石斑魚腫瘤壞死因子基因選殖與其在魚苗發展階段基因表現及功能性研究

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行政院國家科學委員會補助專題研究計畫

^{□成果報告}

■期中進度報告

（計畫名稱）

石斑魚腫瘤壞死因子基因選殖與其在魚苗發展階段基因表現及功能性研究

計畫類別： ■ 個別型計畫□ 整合型計畫計畫編號：NSC 97－2313－B－006－002－MY3 執行期間： 97 年08 月01 日至100 年07 月31 日

計畫主持人：林翰佑助理教授共同主持人：

計畫參與人員：林青丘，林士傑，吳思穎，吳采郿，王雅貞等人成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、

列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢

□涉及專利或其他智慧財產權，□一年■二年後可公開查詢執行單位：國立成功大學生物科技研究所

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附件一

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（一）計畫中文摘要

在魚類，當病原微生物侵入體內時，如同哺乳動物一樣，會引起免疫反應對抗入侵的微生物。使得微生物對魚體的傷害降到最低，而疫苗的使用則是應用這個免疫特性，達到預防動物疾病的目。魚類免疫系統，也如同哺乳動物一般可以跟據其功能，分為先天免疫反應(非特異性免疫系統)，後天免疫反應(特異性的免疫系統) 和一些由免疫細胞所分泌的分子，這些小分子稱為細胞激素，在免疫反應上扮演著訊息傳導的角色。不同的細胞激素具有不同的功能，能夠刺激不同的免疫細胞或是進行不同的免疫功能調控。故在病原入侵，或是疫苗注射後免疫反應中扮演重要的角色。在哺乳動物中TNF-α 為引起發炎反應最初且最重要的分子。雖然在有些魚種TNF-α 基因已被成功的基因選殖，但在大部份的魚種則尚未被探討。石斑魚為台灣重要的養殖魚種之一，養殖的瓶頸主要在魚苗階段的疾病感染問題。為了控制魚病以及發展合適的疫苗，有必要對其免疫系統作深入的探討，其中細胞激素也為一重要的研究課題。本研究擬以點帶石斑魚作為實驗動物，藉由尋找以及選殖石斑魚中TNF 基因，進而去分析魚苗在不同成長階段TNF- α之表現情形，希望透過本研究，能夠提供未來石斑魚疫苗設計，應用以及疾病控制的探討。

關鍵字: 石斑魚(Epinephelus coioides); 腫瘤壞死因子-α (TNF-α); 細胞激素; 魚苗

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Abstract

The immune system of fish divides innate immunity (non-specific immune response), adaptive immunity (specific immune response) and some small molecules that are secreted by different immunocyte called cytokines and act as signaling molecules within immune system. Different kinds of cytokines possess distinct functions and can stimulate varied immunocytes or regulate immune responses; they play an important role in vaccination and against pathogen aggression.Innate immune response is the first line to defense pathogens invasion by inducing inflammatory reaction, numerous of mediators and immunocytes are intervening in it, the initiated cytokine expression is TNF-α and it is the most important molecule in inflammation reaction, subsequently,other cytokines will be expressed, such as interleukin 1β and interleukin-6 in mammals. TNF-αgene was found in some of bony fish; however, the gene of most fish is still unknown.

Orangespotted grouper (Epinephelus coioides) is an important farmed fish in Taiwan; there is a paramount crux of raring fish is pathogen infection, especially it occurs in larvae stage. It is an important thing to understand the immunity maturation of grouper and develop an appropriate method to anti-infection and control diseases. In this study, we cloned the TNF-α gene of orange-spotted grouper, subsequently, analyzing the expression of it in ontogeny of fish. Furthermore, we expect the result of this study can support a vaccine design or application and control diseases in Epinephelus coioides in the future.

Keywords: red-spotted grouper (Epinephelus coioides); TNF-α .

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(二)報告內容進度簡要報告

點帶石斑魚(Epinephelus coioides 俗稱青斑)由於肉質鮮美，為台灣重要養殖經濟魚種之一。但在養殖的過程中常因為疾病的侵襲而造成損失，魚類疾病的預防有賴於成熟且具功能的免疫系統。但由於魚類為體外受精的動物，故其魚苗發育時期皆暴露於環境之中，比胎生動物更容易受到疾病病原的侵襲。故魚苗時期免疫系統的發育，功能性的探討，以及與病原間的關係遂成為研究預防魚苗疾病及防疫上的重要課題。腫瘤壞死因子(TNF-α)為引起發炎反應最初且最重要的因子之一，主要為誘發炎症反應以及刺激免疫系胞活動所需。故可視為魚隻免疫系統接受外來病原刺激後初期免疫反應的指標物質。在許多魚種中TNF-α基因已被成功的選殖。但根據目前已知物種的TNF-α基因比對結果，發現魚類與哺乳動物的TNF-α基因相似度僅達20-50 %，魚類間的TNF-α相似度則依親源的遠近有著

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60-90 %之相似度。這個存在的岐異性也造成相關研究的困難。本研究的目地在於選殖點帶石斑魚TNF-α之基因，及分析這個基因在魚苗胚胎時的表現情形。第一年的主要工作為選殖出石斑魚體內TNF-α。我們成功的利用純化後的類巨噬細胞球Macrophage like cell (MLC)，作為本研究的實驗材料，在經由LPS刺激後萃取其total RNA後，經由以不同魚種已發表之TNF-α基因序列中取其高保留區段設計之退化性引子，經由PCR增幅後選殖到兩個點帶石斑魚TNF-α之基因片段，再經由此一基因片段進行5＇端及3＇端之RACE反應後取得cDNA全長之序列。

基因全長則為以石斑魚肌肉組織所萃取之genomic DNA作為模版，依cDNA序列設計之專一性序列引子反應而成。基因全長為1516與1715 bp，兩個基因皆為4個 exon及3個intron。推定可以產生254及241個胺基酸，分子量約為27 kDa及26 kDa。推定的胺基酸中包括TNF family signature, transmembrane domain,TACE 酵素切位及兩個與結構構型相關的cystein 胺基酸。由胺基酸組成序列上證明其為TNF-α分子。但其中兩個基因間的相似度僅39%，比一般鮭鳟魚科的90%相去甚遠。與其他科學文獻比對，發現此二TNF分子 (TNF 1 及 TNF 2)分屬於不同的群別，目前自同一魚種中分離到不同群別的TNF-α分子僅見於黑鮪魚，但目前為止尚不知道這兩個TNF之基因，其功能是否存在異同的現象，值得進一步的探討。

我們進一步依據點帶石斑TNF-α基因設計特異性引子。以自石斑魚苗養殖場採集到的魚苗樣本所萃取之mRNA 進行定量反轉錄real time PCR。結果發現魚苗體內 TNF-α之基因之mRNA量自第19日後產量有明顯上升的跡象。至於TNF-α基因上升的原因究竟是由於環境的刺激或是魚苗生長發育的需要，則需要進一步的研究來證明，將在來年研究中作進一步的探討。希望這些研究的成果有助於提供石斑魚魚苗時期相關cytokine表現以及免疫系統的發生更進一步的資訊，以作為魚類魚苗階段使用疫苗或是免疫促進劑以防治疾病時的參考。

4初步研究成果 (第二年)

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0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03

0 2 4 8 12 16 24

Hours after inductio

TNF1 TNF2

* * *

* *

圖一, 石斑魚在周邊白血球在LPS刺激下不同時間TNF 1, TNF 2 及 IL-1ß mRNA 表現的情形，結果顯示 TNF 2 分子對免疫刺激的反應較為迅速。

圖二，TNF 1 及 TNF 2 在免疫刺激前後石斑魚 mRNA分布的情形，結果顯示 TNF 1 2 在未刺激時免疫器官有基礎表現。但受到刺激後 TNF 2 在大多數的器官多有表現。

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圖三，跟據氨基酸序列所預測的TNF 1, TNF 2 結構發現其結構在 receptor binding 的結構略有不同 TNF 1 紅色, TNF 2 藍色。

參考文獻

1 林惠珊。(2008)。石斑魚(Epinephelus coioides) 腫瘤壞死因子-α (TNF- α) 基因之

選殖其在魚苗段的表現分析。國立成功大學生物科技研究所碩士論文。__