市售水產品中動物用藥孔雀綠及其代謝物殘留量調查

原型孔雀綠對雄性及雌性大鼠(F344/N)皆疑似有 致癌性，而雌性小鼠(B6C3F1)則有些有致癌性。

囓齒動物實驗顯示孔雀綠會危害肝臟，引起貧血 和甲狀腺異常^(1,9)。聯合國糧農組織/世界衛生組 織聯合食品添加物專家委員會(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA)及國 際癌症研究機構(International Agency for Research on Cancer, IARC)等國際食品安全組織，均未評 估孔雀綠之食用安全問題。歐盟(European Union) 將孔雀綠歸類為R22 (微毒物質，吸入吞食或通 過皮膚吸收引起有限健康損害)，以危險符號Xn 標識。歐盟、美國、加拿大、日本、泰國、新加 坡及我國皆禁用孔雀綠於供人食用之養殖水產品

(10)。然而孔雀綠的價格低廉，抗真菌、細菌及原 蟲的效果良好且易取得，目前仍經常被違法使用 於養殖水產業⁽¹¹⁾。我國於94年驗出部分國內養殖 石斑違法使用孔雀綠，引起政府機關及社會大眾 之重視；本局於95年抽驗香魚等水產品進行孔雀 綠及其代謝產物殘留量調查，結果仍有石斑及蒲 燒鰻等共4件檢出還原型孔雀綠。96年抽驗石斑魚 等64件水產品進行孔雀綠及其代謝產物殘留量調

前　言

孔 雀 綠 ( m a l a c h i t e g r e e n , M G , 4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-methyl]-N,N- dimethyl-aniline)是一種三苯甲烷類染料，其由 苯甲醛(benzaldehyde)和N,N-dimethylaniline縮合 後，在濃鹽酸混和下氧化而得⁽¹⁾，具有綠色金屬 光澤，易溶於水，亦易溶於甲醇及乙醇。孔雀綠 一般作為合成染料，用於絲綢、羊毛、黃麻、皮 革、棉及紙等不同物料⁽²⁾。由於其抗菌效果佳、

價格便宜且易取得，因此早在1930年代起即被廣 泛使用於水產養殖生產過程，預防魚卵感染病菌 或治療魚體的寄生蟲、真菌及原蟲等疾病^(3,4)。孔 雀綠容易被魚組織吸收，並快速代謝為無色的還 原型孔雀綠(leucomalachite green, LMG)，且會長 時間留在魚組織的脂肪內，因此魚體中主要殘留 物為還原型孔雀綠^(5-8)。

依據美國National Toxicology Program (NTP) 以老鼠進行毒性及致癌性試驗顯示，malachite green chloride對雌性大鼠(F344/N)疑似有致癌性，

但對雌性小鼠(B6C3F1)則無證據，另代謝產物還

市售水產品中動物用藥孔雀綠及其代謝物殘留量調查

李瑋埕　謝綺文　周珮如　古遠丰　蘇淑珠　施養志

摘　要

97年度市售水產品檢體委由各縣市(政府)衛生局進行採樣，包括虱目魚12件、吳郭魚 10件、鱸魚8件、石斑魚6件、甲魚5件、鰻魚4件、午仔魚3件、魩仔魚3件、土虱1件、尼 羅紅魚1件及黃花魚1件等54件。依據行政院衛生署97.01.11署授食字第0971800008號公告方 法以液相層析串聯質譜法(liquid chromatography tandem mass spectrometry)利用電灑游離法 (electron spray ionization)配合多重反應偵測模式(multiple reaction monitoring)進行動物用藥孔 雀綠及其代謝物之殘留量調查。結果甲魚4件、石斑魚1件及午仔魚1件與規定不符，不合格 率11.1%。不符規定之檢體皆發布不合格食品資訊，並由地方衛生權責機關依法處辦。

關鍵詞：孔雀綠、還原型孔雀綠、動物用藥、水產品、液相層析串聯質譜法

查，結果均未檢出⁽¹²⁾。為瞭解市售水產品是否仍 有孔雀綠及還原型孔雀綠之不法殘留問題，97年 度持續抽驗虱目魚等54件水產品，進行孔雀綠及 還原型孔雀綠之殘留量調查。

材料與方法

民國97年5月至8月由各縣市(政府)衛生局以 稽查方式至其轄區之大賣場、傳統市場、超級市 場等商號取得檢體，包括虱目魚12件、吳郭魚10 件、鱸魚8件、石斑魚6件、甲魚5件、鰻魚4件、

午仔魚3件、魩仔魚3件、土虱1件、尼羅紅魚1件 及黃花魚1件，共計54件(表一)。檢體取得後置 於-20℃保存，直至分析時取出使用。

二、化學藥品

孔雀綠對照用標準品(malachite green oxalate salt)，購自Fluka Chemie GmbH (Steinheim,

G e r m a n y ) ； 還 原 型 孔 雀 綠 對 照 用 標 準 品 (leucomalachite green)，購自Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany)。孔雀綠同位素內部 標準品(MG-d5 picrate)及還原型孔雀綠同位素內 部標準品(LMG-d₅)皆購自WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH (Berlin, Germany)。醋酸、

乙腈、正己烷及乙酸乙酯為HPLC級，購自Merck Ltd. (Darmstadt, Germany)。甲醇為HPLC級，購自 Riedel-deHaën (Seelze, Germany)。N,N,N’,N’- tetramethyl-1,4-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD)為試藥特級，購自Sigma-Aldrich Inc. (St.

Louis, MO, U.S.A.）。甲酸、檸檬酸(citric acid monohydrate)、磷酸氫二鈉、醋酸銨、25%氨水及 鹽酸為 Nacalai Tesque Inc. (Kyoto, Japan)之特級產 品。固相萃取匣Oasis MCX (3 mL, 60 mg)為Waters Corporation (Milford, MA, U.S.A.)之產品。0.45 μm濾膜(Nylon, 47 mm, MNY 4547)為ChremTech (Great Tide Instrument Co., Taiwan)之產品。0.22 μm濾膜(Nylon)為Micron Separations Inc. (Western Borough, MA, U.S.A.)之產品。

三、儀器設備與裝置

㈠均質攪拌機(Homogenizer)

Nihonseiki Kaisha Ltd., Tokyo, Japan

㈡離心機(Centrifuge)

Labofuge 400, Heraeus Instruments GmbH, Hanau, Germany

㈢旋渦混合器(Vortex mixer)

Type 37600 Mixer, Thermolyne Corporation, IO, U.S.A.

㈣振盪式水浴鍋(Shaker bath) YIHDER, BT-350, Taiwan

㈤超音波振盪器(Ultrasonic vibrator) Elma, transonic TP 690, Germany

㈥固相真空萃取裝置(Solid phase extraction vacuum manifolds)

Supelco, Bellefonte, PA, U.S.A.

㈦去離子水製造機(Milli-Q SP reagent water system)

M÷lipore Ltd., Bedford, MA, U.S.A.

表一、各縣市衛生局送驗檢體件數

衛生局 檢體件數

基隆市 3

台北市 2

桃園縣 1

新竹縣 3

台中市 5

台中縣 4

南投縣 1

雲林縣 1

嘉義市 4

嘉義縣 3

台南市 4

台南縣 4

高雄市 3

高雄縣 4

屏東縣 4

宜蘭縣 1

花蓮縣 4

台東縣 3

總　計 54

㈧液相層析串聯質譜儀(Liquid chromatograph/

tandem mass spectrometer, LC/MS/MS) 為Waters Corporation (Milford, MA, U.S.A.) 之產品，Alliance^®2695液相層析系統連結 Micromass Quattro Premier質譜儀，離子源採 電灑游離法偵測正電離子，並以MassLynx軟 體操控及進行數據處理

㈨層析管柱

Symmetry® C8 (3.5 µm，內徑2.1 mm × 10 cm), Waters Corporation (Milford, MA, U.S.A.)。

四、檢驗方法

㈠試劑之調製

1. McIlvaines緩衝溶液(pH 2.6)

⑴0.1 M檸檬酸溶液

稱取檸檬酸10.5 g，以去離子水溶解使成 500 mL。

⑵0.2 M磷酸氫二鈉溶液

稱取磷酸氫二鈉14.2 g，以去離子水溶解 使成500 mL。

⑶ 取0.1 M檸檬酸溶液445.5 mL及0.2 M磷 酸氫二鈉溶液54.5 mL，混合均勻。

2. 沖提液

取25%氨水溶液5 mL與乙酸乙酯50 mL混合 均勻，再加入甲醇45 mL，混合均勻，臨 用時調製。

3. TMPD (1 mg/mL)溶液

稱取TMPD 50 mg，以甲醇溶解並定容至50 mL。

4. 移動相溶液

⑴ 移動相溶液A (5 mM 醋酸銨溶液，pH 4.5)

稱取醋酸銨0.39 g溶於去離子水900 mL，

以醋酸調整pH為4.5 ± 0.1，再加去離子 水使成1000 mL，以0.45 µm濾膜過濾，

取濾液供作移動相溶液A。

⑵移動相溶液B (含0.1%甲酸之乙腈溶液) 量取甲酸1 mL，加入1000 mL之乙腈 中，為移動相溶液B。

㈡標準溶液之調製

稱取相當於含孔雀綠及還原型孔雀綠對照 用標準品各約5 mg，精確稱定，以乙腈溶 解並定容至50 mL，作為標準原液，避光置 於-20℃貯存備用。使用時取適量標準原液混 合後，以乙腈稀釋至100 ng/mL，作為混合 標準原液，再以50%乙腈溶液稀釋至0.5~5.0 ng/mL，作為標準溶液，臨用時調製。

㈢內部標準溶液之調製

取相當於含孔雀綠及還原型孔雀綠各約5 mg 之同位素內部標準品，精確稱定，分別以 乙腈溶解並定容至50 mL，作為內部標準原 液，避光於-20℃貯存備用。使用時取適量 內部標準原液混合後，以乙腈稀釋至100 ng/

mL，作為內部標準溶液。

㈣檢液之調製

依據行政院衛生署公告「食品中動物用藥殘 留量檢驗方法－孔雀綠及其代謝物之檢驗」

(13)，進行檢體前處理，檢驗流程見圖一。

1. 萃取

將檢體細切後以均質機均質，取均質檢體 約1 g，精確稱定，置於50 mL塑膠離心管 中，加入內部標準溶液50 µL、TMPD溶液 50 µL及McIlvaines緩衝溶液：乙腈(1 : 1, v/v)混合溶液10 mL，旋渦混合45秒後，於 2,400 rpm離心20分鐘。收集上澄液，離心 管中之沉澱物再以McIlvaines 緩衝溶液：

乙腈(1 : 1, v/v)混合溶液5 mL重複操作一 次。合併上澄液，供淨化用。

2. 淨化

取上述供淨化用之溶液，注入預先以甲醇2 mL、去離子水2 mL及McIlvaines緩衝溶液 2 mL潤洗之Oasis MCX固相萃取匣，再加 入0.1 N 鹽酸溶液2 mL，以去離子水2.5 mL 清洗兩次，棄流出液。固相萃取匣以真空 抽乾後，依序再以50%甲醇溶液3 mL及正 己烷3 mL 清洗，真空抽氣乾燥5分鐘。以 沖提液5 mL沖提萃取匣，收集沖提液，於 50℃以氮氣吹乾，殘留物加入50%乙腈溶 液1.0 mL，以旋渦混合器振盪溶解，經0.22

1 g

1. TMPD 50 ML

2. McIlvaines (1:1, v/v) 10 mL

3. 45

2400 rpm, 20 1.

2. McIlvaines

(1:1, v/v) 5 mL

Oasis MCX

( MacIlvaines 2 mL )

1. 0.1 N 2 mL

2. 2.5 mL 2

3.

4. 50% 3 mL

5. 3 mL

6. 5

5 mL

圖一、孔雀綠及其代謝物殘留之檢驗方法流程

µm濾膜過濾後，供作檢液。

五、 高效液相層析串聯質譜儀測定條件分 析

㈠液相層析條件 1. 層析管柱

Symmetry® C8，粒徑3.5 µm，內徑2.0 mm

× 長度5 cm。

2. 移動相溶液

由5 mM醋酸銨溶液(pH 4.5)及含0.1%甲酸 之乙腈溶液組成，流速為0.3 mL/min，兩 移動相溶液之組成分及時間梯度見表二。

㈡串聯質譜測定條件

離 子 源 採 電 灑 法 離 子 化 ( e l e c t r o n s p r a y ionization, ESI)偵測正離子，搭配多重反應 偵測模式(multiple reaction monitoring, MRM) 進行偵測。質譜儀之分析參數條件見表三，

MRM偵測之離子見表四。

六、品質管制分析

每批次檢體(少於15個樣品)於分析孔雀綠及 其代謝物殘留時，分別作空白分析、添加孔雀綠 及還原型孔雀綠1.0 ppb於魚肉樣品之添加回收分 析及重複分析。

結果與討論

表二、移動相組成及梯度時間表 Time

(min) Flow rate (mL/min)

Mob÷e phase*

A (%) B (%)

0.0 0.3 50 50

1.0 0.3 0 100

4.0 0.3 0 100

4.5 0.3 50 50

8.0 0.3 50 50

*A: 5 mM ammonium acetate solutçn

B: acetonitr÷e containing 0.1% formic acid solutçn

表三、質譜儀之分析參數條件

Parameter Conditçn Cap÷lary voltage 2.5 kV

Extractor 3.0 V

Source temperature 100°C Desolvatçn temperature 400°C Desolvatçn gas flow rate 500 L/hr

Cone gas flow 100 L/hr

LM resolutçn 1 15.0

HM resolutçn 1 15.0

Ion energy 1 1.0

Entrance 2.0

Exit 2.0

LM resolutçn 2 15.0

HM resolutçn 2 15.0

Ion energy 2 1.0

Multiplier 650 V

表四、以質譜儀偵測之碰撞能量、離子片段、比率及分析參數

Compound Precursor çn

(m/z) Product çns

(m/z) Relative intensity (%)

Dwell Time (sec)

Cone voltage (V)

Collisçn energy (eV)

MG 329 208^a 100 0.1 60 35

329 313 ^b 36.4 (3.3) ^c 0.1 60 37

LMG 331 239 ^a 100 0.1 40 30

331 316 ^b 38.4 (1.4) ^c 0.1 40 24

MG-d₅ 334 318 0.1 40 38

LMG-d₅ 336 239 0.1 55 30

aMRM transitçn used for quantificatçn

bMRM transitçn used for confirmatçn

cValue in parenthesis is the coefficient of variatçn (CV, %), N=3

每批次水產品(少於15個樣品)檢驗孔雀綠及 其代謝物殘留時，至少作一次空白分析、重複分 析及添加回收分析。本調查之空白分析值均在方 法檢出限量(method detection limit, MDL) 0.5 ppm 以下(圖二)。本調查以魚肉檢體添加1.0 ppb之孔 雀綠及還原型孔雀綠進行重複分析及添加回收分 析，添加回收率之管制上值(upper control limit, UCL)及管制下值(lower control limit, LCL)分別訂 為120%及60%，重複分析之變異係數之管制上值 訂為30%。所得之孔雀綠及還原型孔雀綠添加回 收率分別為83.5~110.0%及77.3~115.9%，均在管 制上下值之內(圖三)；而重複分析之孔雀綠及還 原型孔雀綠變異係數分別為0.3~8.8%及0~6.7%，

均低於管制上值(圖四)。依據聯合國糧農組織/世 界衛生組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization, FAO/

WHO)之國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission) ⁽¹⁴⁾之規定，食品中動物用藥殘留值若 介於1~10 ppb，回收率應介於60~120%，變異係 數(coefficient of variatçn, CV)應小於30%，本調查 之品質管制分析結果皆可符合Codex之要求。

二、 市售水產品中孔雀綠及還原型孔雀綠 殘留之檢測

97年度檢測市售虱目魚12件、吳郭魚10件、

鱸魚8件、石斑魚6件、甲魚5件、鰻魚4件、午仔 魚3件、魩仔魚3件、土虱1件、尼羅紅魚1件及黃 花魚1件等54件，結果(表五)甲魚2件同時檢出孔 雀綠(4.86及5.00 ppb)及還原型孔雀綠(9.60及49.70 ppb)，甲魚1件檢出孔雀綠1.85 ppb，另甲魚、石 班魚及午仔魚各1件分別檢出還原型孔雀綠2.92、

3.90及0.77 ppb。其中以甲魚不合格率80%，最為

MDL

MDL

圖二、 孔雀綠及還原型孔雀綠之空白分析管制圖 MDL：Method detection limit

UCL

LCL

UCL

LCL

圖三、孔雀綠及還原型孔雀綠之添加樣品管制圖 UCL：Upper control limit

LCL：Lower control limit

UCL

UCL

圖四、孔雀綠及還原型孔雀綠之重複分析管制圖 UCL：Upper control limit

嚴重。不符規定之檢體本局皆公布不合格食品資 訊，並由地方衛生局移請農政單位卓辦。本調查 顯示仍有業者違法使用孔雀綠，有關單位仍須加 強對業者之管理及輔導，同時應持續對市售產品 進行監測。

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6.

7.

表五、97年度市售水產品中孔雀綠及其代謝物殘留檢測結果

Category No. of non-compliant

samples Ratç of non-compliance (%) MG/LMG (ppb)

M÷kfish 0 (12)^a 0 N.D. ^b

T÷apia 0 (10) 0 N.D.

Perch 0 (8) 0 N.D.

Grouper 1 (6) 16.7 LMG 2.92

Soft-shell turtle 4 (5) 80.0

MG 4.86, LMG 9.60 MG 5.00, LMG 49.70

MG 1.85 LMG 3.90

Ell 0 (4) 0 N.D.

Lake candidus dace 1 (3) 33.3 LMG 0.77

Fish larva 0 (3) 0 N.D.

Catfish 0 (1) 0 N.D.

Red t÷apia 0 (1) 0 N.D.

Yellow croaker 0 (1) 0 N.D.

Total 6 (54) 11.1

a Value in parenthesis is total number of samples

b Not detected

Survey on Malachite Green and Leucomalachite Green Residues in Marketed Aquatic Products

WEI-CHENG LI, CHI-WEN HSIEH, PEI-JU CHOU, YUAN-FENG KU, SHU-CHU SU AND DANIEL YANG-CHIH SHIH

Food Chemistry Divisçn

ABSTRACT

A survey of malachite green (MG) and leucomalachite green (LMG) residues in marketed aquatic products was conducted in 2008. Fifty-four samples, including 12 milkfish, 10 tilapia, 8 perch, 6 grouper, 5 soft-shell turtle, 4 ell, 3 lake candidus dace, 3 fish larva, 1 catfish, 1 red tilapia and 1 yellow croaker, were collected from retails by local health officials. The samples were analyzed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) with electrospray ionization and multiple reactions monitoring, which was promulgated by the Department of Health (DOH) of Taiwan. The MG and LMG residues in 4 soft-shell turtle, 1 perch and 1 lake candidus dace samples were detected, which violated the regulation. The rate of violation was 11.1%. The result of this survey has been posted and the local governments have enforced the penalties to the suppliers who provided the violative samples.

Key words: malachite green, leucomalachite green, aquatic product, LC/MS/MS Roybal, J. E., Peenning, A. P., Munns, R. K.,

Holland, D. C., Hurlbut, J. A. and Long, A.

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