The Role of Conjugated Linoleic Acid in LPS-Induced Inflammatory Response in Mouse RAW264.7 Macrophages

中山醫學大學營養科學研究所碩士論文

Master Thesis

Graduate Institute of Nutritional Science Chung Shan Medical University

共軛亞麻油酸在脂多醣體誘發 RAW264.7 巨噬細胞 發炎反應相關事件之影響

The Role of Conjugated Linoleic Acid in LPS-Induced Inflammatory Response in Mouse RAW264.7 Macrophages

指導教授: 劉凱莉 博士（Kai-Li Liu, Ph. D.）

研究生: 鄭文玲（Wen-Ling Cheng）

中華民國九十二年七月

July, 2003

綱目

頁

綱目………..……2

圖次………...…….4

表.……….5

縮寫表………..6

摘要……….…….8

前言……….11

文獻回顧 一、Conjugated linoleic acid（CLA）及其生理效用 （一）Conjugated linoleic acid...……….12

（二）CLA 與癌症………...13

（三）CLA 與發炎免疫調節………...14

（四）CLA 調節發炎反應與 CLA 活化 peroxisome proliferator-activated receptors γ 間之關係...………...16

二、巨噬細胞與免疫 （一）巨噬細胞（macrophage）及其功能………...19

（二）Lipopolysaccharide（LPS）與巨噬細胞………..19

（三）發炎與巨噬細胞………...20

Ⅰ、Nitric oxide 及 iNOS...………….………...20

Ⅱ、COX-2 及 PGE

2

………...21

Ⅲ、NF-κB………...23

（四）文獻回顧--附圖………...25

試驗材料………...……….…...30

試驗方法....………...……….……….34

統計分析....……….40

結 果....……….41

討 論....……….45

結 論....……….49

結果圖表....……….50

圖……....……….51

表……....……….63

參考文獻....……….64

圖次

文獻回顧

圖一、CLA isomer ( cis9, trans11；cis10, trans12 CLA )及 LA 之結構式……26

圖二、AA 之代謝途徑及產物..…………...……….26

圖三、LA 及 CLA 之代謝途徑及產物...………....……….27

圖四、CLA 與 PPAR 之分子作用機轉..………....……….27

圖五、PPAR 之轉錄抑制作用.……….28

圖六、LPS 結構……….28

圖七、NO 合成途徑及功能.……….29

圖八、NF-κB 活化途徑.………..29

結 果

圖一、在RAW264.7 細胞添加 CLA 及 LPS 對細胞存活率之影響………51

圖二、CLA 添加混合進入 RAW264.7 細胞中脂肪酸所佔之比率..………52

圖三、CLA 添加混合進入 RAW264.7 細胞中脂肪酸對 LA 及 AA 之影響...……53

圖四、在RAW264.7 細胞添加 CLA 對 LPS 誘發 NO 釋放之影響………54

圖五、在RAW264.7 細胞添加 CLA 對 LPS 誘發 PGE

2

釋放之影響.………55

圖六、在RAW264.7 細胞添加 CLA 對 LPS 誘發 iNOS 蛋白質表現之影響.……56

圖七、在RAW264.7 細胞添加 CLA 對 LPS 誘發 COX-2 蛋白質表現之影響..…57

圖八、在RAW264.7 細胞添加 CLA 對 LPS 誘發 iNOS mRNA 表現之影響……58

圖九、在RAW264.7 細胞添加 CLA 對 LPS 誘發 COX-2 mRNA 表現之影響.…59 圖十、CLA 添加對 LPS 誘發 RAW264.7 細胞 IκB-α-P 表現之影響...……60

圖十一、CLA 添加對 LPS 誘發 RAW264.7 細胞核內 NF-κB/ p65 表現之影響....61

圖十二、CLA 添加對 LPS 誘發 RAW264.7 細胞 NF-κB 與 DNA 結合之影響...62

表次

表一、NF-κB DNA binding site 序列……….63 表二、RT-PCR Primer 相關資料....………...63 表三、GC 升溫程式...………....63

縮寫表

AA Arachidonic acid

AP-1 Activation protein-1 BHA Butylated hydroxyanisole CBP CREB-binding protein CLA Conjugated linoleic acid

COX Cyclooxygenase

DAB 3,3'-diaminobenzodine DMBA 2,4-dimethyl benzoic acid

DMSO Dimethylsulfoxide

EMSA Electromobility Shift Assay eNOS〔NOSⅢ〕 Endothelial Nitric Oxide Synthase EtBr Ethidium bromide FBS Fetal bovine serum

HRP Horseradish peroxidase ICAM Intercellular adhesion molecule IFNγ Interferonγ

IKK IκB kinase

IL Interleukin

iNOS〔NOSⅡ〕 Inducible Nitric Oxide Synthase IκBs Inhibitor κB proteins

LA Linoleic acid

LBP Lipopolysaccharide-binding protein LPS Lipopolysaccharide

LT Leukotriene MNU Methyl nitrosurea

MTT （3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide NF-κB Nuclear factorκB

nNOS〔NOSⅠ〕 nerunal Nitric Oxide Synthase

NO Nitric oxide

PG Prostaglandin PGE

2

Prostaglandin E

2

15-d-PGJ

2

15-deoxy-Delta (12,14) prostaglandin J

2

dnPPARγ Dominant-negative PPARγ

PPARγ Peroxisome proliferator-activated receptorγ PPRE PPAR response element

RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction SRC-1 Steroid receptor coactivator-1

TCA Trichloroacetic acid TNF-α Tumor necrosis factor-α TX Thromoboxanes VCAM Vascular cell adhesion molecule

摘要

共軛亞麻油酸（Conjugate linoleic acid, CLA）是一群 18 個碳，兩個共軛 雙鍵的多元不飽和脂肪酸（Octadecadienoic acid）的同質異構物，目前已知 CLA 同質異構物中，其共軛雙鍵位置可在△7, 9, △9, 11, △11, 13, △8, 10 和△10, 12 上，以順式（cis）或反式（trans）方式排列。飲食中牛羊等反芻 類動物肉類（2.7-5.6 mg CLA/g fat）及乳製品（2.9-7.1mg CLA/g fat）含較高 CLA，為 CLA 主要來源（review in Chin et al., 1992）。動物實驗發現，CLA 除具有抗癌功效外，它亦可影響身體組成，比如減少脂肪組織

（antiadipogenic），增加肌肉組織；減少動脈脂肪層破損（aortic fatty streak lesion）而調節粥狀硬化形成；調控血糖衡定及影響免疫力功能等。雖然探討 CLA 對疾病預防及治療的文獻很多，但至今對探討 CLA 與發炎反應的相關 文獻卻不多。由於發炎反應與許多疾病發生及病程有關，故本實驗模擬生理 感染及發炎反應之實驗模式，評估CLA 對 RAW264.7 小鼠巨噬細胞經細菌內 毒素lipopolysaccharides（LPS）刺激所誘發產生及發炎反應的相關事件之影 響，並探討相關可能的調控機轉。結果顯示，20-200μM CLA 及 0.1-1μg/ml LPS 處理下，均不影響 RAW264.7 巨噬細胞存活率。而 CLA 處理呈劑量關係 的有效抑制LPS 誘發 inducible nitric oxide synthase（iNOS）和 cyclooxygenase-2

（COX-2）蛋白質及 mRNA 的表現，也抑制 nitric oxide（NO）和 prostglandin E

2

（PGE

2

）的生成，尤以200μM CLA 之抑制效果最顯著（p<0.05）。結果也 顯示200μM CLA 可顯著減緩 LPS 誘發 IκBα磷酸化並抑制 NF-κB 與 DNA 結合。綜合以上結果可知LPS 活化 RAW264.7 小鼠巨噬細胞所誘發之 iNOS、

COX-2 蛋白質和 mRNA 及其催化生成之事件可被 CLA 有效抑制，且此抑制 作用可能與CLA 降低 LPS 誘發 NF-κB 活化，進而影響 NF-κB 之轉錄活性

有關。

關鍵詞：共軛亞麻油酸、RAW264.7 巨噬細胞、脂多醣體、一氧化氮、發炎 反應

Conjugated linoleic acid（CLA）refers to a group of positional and geometric isomers of octadecadienoic acid with conjugated dienoic double bond in △7, 9, △9, 11, △11, 13, △8, 10 and △10, 12 positions, in either cis and/or trans configurations.

Dietary CLA is primarily found in dairy products and beef fat. CLA has been shown to play an important role in chemopreventation, immune function as well as blood sugar and lipid homeostasis. However, the role of CLA on the inflammatory reaction is still not clear so far. In order to explore the anti-inflammatory ability of CLA, exogenous CLA（0, 20, 100 or 200μM）was added with 0.1 or 1μg/ml medium bacteria endotoxin lipopolysaccharides（LPS）in mouse RAW264.7 macrophage cell. The 3-

（4,5-dimetyl-thiazo-2-yl）-2,5-diphenyl-tetrazoleum assay showed that exogenous CLA addition did not influence cell viability. CLA, however dose-dependently

diminished LPS-induced inducible nitric oxide synthase（iNOS）and cyclooxygenase-2

（COX-2） expression and subsequent nitric oxide（NO）and prostaglandin E

2

（PGE

2

） synthesis.respectively. Furthermore, 200μM CLA significantly decreased LPS-induced IκB-αphosphorylation, p65 translocation to nucleus and NF-κB nuclear

protein –DNA binding activity. In conclusion, CLA significantly inhibits LPS- induced inflammatory events in RAW264.7 macrophages, and this inhibitory activity of CLA may be through its modulating NF-κB transcriptional activity.

Key words : CLA, RAW264.7 macrophages, LPS, inflammation, NO, NF-κB.

Summary

前言

發炎是身體抵抗外來微生物侵略時所誘發的防禦反應之一（Hawiger, 2001），

而慢性發炎反應與許多慢性疾病（例如：癌症，動脈粥狀硬化，氣喘及風濕性關 節炎）的病程發展有密切關係（reviewed in：Holtzman et al., 2002；O’Byrne and Dalgleis, 2001；de Boer et al., 2000；Weinberg, 2000）。在動物實驗模式中，CLA 在

疾病預防及治療上的功效早已被廣為研究討論，但相對而言，探討CLA 與發炎反

應關係之參考研究資料發表卻不多。本研究目的即評估CLA 對發炎反應之影響，

及其相關可能之調控機轉。

文獻回顧

一、Conjugated linoleic acid（CLA）及其生理效用

（一）Conjugated linoleic acid

CLA 是於 1961 年在不飽和脂肪酸經細菌氫化過程中之中間產物中首度被發 現（Bartlet et al., 1961）。CLA 代表一群 18 個碳在位置及幾何圖形上帶兩個共軛雙 鍵之多元不飽和脂肪酸（octadcadenoic acid）的同質異構物（圖一）。目前已知CLA 同質異構物中，共軛雙鍵位置可在△7, 9, △9, 11, △11, 13, △8, 10 和 △10, 12 上，以順式（cis）或反式（trans）方式排列（Lavillonniere et al., 1998；Yurawecz et al., 1998）。飲食中的肉類為CLA 主要來源，其中牛羊等反芻類動物肉類（2.7-5.6 mg CLA/g fat）及乳製品（2.9-7.1mg CLA/g fat）含較高 CLA，但是海鮮類及植物油則 僅有極少量CLA（0.1-0.7 mg CLA/g fat）。除火雞肉外，其他家禽及豬肉中 CLA

含量也都不高。食物烹調過程中若經高溫處理，可增加食物中CLA 含量，例如：

乳製品之巴斯德滅菌法（Pasteurization）及肉類油煎炸（reviewd in Chin et al., 1992）。目前CLA 除可由反芻動物內細菌自行合成外，亦可用人工方法以 linoleate 當作受質利用氫化（hydrogenation）或鹼性催化反應（alkalie-catalyzed reaction）

來合成（Banni, 2002；Belury et al., 2002

^b

）。

經過去數年的研究，CLA 的許多生理功能已漸漸被證實且日漸受到重視，目 前為止，CLA 被發現有抗癌（anticarcinogenic）、影響身體組成、減少脂肪組織

（antiadipogenic）、增加肌肉組織、減少動脈脂肪層破損（aortic fatty streak lesion）、

調控血糖衡定及影響免疫力等特性（reviewed in MacDonald, 2000）。此外，CLA 亦 可影響骨質形成（bone formation）、脂質代謝（lipid metabolism）及調節基因表現

（gene expression）（reviewed in Belury, 2002

^b

），但本文獻回顧將著重於討論CLA

在抗癌及調節免疫與發炎反應上所扮演的角色。

（二）CLA 與癌症

CLA 主要因為具有抗癌功效（Chemoprevention）而被廣泛研究。動物實驗證 實，CLA 可抑制大鼠乳腺癌（Ip et al., 1991）、結腸癌（Liew et al., 1995）及小鼠 前胃癌（Ha et al., 1990）、皮膚癌（Ha et al., 1987；Belury et al., 1996）和前列腺癌

（Cesano et al., 1998），但機轉未知。

實驗顯示CLA（1.5﹪/ body weight）可達最大抑制腫瘤效果，且 CLA（0.25

﹪/ body weight）有最大降低乳腺脂質過氧化的作用。且不像其他抗氧化劑，例如 butylated hydroxyanisole（BHA），它可誘發 glutathione-S-transferase 活性（Ohkawa et al., 1979），由此可知可能有其他比抗氧化機轉更合理的詮釋CLA 抗癌症的機轉。

飲食中 CLA 不但可抑制 methyl nitrosurea（MNU）所誘發之大鼠乳腺癌，亦 可降低由間接致癌原2,4-dimethyl benzoic aicd（DMBA）誘發之乳腺癌發生率及腫 瘤數目（IP et al., 1996, 1995, 1994, 1991）。於直接致癌原MNU 誘發乳腺癌模式下，

CLA 可直接調節影響標的器官，乳腺（IP et al., 1994），而在DMBA 誘發乳腺癌模 式下發現，CLA 並不會影響 DMBA 與乳腺上皮細胞 DNA 結合，且也不會改變 glutathione-S-transferase 和 UDP-glucuronosyl transferase 活性（屬 phaseⅡ解毒酵素）

（IP et al., 1991）。由此可知，CLA 抑制乳腺腫瘤的機轉並非透過調節解毒酵素影 響DMBA 活化所造成。已有研究指出 CLA 具有誘發乳腺癌細胞凋亡（apoptosis）

的作用，可能與其降低具抑制細胞凋亡之訊號傳遞蛋白bcl-2 有關（Ip et al., 2000）。 Ip 等人（2001）亦證實 CLA 能透過減少調節 cell cycle 的 cyclin D1 及 cyclin A 蛋 白質之生成，達到減少大鼠乳腺上皮癌細胞之增生（proliferation）。Hubbard 等人 也於 2003 年發表飲食中添加 CLA 異構物（c9, t11 或 t10, c12）可顯著減少雌性 BALB/cAnN 小鼠乳腺腫瘤的轉移，且其轉移至肺中腫瘤的體積遠小於飲食中沒有 CLA 的對照組。

CLA 除了抑制乳腺癌發生率外，也有文獻證實飲食中添加 CLA 可調節皮膚癌 發生過程中的起始期（initiation）（Ha et al., 1990）及促進期（promotion）的相關 反應。CLA 因可能扮演著調節自由基所誘發的氧化作用（free radical-induce oxidation）、致癌物質代謝、或致癌物質與 DNA 聚合物（carcinogen-DNA adduct）

的形成，故於多步驟小鼠皮膚癌模式中，CLA 被認為是 anti-initiator （Ha et al., 1987；reviewed in Belury et al., 1995）。另外，Belury 等人（1996）研究亦證實於多 步驟誘發小鼠皮膚癌形成（muti-stage skin carcinogenesis）之促進期中餵食小鼠 CLA 飲食，可有效抑制小鼠皮膚上皮組織papilloma 和 carcinoma 之生成數目及發生率。

相較於亞麻油酸（Linoleic acid, LA）或花生四醯酸（Arachidonic Acid, AA）處理 組，添加CLA 於 HEL-30 鼠類皮膚角質細胞株（murine keratinocyte）可顯著降低 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate 誘發之 ornithine decarboxylase 活性及前列腺素 E

2

（Prostaglandin E

2

, PGE

2

）合成（Liu＆Belury, 1997）。此作用可能是由於 CLA 改變細胞內LA 及 AA 量，減少細胞中 AA 代謝產物 eicosanoids 形成，使 CLA 抑 制tumor promoter 所誘發之 PGE

2

生成，而有抑制癌細胞生成之功效（Kavanaugh et al., 1999）。綜合以上可知，雖然 CLA 扮演抑制癌症形成的角色是令人信服的，但 其抗癌機轉仍需更進一步探討。

（三）CLA 與發炎免疫調節

過去文獻大多著重於 CLA 之抗癌功效，相對而言，探討 CLA 對免疫系 統及身體發炎反應之影響等相關文獻較少。細胞中LA 可透過 desaturation 及 elongation 反應生成 AA，AA 再經由 cyclooxygenase（COX）及 lipooxygenase 分別 生成二系列的prostaglandins （PGs 如 PGE

2

, PGF

2

α）與thromboxanes （TX 如 TXA

2

, TXB

2

）及四系列的leukotrienes（LT 如 LTB

4

），已知這些催化eicosanoids 生成之酵素及所生成之eicosanoids 和身體免疫發炎反應有關（圖二）。研究指出在 HEL-30 細胞中添加的 CLA 可取代磷脂質上的 AA（Liu et al., 1998）。小鼠餵食不

同濃度CLA（0-1.5﹪），發現CLA 可取代肝細胞中磷脂質上的 AA precursor- LA，

且呈濃度劑量關係（Moya et al., 1999

^a

；Belury et al., 1997

^a

）。Banni 等人 2001 年指 出CLA 合成 conjugated arachidonic acid 過程中所需的酵素會與利用 LA 合成 AA

所需的酵素相互競爭（圖三），這可能是餵食小鼠CLA 飲食可降低細胞總脂質中

AA 的生成之原因之一（Banni et al., 1999；Belury et al., 1997

^a

）。於人類隱靜脈內 皮細胞（human saphenous vein endothelial cells）中添加 CLA isomers，結果證實 cis9, trans11 CLA 可減少 AA 及 eicosanoid 生成，而 trans10, cis12 CLA 也同樣具降低 eicosanoid 生成功效，但 trans10, cis12 CLA 若濃度高於 100μM 反而刺激 PGs 生 成（Urquhart et al., 2002），但機轉未知。Whigham 等人（2002）發表，天竺鼠餵 食CLA 飲食可抑制身體各組織 eicosanoids 生成，另外 Bulgarella 等人（2001）研 究證實CLA 可降低公羊精囊微粒体（ram seminal vesicle microsomes）中

prostaglandin H synthase 活性，進而調節 PGs 生成。其他研究也指出，於大鼠飲食 中添加CLA 可降低 LTB

4

釋放及降低血清中PGE

2

量（Sugano et al., 1998）。若於成 長中大鼠餵食butter fat 與 CLA，則可促進骨頭形成（bone formation），且可減少 骨質中PGE

2

生成，作者推論CLA 或許可經由減少 PGE

2

生成而有抗發炎反應之效 果（Watkins et al., 2000）。除骨組織外，Park 等人（2001）的研究也發現 CLA 可 減少結腸黏膜細胞中AA 及其代謝物 PGE

2

和TXB

2

的濃度，並誘發結腸黏膜細胞

之程式凋亡，故推論CLA 可能有助於改善結腸發炎之症狀。此外，於天竺鼠呼吸

道模式（guinea pig tracheae）下，CLA 可降低 antigen 誘發之 histamin 及 PGE

2

分 泌（Whigham et al., 2001），此可推論 CLA 可調節過敏反應。Pariza 等人（2000）

研究指出CLA 可調節 Tumor necrosis factor（TNF-α）、Interleukin-1（IL-1）及其 他cytokines 分泌，因而可影響骨骼肌細胞的異化分解及免疫功能。Yang 等人（2003）

證實，於BALB/c 小鼠模式下，相較於餵食玉米油控制組，CLA 可減少 LPS 誘發 產生之TNF-α及 IL-4 生成；而 Yu 等人（2002）在 RAW264.7 巨噬細胞中加入 CLA，

發現CLA 亦可抑制 LPS 誘發 TNF-α之生成。Iwakiri 等人（2002）在相同模式中，

指出CLA 可顯著抑制 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞中 COX-2 和 inducible nitric oxide synthase（iNOS）mRNA 表現，進而降低 nitric oxide （NO）和 PGE

2

的分泌

（P＜0.05）。但添加 AA 雖具抑制 iNOS mRNA 及 NO 之生成，卻不具抑制 PGE

2

生成之效果，反而促進PGE

2

生成達62﹪。最近更有研究發現 CLA 透過 peroxisome proliferator-activated receptor γ（PPARγ）的活化，調控基因轉錄（Belury et al., 2002）。Yu 等人（2002）則證實，CLA 除可抑制 IFNγ誘發 RAW264.7 巨噬細胞 下，iNOS 及 COX-2 表現及 NO 及 PGE

2

生成，也可抑制IFNγ誘發之發炎反應相 關基因表現，如TNF-α、IL-1β及 IL-6 等。將 peroxisome proliferator responsive element（PPRE）-reporter plasmid 及 dominant-negative PPARγ（dnPPARγ）殖入 COS1 細胞中，發現隨著 dnPPARγplasmid 濃度增加，PPRE-reporter 活性隨之減弱 且呈劑量關係，且於dnPPARγplasmid 轉殖之 RAW264.7 巨噬細胞中，也發現 CLA isomers 並無法抑制 iNOS promotor reporter 活性。綜合以上結果推論 CLA 抑制前 發炎反應相關基因之表現，有一部分可能是透過CLA 活化 PPARγpathway。但詳 細調控作用，仍需更進一步探討。

（四）CLA 調節發炎反應與 CLA 活化 PPARγ間之關係

PPARs 屬於 nuclear hormone receptor 家族成員（Issemann et al., 1990），亦是 轉錄因子（transcription factors）之一（Mangelsdorf, 1995）。PPARs 與其他 nuclear hormone receptor 結構相似，含 A，B，C，D，E，F 等六個功能性 domains，其中 C domain 為 DNA 結合區（DNA binding domain，DBD），E domain 為活化體結合 區（ligand binding domain，LBD），DBD 和 LBD 兩者協同調控訊息傳遞，活化基 因轉錄作用。被ligand 活化的 PPAR 會與 retinoid X receptor 形成異雙元體

（heterodimers），而後轉移到核內與標的基因 promotor region 上的特定 DNA 序列

（PPRE）結合，進而調控 PPAR response genes 的表現（Lemberger et al., 1996）（圖 四）。

經基因選殖發現PPARs 大致可分為α、β（在各不同物種中又名 NUC-I，δ 或FAAR）、γ三個次家族（Dreyer et al., 1992；Kliewer et al., 1994；Sher et al., 1993），但本文獻回顧將以PPARγ為討論對象。PPARγ依 N 端結構不同又可分為 PPARγ1 和 PPARγ2（較 PPARγ1 多 30 個氨基酸）（Tontonoz et al., 1994），近 年來Fajas 等人（1998）也於人類組織中發現第三個 PPARγ isoform，稱為 PPAR γ3。研究證實，15-deoxy-Delta(12,14) prostaglandin J

2

（15-d-PGJ

2

）、結構類似 clofibrate 的抗糖尿病藥物 thiazolidinediones、非固醇類抗發炎藥物以及花生四醯 酸、亞麻油酸等長鏈脂肪酸都是PPARγ的 ligands（Kliewer et al., 1997）。Belury 等人（2002

^a

）利用scintillation proximity assay（SPA）證實在 in vitro 狀況下 CLA 會與PPARγ的 ligand rosiglitazone 競爭與 PPARγ結合。除此之外，在 CV-1 細胞 中共同轉殖PPARγ及 PPRE-luciferase reporter construct 後，添加 CLA 可增加 luciferase 表現，且呈劑量關係。由以上實驗可知 CLA 為 PPARγligand，因此可透 過PPARγ的活化而影響 PPARγresponse genes 的表現。但若以Δ6 desaturse 抑制 劑SC-26,196 預處理，結果 CLA 誘發 PPARγresponse genes 表現之能力顯著受到 抑制（Belury et al., 2002

^a

）。此一證據也顯示：除CLA 本身外，CLA 代謝物亦可 活化PPARγ，進而誘發 PPAR response 基因表現。除了可影響 PPARγ對 gene 表 現之調控外，Evans 等人（2000）也證實 CLA 除可誘發 PPARγ相關基因表現外，

也可以增加PPARγ表現量。

PPARγ一般認為在調節脂肪組織分化（differentiation）、脂肪酸代謝及葡萄糖 恆定上扮演著極重要的角色（reviewed in Tontonoz et al., 1994, 1995；Burn et al., 1996），然而近年亦有研究開始探討 PPARγ在調控免疫發炎反應上所扮演之角 色。Ricote 等人（1999）發表，PPARγ可負向調控前發炎反應基因如: iNOS、IL-1 β、TNF-α及 IL-6。由於這些基因的 promoter 區域已被證實擁有 nuclear factor - κB（NF-κB）、activation protein-1（AP-1）或/及 STAT transcription factor 的 binding site，故學者推論 PPARγ抑制發炎反應基因之活化可能是由於 PPARγ與 NF-κB，

AP-1，或/及 STAT 競爭這些發炎反應相關基因 promoter 上之 binding site 所致（圖 五）。而另一方面，Ricote 等人（1999）亦證實 PPARγ也可能是因影響巨噬細胞 分化及活化而調控發炎反應。在U937 巨噬細胞中加入 LPS 可誘發 COX-2 表現，

而15 d-PGJ

2

則可透過活化PPARγ而抑制 LPS 活化 NF-κB，進而抑制 COX-2 表 現（Inoue et al., 2000）。Phorbol myristyl acetate（PMA）處理下可誘發人類 monocytes 分泌cytokines，而 PPARγligands 則可顯著抑制 PMA 誘發前發炎反應相關

cytokines，如 TNF-α及 IL-6 之分泌（Jiang et al., 1998）。在RAW264.7 巨噬細胞轉 殖murine PPARγplasmid 後，以 BRL49653 活化 PPARγ並以 IFN-γ或 LPS 誘發 iNOS 基因，結果顯示 PPARγ大量表現及被活化可顯著抑制 iNOS 基因表現。因 此抑制作用需PPARγ與 CREB-binding protein （CBP）和 steroid receptor

coactivator-1（SRC-1）協同作用，若以單一氨基酸突變（single amino acid mutation）

PPARγ或使 CBP 發生 deletion，使得 PPARγ無法與 CBP 及 SRC-1 相互作用下，

則IFN-γ或 LPS 誘發 iNOS 基因表現之現象將不受 BRL49653 抑制（Li et al., 2000）。除免疫細胞外，於人類胎盤（placental）、羊膜（amnion）、絨毛膜蛻膜

（choriodecidual）組織細胞中加入 15d-PGJ

2

處理，也可以顯著降低由LPS 所誘發 之IL-6、IL-8 及 TNF-α之分泌，且 gel shift assay 證實此抑制作用與 15d-PGJ

2

抑 制NF-κB 與 DNA 結合有關（Lappas et al., 2002）。綜合以上可知在調控發炎反應 中雖然PPARγ非唯一因素，但仍扮演重要角色。

二、巨噬細胞與免疫

（一）巨噬細胞（macrophages）及其功能

身體內具吞噬功能之單核細胞由骨髓中的前單核血球（promonocytes）分化而 成，血液中的單核球也會定居於組織中，再分化為成熟的巨噬細胞。巨噬細胞不 像多核細胞，它們的生命長，並且具有粗內質網和粒線體。一般而言多形核球主 要提供了對化膿菌的防禦，而巨噬細胞則以吞噬容易寄生在宿主細胞內的細菌、

病毒及原生動物為主。巨噬細胞在免疫及發炎反應上扮演了一個很重要的角色，

它可正向或負向調控宿主的防禦機制，包括辨識及消滅病原微生物（Qureshi et al., 1999）或分泌製造一些前發炎（pro-inflammotory）物質，如 IL-1、IL-6、TNF-α、

PGE

2

和NO

2

等。事實上在正常生理條件下，巨噬細胞的功能是受到限制的，只有 在受到特定刺激如細菌内毒素lipopolysaccharide（LPS）或 cytokines（如 IFN-γ）

刺激下，才會被活化（Schwacha et al., 2003）。

（二）Lipopolysaccharides（LPS）與巨噬細胞

脂多醣體（LPS）屬於細菌內毒素 endotoxin 的一種，為革蘭氏陰性菌外膜的 構成要素（Rietschel et al., 1994）（圖六）。LPS 在真核細胞生理影響上，被歸類於 具細菌毒性的因子。研究發現LPS 組成上最具潛在刺激特性的部分為 Lipid A，無 論天然或人工合成的Lipid A 都可誘發致命的宿主發炎反應（Glauser et al., 1994）。

Lipopolysaccharide-binding protein（LBP）為一 65kD 血漿醣蛋白，在人體中濃 度約3-10μg/ml 但若處於急性反應下，LBP 會大量增加（Guha et al., 2001），將可 加速催化LPS 在體內的移動，此複合體如與另一血漿蛋白 CD14 結合，將可活化 免疫細胞（Hailman et al., 1994, 1996），進而誘發相關免疫反應。巨噬細胞受到LPS 刺激後會分泌許多發炎相關物質，包括TNF-α，IL-1，IL-6、NO 和 PGE

2

，導致

人體發生敗血症（sepsis）、敗血性休克（sepsis shock）及全身性發炎等症狀（systemic inflammatory response syndrome）（Guha et al., 2001）。

（三）發炎與巨噬細胞

發炎是身體對抗感染源與抗原入侵，或身體受傷時所引發的免疫反應之一。

不少研究已證實，在慢性發炎及感染之細胞組織，會有一系列cytokines（IL-1、

TNF-α、IFN-γ）（Hanada et al., 2002）、酵素及訊息蛋白（signal protein）生成。

iNOS 及 COX-2 分別可催化 NO 及 PGs 大量生成，已知也與發炎反應有關，例如，

NO 及 PGs 等 biological mediators 不正常大量產生時，不但造成組織發炎及併發敗 血性休克，也使得慢性傳染病（例如：肺結核）及自體免疫性疾病（例如：風濕 性關節炎）等疾病症狀更加惡化（reviewed in Sautebin, 2000；Nussler and Billiar, 1993）。

Ⅰ、Nitric oxide 及 iNOS

在哺乳動物細胞中油，L-arginine 可經由 nitric oxide synthase（NOS）催化生 成L-citrulline 及 NO（Palmer et al., 1988）（圖七）。NO 為自由基的一種，半衰期 短（Chi et al., 2003），分子量小（30Da）（Nathan and Xie, 1994

^a

），可穿過細胞膜，

因此可作為生化訊息之傳遞物質，已知它調控了許多重要之生理功能。

在許多組織，NO 可藉由 NOS 催化生成，經由基因分子複製（molecular cloning）

及定序分析（sequential analysis），至今已發現三種NOS isomers:分別是 nerunal NOS

〔nNOS，又名 NOSⅠ〕、endothelial NOS〔eNOS，又名 NOSⅢ〕及 inducible NOS

〔iNOS，又名 NOSⅡ〕。nNOS 為一個 155 kDa 的蛋白質，存在於神經、骨骼肌 纖維及肺上皮組織中（Bredt and Snyder, 1990），eNOS 分子量則是 140 kDa，存在 於內皮組織，及一些神經和心肌細胞中（Pollockm et al., 1991）。nNOS 及 eNOS 均 於組織細胞中持續表現，因此又稱為constitutive NOS。這兩種 constitutive NOS 均

屬於Ca

²⁺

/calmodulin-dependent isoform，因此其活性受到 Ca

²⁺

濃度的調控。在Ca 離子濃度催動劑（agonist）刺激下，constitutive NOS 受到活化，進而催化腦神經 細胞及內皮細胞持續有限度生合成NO，除扮演訊息傳遞物質（neurotransmitter）

外，它也參與血管舒張、調整血壓（Nathan and Xie, 1994

^b

）、抑制血小板凝集等作 用（reviewed in Lorsbach et al., 1993；reviewed in Moncada et al., 1991）。

第三種NOS isomer 則是 iNOS，它的分子量約為 130 kDa，屬於 Ca

²⁺

-independent NOS。在 resting state 下，iNOS 並不會表現，iNOS 存在巨噬細胞、單 核球、neutrophils、內皮細胞及平滑肌細胞中，在 LPS 或 cytokines 誘發下，將產 生大量NO（reviewed in Knowles and Moncada, 1994）。iNOS 催化所生成之 NO 生 成量相較constitutive NOS 可高達 1000 倍以上（Robbins et al., 2000）。在如此高濃 度NO 條件下，將會促進 endothelial cell adhesion molecules 表現、

leukocyte-endothelial 交互作用及活化 leukocyte 滲透入發炎組織而導致發炎反應發 生（reviewed in Larlux et al., 2001）。NO 亦為發炎反應的 marker 之一（Vural et al., 2003），報告顯示過多 NO 除直接對於血管內皮組織造成傷害外（Cobb et al., 1996），大量 NO 也會與超氧陰離子反應形成 peroxynitrite，peroxynitrite 具有相當 毒性，可誘發低密度脂蛋白氧化，也可促進血小板凝集，因而增加動脈粥狀硬化 之形成機會（Rodomski and Salas, 1995）。過量的NO 亦被證實可使得 DNA 鹼基發 生脫氨基作用（nitrosative deamination）、破壞 DNA 序列片段、產生氧化壓力，而 促進癌症生成（Graziewicz et al., 1996；Sporn and Roberts, 1986）。

根據過去文獻資料歸納，在體內持續表現之nNOS 及 eNOS 所生成之少量 NO 與發炎反應及癌症生成較不相關，然而iNOS 所催化生成之大量 NO 則在組織受傷 或物質感染產生之發炎反應，及其他與發炎相關疾病或癌症形成上扮演著重要角 色（reviewed in Sautebin, 2000）。

Ⅱ、COX-2 及 PGE

2

AA 可經由 COX 催化代謝為 PGs、Prostacyclin 及 TXA2（Smith et al., 1991）。

目前已知COX 有兩個同功異構物，分別為 COX-1 及 COX-2。COX-1 可持續少量

表現於各組織細胞中，催化PGs 的生成來調節許多重要生理功能，如

gastroprotection 及 vascular homeostasis（O’Neill et al., 1993）。COX-2 則為一 early gene（Wadleigh et al., 2000），平時在各組織中表現量相當少，但在組織受傷或受到 內毒素、mitogens、荷爾蒙及其他 ligands 刺激時（Herschman, 1996），COX-2 表現 將會明顯受到誘發，使得PGs 大量生成，進而促進發炎反應發生（reviewed in Pairet et al., 1996）。已知monocytes（Hla and Neilson, 1992）、巨噬細胞（D’Acquisto et al., 1997）及 colon adenocarcinoma cell lines（Kojima et al., 2000）若給予 LPS 處理，

均可誘發COX-2 表現及 PGs 大量生成。PGs 除了被證實是促發炎媒介劑

（proinflammation meditor）外，亦有降低免疫功能，抑制細胞程式凋亡及促進細 胞增生，增加侵略惡質性癌細胞數目等特性（Boolbol et al., 1996）。因此若能抑制 COX-2 酵素活性，使得 PGs 生成減少，將有助於預防癌症形成及減輕發炎症狀

（Steinbach et al., 2000）。

在iNOS 基因 promotor region 已被證實有 AP-1, NFκB,

CCAAT/enhancer-binding protein, activating transcription factor/c-AMP-response element binding protein 和 STAT 等基因轉錄因子之 binding sites（Lowenstein et al., 1993），但在 LPS 刺激巨噬細胞誘發之 iNOS 基因表現實驗模式中，NF-κB 是必 要的轉錄因子（Xie et al., 1994）。至於 COX-2 基因，也已發現其 promotor region 之5’端有兩個可與 NF-κB 的結合區域（κB sites），將 NF-κB 抑制劑 N-α -p-tosyl-L-lysine chloromethylketone 處理下，將使得 LPS 誘發 PGE

2

之生成受到抑 制，證實活化NF-κB 在 COX-2 基因表現上亦有著關鍵角色（D’ Acquisto et al., 1997）。綜合以上結果可知，iNOS 及 COX-2 兩個基因 promoter region 上的 NF-κ B response element（κB site），可透過與 NF-κB 結合而開啟基因轉錄。

Ⅲ、NF-κB

NF-κB 是一個廣泛存在各組織細胞的轉錄因子，在免疫及發炎相關基因表現 上扮演著重要的角色（Siebenlist et al., 1994；Baeuerle and Henkel, 1994）。屬於NF- κB/Rel 家族成員的蛋白質，包含有：p50，p52，p65（Rel A），Rel B，c-Rel 等五 大類。在真核細胞之細胞質中NF-κB/Rel 家族成員蛋白質以 homodimer 或

heterodimer 互相結合在一起（reviewed in Sen and Baltimore, 1986）。細胞在不受刺 激的狀態下，NF-κB dimer 會與抑制蛋白 inhibitorκB protein（IκBs, IκB-α，I κB-β，IκB-γ和 bcl-3）（Verma et al., 1995）結合，因而呈不活化狀態且存留在 細胞質中。但當細胞受到NF-κB inducers（如 proinflammatory cytokines [ IL-1β, TNF-α, IL-11, IL-17 ]，LPS，phorbol esters，platelet-activating factor，oxidants [ hydrogen peroxide ]，UV，ionizing radiation 及 virus）作用時，則會活化 IκB kinase

（IKK），使 IκB-α上 Ser-32 及 Ser-36 發生磷酸化，並被 ubiquitin-dependent 26S proteosome 分解，因而活化 NF-κB dimer（Baeuerle and Baltimore D, 1996）。被活 化的NF-κB 將快速從細胞質轉移到細胞核內，並與 NF-κB response gene promoter region 上 NF-κB response element（κB site）結合，開啟基因 mRNA 轉錄（Mercurio et al., 1997）（圖八）。抑制NF-κB pathway 上任何一個蛋白質或酵素都可能影響到 NF-κB 活化，而影響 NF-κB 轉錄活性。Castrillo 等人（2000）指出，在 LPS 誘 發RAW264.7 巨噬細胞模式下，15d-PGJ

2

可透過抑制IKK 活性而影響 IκB-α磷酸 化達83﹪，相對於 IκB-α，IκB-β被 IKK 磷酸化降解的機會則小很多。此外 Castrillo 等人（2000）也提出 15d-PGJ

2

也會增加核內IκB-α與 IκB-β蛋白質的 表現，若此蛋白質存在細胞核中則可抑制NF-κB 與 NF-κB response element 結合

（Velaseco et al., 1997；Thompson et al., 1995）。Straus 等人（2000）也提出 15d-PGJ

2

可透過修飾IKK 及 NF-κB response element 上 cysteine residues（p65 [ cysteine 38]

及p50 [cysteine 62]）而抑制 NF-κB 與 DNA-binding 的能力，但 15d-PGJ

2

並不影 響NF-κB 進入細胞核內。由此可知，15d-PGJ

2

經由抑制LPS 活化 NF-κB 及 NF-

κB 與κB site 之結合，而抑制 NF-κB 轉錄活性並減少 NF-κB-相關基因表現。

過去研究顯示，在不同組織細胞中，受到NF-κB 調控之 NF-κB response genes 包括了proinflammatory cytokines（IL-1β, TNF-α, IL-2, IL-11, IL-17, granulocyte macrophage colony stimulating factor），chemokines（IL-8, RANTES, MIP-1α, MCP-2），enzymes（iNOS, COX-2），vascular cell adhesion molecules-1（VCAM-1），

Intercellular adhesion molecules-1（ICAM-1），E-selectin 及 receptors（IL-2 receptor）

等，證實這些NF-κB response genes 之生理功能，可知 NF-κB 途徑與身體免疫系 統及許多疾病之發展有密切關係（reviewed in Barnes, 1997）。持續及完全抑制 NF- κB 活化可直接影響細胞程式凋亡、不正常免疫細胞發展、及生長遲緩。然而不正

常過度NF-κB 活化也常見於與疾病發炎反應相關之疾病，例如：自體免疫性關節

炎、氣喘、敗血性休克、肺纖維化、腎絲球腎炎、粥狀動脈硬化及後天免疫不全 症（reviewed in Chin et al., 1999）。

過去文獻證實，CLA 可抑制 LPS 刺激巨噬細胞誘發之 iNOS 及 COX-2 mRNA 表現進而降低發炎反應發生（Iwakiri et al., 2002）。本研究將以此研究模式，探討 CLA 調控發炎反應之機轉與 NF-κB pathway 調控基因表現間之相互關係。

文獻回顧-附圖

(圖一) CLA isomer ( cis9, trans11；cis10, trans12 CLA )及 LA 分子結構 （Belury, 2002

^b

. Annu. Rev. Nutr. 22:505-531）

（圖二）AA 之代謝途徑及產物

（Belury, 2002

^b

. Annu. Rev. Nutr. 22:505-531）

（圖三）LA 及 CLA 之代謝途徑及產物

（Belury, 2002

^b

. Annu. Rev. Nutr. 22:505-531）

（圖四）CLA 與 PPAR 之分子作用機轉

（Belury, 2002

^b

. Annu. Rev. Nutr. 22:505-531）

（圖五）PPAR 之轉錄抑制作用

（Chinetti et al., 2000. Inflamm. Res. 49:497-505）

（圖六）LPS 結構

（圖八）NF-κB 活化途徑

（Burhard Haefner. 2002. DDT. 7:653-663）

（圖七）NO 合成途徑及功能

(Robbins et al., 1997. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29:857-860)

試驗材料

一、 試驗材料 實驗細胞：

RAW264.7 巨噬細胞購自新竹食品工業研究所菌種中心，實驗所用細胞 繼代數維持在2-7 代之間

化學試劑：

（一）細胞培養：

1.購自美國 Gibco Laboratory RPMI 1640

Trypsin-EDTA Penicillin Streptomycin

2.購自美國 Sigma Chemical Company Lipopolysaccharride（LPS）

Sodium bicarbonate（NaHCO

3

）

Sodium phosphate（Na

2

HPO

4

．7H

2

O）

3.購自 NuChek Prop（Elysian, MN）

Conjugated linoleic acid（CLA）

（二）細胞存活率分析 1.購自美國 Sigma

3-〔4,5-Dimethylthiazol-2-yl〕-2, 5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）

（三）Nitrite 分析

1.購自美國 sigma

N-（1-naphyl）ethylenediamine dihydiochloride Sulfanilamide

（四）PGE

2

分析 1.購自 Cayman

PGE

2

EIA Kit

（五）Western blot

1.購自美國 Sigma Chemical Company β-Mercaptoethanol

Sodium dodecyl sulfate（SDS）

Trizma Base（Tris）

3,3-diaminobenzine（DAB）

2.購自美國 BioRad Laboratory

30﹪Acrylamide/ 0.8﹪N, N-methylene-bis-acrylamide Bromophenol blue

Glycine

3.購自美國 Pharmacia Biotech Ammonium persulfate

N,N,N,N-Tetramethylethylene-diamine（TEMED）

ECL

4.購自美國 Chemicon

Goat anti-rabbit IgG Horseradish peroxidase-conjugate antibody 5.購自美國 BD Biosciences

iNOS antibody（mouse IgG2a）

p65 antibody（mouse IgG1）

6.購自 Cayman

COX-2 antibody（rabbit）

7.購自 Santa Cruz

IκB-α antibody（rabbit）

8.購自 Cell Signaling

IκBα-P antibody（rabbit）

9.購自美國 Fisher Scientific Company Isobutanol

10.購自美國 Millpore

Polyvinylidene difluoride（PVDF）membrane 11.購自德國 Merck Chemical Company

Methanol

Sodium chloride（NaCl）

（六）RT-PCR

1.購自 Merck Chloroform Isopropanol Absolute ethanol 2.購自 Promega

RNase inhibitor dATP

dCTP dGTP dTTP

Reverse transcriptase

3.購自真興 Taq

4.購自生工公司

Primer（iNOS, COX-2）

（七）EMSA

1.購自 PIERCE

LightShift

^TM

Chemiluminescent EMSA Kit

NE-PER

^TM

Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent Kit

試驗方法

細胞培養與保存

一、RAW264.7 巨噬細胞株之培養

RAW264.7 巨噬細胞培養於含 10﹪fetal bovine serum（FBS）及 1﹪

penicillin/streptomycin (100U/ ml)之 RPMI 1640 培養液中，置於 37℃含有 5﹪CO

2

之培養箱中培養。本研究各式實驗皆以種植8x10

⁵

個RAW264.7 巨噬細胞於直徑 3.5 公分之培養盤中，至細胞八分滿盤時依實驗給予不同處理。

二、RAW264.7 巨噬細胞株之解凍與保存

將RAW264.7 巨噬細胞由液態氮桶中取出，放入 37℃水浴解凍，隨後將解凍 的細胞移至含37℃培養液之離心管中，以 300 g 離心 5 分鐘，去除上清液，再加 入培養液混合細胞並移到10 cm 培養盤中，置於 37℃含有 5﹪CO

2

之培養箱中培養。

RAW264.7 巨噬細胞以 0.05﹪胰蛋白( Trypsin/ EDTA )，分離細胞後，以血球 計數器計算細胞數目，取1x10

⁶

個細胞加入含有10﹪dimethylsulfoxide ( DMSO )之 RPMI 1640 培養液均勻混合後移至抗凍管中，並置於-80℃低溫冷凍，隔日再移到 液態氮桶中儲存。

試驗分析

一、細胞存活率分析

本分析係參考 Denizot and Lang (1986) 發表的方法來測量 RAW264.7 巨噬細 胞在各種處理條件下之存活率。MTT

（3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide）為一種淡黃色水溶

性的tetrazolium salt，在活細胞中，可藉由粒線體中的 succinated-tetrazolium reductase system (Slater et al., 1963) 將 MTT 的 tetrazolium ring 轉變為非水溶性呈藍 紫色的formazan。由測量細胞培養液中 formazan 產量即可快速精確判斷細胞存活 率及細胞增生情形。

於直徑3.5 公分之培養盤中植入 8x10

⁵

個RAW264.7 巨噬細胞，待細胞生長至 八分滿時加入0, 20, 100 或 200μM CLA (methanol 當作 vehicle control)及 LPS (0 和 1μg/ml )培養 18 小時，倒掉培養液，以 PBS 沖洗 2-3 次，加入 0.5 mg/ml MTT 但 不含phenol red 之 RPMI 1640 細胞培養液，置於 37℃含有 5﹪CO

2

之培養箱中3 小時，去除培養液，加入1 ml isopropanol 將 formazan 溶解，利用 ELISA 讀取儀以 波長570 nm 測定其吸光值。

二、脂肪酸組成分析

於 10 公分培養盤中種植 2×10

⁶

個RAW264.7 巨噬細胞，生長至八分滿後，先 以0, 20, 100 或 200μM CLA 處理 12 小時後，移除培養液，以 PBS 清洗細胞 2-3 次，加入500μl PBS，小心刮下細胞，隨後加入 2ml (methanol：benzene 混合溶液

（4：1, v/v），震盪均勻，緩慢旋轉加入 200μl acetyl cholride，以 parafilm 封住管 口，於90℃乾浴 1 小時，冷卻 10 分鐘，加入 5 ml 6﹪K

2

CO

3

中和，3000 rpm 離心 10 分鐘，取出上層液，氮氣吹乾，最後加入 50μl hexane 將乾燥物溶解，取 3μl 注入Gas Chromatograph（GC, G-300, HITACHI），GC 設定條件如（表三）進行分 析。將實驗樣本之滯留時間點與標準品之滯留時間點相比較即可比對出脂肪酸的 種類，且依波鋒面積大小亦可得知其相對濃度。

三、Nitrite 分析

RAW264.7 巨噬細胞以 CLA 和 LPS 處理 18 小時後，測量細胞培養液中 NO

2

濃度。簡述如下：取出100μl 不含 phenol red 之 RPMI 1640 細胞培養液，加入 96

孔盤中，先以ELISA 讀取儀（microplate reader, VERSA max），於波長 540 nm 下 讀取背景吸光值(A1)，加入等量的 Griess Reagent ( 1﹪sulfanilamide, 5﹪H

3

PO4, 0.1

﹪N-(1-naphthl)-ethylenediamine)，避光反應 10 分鐘後，再以相同波長讀取第二次 吸光值(A2)。

先計算出：Nitrite 吸光值=(A2-A1)

Nitrite 吸光值再內差入以 NaNO

2

標準品所得之濃度標準曲線，即可得知細胞培養 液中NO

2

濃度，單位以μM 表示之。

四、Prostaglandin E

2

（PGE

2

）之測定

於直徑3.5 公分之培養盤中植入 8x10

⁵

個RAW264.7 巨噬細胞，八分滿時加入 0, 20, 100 或 200μM CLA （methanol 當作 vehicle control）及 LPS (0 和 1μg/ml ) 培養12 小時，取出部份胞外培養液，稀釋 500 倍，利用 PGE

2

EIA Kit 測量培養液 中PGE

2

濃度。方法如下：分次將50μl 稀釋之培養液、acetylcholinesterase- linked PGE

2

（Tracer）及 PGE

2

單株抗體加入預塗有goat polyclonal anti-mouse IgG 的 96 孔盤中，先於4℃下暗反應 18 小時，以 wash buffer 沖洗 5-6 次，最後加入 200μl Ellman's reagent（含 acetylthiocholine, 5,5;-dithio-bis-（2-nitrobenzoic acid）），室溫 下震盪1 小時，即可以波長 412 nm 測定其吸光值，將吸光值內差入以 PGE

2

EIA 標準品所得之濃度標準曲線，即可得知培養液中PGE

2

濃度（pg/ml）。

五、Western Blot

RAW264.7 巨噬細胞在不同濃度 CLA ( 0, 20, 100 和 200μM )及 LPS (0, 0.1 和 1μg/ml )處理 18 小時後取樣供 iNOS 蛋白質分析，至於 COX-2 蛋白質分析樣本的 處理則是先以CLA 預處理 12 小時後，再加入 LPS 刺激 6 小時後取樣。倒掉培養 液後，細胞以PBS 沖洗 2-3 次，加入 200μl 之 RIPA lysis buffer ( PBS, 含 1﹪NP-40, 0.1﹪SDS, 0.5﹪sodium deoxycholate )，取下細胞，超音波震盪( Micro Ultrasonic Cell

disrupter, KONTES )後，以 15000g 於 4℃離心 20 分鐘，吸取上清液即為蛋白質液，

存於-20℃備用。

蛋白質定量分析採用 Lowry ( 1951 ) 之方法。實驗樣品以等量之 10﹪

trichloroacetic acid ( TCA )進行蛋白質沉澱 30 分鐘，以 10000g 離心 10 分鐘，去除 上清液，加入300μl NaOH 將蛋白質沉澱物溶解後，取 100μl 混合液進行蛋白質 分析。100μl 混合液依次加入 200μl 二次水與 100μl 反應溶液(25﹪Na

2

CO

3

, 2﹪

Na-K-tartarate, 1﹪CuSO

4

=8:1:1, v/v/v)，室溫靜置 10 分鐘，加入 1 ml Folin reagent ( Folin reagent：H

2

O=1:19.5, Wako Chemical Co., Osaka, Japan )，37℃水浴 20 分鐘，

冷卻至室溫後，利用分光光度計( U2000, Hitachi, Tokyo, Japan ) 以 660 nm 測定吸 光值。利用牛血清白蛋白 ( bovine serum albumin, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA ) 為標準品求得蛋白質標準濃度曲線，並依此計算樣品蛋白質濃度。

蛋白質校正後，與sample buffer 混合調成所需濃度，於 95℃下乾浴 5 分鐘，

取適量蛋白質（iNOS：75μg, COX-2：15μg）注入 7.5﹪polyacrylamide gels 樣品 槽中，以100 伏特電壓進行電泳分析。轉印膜 ( polyvinylidene difluride membrane, PVDF )，先浸潤於 99.5﹪酒精中 3 分鐘，再與膠片、濾紙及海綿一起浸泡於 transfer buffer ( 80﹪25 mM Tris/ 192 mM glycine 緩衝溶液及 20﹪methanol ) 中約 5 分鐘，

隨後依序將海綿、濾紙、膠片、PVDF 膜、濾紙、海綿放置於三明治式塑膠板中，

以100 伏特於冰水浴中進行轉印。

90 分鐘後取出 PVDF 膜，先以 buffer A ( 25 mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.3﹪

Tween 20, pH 7.4) 清洗 3 次，每次 5 分鐘，接著以 buffer B ( 25 mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.4 )製備含 5﹪skim milk 溶液，室溫下 1 小時或 4℃隔夜行 blocking 反應。

取出PVDF 膜以 buffer A 沖洗 3 次，每次 5 分鐘，倒入一級抗體，室溫下處理 1 小時後，以 buffer A 沖洗 3 次，每次 5 分鐘，再倒入 anti-mouse（iNOS）或 anti-rabbit

（COX-2）horseradish peroxidase（HRP）-conjugated 二級抗體，室溫反應 1 小時，

接著以buffer A 沖洗 3 次，每次 5 分鐘，最後以含 3,3'-diaminobenzodine (DAB)的

顯色液（10 ml, 5 mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.4，含 4μl 30﹪H

2

O

2

（3.52 mM）

及40μl DAB 25mg/ml（0.277 mM））或 ECL 呈色。

六、Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction（RT-PCR）

於直徑3.5 公分之培養盤中植入 8x10

⁵

個RAW264.7 巨噬細胞，八分滿時加入 不同濃度之CLA ( 0（methanol 當作 vehicle control）, 20, 100 和 200μM )，預處理 12 小時，再加入 LPS ( 0 和 1μg/ml )培養 3 小時 （COX-2 mRNA）或 6 小時 （iNOS mRNA），以 PBS 清洗細胞 2 次，加入 0.8 ml TRI

^TM

reagent 將細胞刮下，移至 eppendorf tube 中，室溫靜置 5 分鐘，加入 160μl chloroform，充分震盪 15 秒，靜 置15 分鐘，接著於 4℃下 14000g 離心 15 分鐘，小心取出上清液，與 0.5 ml isopropanol 混合均勻，靜置 10 分鐘使 RNA 沈澱，於 4℃下以 14000g 離心 15 分 鐘，倒掉上清液，加入1 ml 70﹪冰酒精洗去殘餘的鹽類，再次以 9500g 離心 5 分 鐘，倒掉上清液，將RNA 風乾，最後加入 50μl 滅菌水將 RNA 溶解，即可進行 RNA 定量，將所有 RNA 濃度調整為 0.05μg/μl，保存於-20℃。

首先，將10 倍 PCR buffer、MgCl

2

（25 mM）、dATP（100 mM）、dGTP（100 mM）、dCTP（100 mM）、dTTP（100 mM）、RNase inhibitor（40U/μl）、oligo dT

（5μM）和 Reverse Transcriptase（200U/μl）混合於 eppendrof 中，再加入 0.1μg RNA、2μl internal standard（10μM）混合均勻，隨後置入 PCR 儀器中，以 42℃, 15 分鐘，99℃, 5 分鐘，4℃, 10 分鐘，進行 Reverase Transcription，最後將完成的 cDNA 靜置於室溫下。此時製備 PCR reagent（10 倍 PCR buffer、MgCl

2

、3' primer

（10μM）及 5' primer（10μM））（表二），於 95℃乾浴 5 分鐘，加入 Taq （DNA polymerase, 2U/μl），從此混合物中取30μl 加入 cDNA 中，最後總體積為 50μl，

接著放入PCR 機器中進行 DNA 複製。PCR DNA 產物加上 5μl 10 倍 loading dye，

混合均勻後，注入含Ethidium bromide（EtBr）之膠片中，以 90 伏特進行電泳。

最後於紫外燈照射下拍攝電泳圖，並以分析軟體（ONE-Dscan 1-D Gel Analysis

Software）定量其 mRNA 表現。

七、Electrophoretic Mobility Shift Assay（EMSA）

於直徑3.5 公分之培養盤中植入 8x10

⁵

個RAW264.7 巨噬細胞，八分滿時加入 不同濃度之CLA ( 0（methanol 當作 vehicle control）, 20, 100 和 200μM )預處理 12 小時，隨後再加入 LPS ( 0 和 1μg/ml )培養 1 小時，移除上清液後，細胞先以 PBS 清洗 2 次，加入 400μl PBS 刮下細胞，隨後於 4℃下以 500g 離心 5 分鐘，倒 掉上清液並將細胞靜置於冰上。以NE-PER

^TM

Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent Kit （PIERCE）分離核蛋白。將離心後的細胞以 100μl cytoplasmic extraction reagentⅠ（CERⅠ）重新懸浮，並於振盪器最高轉速下震盪 15 秒，隨即 靜置於冰上10 分鐘，加入 5.5μl cytoplasmic extraction reagentⅡ（CERⅡ），同樣 於最高轉速下震盪5 秒後靜置於冰上 1 分鐘，以 16000g 離心 5 分鐘，所得上清液 即為細胞質液（可供IκBα及 IκBα-P 分析）。另外，離心所得沈澱物則以 50μl nuclear extraction reagent（NER）重新懸浮，且每隔 10 分鐘以最高轉速震盪 15 秒，

重複4 次後，以 16000g 離心 10 分鐘，最後所得上清液則含有細胞核釋出蛋白（供 p65 及 EMSA 分析），並存於-80℃。

【EMSA】

本實驗以LightShift

^TM

Chemiluminescent EMSA Kit（PIERCE）進行 EMSA 實 驗。依說明，先將poly（dIdC）、binding buffer、MgCl

2

、NP-40、Glycerol 及標定 biotin 之 NF-κB DNA 片段（表一）（2ng/tube）混合於 eppendorf tube 中，再各別加

入2μg 核蛋白質，最後以滅菌去離子水補到 20μl。混合均勻後，將此混合物置

於室溫下30 分鐘，接著加入 5μl 5x sample dye，此混合後即可將此樣本注入 6﹪

TBE-polyacrylamide 膠片樣品槽中，於 32 mA 及冰水浴下進行電泳。

電泳完成後，將膠片取下並浸泡於0.5 倍 TBE buffer ( 450 mM Tris, 450 mM boric Acid, 10 mM EDTA, pH 8.3 )，隨後依序將海綿、濾紙、膠片、硝化纖維膜 ( NC

membrane, Hybond

^TM

-N+ )、濾紙、海綿放置於浸泡在 TBE buffer 中的三明治式塑 膠板，放入轉印槽，以100 伏特於冰水浴中轉印 1 小時。

轉印完成後取出硝化纖維膜，置於紙巾上風乾 10 分鐘，接著於紫外燈上進 行10 分鐘 cross link（使 DNA 固定於膜上）。硝化纖維膜以 wash buffer 清洗 5 分 鐘，再以15 ml Blocking buffer，於 Shaker 下與膜均勻作用 15 分鐘，再將

Streptavidin-Horseradish Peroxidase 依比例（HRP：BSA=1：600-1000μl）加入 Blocking buffer 中反應 15 分鐘，隨即以 wash buffer 清洗 20 分鐘，每次 5 分鐘共 4 次，最後加入Substrate Equilibration buffer 平衡 5 分鐘。完成所有反應之後，取出 硝化纖維膜置於紙巾上滴乾，以ECL Kit 呈色，並以 X 光片照像結果。

統計分析

各組實驗數據均以平均值加減一個正負標準差（mean±SD）表示，統計分析以 one-way analysis of variance（ANOVA）分析 (SAS, Cary, NC, USA)，並以 Tukey test 進行顯著差異分析，當P 值小於 0.05 表示各組間有顯著差異。

結果

一、CLA 和 LPS 處理下對 RAW264.7 巨噬細胞存活率之影響

為了探究所添加CLA 是否對 RAW264.7 巨噬細胞存活率造成之影響，因此先 以MTT assay 予以檢驗。結果如圖一所示，與控制組（CLA0 及 LPS 0）比較，

僅加入CLA 或 LPS 並不影響細胞存活率，同時添加 200μM CLA 及 1μg/ml LPS 條件下，細胞存活率仍能維持 99﹪以上，此結果表示本實驗所採用 CLA 及LPS 處理濃度對 RAW264.7 巨噬細胞不會產生傷害。

二、CLA 添加對 RAW264.7 巨噬細胞內脂肪酸組成比例之影響

為了探究 CLA 的添加是否對 RAW264.7 巨噬細胞內各脂肪酸組成比例生

成影響，本實驗因此利用GC 來分析細胞總脂肪中各脂肪酸比例。結果如圖

二所示，CLA 在巨噬細胞內脂肪酸分配比例，隨著 CLA 添加濃度之增加而 遞增，表示培養液中添加的CLA 可進入 RAW264.7 巨噬細胞中。另外，CLA 的添加，也同時減少RAW264.7 巨噬細胞內 LA（18：2）（圖三 A）及 AA（20：

4）所佔比例（圖三 B）。

三、CLA 對 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 Nitric oxide（NO）釋放能力之影 響

結果如圖四所示，與控制組（CLA0 和 LPS 0）相較下，LPS 呈劑量關係 的增加RAW264.7 巨噬細胞 NO 之釋放；雖單獨加入 CLA 不會影響 NO 生合 成，但在LPS 與 CLA 共處理下，LPS 誘發之 NO 生成卻隨著 CLA 濃度增加 而遞減。在0.1 或 1μg/ml LPS 下，200μM CLA 分別抑制了 43﹪及 37% nitrite 生成濃度。

四、CLA 對 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 PGE

2

釋放能力之影響

為探究 CLA 是否會影響 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 PGE

2

釋放能力，

本分析先將細胞以CLA 預處理 12 小時，再加入 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細 胞PGE

2

釋放，並以Enzyme immnoassay kit 測培養液中 PGE

2

濃度。結果如圖 五所示，LPS 顯著增加 RAW264.7 巨噬細胞 PGE

2

的釋放，而CLA 則具有抑 制PGE

2

釋放之效果。200μM CLA 對 LPS 誘發 PGE

2

釋放抑制效果最為顯著，

其抑制PGE

2

釋放達20﹪。

五、CLA 對 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 iNOS 蛋白質表現之影響

結果如圖六所示，與控制組（CLA0 和 LPS 0）比較之下，0.1 或 1μg/ml LPS 均顯著誘發 RAW264.7 巨噬細胞表現 iNOS 蛋白質，而 LPS 誘發 iNOS 蛋 白質表現卻隨著CLA 濃度增加而遞減，且呈劑量效應（dose-dependent response）。200μM CLA 對 0.1 和 1μg/ml LPS 抑制效果分別可達 91﹪及 51

﹪。

六、CLA 對 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 COX-2 蛋白質表現之影響 為了探究CLA 是否影響 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 COX-2 蛋白質 表現，RAW264.7 巨噬細胞添加 CLA 12 小時後加入 LPS 處理 6 小時，誘發 RAW264.7 巨噬細胞 COX-2 表現。結果如圖七所示，RAW264.7 巨噬細胞只 有LPS 處理下才會顯著誘發 COX-2 蛋白質表現，而 LPS 誘發之 COX-2 蛋白 質表現則因CLA 濃度增加而隨之減弱，且呈劑量效應（dose-dependent response）。添加 CLA 200μM 對 LPS（0.1 和 1μg/ml）誘發 RAW264.7 巨噬 細胞COX-2 蛋白質抑制效果最顯著（P＜0.05），其抑制效果分別達49﹪及 54

﹪。

七、CLA 對 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 iNOS mRNA 表現之影響

為了探究CLA 是否會影響 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 iNOS mRNA 表 現，RAW264.7 巨噬細胞處理 CLA 12 小時後加入 LPS 處理 6 小時，誘發 RAW264.7 巨噬細胞 iNOS mRNA 表現。結果如圖八所示，iNOS 之 mRNA 表現與控制組（CLA0 及 LPS 0）比較下，只有在 LPS 刺激下才會被顯著誘 發，且1μg/ml LPS 誘發效果比 0.1μg/ml 強（data not shown）。添加 CLA 可 明顯抑制LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 iNOS mRNA 表現，且隨著 CLA 濃度 增加而隨之減弱，呈劑量效應（dose-dependent response）。添加 200μM CLA 對LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 iNOS mRNA 抑制效果最顯著（P＜0.05），

抑制效果達63﹪。

八、CLA 對 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 COX-2 mRNA 表現之影響 為了探究CLA 是否會影響 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 COX-2 mRNA 表現，RAW264.7 巨噬細胞處理 CLA 12 小時後加入 1μg/ml LPS 處理 3 小時，

誘發COX-2 mRNA 表現。結果如圖九所示，COX-2 mRNA 表現與控制組

（CLA0 和 LPS 0）比較下，只有在 LPS 刺激下才會被顯著誘發。添加 CLA 可以抑制LPS 誘發之 COX-2 mRNA 表現，且隨著 CLA 濃度增加而隨之減弱，

呈劑量效應（dose-dependent response）。添加 200μM CLA 對 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 COX-2 mRNA 抑制效果最顯著，抑制效果達 66﹪。

九、CLA 對 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 IκB-α、IκBα-P、p65 蛋白質 表現之影響

為了更進一步探討CLA 是否透過抑制 LPS 誘發 NF-κB 活化途徑影響 iNOS 表現，因此以 western blot 分析 CLA 對 IκB-α、IκBα-P 及 p65 蛋白

質表現的影響。控制組（CLA0 和 LPS 0）IκB-α蛋白質表現明顯高於 1μg/ml LPS 刺激處理組，而添加 200μM CLA 卻反而比 LPS 處理組之 IκB-α蛋白質 略少，但未達統計差異（data not shown）。LPS 處理組 IκBα-P 蛋白質表現顯 著高於控制組，添加200μM CLA 可抑制 LPS 誘發之 IκBα-P 蛋白質表現，

達57﹪（圖十）。控制組細胞核中 p65 蛋白質表現顯著低於 LPS 處理組，而 添加200μM CLA 細胞核中 p65 蛋白質表現顯著低於 LPS 處理組達 33﹪（圖 十一）。

十、CLA 對 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 NF-κB 與其 consensus oligonucleotide（κB site）結合之影響

為探究 CLA 是否會影響 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 NF-κB 與其 consensus oligonucleotide（κB site）結合能力，以 EMSA 方法來分析。結果 如圖十二所示，1μg/ml LPS 處理組 NF-κB 與 consensus oligonucleotide（κ B site）結合表現（band 2）顯然高於控制組（CLA0 和 LPS 0）（band 1）。加 入mutant consensus oligonucleotide（κB site）並不影響 NF-κB 與正常 consensus oligonucleotide（κB site）結合表現（band 6）；相反的若加入cold probe

（沒有biotin lable 之 probe）處理，可與 biotin lable probe 競爭κB site（band 5）。添加200μM CLA 則可抑制 LPS 誘發 NF-κB 與 consensus oligonucleotide

（κB site）之結合（band 3）。

討論

根據國民營養調查得知，近年來國人熱量及油脂的攝取量有逐年增加的趨 勢。因此慎選油脂種類及所付予的附加價值則顯得格外重要。

CLA 代表一群 18 個碳在位置及幾何圖形上帶兩個共軛雙鍵之多元不飽和脂肪 酸（octadcadenoic acid）的同質異構物，飲食中牛羊等反芻類動物肉類（2.7-5.6 mg/g fat）及乳製品（2.9-7.1 mg/g fat）含較高 CLA（review in Chin et al., 1992）。過去文 獻指出CLA 具有許多生理功能，包括：抗癌（anticarcinogenic）；影響身體組成，

減少脂肪組織（antiadipogenic），增加瘦肉組織；減少動脈脂肪層破損（aortic fatty streak lesion），調節粥狀硬化形成；調控血糖衡定；影響免疫力等特性（reviewed in MacDonald, 2002）。此外，在許多組織中亦發現 CLA 可影響骨質形成（bone formation），脂質代謝（lipid metabolism），及基因表現（gene expression）（Belury et al.,1997

^b

；Eggert et al., 2002；Houseknecht et al.,1998；Li et al.,1998；Park et al., 2002）。至於探討CLA 與發炎免疫之關係之文獻並不多，因此本研究主要探討 CLA 對LPS 刺激 RAW264.7 巨噬細胞誘發與發炎相關事件之影響及其可能之機轉。

由MTT 結果顯示（圖一），單純加入CLA（0（methanol 當作 vehicle control）, 20, 100 和 200μM）或 LPS (0 和 1μg/ml )並不影響細胞存活率且當同時添加 200 μM CLA 及 1μg/ml LPS，細胞存活率仍能維持 99﹪以上，表示添加 CLA 至 200 μM 對 RAW264.7 巨噬細胞沒有毒害。但若 CLA 高於 300μM 以上，對細胞型態 及存活率均會造成傷害（data not shown），故本研究CLA 最高添加劑量為 200μM。

由GC 結果顯示 CLA 可混合進入 RAW264.7 巨噬細胞之脂肪中（圖二），並 且減少LA 及 AA 的比例（圖三），此結果與 Liu 等人（1998）發現在小鼠皮膚角 質細胞中CLA 可取代磷脂質上的 AA，及 Moya 等人（1999）發現於鼠類肝細胞 中CLA 可取代磷脂質上的 arachidonate precursor, linoleate （Moya et al., 1999；

Belury et al., 1997

^a

）結果相近。Banni 發表 CLA 合成 conjugated arachidonic acid 過 程中所需的酵素會與LA 合成 AA 所需酵素相互競爭（Banni et al., 2001），這可能 也是CLA 飲食可降低總脂質中 AA 含量原因之一。

在本研究中發現添加CLA 可顯著抑制 LPS 所誘發之 COX-2 mRNA（3 小時）

和蛋白質（6 小時）表現，此外實驗中亦發現 CLA 對抑制 LPS 誘發之 COX-2 mRNA 及蛋白質能力，僅在短時間（6 小時）刺激下才有最大抑制效果（圖七及圖九），

然而隨著誘發時間的延長其抑制效果則隨之減弱，24 小時後則不具抑制效果（data not shown）。在RAW264.7 細胞中添加 CLA 對 LPS 誘發之 COX-2 mRNA 和 protein 僅在短時間才有顯著的抑制效果，長時間下LPS 誘發之 COX-2 mRNA 和蛋白質生 成量或許已超過CLA 所能抑制的極限，因此無法顯著看到 CLA 之抑制效果。

COX-2 酵素催化作用是 AA 代謝生成 PGE

2

之速度限制步驟（rate-limite step），本 研究結果發現雖CLA 可抑制 LPS 誘發 COX-2 蛋白質生成達 50﹪，但 CLA 可降低 PGE

2

生成（圖五）僅達20﹪，這或許與 CLA 降低總脂質中 AA 之比例（35﹪）

及測量PGE

2

生成時間點有關。

過去文獻指出LPS 除了會誘發 COX-2 表現、增加 PGE

2

合成外也會促進iNOS

表現及NO 大量生成，而這些物質生成在免疫及發炎反應上則扮演著重要的調控

角色（Perkins et al., 1999）。本研究證實在LPS 刺激 RAW264.7 巨噬細胞誘發 iNOS 生成模式下，添加200μM CLA 可顯著抑制 iNOS mRNA 表現（圖八），此結果與 Iwakiri 等人（2002）及 Yu 等人（2002）發現一致。本研究除了證實 CLA 可抑制 LPS 誘發之 iNOS mRNA 表現外，另外也發現 CLA 亦可顯著抑制 iNOS 蛋白質的 表現且呈濃度劑量關係，其中以添加200μM CLA 抑制 LPS 誘發之 iNOS 蛋白質 表現最為顯著（P<0.05）（圖六），此結果目前為止尚未有其他相關文獻發表。本研 究亦證實CLA 確實可抑制 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 NO 的生成（圖四），且 隨著CLA 濃度增加，NO 的生成也隨之減少，呈劑量效應，添加 200μM CLA 可 達最大抑制效果(p<0.05)。除此之外，有趣的是本研究亦發現在沒有任何物質刺激

下單獨加入CLA，相較於 vehicol control 反而稍略增加 NO 的表現，由於低濃度之 NO 亦扮演著神經傳導，血管舒張，抑制血小板凝集等重要角色（reviewed in Lorsbach et al., 1993），或許在內皮組織或神經細胞之 constitutive NOS 合成生理所

需NO 的途徑上，CLA 有著更不同定位及重要性，但仍需進一步之探討。

為了更進一步探究CLA 抑制 iNOS mRNA 所調控之機轉，Yu 等人（2002）以 reporter assays 間接證實 CLA 抑制前發炎反應相關基因之表現有一部分可能是透過 CLA 活化 PPARγpathway。但由於在 iNOS promoter region 沒有 PPRE，故推論被 CLA 活化之 PPARγ可與細胞內其他轉錄因子作用，而有抑制 iNOS 基因表現之能 力。文獻指出iNOS 及 COX-2 promoter region 上都有 NF-κB binding site，為了更 進一步探究CLA 抑制 iNOS 及 COX-2 基因表現可能的調控機轉，本研究另一個重 點是探討CLA 對 NF-κB 路徑之影響。本實驗研究證實以 LPS 刺激 RAW24.7 巨 噬細胞30 分鐘後，LPS 刺激組 IκB-α-P 的表現高於控制組，而添加 CLA 則使 I κB-α-P 表現顯著低於 LPS 刺激組（圖十）。此外LPS 刺激組 IκB-α的表現較控 制組少但未達統計上差異，雖添加CLA 處理組其 IκB-α的表現低於 LPS 刺激組，

但若比較IκB-α-P/ IκB ratio 則可發現，添加 CLA 處理組之 ratio 顯著低於 LPS 組（data not shown），由此推論 CLA 可抑制 IκB-α-P，進而使 IκB-α被降解的 時間延後，影響NF-κB 活化。至於 CLA 未抑制 LPS 減少之 IκB-α量之原因可 能與時間點或其他未知因子之影響有關，仍須更進一步實驗探討。接下來，我們 為想探究CLA 對 NF-κB 進入核內之影響，以 p65 的抗體偵測核內 p65 表現量，

由結果可知（圖十一）LPS 確實會促進 NF-κB/ p65 進入核內，但當添加 CLA 時 則會減少LPS 誘發之 NF-κB/ p65 進入核內的量，這或許與 CLA 影響 NF-κB 活 化之上游步驟有關。至此，我們為進一步探究CLA 對 NF-κB 轉錄活性之影響，

以EMSA 作驗證，評估 CLA 對 NF-κB DNA binding 之影響。結果顯示，CLA 可 抑制NF-κB 與 NF-κB binding site 的結合（圖十二），由此可知 CLA 可能透過抑 制LPS 誘發之 NF-κB 活化及 NF-κB 與 DNA binding 來影響發炎相關基因（如

iNOS 及 COX-2）的表現。

綜合以上結果可知，CLA 除了可抑制 LPS 誘發 RAW264.7 巨噬細胞 iNOS 及 COX-2 mRNA 和蛋白質表現之外，亦可抑制 NO 及 PGE

2

生成。在LPS 活化 NF- κB 的路徑上，CLA 亦扮演著抑制 IκB-α-P，NF-κB/ p65 進入核內及影響 NF- κB 與 DNA binding 的重要角色。Leung（2000）指出，CLA 被證實為自由基補捉 劑（free radical scavenging agent），它所影響的一些對身體有益的功能或許是透過 抗氧化機轉所致。而過去文獻也指出活性氧自由基（reactive oxygen species）也可 誘發NF-κB 活化（Janssen-Heininger et al., 2000），因此CLA 之抗氧化特性與 CLA 對NF-κB pathway 影響間之相互關係仍須更進一步探討。

本研究證實CLA 經由抑制 LPS 誘發之 NF-κB 活化，調控發炎反應。由於發 炎反應在生理功能調節上扮演重要角色，且發炎反應亦影響許多疾病（例如：風

濕性關節炎）、癌症生成及病程發展。故本研究結果可有助於了解CLA 在健康保

健上所扮演之功能。除CLA 對調控發炎反應之影響外，未來未來研究可著重於探

討CLA 經由調控 NF-κB 路徑對其他與發炎疾病上所扮演之角色。

結論

在不影響RAW264.7 巨噬細胞細胞存活率之濃度下，CLA 可顯著抑制 LPS 誘 發iNOS 和 COX-2 蛋白質及 mRNA 表現，及其分別催化之 NO 及 PGE

2

生成。而 CLA 調控發炎反應相關基因表現及 pro-inflammatory 物質生成之機轉可能與 CLA 減少LPS 誘發 IκB-α-P 生成及 NF-κB 與 DNA 結合之能力而降低 NF-κB 轉錄 活性之能力有關。

結果圖表

（圖一）在RAW264.7 細胞添加 CLA 對細胞存活率之影響。

RAW264.7 細胞同時給予 LPS（0 和 1μg/ml）及 CLA（0, 20, 100 和 200μ M）18 小時後進行 MTT assay。本圖以細胞在不同濃度 CLA 處理下測量出 之吸光值與0μg/ml LPS，0μM CLA 細胞處理組之吸光值相較的比值表 示。（n=3）

0 20 40 60 80 100 120

LPS(μg/ml): 0 1

CLA(μM): 0 20 100 200 0 20 100 200

Cell viability (%)

（圖二）CLA 添加混合進入 RAW264.7 細胞中脂肪酸所佔之比率。

RAW264.7 細胞給予 CLA（0, 20, 100 和 200μM）12 小時後進行 GC assay。

本圖表示細胞在不同濃度CLA 處理下佔 RAW264.7 細胞中總脂肪酸之比率 (%)。（n=2）

CLA

0 10 20 30 40 50 60

CLA in totoal lipid (%)

0 20 100 200 CLA (μM)