損害），以危險符號Xn標識。

歐盟、美國、加拿大、日本、泰國、新加坡及我 國皆禁用孔雀綠於供食用之養殖水產品⁽¹²⁾。然而 孔雀綠的價格低廉，抗真菌、細菌及原蟲的效果 良好且易取得，仍經常被違法使用於養殖水產業

(11)。我國於94年驗出部分國內養殖石斑違法使用 孔雀綠，引起政府機關及社會大眾之重視；本局 於95年抽驗香魚等水產品進行孔雀綠及其代謝產 物殘留量調查，結果仍有石斑及蒲燒鰻等共4件檢 出還原型孔雀綠。為瞭解市售水產品是否仍有孔 雀綠及還原型孔雀綠之不法殘留問題，96年度抽 驗石斑魚等共64件之水產品，進行孔雀綠及還原 型孔雀綠之殘留量調查。

材料與方法 一、檢體來源

民國96年5月至7月由各縣市衛生局（表一）

以稽查方式至其轄區之大賣場、傳統市場、超級 市場等商號取得檢體，包括石斑魚9件、吳郭魚 14件、虱目魚11件、香魚10件、鰻魚5件、鱒魚5 件、土虱2件、牛蛙2件、田雞2件及甲魚4件等共 64件（表二）。檢體取得後於-20℃保存，直至分 析時取出使用。

表一、各縣市送驗檢體件數

縣市名稱 送驗檢體數 縣市名稱 送驗檢體數

基隆市 2 雲林縣 2

台北市 4 台南市 2

台北縣 2 台南縣 4

桃園縣 2 高雄市 4

新竹縣 2 高雄縣 3

苗栗縣 2 屏東縣 5

彰化縣 2 宜蘭縣 4

台中市 2 花蓮縣 4

台中縣 3 台東縣 3

南投縣 1 澎湖縣 3

嘉義縣 4 金門縣 1

嘉義市 2 福建省連江縣 1

總 計 64

表二、水產品採樣種類及件數

檢體類別 件數

石斑魚 9

吳郭魚 14

虱目魚 11

香魚 10

鰻魚 5

鱒魚 5

土虱 2

牛蛙 2

田雞 2

甲魚 4

總 計 64

二、試藥及材料

孔雀綠對照用標準品（malachite green oxalate salt），購自Fluka Chemie GmbH（Steinheim, Germany）；還原型孔雀綠對照用標準品，購 自 Sigma-Aldrich Chemie GmbH（Steinheim, Germany）。孔雀綠同位素內部標準品（MG-d₅ p i c r a t e ） 及 還 原 型 孔 雀 綠 同 位 素 內 部 標 準 品

（LMG-d5）皆購自WITEGA Laboratorien Berlin- Adlershof GmbH（Berlin, Germany）。醋酸、乙 腈、正己烷及乙酸乙酯為HPLC級，購自Merck Ltd.（Darmstadt, Germany）。甲醇為HPLC級，購 自Riedel-deHaën（Seelze, Germany）。N,N,N',N'- tetramethyl-1,4-phenylenediamine dihydrochloride

（TMPD）為試藥特級，購自Sigma-Aldrich Inc.

（St. Louis, MO, U.S.A.）。甲酸、檸檬酸（citric acid monohydrate）、磷酸氫二鈉、醋酸銨、25%

氨水及鹽酸為試藥特級，購自Nacalai Tesque Inc.

（Kyoto, Japan）。固相萃取匣Oasis MCX（3 mL, 60 mg）為Waters Corporation（Milford, MA, U.S.A.）之產品。0.45 µm濾膜（Nylon, 47 mm, MNY 4547）為ChremTech（Great Tide Instrument Co., Taiwan）之產品。0.22 µm濾膜為Nylon材質，

購自Micron Separations Inc. （Western Borough, MA, U.S.A.）。

三、儀器設備與裝置

㈠均質攪拌機（Homogenizer）

NihonseikiKaisha Ltd., Tokyo, Japan

㈡離心機（Centrifuge）

Labofuge400, Heraeus Instruments GmbH, Hanau, Germany

㈢旋渦混合器（Vortex mixer）

Type37600 Mixer, Thermolyne Corporation, IO, U.S.A.

㈣水浴鍋（Shaker bath）

YIHDER, BT-350, Taiwan

㈤超音波振盪器（Ultrasonic vibrator）

Elma, transonic TP690, Germany

㈥ 固相真空萃取裝置（Solid phase extraction

vacuum manifolds）

Supelco, Bellefonte, PA, U.S.A.

㈦ 去離子水製造機（Milli-Q SP reagent water system）

Millipore Ltd., Bedford, MA, U.S.A.

㈧ 液相層析串聯質譜儀（liquid chromatograph/

tandem mass spectrometer, LC/MS/MS）為 Waters Corporation（Milford, MA, U.S.A.）

之產品，包括Alliance®2695液相層析系統及 Micromass Quattro Premier質譜儀，離子源採 電灑法偵測正電離子，搭配MassLynx數據分 析軟體之電腦系統

㈨層析管柱

Symmetry®C8（3.5µm，內徑2.1mm × 10cm）, Waters Corporation（Milford, MA, U.S.A.）

四、方法

㈠試劑之調製

1. McIlvaines緩衝溶液（pH 2.6）

⑴0.1 M 檸檬酸溶液

稱取檸檬酸10.5 g，以去離子水溶解使成 500 mL。

⑵0.2 M 磷酸氫二鈉溶液

稱取磷酸氫二鈉14.2 g，以去離子水溶解 使成500 mL。

⑶ 取0.1 M檸檬酸溶液445.5 mL及0.2 M磷 酸氫二鈉溶液54.5 mL，混合均勻。

2. 沖提液

取25%氨水溶液5 mL與乙酸乙酯50 mL混合 均勻，再加入甲醇45 mL，混合均勻，臨 用時調製。

3. TMPD （1 mg/mL）溶液

稱取TMPD 50 mg，以甲醇溶解並定容至50 mL。

4.移動相溶液

⑴ 移動相溶液A （5 mM 醋酸銨溶液，pH 4.5）

稱取醋酸銨0.39 g溶於去離子水900 mL，

以醋酸調整pH為4.5 ± 0.1，再加去離子 水使成1000 mL，以0.45 µm濾膜過濾，

取濾液供作移動相溶液A。

⑵ 移動相溶液B（含0.1%甲酸之乙腈溶 液）

量取甲酸1 mL，加入1000 mL 之乙腈 中，為移動相溶液B。

㈡標準溶液之調製

稱取相當於含孔雀綠及還原型孔雀綠對照 用標準品各約5 mg，精確稱定，以乙腈溶 解並定容至50 mL，作為標準原液，避光置 於-20℃貯存備用。使用時取適量標準原液混 合後，以乙腈稀釋至100 ng/mL，作為混合 標準原液，再以50% 乙腈溶液稀釋至0.5-5.0 ng/mL，作為標準溶液，臨用時調製。

㈢內部標準溶液之調製

取相當於含孔雀綠及還原型孔雀綠各約5 mg 之同位素內部標準品，精確稱定，分別以 乙腈溶解並定容至50 mL，作為內部標準原 液，避光於-20℃貯存備用。使用時取適量 內部標準原液混合後，以乙腈稀釋至100 ng/

mL，作為內部標準溶液。

㈣檢液之調製（流程見圖二）

1. 萃取

將檢體細切後以均質機均質，取均質檢體 約1 g，精確稱定，置於50 mL塑膠離心管 中，加入內部標準溶液50 µL、TMPD溶液 50 µL及McIlvaines緩衝溶液：乙腈（1：1, v/v）混合溶液10 mL，旋渦混合45秒後，

於2,400 rpm離心20分鐘。收集上澄液，

離心管中之沉澱物再以McIlvaines 緩衝溶 液：乙腈（1：1, v/v）混合溶液5 mL重複 操作一次。合併上澄液，供淨化用。

2. 淨化

取上述供淨化用之溶液，注入預先以甲醇2 mL、去離子水2 mL及McIlvaines 緩衝溶液 2 mL潤洗之Oasis MCX固相萃取匣，再加 入0.1 N鹽酸溶液2 mL，以去離子水2.5 mL 清洗兩次，棄流出液。固相萃取匣以真空 抽乾後，依序再以50%甲醇溶液3 mL及正

己烷3 mL 清洗，真空抽氣乾燥5分鐘。以 沖提液5 mL沖提萃取匣，收集沖提液，於 50℃以氮氣吹乾，殘留物加入50%乙腈溶 液1.0 mL，以旋渦混合器振盪溶解，經0.22 µm濾膜過濾後，供作檢液。

㈤檢量線之製作

精確量取標準溶液添加於空白檢體中，使檢 均質檢體 1 g

內 部標準 溶 液50 ML、TMPD50 ML 及McIlvaines緩衝溶液：乙腈(1：1, v/v)10 mL

旋渦混合45秒 2.

離心(2400 rpm, 20 分) 1. 收集上清液

2. 沉澱物再以McIlvaines緩衝溶液：

乙腈(1：1, v/v)5 mL萃取

合併上清液

Oasis MCX 固相萃取匣淨化 (先以甲醇、去離子水及MacIlvaines 緩衝液各2 mL潤洗)

1. 以 0.1 N 鹽酸溶液 2 mL 及 去離子水2.5 mL x 2 清洗 2. 真空抽氣至乾

3. 50%甲醇溶液 3 mL及正己烷 3 mL 清洗

4.

沖提液 5 mL，收集沖提液 1. 50℃以氮氣吹乾

2. 50%乙腈溶液 1.0 mL 溶解 3. 0.22 Mm 濾膜過濾

液相層析串聯質譜儀分析 1.

真空抽乾5分鐘

圖二、孔雀綠及其代謝物殘留之檢驗流程圖

體含相當於0.5、1.0、2.0及5.0 ppb孔雀綠及 還原型孔雀綠之含量，依上述方法調製檢 液，並以液相層析串聯質譜分析，以孔雀綠 及還原型孔雀綠與內部標準品波峰面積比，

與對應之孔雀綠及還原型孔雀綠濃度，分別 製作檢量線。

㈥液相層析串聯質譜儀測定條件分析 1. 液相層析條件

⑴層析管柱：Symmetry®C8。

⑵移動相溶液

由5 mM醋酸銨溶液（pH 4.5）(A)及含 0.1%甲酸之乙腈溶液(B)組成，流速為 0.3 mL/min，兩移動相溶液之組成分及 時間梯度見表三。

2. 串聯質譜測定條件

離子源採電灑法離子化（electron spray ionization, ESI）偵測正離子，搭配多重反 應偵測模式（multiple reaction monitoring, MRM）進行偵測。質譜之分析參數條件見

表四，MRM偵測之離子見表五。

㈦鑑別試驗及含量測定

精確量取檢液及標準溶液各20 µL，分別注入 液相層析串聯質譜分析儀中，依據上述條件 進行分析，就檢液與標準溶液所得波峰之滯 留時間及多重反應偵測相對離子強度，參照 歐盟2002/657/EC ⁽¹²⁾之規範（表六）鑑別之，

並依下列計算式求得檢體中孔雀綠及還原型 孔雀綠之含量（ppb）：

表三、移動相組成及梯度時間表 時間

(min)

流速 (mL/min)

移動相 A (%) B (%)

0.0 0.3 50 50

1.0 0.3 0 100

4.0 0.3 0 100

4.5 0.3 50 50

8.0 0.3 50 50

表四、質譜儀分析條件

ESI mode Positive

Capillary voltage 2.5 kV

Extractor 3.0 V

Source Temperature 100 ºC Desolvation temperature 400 ºC Desolvation gas flow rate 500 L/hr Cone Gas Flow 100 L/hr LM 1 Resolution 15.0 HM 1 Resolution 15.0

Ion Energy 1 1.0

Entrance 2

Exit 2

LM 2 Resolution 15.0 HM 2 Resolution 15.0

Ion Energy 1 1.0

Multiplier 650 V

表五、以質譜儀偵測之碰撞能量、離子片段、比率及分析參數 Compound Precursor ion

(m/z) Product ions

(m/z) Relative intensity

(%) Dwell

(secs) Cone Voltage

(V) Collision energy (eV)

MG 329 208 ^a 100 0.1 60 35

329 313 ^b 36.4 (3.3) ^c 0.1 60 37

LMG 331 239 ^a 100 0.1 40 30

331 316 ^b 38.4 (1.4) ^c 0.1 40 24

MG-d5 334 318 0.1 40 38

LMG-d5 336 239 0.1 55 30

a

MRM trasition used for quantitation.

b

MRM transition used for confirmation.

c

Value in parenthesis is the coefficient of variation (CV, %), N=3.

檢體中MG或LMG之含量（ppb）＝C × V M  C： 由檢量線求得檢液中MG或LMG之濃度

（ng/mL）

V： 檢體最後經定容之體積（mL）

M： 取樣分析檢體之重量（g）

㈧品質管制分析

每批次檢體（少於15個樣品）於分析孔雀綠 及其代謝物殘留時，分別作空白分析、添加 孔雀綠及還原型孔雀綠2.0 ppb於魚肉樣品之 添加樣品分析及重複分析。

結果與討論

一、孔雀綠及還原型孔雀綠殘留之檢測

本調查採用本局於95年⁽¹⁵⁾所研擬之檢驗方 法，以液相層析串聯質譜儀（LC/MS/MS）為檢 測儀器，孔雀綠及還原型孔雀綠之母離子分別 為m/z 329及m/z 331，孔雀綠之偵測子離子為m/z 313及m/z 208；還原型孔雀綠之偵測子離子為m/z

239及m/z 316。依據歐盟2002/657/EC⁽¹²⁾之串聯質 譜技術規範，針對同一分析物之母離子可得1.0個 鑑別點數（identification points, IP），每一個子離 子可得1.5個鑑別點數（表七），因此本實驗所選 定的離子對照上述計分方式，孔雀綠與還原型孔 雀綠皆可得4.0個鑑別點數，符合歐盟禁用藥物⁽¹⁶⁾ 需有4個鑑別點數之規定，能準確鑑別孔雀綠及其 代謝物之殘留。再者，此方法靈敏度高，檢出限 量皆達0.5 ppb，符合歐盟規定對於其總量分析方 法之2 ppb檢測能力最低要求（minimum required performance limits, MRPL）⁽¹⁷⁾。本方法於檢體處 理時添加孔雀綠及還原型孔雀綠之同位素標準品 做為內部標準品，以求定性及定量更加準確。孔 雀綠、還原型孔雀綠及其同位素內標之層析圖如 圖三所示。

表六、質譜分析之相對離子強度最大可容許範圍 相對離子強度

Relative intensity (% of base peak)

液相串聯質譜儀之容許範圍 Tolerance range (%)

＞ 50 ± 20

＞ 20 to 50 ± 25

＞ 10 to 20 ± 30

≦ 10 ± 50

表七、各類質量片斷與獲得鑑別點數之關係

MS technique Identification points earned per ion Low resolution mass spectrometry

(LR-MS) 1.0

LR-MSⁿ precursor ion 1.0 LR-MSⁿ transition products 1.5 High resolution mass spectrometry

(HR-MS) 2.0

HR-MSⁿ precursor ion 2.0 HR-MSⁿ transition products 2.5

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00Time

%

-5 95

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

%

-5 95

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

%

-5 95

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

%

-5 95

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

%

-5 95

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

%

-5

95 1.69

1.70

5.27

5.27

1.67

5.24

(a)

(f) (e) (d) (c) (b)

圖三、 孔雀綠、還原型孔雀綠及其同位素內標之多重 反應偵測層析圖譜

(a)孔雀綠329>208 (b)孔雀綠329>313 (c)還原型孔雀 綠331>239 (d)還原型孔雀綠331>316 (e)孔雀綠-d5 334>318 (f)還原型孔雀綠-d5 336>329

二、品質管制分析

每批次水產品（少於15個樣品）檢驗孔雀綠 及其代謝物殘留時，至少作一次空白分析、重複 分析及添加樣品分析。本調查之空白分析值均 在方法檢出限量（method detection limit, MDL）

0.5 ppm以下（圖四）。依據聯合國糧農組織/世 界衛生組織 （Food and Agriculture Organization of The United Nations/World Health Organization, FAO/WHO）之國際食品法典委員會（Codex

Alimentarius Commission）⁽¹⁸⁾之規定，食品中 動物用藥殘留值若介於1~10 ppb，回收率應介 於60~120%，變異係數（coefficient of variation, CV）百分比應小於30%，本調查以魚肉檢體添 加2.0 ppb之孔雀綠及還原型孔雀綠進行重複分 析及添加樣品分析，添加樣品回收率之管制上 值（upper control limit, UCL）及管制下值（low control limit, UCL）分別訂為120%及60%，所得 之添加樣品之回收率均在管制上下值之內（圖 五）；變異係數百分比之管制上值訂為30%，本 調查所得之變異係數百分比均在管制上值以下

（圖六），皆符合Codex之要求，顯示魚肉檢體 中孔雀綠及還原型孔雀綠殘留分析之品質管制良 好。

三、 市售水產品中孔雀綠及還原型孔雀綠 殘留之檢測

96年度分析市售石斑魚9件、吳郭魚14件、虱 目魚11件、香魚10件、鰻魚5件、鱒魚5件、土虱2 件、牛蛙2件、田雞2件及甲魚4件等共64件，結果 均未檢出孔雀綠或還原型孔雀綠殘留，並無95年 水產品殘留還原型孔雀綠0.8∼18.3 ppm（檢出率 7%）之情況⁽¹⁵⁾，顯示有關單位已加強對業者之管 理及輔導，並有一定成效。

次 數 -1.00

-0.80 -0.60 -0.40 -0.200.000.200.400.60

0 1 2 3 4 5 6

LMG(ppb)MG(ppb)

-1.00 -0.80 -0.60 -0.40 -0.200.000.200.400.60

0 1 2 3 4 5 6

MDL

MDL 次 數

圖四、孔雀綠及還原型孔雀綠之空白分析管制圖 圖六、孔雀綠及還原型孔雀綠之重複分析管制圖

UCL：Upper control limit

0 5 10 15 20 25 30 35

0 1 2 3 4 5 6

0 5 10 15 20 25 30 35

0 1 2 3 4 5 6

MG(%)(%)

UCL

UCL 次 數

次 數

LMG

圖五、孔雀綠及還原型孔雀綠之添加樣品管制圖 UCL：Upper control limit

LCL：Low control limit

5060 70 8090 100110 120130

0 1 2 3 4 5 6

5060 7080 10090 110120 130

0 1 2 3 4 5 6

LMG(%)MG(%)

UCL

LCL

UCL

LCL

次 數 次 數

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Survey on Malachite Green and Leucomalachite Green Residues in Marketed Aquatic Products

PEI-JU CHOU, YUAN-FENG KU, SHU-CHU SU AND DANIEL YANG-CHIH SHIH

Food Chemistry Division

ABSTRACT

A survey of malachite green and leucomalachite green residues in marketed aquatic products was conducted in 2007. Sixty four samples, including 9 grouper, 14 tilapia, 11 milkfish, 10 smelt, 5 ell, 5 trout, 2 catfish, 2 bullfrog, 2 rice frog and 4 soft-shell turtle, were collected from retails by local health personnel.

Homogenized samples were extracted using acetonitrile and cleaned up using Oasis MCX cartridge. The extracts were analyzed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) with electrospray ionization and multiple reaction monitoring. Neither malachite green nor leucomalachite green was detected in all samples with the detection limit of 0.5 ppb.

Key words: malachite green, leucomalachite green, aquatic product, LC/MS/MS