氮肥種類與施用量對紫花紫錐菊生長及咖啡酸衍生物含量的影響

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國立臺灣大學生物資源暨農學院農業化學系碩士論文

Department of Agricultural chemistry College of Bio-Resources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

氮肥種類與施用量對紫花紫錐菊生長及咖啡酸衍生物含量的影響

Effects of Different Nitrogen Fertilizers and Application Rates on the Growth and Caffeic Acid Derivative Contents in

Echinacea purpurea (L.) Moench

盧逸 Yi Lu

指導教授：鍾仁賜博士 Advisor: Ren-Shih Chung, Ph. D.

中華民國 104 年 7 月

July, 2015

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誌謝

時光飛逝，碩士班生涯即將畫下句點，非常感謝恩師鍾仁賜教授，老師對事情認真負責與親力親為的態度，讓我受用良多。在研究方向以及實驗過程中也給予我許多建議與協助，待人處事上也以身作則，並與我們分享人生經歷，

讓我在求學過程中有所成長。老師作為學者的態度和風範，對學生的教導與包容，也成為我學習的典範。謝謝老師在這兩年的指導，讓我得以在兩年完成我的研究並順利畢業。

論文初稿承蒙本系黃良得老師、張必輝老師、中興大學土壤環境科學系陳仁炫老師和黃裕銘老師的詳細批閱，並於口試時提供寶貴的意見，使我能夠更仔細、更多元和更深入的思考實驗結果的意義，論文得以更加完善。

在這兩年中，感謝蘇育萩小姐在生活上的照顧。也謝謝植營實驗室的夥伴們，我會懷念在實驗室嘴砲、大笑、崩潰地做實驗還要邊唱歌的日子，一起開伙、喝下午茶和聚餐的時光，以及去 KTV 唱歌嗨翻天的盛況。謝謝維德、彥涵、承翰學長以及育歆學姊，幫助我熟習各種實驗操作，教導我實驗原理與技巧，並且在我遇到瓶頸時引導我，讓我逐漸地能獨當一面。謝謝俊翰學長，在我需要諮詢時，總會義不容辭地放下手邊的工作，耐心地幫我解決問題，並給予我可靠的建議。謝謝金鳳學姐，教導我使用統計軟體，在繁忙的工作中撥空提點我。謝謝昭穎，在良性競爭中，促使我做實驗更加積極，也讓我抵擋冷笑話的功力更上一層樓，亦學習到如何在人群中擁有高人氣。謝謝勁甫，引領實驗室穿搭走在流行的尖端，以身教使實驗室氣氛更加圓融，讓我嘴賤的功力提升不少。謝謝德宏，總是幫忙實驗室的大小事，你爸滷的豬腳真的超好吃。謝謝鈞憲和朝源，讓實驗室常常有現泡咖啡可以喝，為忙碌的實驗生活帶來歡笑。謝謝泰祥學長和靜芳學姊，不厭其煩地鼓勵我，並給予我許多建議。

謝謝 R02 的夥伴們：佳貞、翎虹、宜、柏勛和蓓伶，每次與你們閒話家

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們，兩年生活中最期待的就是每次聚會和相遇，彼此更新近況、講八卦和垃圾話，都能使我暫時放鬆。謝謝哲倫，總能與你分享各種事情，雖然相聚的時光不多，但我們的情誼依舊不變。謝謝我的室友：文娟和姿蓉，在宿舍對我的包容，並且讓我每天的心情有個出口。

謝謝系羽的同伴：榮顥學長、大中、雅萍、柏成、暐昕、怡瑄、鼎翔、恆真、心愉、映希和綱祐。碩班這兩年跟你們一起練球，在球場上揮灑汗水，一起比賽追求勝利，都可以讓我暫忘實驗的煩惱和壓力。也謝謝在羽球場上遇見的每個人，因為有你們，球場上總是充滿挑戰與歡笑。

特別感謝星佑，忍受我的忙碌、小小任性以及莫名的起床氣。總是能夠很理性地與我討論和分析事情，帶給我許多正面的思考和想法。並且承受我所有的負面情緒，也與我一同分享生活的喜悅。常犧牲形象搞笑帶給我歡樂，讓我能夠樂觀、開朗的迎接每一天。

最後，我要感謝我的家人。爸媽使我在生活上無須擔憂。並且永遠支持我做任何事事情，包容我的任性與壞脾氣，督促我學習，也不忘給予我鼓勵及肯定。當我回家時，總是會有滿桌的菜和切好的水果，讓我感受到滿滿的愛與關懷。哥哥一直都是我的榜樣，並容忍我沒大沒小的態度。謝謝你們無條件的支持，使我在人生道路上能夠勇敢地向前進。

盧逸 2015.08.20

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摘要

紫錐菊 (E. purpurea) 為菊科紫錐菊屬多年生草本植物，原產地於北美洲，

為歐美地區相當風行的藥用植物之一，且市場對其相關產品的需求日益提高。紫錐菊是少數被研究證實具有增強及刺激人體免疫系統的功效之植物，所含的活性成分包括多醣體、咖啡酸衍生物及烷醯胺，而其中最具有指標性的為咖啡酸衍生物，如卡夫塔酸 (caftaric acid)、綠櫞酸 (chlorogenic acid)、洋薊酸 (cynarin)、紫錐菊苷 (echinacoside) 和菊苣酸 (cichoric acid)。由於紫錐菊在臺灣的肥培管理資料不多，目前研究皆未考慮其咖啡酸衍生物的含量，且紫錐菊在臺灣的收穫適期目前也沒有明確的定論。本研究以紫錐菊為材料，探討不同種類的氮肥與施用量對紫錐菊的乾重、氮磷鉀吸收、總酚類及咖啡酸衍生物的影響，同時比較紫錐菊在不同生長階段成分含量的差異。試驗採完全隨機設計，處理分別為控制組 (Control, 0 g N plot^-1)、化學肥料 (Chem 1, 0.40 g N plot^-1)、兩倍化學氮肥 (Chem 2, 0.80 g N plot^-1)、三倍化學氮肥 (Chem 3, 1.20 g N plot^-1)、有機質肥料 (Org 1, 0.80 g N plot^-1)、兩倍有機質肥料 (Org 2, 1.60 g N plot^-1) 和三倍有機質肥料 (Org 3, 2.40 g N plot^-1)，共七種處理，每處理四重複。於幼苗移植盆栽後第 150 和 180 天分別採收根部和地上部植體與土壤進行分析。結果顯示施用有機質肥料在紫錐菊採收後能增加土壤有機質含量，且具有較高的總氮、可萃取磷、鈣、鎂及錳的含量，能保持土壤肥力並維持土壤 pH 值。此外，全部肥料處理對紫錐菊的乾重皆沒有顯著影響。紫錐菊在開花期後仍會吸收氮、磷、鉀、鈣及鎂，並將根多量的鉀轉移至地上部。施用高量化學肥料會使植物體中氮和鈣的濃度較高；而施用有機質肥料有助於紫錐菊對磷和鉀的吸收，但會降低植物體中的氮濃度，不過會使紫錐菊之酚類及咖啡酸衍生物的濃度增加。綜上所述，考量紫錐菊之活性成分含量以及土壤的永續經營，施用有機質肥料為較佳的肥培策略。其中以有機質肥料處理 (Org 1) 可得到最高的酚類 (18.3 g kg^-1) 及咖啡酸衍生物 (36.1 μmol g^-1) 濃度。

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Abstract

E. purpurea, also known as the purple coneflower, is a native North American

perennial medicinal herb and widely used to treat cold, sore throats, upper respiratory infections, and some inflammatory conditions for hundreds of years. The main bioactive compounds responsible for the pharmacological actions are caffeic acid derivatives (CADs), such as caftaric acid, chlorogenic acid, caffeic acid, echinacoside and cichoric acid. Few researches have investigated the relationship between the fertilizer management and the content of bioactive compounds of E. purpurea in Taiwan.

The aims of this study were: (1) to investigate the effects of different nitrogen (N) fertilizers and application rates on the growth and caffeic acid derivative contents of E.

purpurea; and (2) to evaluate caffeic acid derivative contents of E. purpurea in two

different growth stages. The study was conducted under completely randomized design with four replications. The treatments were Control (0 g N plot^-1), Chem 1 (0.40 g N plot^-1), Chem 2 (0.80 g N plot^-1), Chem 3 (1.20 g N plot^-1), Org 1 (0.80 g N plot^-1), Org 2 (1.60 g N plot^-1) and Org 3 (2.40 g N plot^-1). The samples of plants (shoots and roots) and soil were taken and analyzed at 150 and 180 days after transplanting (DAT). The results showed that the application of organic fertilizer could maintain pH at a relatively constant level and increase the concentrations of total N, organic matter, Mehlich Ⅲ extractable phosphorus (P), calcium (Ca), magnesium (Mg) and manganese of soil after harvesting. Moreover, there was no significant difference on the dried weight of E.

purpurea in all treatments. After blooming stage, E. purpurea would uptake

considerable amount of N, P, K, Ca and Mg, and transported great amount of K from roots to shoots. The high application rate of chemical fertilizer could increase the N and Ca concentrations of the plant. The application of organic fertilizer would enhance the uptake of P and K, but decrease the production of phenol and caffeic acid derivatives

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in E purpurea. In summary, to consider the content of bioactive compounds and sustainable development of soil, the application of organic fertilizer is a better strategy for cultivating E. purpurea. The highest concentrations of total phenol (18.3 g kg^-1) and coffeic acid derivatives (36.1 μmol g^-1) were found in Org 1.

Key words: coneflower, cichoric acid, caftaric acid, nutrients uptake, secondary metabolites.

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圖目錄

圖一、紫錐菊之 21 種主要親脂性化合物的結構式... 9

圖二、紫錐菊品種所含之五種咖啡酸衍生物的結構式及其生合成途徑... 10

圖三、不同肥料處理對土壤 pH 值的影響 ... 36

圖四、不同肥料處理對土壤 EC 值的影響 ... 38

圖五、不同肥料處理對土壤有機質含量的影響... 40

圖六、不同肥料處理對土壤總氮濃度的影響... 42

圖七、不同肥料處理對土壤無機態氮濃度的影響... 44

圖八、不同肥料處理對土壤 Mehlich Ⅲ可萃取磷濃度的影響 ... 46

圖九、不同肥料處理對土壤 Mehlich Ⅲ可萃取鉀濃度的影響 ... 48

圖十、不同肥料處理對土壤 Mehlich Ⅲ可萃取鈣濃度的影響 ... 50

圖十一、不同肥料處理對土壤 Mehlich Ⅲ可萃取鎂濃度的影響 ... 52

圖十二、不同肥料處理對土壤 Mehlich Ⅲ可萃取鐵濃度的影響 ... 54

圖十三、不同肥料處理對土壤 Mehlich Ⅲ可萃取錳濃度的影響 ... 56

圖十四、不同肥料處理對土壤 Mehlich Ⅲ可萃取銅濃度的影響 ... 58

圖十五、不同肥料處理對土壤 Mehlich Ⅲ可萃取鋅濃度的影響 ... 60

圖十六、移植後 150 天，不同肥料處理之紫錐菊生長狀況... 63

圖十七、移植後 180 天，不同肥料處理之紫錐菊生長狀況... 64

圖十八、不同肥料處理對紫錐菊根部與地上部之氮含量的影響... 68

圖十九、不同肥料處理對紫錐菊根部與地上部之總磷含量的影響... 71

圖二十、不同肥料處理對之紫錐菊根部與地上部之鉀含量的影響... 74

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圖二十一、不同肥料處理對之紫錐菊根部與地上部之總鈣含量的影響... 77

圖二十二、不同肥料處理對之紫錐菊根部與地上部之總鎂含量的影響... 80

圖二十三、不同肥料處理對紫錐菊全株之總酚濃度的影響... 84

圖二十四、紫錐菊全株之總酚類化合物濃度與總氮濃度的關係... 85

圖二十五、紫錐菊咖啡酸衍生物之 HPLC 分析圖譜 ... 88

圖二十六、不同肥料處理對紫錐菊全株之總咖啡酸衍生物濃度的影響... 91

圖二十七、紫錐菊全株之總咖啡酸衍生物濃度與總氮濃度的關係... 92

圖二十八、紫錐菊全株之總咖啡酸衍生物濃度與總酚類化合物濃度的關係... 93

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表目錄

表一、土壤之物理和化學性質 ... 21

表二、本試驗施用的有機質肥料之基本性質 ... 22

表三、高效液相層析儀之動相條件 ... 33

表四、本試驗中五種咖啡酸衍生物標準品之滯留時間 ... 33

表五、四種咖啡酸衍生物之標準曲線 ... 34

表六、不同肥料處理對紫錐菊農藝性狀和乾重的影響 ... 65

表七、不同肥料處理對之紫錐菊之氮濃度的影響 ... 67

表八、不同肥料處理對紫錐菊之磷濃度的影響 ... 70

表九、不同肥料處理對移紫錐菊之鉀濃度的影響 ... 73

表十、不同肥料處理對移紫錐菊之總鈣濃度的影響 ... 76

表十一、不同肥料處理對紫錐菊之總鎂濃度的影響 ... 79

表十二、不同肥料處理對紫錐菊根及地上部之總酚濃度的影響 ... 83

表十三、不同肥料處理對紫錐菊根之咖啡酸衍生物的影響 ... 89

表十四、不同肥料處理對紫錐菊地上部之咖啡酸衍生物的影響 ... 90

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附錄目錄

附錄一、不同肥料處理對土壤 pH、EC 值和有機質含量之影響... 109

附錄二、不同肥料處理對土壤總氮、無機態氮、Mehlich Ⅲ可萃取磷與鉀濃度之影響... 110

附錄三、不同肥料處理對土壤 Mehlich Ⅲ可萃取鈣、鎂、鐵、錳、銅與鋅濃度之影響... 111

附錄四、不同肥料處理對紫錐菊之氮含量的影響... 112

附錄五、不同肥料處理對紫錐菊之磷含量的影響... 113

附錄六、不同肥料處理對紫錐菊之鉀含量的影響... 114

附錄七、不同肥料處理對紫錐菊之鈣含量的影響... 115

附錄八、不同肥料處理對紫錐菊之鎂含量的影響... 116

附錄九、不同肥料處理對紫錐菊全株之總酚濃度的影響... 117

附錄十、不同肥料處理對紫錐菊全株之總咖啡酸衍生物濃度的影響... 117

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第一章前言

人類使用藥用植物已有數千年，近年來由於「回歸自然」的風氣興起，消費者對於草藥的興趣增加。美國於1994年通過膳食補充劑健康教育法 (Dietary Supplements Health and Education Act) 後，草藥產品銷售量每年增加約10-15%

(Percival, 2000)。根據Qi與Kelley (2014) 在「世衛組織2014-2023年傳統醫學戰略」

的調查顯示，中國在2012年中草藥產值估計達831億美元，與前一年比增加20%

以上；韓國於2004年至2009年草藥的開支為由44億增加到74億美元；美國在2008 年用於天然物產品的開支為148億美元，故藥用植物在醫藥或保健食品市場具有高度的發展潛力。

在過去，藥用植物主要來自野外採集，由於市場需求量以及對品質的追求提高，野外採集容易受限於數量，且會造成族群減少、遺傳多樣性喪失、當地物種滅絕和環境破壞 (Canter et al., 2005)，藥材的品質也會隨採收時間、地點、方法或植物大小、生長期長短等因子而改變，不利應用。藥用植物的天然化合物結構複雜不易合成，許多具療效的生理活性成分也尚未明瞭，或是並非由單一化合物所貢獻，且人工合成所費不貲，因此，人工栽培藥用植物的方式日趨重要。許多研究顯示栽培方式、施肥、環境及採收時間等條件皆會影響藥用植物的品質 (Shalaby et al., 1997; Knee and Thomas, 2002; El-Sayed et al., 2012; Thomsen, 2012)，

且人工栽培可以進行選拔育種，或是以不同的栽培管理來增加藥用植物特定的成分含量。因此，利用栽培管理以生產高品質及產量穩定的藥用植物為目前開發的重點。

肥培管理為栽培過程中重要的環節之一，肥培管理需考慮土壤和作物需求，

適當的管理可以提高作物產量，並減少肥料和農藥的施用，達到農業永續發展的目標。植物對氮、磷和鉀養分的需求量高，其中氮為植物蛋白質、葉綠素、核酸、

酵素等物質的組成分，而蛋白質為構成植物細胞的要素之一，葉綠素a、b皆為含

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氮化合物，因此，氮充足可以促進植物生長良好、產量增加。研究顯示，氮肥可 以提高茴香 (Foeniculum vulgare Mill.)、草莓 (Fragaria × ananassa Duch.)、青錢 柳 (Cyclocarya paliurus) 及卡琪花蒂瑪 (Labisia pumila Blume) 的產量，但對其 類黃酮含量有負成長 (Ibrahim et al., 2011; Deng et al., 2012; Ehsanipour et al., 2012;

Sun et al., 2012)。因此，如何在最佳的肥培條件下收穫高品質的藥用植物為栽培管理的重要課題之一。

紫錐菊 (Echinacea spp.) 為菊科 (Asteraceae) 紫錐菊屬多年生草本植物，主 要分布於北美洲和歐洲，是北美洲原住民的傳統草藥，常用來治療蛇蟲咬傷，以及許多疾病，如咳嗽、牙痛和性病等 (Flannery, 1999)。紫錐菊的主要用於免疫調節，例如治療感冒和流感，目前尚未有研究顯示其單一化合物對人體有副作用。

許多研究指出紫錐菊所含之親脂性化合物、酚酸和多糖等化合物皆對人體有益，

且三種化合物混合後具有顯著的協同作用 (Mazza and Oomah, 2000; Dalby- Brown et al., 2005)。此外，研究顯示紫錐菊成分能抑制HIV-1病毒 (Lin et al., 1999)，

使紫錐菊在醫藥用途上更受到重視。

紫錐菊在歐美地區已發展出各式各樣高附加價值的產品，在健康食品店、藥局或超市均可購得，常以茶包、膠囊、酊劑、飲品等形式銷售 (邱等，2001)。在歐洲紫錐菊產品為2005年銷售最高的藥用植物之第四名 (European Advisory Services, 2006)；為美國2010年第六大銷售商品 (Blumenthal et al., 2011)。根據 Keating等 (2015) 的調查顯示，2014年美國藥用植物茶包銷售前五名依序為：洋 甘菊 (Matricaria recutita) 花、亞歷山大決明 (Senna alexandrina) 葉、薑 (Zingiber officinale) 根、蒲公英 (Taraxacum officinale) 根和葉、紫錐菊 (Echinacea spp.) 根和葉。另外，紫錐菊的萃取液也常被添加入許多產品中，如食 品、飲品、化妝品或牙膏等，應用範圍廣泛。

紫錐菊屬有九個種 (species)，目前以E. purpurea和E. angustifolia為主要商業 化栽培種，E. purpurea約佔80%，E. angustifolia約佔20%。臺灣台中區農業改良

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殖能力，並含有多種活性成分 (邱等，2001)。紫錐菊為臺灣興新的保健植物之一，

具有發展潛力，但影響紫錐菊的生長、產量和化學成分之栽培管理方式或收穫調製方法研究仍缺乏。本研究的目的在探討不同氮肥和施用量對紫錐菊的生長及咖啡酸衍生物含量的影響，作為紫錐菊的肥培管理和收獲之參考，建立營養管理與活性成分的關係。

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第二章前人研究

一、紫錐菊簡介

紫錐菊 (Echinacea spp.) 為菊科 (Asteraceae) 紫錐菊屬 (Echinacea spp.) 之多年生植物，英文名稱為 coneflower，中文名又稱為松果菊或紫錐花。紫錐菊原生於北美溫帶地區，耐低溫 (-35°C) 及乾旱 (Galambosi et al., 1993; Thomsen et al., 2012)。葉片呈卵形或橢圓形至披針形，粗糙具有細毛，

葉脈約三至五條，葉緣有波浪鋸齒狀，長約 15-30 cm；根部依品種不同有鬚根系或主根系 (陳等，2012b、c)。紫錐菊開花期由夏初至早秋季節，單一或分支且具細毛之花莖，舌狀花著生於頭狀花序基部並呈放射狀 (5-15 cm)，

中心則為筒狀花，授粉後會形成針刺狀種子組成錐形的種子球，每株會開一朵以上花，花期可達兩個月，花色隨品種不同，在白色、粉紅或紫色等顏色之間變化，紫錐菊花形美觀，可發展為觀賞或切花用途 (陳等，2012b、c)。

紫錐菊屬有九個種 (species)，目前僅有三種被廣泛利用，即紫花紫錐菊 (E. purpurea)、狹葉紫錐菊 (E. angustifolia) 和白花紫錐菊 (E. pallida)，以 E.

purpurea (L.) Moench、E. angustifolia D.C.和 E. pallida Nutt.為主要商業化栽

培品種，栽培面積最廣，另外六個品種的利用並不普遍。三者中以紫花紫錐菊最適合種植於臺灣氣候和土壤環境，生長良好，可以收穫種子，且整體的農藝性狀表現最佳，植株產量較高，在臺灣栽培的藥用潛能最佳 (陳等，

2012c；張，2005)。紫花紫錐菊的莖粗壯、直立、分支、多毛或無毛、高可達 60-180 cm。基生葉 (basal leaves) 之葉柄可長達 25 cm，葉片長 15-22 cm，

寬長 5-10 cm，葉片呈卵形至披針形，葉片到基部會縮小；莖生葉 (cauline leaves)，無葉柄，長 7-20 cm，寬 1.5-8 cm，雙面粗糙，外側具絨毛。舌狀花反摺與花莖平行，略帶紫色，花粉粒為黃色。根部為鬚根系，根系不深 (吳，

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花紫錐菊於臺灣早春育苗，再將其移植田間種植，可以在第一年夏季或十至十二月開花，每株花枝數平均三到五枝 (邱等，2001)。

二、紫錐菊之二次代謝物

雖然生命體間的變異很大，但脂質、胺基酸、蛋白質、大部分碳水化合物和核酸之合成與代謝在大多數的生物體中是類似且必要的，這些會直接涉及正常生長、發育和生殖的代謝物，稱作「一次代謝物」 (Seigler, 1977)。

然而，很多代謝為某些特定物種或是某些特定細胞分化階段所特有的，這些代謝稱作「二次代謝」，產生的化合物稱作「二次代謝物」 (Luckner, 1990)。

二次代謝物常因為其顏色、氣味或味道而被發現，如食物與飲品中的味道或是水果與花的顏色和香味 (Luckner, 1990)。在近年來，許多研究指出二次代謝物參與許多重要的植物功能，包括防止病蟲或環境逆境的攻擊、抵抗紫外線輻射、吸引傳粉和傳播種子的動物、參與毒他作用、代謝等 (Wills et al., 2000)。植物體內能合成的二次代謝物種類很多，基本上可分成三大類如萜烯 (terpenes) 、酚類 (phenolics) 與含氮化合物 (nitrogen-containing compounds)，各種分子以簡單或複雜的聚合物形式存在植物的葉、花、果實或樹皮中 (陳，2013)。

紫錐菊具有非專一性免疫調節功能，可早期治療上呼吸道感染 (Barrett, 2003)，其活性成分可分成親脂性成分 (lipophilic compounds)，如烷醯胺類 (alkylamide) 和精油 (essential oils) ，以及親水性成分 (hydrophilic compounds)，如咖啡酸衍生物 (caffeic acid derivatives)、醣蛋白 (glycoproteins) 和多醣體 (polysaccharides) (Bauer, 1999; Barnes et al., 2005)。大部分關於紫錐菊活性成分之研究著重於其咖啡酸衍生物和烷醯胺類，因為這兩者被認為是紫錐菊免疫調節功效的來源。但許多研究顯示，紫錐菊中咖啡酸衍生物、

烷醯胺類、多醣體三者皆具有療效，且三者混合後具有顯著的加乘效應

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(synergistic effect) (Clifford et al., 2002; Speroni et al., 2002; Dalby-Brown et al., 2005; LaLone et al., 2007)。因此，紫錐菊的療效也被認為是許多化合物混合後的加乘效應所造成的，而各成分在反應中所扮演的作用仍尚待釐清。

(一) 親脂性化合物

紫錐菊之親脂性化合物包含酮烯/炔類 (ketoalkenes/alkynes) 和烷醯胺類。酮烯/炔類為脂肪族不飽和碳鏈和酮基相連的化合物 (如圖一，

tetradeca-8Z-ene-11,13-diyn-2-one，化合物 8)，是脂肪酸降解後的副產物。

烷醯胺類為多元不飽和脂肪酸與丁基醯氨聚合的化合物 (如圖一，

undeca-2E,4Z-diene-8,10-diynoic acid isobutylamide，化合物 1)。紫錐菊之親脂性化合物的碳鏈碳數通常在 11 至 16 之間。根據 Thomsen (2012) 研究顯示紫錐菊之親脂性化合物在三種紫錐菊中差異很大，白花紫錐菊根部大部分為酮烯/炔類；紫花紫錐菊和狹葉紫錐菊根部大部分為烷醯胺類。紫花紫錐菊中含量最高的烷醯胺類為 dodeca-2E,4E,8Z,10E/Z- tetraenoic acid isobutylamide 與其同分異構物 (圖一，化合物 13 和 14)。

(二) 咖啡酸衍生物

紫錐菊所含之咖啡酸衍生物有五種，皆為酚類化合物。來自咖啡酸與酒石酸 (tartaric acid) 反應產生的卡夫塔酸 (caftaric acid) 和菊苣酸 (cichoric acid)、與奎寧酸 (quinic acid) 反應產生的綠櫞酸 (chlorogenic acid) 和洋薊酸 (cynarin)、與糖苷 (glycoside) 反應產生的紫錐菊苷 (echinacoside)，其反應途徑及結構如圖二。五種咖啡酸衍生物的分布會隨紫錐菊品種和生長地區而有差異，例如：狹葉紫錐菊和白花紫錐菊含有紫錐菊苷，而紫花紫錐菊中並未發現，但是在丹麥、中國以及臺灣的紫錐菊根部之研究顯示其含有紫錐菊苷 (Thomsen, 2012)。此外，依大部分研究可歸納出紫花紫錐菊含有菊苣酸和卡夫塔酸；白花紫錐菊含有

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(Binns et al., 2001; Pietta et al., 2004; Sabra et al., 2012; Thomsen et al., 2012)。

1. 卡夫塔酸 (caftaric acid)

其分子式為 C13H12O9，為葡萄、萵苣、菠菜和酒中主要的非類黃酮的酚類化合物，具有氫氧自由基，可作為抗氧化劑 (Singleton et al., 1985; Gonthier et al., 2006)。大鼠吸收卡夫塔酸後在 10 至 20 分鐘後能在血漿及腎臟測得，亦可在一些老鼠的大腦中測得，而肝臟與尿液中並未測得。被吸收之卡夫塔酸會轉變為 fertaric acid，並在腎臟被代謝 (Vanzo et al., 2007)。在臺灣栽種之紫花紫錐菊的咖啡酸衍生物中含量僅次於菊苣酸，為咖啡酸衍生物次多的活性成分 (張，

2005；吳，2007；Lin et al., 2011)。

2. 綠櫞酸 (chlorogenic acid)

別名為氯原酸，其分子式為 C16H18O9，為咖啡中主要的酚類化合物，其具抗氧化能力 (Olthof et al., 2001)、能清除破壞力強的羥基自由基 (Moure et al., 2001)，與抑制突變和致癌性的亞硝基化合物 (Kono et al., 1995)，另也可以保護 DNA 不受到損害 (Shibata et al., 1999)，及抑制由亞麻油酸生成之共軛雙烯 (Ohnishi et al., 1994)。

3. 菊苣酸 (cichoric acid)

其分子式為 C22H18O12，為紫花紫錐菊中主要的活性成分。研究指出，紫錐菊萃取之菊苣酸可以提高人體免疫能力，且不論在體內或體外皆具有促進巨噬細胞的吞噬作用能力 (Bauer and Wagner, 1991; Letchamo et al., 1999)，並且抑制 HIV type I 病毒的複製能力及其接合酶 (integrase) 的活性 (King and Robinson, 1998; Robinson, 1998; King et al., 1999)。研究也指出，結締組織外圍的成分若是被透明質酸酶降解，會增加發炎反應，而紫錐菊之菊苣酸會抑制透明質酸酶 (hyaluronidase)，保護第三型膠原蛋白 (collagen type Ⅲ) 免於

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被自由基攻擊而降解 (Bauer and Wagner, 1991; Facino et al., 1995)，

故能減減少後續的發炎反應。

4. 洋薊酸 (cynarin)

其分子式為 C25H24O12。含有洋薊酸之萃取物具有治療肝膽或膽固醇代謝的疾病以及高脂血症 (hyperlipidaemia)，且具有強抗氧化力，

能清除 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 和 ABTS [2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)] 自由基 ( 分別為 EC50 = 14.09 和 28.85 μM) (Jun et al., 2007)。

5. 紫錐菊苷 (echinacoside)

其分子式為 C35H46O20，為紫錐菊最早被分離出來的化合物。狹葉紫錐菊和白花紫錐菊含有紫錐菊苷，但在紫花紫錐菊中含量很低或是未被發現 (Thomsen, 2012)。此成分可以保護結締組織不受到超氧陰離子和羥基自由基的攻擊而降解，因此，與菊苣酸皆具有抗發炎作用，且可促進傷口癒合 (Facino et al., 1995; Speroni et al., 2002)。

另外，紫錐菊苷也具有抗濾過性病毒的能力，可做為抗菌劑 (Bauer and Wagner, 1991; Bergeron et al., 2000)。

(23)

圖一、紫錐菊之 21 種主要親脂性化合物的結構式

Fig. 1. Chemical structures of the main 21 lipophilic compounds of E. purpurea.

ALipophilic compounds found in E. purpurea roots. ^BLipophilic compounds found in aerial parts of E. purpurea. ^CLipophilic compounds found in E. pallida roots (Thomsen, 2012).

(24)

圖二、紫錐菊品種所含之五種咖啡酸衍生物的結構式及其生合成途徑

Fig. 2. Chemical structures and biosynthetic pathway of the five caffeic acid derivatives in Echinacea species. (Thomsen, 2012).

(25)

三、紫錐菊之藥理作用

紫錐菊早在二十世紀以前就被廣泛的使用，美洲的原住民大量地使用紫錐菊治療各種疑難雜症，包括咳嗽、牙痛、發炎和性病等，或是一些蛇蟲咬傷、外傷與發炎症狀，為原住民提升身體免疫力的傳統藥用植物之一 (邱，

2001；Flannery, 1999)，二十世紀後紫錐菊被廣泛地用來治療外傷，如創傷、

燒傷和蚊蟲咬傷，以及內傷，如牙痛、頭痛、胃痙攣、咳嗽、畏寒、麻疹和淋病 (Bauer and Wagner, 1991)。

(一) 免疫調節

紫錐菊的主要功效為刺激和調節免疫系統。其萃取物可以活化殺手細胞，

並且會刺激巨噬細胞株 RAW264.7 之 TNF-α 與 NOS 蛋白質的表現，促進一氧化氮 (NO) 產生，NO 可以與活性氧物質結合形成具破壞性的氮氧自由基，

是巨噬細胞狙殺病原菌的方式 (郭等，2006；Lee et al., 2010)。此外，紫錐菊萃取物可調節樹突細胞的分化和樹突細胞中特定免疫相關基因的表現，且施用菊苣酸或正丁醇萃取之紫錐菊作用在人類未成熟的樹突細胞 (human immature dendritic cells) 四小時後，樹突細胞會產生細胞激素 cytokines (IL- 8、IL-1β、和 IL-18) 以及 chemokines (CXCL 2、CCL 5 和 CCL 2)，並提高抗氧化蛋白以及細胞骨架蛋白的表現量，而樹突細胞為免疫系統中重要的抗原呈現細胞，此結果與紫錐菊萃取物調解人體免疫功能有很大的關聯 (Wang et al., 2006; Wang et al., 2008)。

近年來許多研究也關注紫錐菊之烷醯胺類與免疫調節的關係，烷醯胺類可以活化人體細胞上的第一型以及第二型大麻素受體 (cannabinoid receptor 1, CB1; cannabinoid receptor 2, CB2)，CB1 主要存在大腦，參與許多大腦活動的調節，包括認知、記憶、學習以及運動協調，CB2 主要分布脾臟邊緣區、

扁桃腺或免疫細胞 (B 細胞、單核細胞和 T 細胞) 等免疫系統重要器官和細胞，與紫錐菊能增強免疫能力有相當大的關連 (Woelkart et al., 2005; Demuth

(26)

and Molleman, 2006; Woelkart and Bauer, 2007)。

(二) 抗氧化

近年來許多研究指出自由基會促進脂質的過氧化，造成 DNA 斷裂，並氧化細胞內的有機分子，造成細胞老化、突變甚至死亡，因此，當體內自由基或活性氧物質增加時，易造成細胞、組織和器官的損傷，並可能引發其他系統性疾病或癌症等 (McCord, 2000; Moskovitz et al., 2002)。酚類化合物常被認為是植物體內的抗氧化劑，因為酚類化合物具有許多氫氧基，可藉由釋放氫氧基上的氫原子與自由基作用，而不成對之電子可在酚類的苯環結構上形成穩定的共振結構 (resonating structure) (古，2006)。許多研究指出紫錐菊萃取物之酚類與咖啡酸衍生物具有抗氧化活性，能抑制脂質的過氧化，並且可以清除自由基 (Speroni et al., 2002; Thomsen, 2012; Yu et al., 2013)。紫錐菊萃取物 (10 μg mL^-1) 可達到約 50% DPPH 清除能力 [同濃度之抗壞血酸 (ascorbic acid) 約 94%、丁基羥苯甲醚 (BHA) 約 90%和生育醇 (α-tocopherol) 約 40%] (Tsai et al., 2012)。紫錐菊萃取物 (0.1 mg mL^-1) 的總抗氧化能力 (Trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC) 為同濃度之抗壞血酸的 30%；

紫錐菊萃取物 (2.0 mg mL^-1) 之還原力 (reducing power) 可達抗壞血酸的 65%；與二價鐵螯合能力約為 EDTA 的 70%，其超氧陰離子清除能力相當於 90%的抗壞血酸 (Lee et al., 2009)。

(三) 抗菌

紫錐菊之綠櫞酸會結合和破壞細菌外膜，導致細胞的死亡，具有抗革藍氏陰性菌和陽性菌的活性 (Lou et al., 2011)。不同品種之紫錐菊萃取液對不同細菌的抗性不盡相同 (Sharma et al., 2008)。紫錐菊萃取物對於部分具有致病性的呼吸道感染細菌有直接地殺菌作用，且可以減少病原菌的傳播，緩解感染或感冒症狀 (Hudson, 2010)。

(27)

紫錐菊萃取物具有抗真菌的功效，包括臨床相關致病性真菌。以正己烷 萃取之紫錐菊可以抑制酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae、Candida shehata、

C. kefyr、C. albicans、C. steatulytica 和 C. tropicalis) 的生長 (Binns et al., 2000)。

不同品種紫錐菊萃取物對不同品種真菌的抑制效果不同，但紫錐菊根部萃取物對大部分的病原性真菌皆有抑制作用 (Merali et al., 2003)。

(五) 抗病毒

紫錐菊之酚類化合物具有抗病毒的能力。紫錐菊製劑能防止和控制上呼吸道感染 (upper respiratory infections, URIs)，而上呼吸道感染主要是由病毒所引起，與紫錐菊具抗病毒能力有關 (Barrett, 2003)。此外，紫錐菊之菊苣酸具有抗病毒的能力，可以抑制 HIV type I 病毒的複製能力以及其接合酶的 活性，並且可以抗單純皰疹病毒 (Herpes simplex virus, HSV) (King and Robinson, 1998; Robinson, 1998; King et al., 1999; Binns et al., 2002)。綠櫞酸也被研究指出可作為 A 型流感病毒 H5N1 神經氨酸酶 (neuraminidase) 的抑制劑 (Luo et al., 2011)；神經氨酸酶存在於病毒表面，其被阻斷能使病毒無法離開人體細胞，減緩細胞感染。

(六) 抗致突變

近年研究顯示紫錐菊具有抑制沙門氏菌的致突變性。市售的紫錐菊產品可以抑制沙門氏菌 TA 1535/pSK1002 菌株的致突變活性，另外，紫錐菊之乙醇萃取物能強力抑制沙門氏菌 TA98 和 TA100 的致突變性 (Caillet et al., 2011;

Tsai et al., 2012)。

(七) 抗發炎

紫錐菊萃取物具有抗發炎的功效，烷醯胺類可以抑制環氧合酶 (cyclooxygenase-2, COX-2) 的活性以及前列腺素 E2的產生 (Thomsen, 2012)。

在發炎部位常發現大量 COX-2 存在，而抑制 COX-2 可以減輕發炎的症狀。

另外，紫錐菊萃取物能有效抑制脂多醣 (lipopolysaccharide) 刺激之細胞株

(28)

RAW264.7 的 NO 與 TNF-α 產量，以減少後續的發炎反應 (陳等，2012a；

LaLone et al., 2007; Zhai et al., 2009)。另外，研究曾指出紫錐菊的抗發炎作用可能是咖啡酸衍生物與烷醯胺類加乘效應作用的結果 (Zhai et al., 2009)。

四、影響紫錐菊活性成分之要素

(一) 栽培方式

紫錐菊在歐美地區風行已久，而現今紫錐菊幾乎生長在世界各地 (Bauer et al., 1988; Laasonen et al., 2002; Kreft, 2005)，不論是在溫帶、亞熱帶和熱帶地區、低海拔和高海拔、陸地和海岸邊都可以發現其蹤跡 (El- Gengaihi et al., 1998; Stuart and Wills, 2000; Lin et al., 2011)。紫錐菊大部分生長在原產地北美洲貧瘠、日照充足的石礫地，一般土壤栽培可選擇肥力中等的砂質壤土、排水良好且 pH 值介於 6-7 的土壤。根據 Galambosi 等 (1993) 研究顯示，紫花紫錐菊行株距須至少 40 × 40 cm (6-7 plant m^-2)，在第二年可收穫 4.5 kg FW m^-2之紫錐菊。種植於 80 cm³盆栽的紫錐菊於第一年可收穫 210 g FW plant^-1，地上部可達 50 g DW plant^-1。雖然種植密度增加會降低紫花紫錐菊單株的生長及產量，但單位面積的產量會隨密度增加而提高 (Shalaby et al., 1997)。在雜草防除上，因紫錐菊對雜草競爭力低，在栽培過程中可覆蓋塑膠布，不但可節省成本且可以增加植株乾重達 114%，但要注意夏季土溫過高的問題，可能會導致紫錐菊生長遲緩，也可使用除草劑，如莫多草淨 (metolachlor)、大克草 (DCPA)、樂滅草 (oxadiazon)、及施得圃 (pendimethalin) (邱，2001)。

由於傳統的栽種方式常常受限於作物栽種時間過長、遭受病蟲害攻擊和天氣不穩定等因子的影響，植物萃取產量常常供不應求，因此，為了開發更有效率的方法來滿足日益增長的需求，許多研究也轉向植物細胞培養的方式，

(29)

長因子來增加植物細胞的生長、產量以及其活性成分的含量。利用農桿菌 (Agrobacterium rhizogenes) 感染促使植物細胞產生毛狀根，再放入生物反應 器進行培養，在第 15 天以超音波處理六分鐘，可以得到最高的咖啡酸衍生物產量 (菊苣酸含量約可達 18 mg g^-1 DW)，超音波刺激咖啡酸衍生物的增加與細胞內源性 IAA 的生合成和苯丙胺酸解氨酶 (phenylalanine ammonia lyase, PAL) 的活性增加有關 (Liu et al., 2012)。利用不定根栽培來生產紫錐菊之咖啡酸衍生物，20°C 為最佳孵育溫度，而不定根在黑暗中有最高的生質量，但咖啡酸衍生物的累積則是在光照/黑暗比為 3/21 h 最佳 (Wu et al., 2007)。但兩種方法技術需求高，所需經費不貲，目前大量取得植物之二次代謝物仍以傳統栽種方式為主。

(二) 肥培管理

良好的施肥策略不但可以提升作物的產量及品質，也可以減少農業和肥料的施用，不僅節省成本，也可以避免土壤生產力衰退及對環境造成汙染 (陳，1999)。合理的肥培管理的策略包括：(1) 添加作物真正需要的養分；(2) 施用正確的肥料和施用量；(3) 施用在正確的位置，以及 (4) 在正確的時間施肥 (陳，1999)。因此，評估作物的施肥策略需要分析土壤和植體，瞭解土壤養分的高低和植體的營養狀況。氮對植物的生長很重要，氮不只是影響植物生長也會改變植物組織中的二次代謝物含量。而咖啡酸衍生物的前驅物—

咖啡酸合成自莽草酸途徑，其中的關鍵酵素為苯丙胺酸解氨酶。許多研究指出缺氮會增加多種植物中苯丙胺酸解氨酶的活性，而當苯丙胺酸解氨酶被活化後，酚類化合物含量就會增加。另一方面，烷醯胺類的化學式中含有氮，

因此，缺氮並不會增加烷醯胺類的含量。理論上，缺氮會增加咖啡酸衍生物的含量但會減少烷醯胺類的合成 (Thomsen, 2012)。

紫錐菊的肥培管理資料較有限，目前已知肥料施用量提高會增加地上部的產量，但會降低根的產量 (Galambosi et al., 1993)。氮肥、鉀肥和兩者交互

(30)

作用皆會提高紫錐菊的生長和有效成分，不論施用 146 kg N ha^-1、114 kg K ha^-1或是兩者之複合肥料可得最佳生長 (分別為 86.3、72.4 和 90.8 mg DW plant^-1) 及活性成分 (El-Sayed et al., 2012)。但根據 Shalaby 等 (1997) 研究顯示，當氮、鉀肥依不同比例混合施用時，紫錐菊產量並不一定會隨氮肥和鉀肥的施用量增加而提高，適當的氮鉀比才可以得到最佳的紫錐菊生長及產量。一般而言，缺氮會增加咖啡酸衍生物的含量，但沒有任何研究結果顯示紫錐菊在缺氮的情況下咖啡酸衍生物有顯著地增加，但施用氮肥會顯著地增加烷醯胺類的含量 (Thomsen, 2012)。

施用有機質肥料可以改善土壤的物化和生物性質，會影響植物的養分吸收以及各種代謝反應等。有機質在土壤中由微生物及酵素作用而分解，在土壤之碳水化合物會分解而成二氧化碳；水溶性蛋白質分解後成為胺基酸，是胺態氮之來源，然後經過細菌作用而成為硝酸態氮，再被植物利用。除了氮以外，有機質亦提供其他必要元素 (朱，1984)。紫花紫錐菊從移植後到採收期對養分的吸收量呈現持續增加的趨勢，在採收期施用有機質肥料的紫花紫錐菊養分吸收量大於施用化學肥料者，而施用有機質肥料的紫錐菊之氮：磷：

鉀：鈣：鎂等養分吸收量比例約為 6：1：12：4：2，且可以增加其營養要素之絕對吸收速率，其中鉀的絕對吸收率最高 (11.6 mg d^-1)，其餘依次為氮、

鈣、鎂、磷和微量元素等 (蔡等，2001)。

(三) 收穫調製

紫錐菊的活性成分會隨植物生育階段、採收部位、收穫季節、萃取條件、

乾燥方式和溫度，以及貯存容器和溫度等的不同而有差異。根據 Thomsen (2012) 的研究指出，在春天或夏天收穫紫錐菊根部，可以得到高含量的咖啡酸衍生物和一半量的烷醯胺類，且春天收穫紫錐菊根部後，農地可以種植其他經濟作物，夏天收穫則適合一起採收地上部，不建議在秋天收穫紫錐菊，

(31)

含量僅比花低 50%，並不需要分開收集。紫錐菊產量和咖啡酸衍生物含量會隨植物的年齡而增加，地上部則建議每年採收 (Thomsen, 2012)。地上部可在紫錐菊結花苞時採收，可得最高的咖啡酸衍生物含量，但在花凋謝期烷醯胺類的含量最高，且烷醯胺類與咖啡酸衍生物的總產量較高 (Thomsen, 2012)。紫錐菊採收後以冷凍乾燥處理會保存較多的有效成分，在萃取的過程中以 70%甲醇超音波萃取兩次可以得到 95%的咖啡酸衍生物及總酚類化合物，且超音波萃取會比震盪萃取效果好 (林，2003)。將紫錐菊乾燥樣品放置在 24°C 下貯存 64 週後，會有超過 80%烷醯胺類降解 (Perry et al., 2000)。

(四) 逆境誘導

當植物受到生物或非生物性逆境時，會被刺激產生和累積二次代謝物，

因此，可以利用植物面對逆境的反應，來提高藥用植物的品質。兩種常用的方法為 (1) 添加外源性誘引劑 (elicitors)，在植物遭遇逆境時誘引劑可誘發植物產生防禦機制，為誘發二次代謝物合成的信號；與 (2) 從外部給予植物逆境，皆可以誘發或調節植物二次代謝物的生合成 (Thomsen, 2012)。烷醯胺類在刺激逆境相關之基因中扮演重要的角色 (Méndez-Bravo et al., 2011)，

由外部施用茉莉酸甲酯於白花紫錐菊的地上部，其根部之烷醯胺類會受到誘導而增加 (Binns et al., 2001)。咖啡酸衍生的合成與其前驅物—肉桂酸 (cinnamic acid) 息息相關，而肉桂酸是由苯丙胺酸經過苯丙胺酸解氨酶反應後的產物 (Dixon and Paiva, 1995; Winkel-Shirley, 2001)，故可活化苯丙胺酸解氨酶的物質，皆具有作為增加咖啡酸衍生物含量之誘引劑的潛力 (如 H2O2、茉莉酸甲酯和水楊酸)。根據 Thomsen (2012) 研究結果指出施加 H2O2會減少紫錐菊葉的烷醯胺類含量，雖然咖啡酸衍生物在花中的含量增加，但在葉中並沒有顯著差異，而茉莉酸甲酯對紫錐菊的二次代謝物並沒有顯著的影響。

在紫錐菊不定根中添加除草劑嘉磷塞也並未如預期地增加紫錐菊的二次代謝物含量，反而抑制不定根咖啡酸衍生物的合成，且發現莽草酸脫氫酶

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(shikimate dehydrogenase, SKDH)、分支酸變位酶 (chorismate mutase, CM) 和苯丙胺酸解氨酶與酚類、黃酮類和咖啡酸衍生物含量的改變並沒有直接關係 (Mobin et al., 2015)。在鹽逆境的誘導下，狹葉紫錐菊在 50 mM 氯化鈉處理後，大部分烷醯胺類和酚類化合物相對增加；紫花紫錐菊在 50 和 75 mM 氯化鈉處理後，根的乾重增加 (分別為 121 和 117%)，雖然烷醯胺類沒有明顯差異，但總咖啡酸衍生物含量皆增加 (Sabra et al., 2012)。眾多研究都顯示，

不論是傳統栽培或是細胞培養，以逆境誘導紫錐菊增加二次代謝物含量結果不盡相同，仍需要更進一步的研究才能有效地增加植物的有效成分。

(五) 二次代謝物之前驅物

許多二次代謝物是由莽草酸途徑產生，包括咖啡酸衍生物、酚類和黃酮類化合物，此途徑會受到其所需的蛋白質或中間產物的調控，故添加前驅物也可作為在細胞培養下，增加植物二次代謝產物的方法之一。在紫錐菊不定根栽培中添加咖啡酸衍生物之前驅物—苯丙胺酸和色胺酸，會增加紫錐菊不定根的生長和二次代謝物的累積 (Mobin et al., 2015)。

(33)

第三章、研究目的

本研究的目的在探討不同氮肥和施用量對紫錐菊的生長及咖啡酸衍生物含量的影響，並調查不同採收時間對紫錐菊的生長及咖啡酸衍生物含量的影響。

作為栽種紫錐菊的肥培管理和收獲之參考，建立營養管理與活性成分的關係。

(34)

第四章材料與方法

材料

一、試驗地點與時間

自 2013 年 12 月 4 日至 2014 年 7 月 24 日，於臺灣大學農場溫室 (121°32’

27” E, 25°0’ 54” N) 中進行栽種。

二、土壤

試驗用之土壤採集自桃園縣新屋區。屬美國土壤分類之 Hapludults，其基本性質如表一所示。

三、肥料

(一) 有機質肥料：使用市售肥料，為禽畜糞肥，其基本性質如表二所示。

(二) 化學肥料：以硝酸鉀和磷酸二氫鈣作為基肥，尿素作為追肥。

四、試驗作物

紫花紫錐菊 (Echinacea purpurea)，種子由行政院農業委員會臺中區農 業改良場提供。將種子與砂 (1：1，w/w) 混合，至於塑膠袋保持 10%含水量，經六週低溫層積處理 (4°C) (邱等，2001)，於 2013 年 12 月 4 日進行穴盤育苗，介質為珍珠石和泥炭土以 (1：1，v/v) 比例混合，種子發芽後生長至 4-5 片葉子時移植盆栽。

(35)

表一、土壤之物理和化學性質

Table 1. Physical and chemical properties of the soil Physical properties

Sand (g kg^-1) 520

Silt (g kg^-1) 470

Clay (g kg^-1) 10

Texture Sandy loam

Chemical properties

pH (1:1) 4.7

EC^a (dS m^-1) 1.2

Total nitrogen (g kg^-1) 2.5

M-Ⅲ^b phosphorus (mg kg^-1) 87

M-Ⅲ^b potassium (mg kg^-1) 134

M-Ⅲ^b calcium (mg kg^-1) 84

M-Ⅲ^b magnesium (mg kg^-1) 127

M-Ⅲ^b iron (mg kg^-1) 564

M-Ⅲ^b manganese (mg kg^-1) 30

M-Ⅲ^b copper (mg kg^-1) 2.5

M-Ⅲ^b zinc (mg kg^-1) 8.0

Organic matter (g kg^-1) 55

a EC: electrical conductivity of saturated extract. ^b M-Ⅲ: Mehlich Ⅲ extractable.

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表二、本試驗施用的有機質肥料之基本性質

Table 2. Chemical properties of the organic fertilizer used in the experiment

pH (1:10) 5.0

EC^a (1:5) (dS m^-1) 13.7

Total nitrogen (g kg^-1 DW^b) 46.7

Total phosphorus (g kg^-1 DW^b) 18.1

Total potassium (g kg^-1 DW^b) 17.5

Total calcium (g kg^-1 DW^b) 15.1

Total magnesium (g kg^-1 DW^b) 18.6

Total copper (mg kg^-1 DW^b) 32.2

Total zinc (mg kg^-1 DW^b) 142

Total cadmium (mg kg^-1 DW^b) 1.0

Total nickel (mg kg^-1 DW^b) 1.3

Total lead (mg kg^-1 DW^b) nd^c

Organic matter (g kg^-1 DW^b) 855

Water content (g kg^-1 FW^d) 677

a EC: electrical conductivity. ^bDW: dry weight.^c nd: not detected. ^d FW: fresh weight.

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方法

一、試驗設計與處理

採盆栽試驗，於 2014 年 1 月 25 日將將生長三到四葉之紫錐菊幼苗植入盆栽，每盆含有四公斤風乾土壤，且每盆種植一株紫錐菊。試驗期間月均溫介於 15 至 35°C，相對濕度於 60-85%，每日以自來水適量澆灌。採完全隨機排列 (completely randomized design, CRD)，試驗之變因為肥料和氮施用量。化學肥料以基肥和追肥的形式施用，以硝酸鉀和磷酸二氫鈣作為基肥，以尿素作為追肥。

依據 Shalaby 等 (1997)、Chen 等 (2008) 及 El-Sayed 等 (2012)，化學肥料基肥施用約 100 kg N ha^-1，並假設有機質肥料的礦化速率為 50%，依化學肥料之氮施用量，計算有機質肥料施用量。於 2014 年 5 月 5 日 (移植後第 100 天) 進行第一次追肥，2014 年 6 月 4 日 (移植後第 130 天) 進行第二次追肥；有機質肥料為一次施用，不施加追肥。本試驗共有七種處理，每處理種植 16 株紫錐菊，每次採樣隨機採收四株。所有盆栽加入六克碳酸鈣調整土壤 pH 值至約 6.0，經過 24 小時候進行處理。七種處理分別為：

(一) 空白 (Control)：不施用肥料。

(二) 化學氮肥 (Chem 1)：施用 0.20 g N plot^-1、0.30 g P plot^-1和 0.56 g K plot^-1作為基肥；第一次追肥施 0.20 g N plot^-1，不進行第二次追肥。因此，共施用 0.40 g N plot^-1。

(三) 兩倍化學氮肥 (Chem 2)：施用 0.20 g N plot^-1、0.30 g P plot^-1和 0.56 g K plot^-

1作為基肥；第一次追肥施 0.20 g N plot^-1，第二次施 0.40 g N plot^-1。因此，

共施用 0.80 g N plot^-1。

(四) 三倍化學氮肥 (Chem 3) ：施用 0.20 g N plot^-1、0.30 g P plot^-1和 0.56 g K plot^-

1作為基肥；第一次追肥施 0.20 g N plot^-1，第二次施 0.80 g N plot^-1。因此，

共施用 1.20 g N plot^-1。

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(五) 有機質肥料 (Org 1)：施 0.80 g N plot^-1、0.31 g P plot^-1和 0.3 g K plot^-1之有機質肥料，全部以基肥施入，不進行追肥。

(六) 兩倍有機質肥料 (Org 2)：施 1.60 g N plot^-1、0.62 g P plot^-1和 0.6 g K plot^-1之有機質肥料，全部以基肥施入，不進行追肥。

(七) 三倍有機質肥料 (Org 3)：施 2.40 g N plot^-1、0.93 g P plot^-1和 0.9 g K plot^-1之有機質肥料，全部以基肥施入，不進行追肥。

二、採樣

第一次採收時間為 2014 年 6 月 24 日 (移植後 150 天，150 days after transplanting，150 DAT) ，紫錐菊尚未抽台開花，於每處理的 16 株紫錐菊中隨機採收四株並採集盆栽土樣；第二次採收時間為 2014 年 7 月 24 日 (移植後 180 天，180 DAT)，此時紫錐菊進入開花期，於每處理之剩餘植株中隨機採收四株紫錐菊全株並採集盆栽土樣。

三、樣品處理

紫錐菊採收後，分為地上部和根部，依序以自來水和去離子水沖洗，隨後放入紙袋中以 45°C 烘乾至恆重。以高速粉碎機 (Pulverizing Machine RT-02B, Rong Tsong Precision Technology Co., Taichung, Taiwan) 磨成粉末狀，用於後續分析。

四、樣品分析

(一) 試劑

1. 硝酸 - 釩酸 -鉬酸呈色液：溶解 25 g 鉬酸銨 (ammonium molybdate ， (NH4)6Mo7O24∙4H2O) 於 400 mL 純水中，此為 A 液。溶解 1.25 g 偏釩酸銨 (ammonium metavanadate，NH VO ) 於 300 mL 沸水中，冷卻後加入 250

(39)

mL 濃硝酸，冷卻，此為 B 液。將 B 液倒入 100 mL 量瓶中，再倒入 A 液，

混合後，加純水稀釋成 1,000 mL。

2. Mehlich Ⅲ萃取劑 (Mehlich Ⅲ extraction mixture) (Mehlich, 1984)：0.2 N 醋酸、0.25 N 硝酸銨、0.015 N 氟化銨、0.013 N 硝酸及 0.001 M EDTA。

(1) Mehlich Ⅲ儲備液：加入 277.8 g 氟化銨與 146.1 g ETDA 於 1,200 mL 去離子水中，稀釋 2 L 定量瓶並混合之。

(2) 秤取 1,000 g 硝酸銨於 40 L 純水中，加入 200 mL Mehlich Ⅲ儲備液，再加入 575 mL 醋酸及 41 mL 硝酸，以純水稀釋至 50 mL 並混合。此溶液之 pH 值為 2.5 ± 0.1。

3. 單一試劑 (single solution)

(1) 5 N 硫酸溶液：將 70 mL 濃硫酸稀釋至 500 mL。

(2) 0.07 M 鉬酸銨溶液：將 20 g 鉬酸銨溶於去離子水中並定量至 500 mL。

(3) 0.1 M 抗壞血酸 (ascorbic acid) 溶液：將 1.32 g 抗壞血酸溶於 75 mL 去離子水。

(4) 酒石酸銻鉀 (1 g Sb L^-1) 溶液：將 0.2743 g 酒石酸銻鉀 (KSbC4H4O7) 溶於去離子水並定量至 1,000 mL。

(5) 250 mL 混合液：將 125 mL 5 N 硫酸、37.5 mL 鉬酸銨、75 mL 抗壞血酸及 12.5 mL 酒石酸銻鉀混合後即可使用，但由於抗壞血酸易氧化，所以混合液不宜放置 24 小時以上，抗壞血酸宜於使用前加入。

4. 1 N 福林酚試劑 (Folin-Ciocalteu’s phenol reagent) ：取 50 mL Folin- Ciocalteu’s phenol reagent，以去離子水定量至 100 mL。

5. 20%碳酸鈉 (Na2CO3) 溶液：取 100 g 碳酸鈉，以去離子水定量至 500 mL。

(40)

(二) 有機質肥料基本性質分析 (國立中興大學土壤調查試驗中心，2012) 1. pH 值 (1 : 10，w/v)

秤 5 g 堆肥樣品於燒杯中，加入 50 mL 去離子水，攪拌均勻後靜置一小時 (期間偶爾攪拌)，以 pH 計測定。

2. 電導度 (EC) (1 : 5，w/v)

秤 10 g 堆堆肥樣品於燒杯中，加入 50 mL 去離子水，攪拌均勻後靜置六十分鐘 (期間偶爾攪拌)。以 Whatman No. 1 濾紙抽氣過濾，所得之濾液以電導度計測定。

3. 總氮

(1) 精秤 0.3 g 樣品置於分解管中，加入 0.2 g 水楊酸 (salicylic acid)，及 7 mL 濃硫酸混合均勻後靜置過夜 (需將分解管封口，避免吸入氨氣)，於加熱前加入 0.3 g 硫代硫酸鈉 (Na2S2O3)。

(2) 以微火加熱 (100°C) 至不產生泡沬時，以每 20-30 分鐘升溫 50°C 的速度加熱至 350°C，於 350°C 加熱至固體分解 (分解液呈醬油色)。

(3) 取出分解管待冷卻後加入 2 mL 30%過氧化氫，繼續以 350°C 加熱至澄清，並使過氧化氫分解 (約需 20 分鐘)。

(4) 未澄清，則重覆步驟 (3) 至澄清為止。

(5) 待冷卻後，加入少量去離子水使分解液釋出部分稀釋熱。

(6) 將分解液定量至 50 mL，均勻混合後以 Whatman No. 1 濾紙過濾，裝置塑膠瓶中貯藏待測。

(7) 以蒸氮法測定總氮。

4. 磷

(1) 精秤 0.4 g 樣品置於分解管中，加入 6 mL 二酸 (濃硝酸：濃過氯酸 = 4：1)，混合均勻後靜置過夜。

(2) 將分解管置於高溫爐緩慢加熱至 200°C，持續加熱至澄清狀態。

(41)

(4) 取適量分解液於 50 mL 定量瓶中，加水約 20 mL，再加入硝酸-釩酸-鉬酸呈色液 10 mL，混合後加去離子水至刻度，混合均勻。

(5) 靜置 30 分鐘，以分光光度計 (Beckman DU-640 spectrophotometer, Beckman Instituments Inc., CA, USA) 在 420 nm 下測定吸光值

(6) 標準液磷之終濃度為 0、2、4、6、8 和 10 mg L^-1。 5. 鉀

將磷測定之分解液經適當的稀釋後，鉀以火焰光度計 (Clincal Flame Photometer 410C, Sherwood, Scientific, Ltd, Combridge, UK) 測定。

6. 鈣、鎂、銅、鋅、鎘、鎳與鉛

將總氮測定之分解液經適當的稀釋後，鈣、鎂、銅、鋅、鎘、鎳與鉛以原子吸收光光譜儀 (Atomic Absorption Spectrophotometer, Hitachi 180- 30, Tokyo, Japan) 測定。

7. 水分含量測定

秤取樣品約 3 g (S1)，在烘箱內以 105°C 之溫度烘乾四小時，放置乾燥皿內冷卻，秤出其乾燥損失之重量 (a) 以計算試樣中之水分含量。其計算如下：

水分含量 (%) = a / S1 × 100 8. 有機質測定

(1) 記錄坩堝 (經 600°C 灼熱兩小時，放冷後) 空重。

(2) 秤取樣品約 2 g (W)，在高溫爐內以 600°C 下加熱四小時後，移至乾燥皿中冷卻，秤其殘留灰分重量 (Wb)。

(3) 計算試樣之有機質含量及有機碳含量。其計算公式如下：

(4) 有機質含量 (g kg^-1) = (W − Wb)/W × 1000 有機碳含量 (g kg^-1) = 有機質含量× 0.46

(42)

(三) 土壤基本性質分析 1. 質地 (Gee et al., 1986)

(1) 秤 50 g (W) 風乾土置於 500 mL 燒杯中，加入 200 mL 去離子水充分攪拌。

(2) 加入 10 mL 50 g kg^-1偏磷酸鈉溶液，並加入去離子水至離杯口約三分之二處，將杯至於攪拌器下攪拌。

(3) 攪拌後，將全部懸濁液移入 1,000 mL 量筒內，並加去離子水至 1,000 mL。

(4) 用攪拌槳上下攪動 20 次，取出開始計時。

(5) 20 秒後，輕放入比重計，不使上下振動，待 40 秒時，記錄比重計讀數 (Ps)，此值為黏土與坋土合量。

(6) 重新用攪拌槳上下攪動，靜置兩小時後，放入比重計讀取讀數 (Pc)，此值為黏土量。

(7) 計算：

Sand (g kg^-1) = 1000 – (Ps/W) × 1000 Clay (g kg^-1) = (Pc/W) × 100%

Silt (g kg^-1) = 1000 – (Sand + Clay) 2. pH 值 (1 : 1) (McLean, 1982)

秤 20 g 土壤於 100 mL 塑膠燒杯中，加入 20 mL 去離子水，以玻棒攪拌均勻後靜置一小時 (期間偶爾攪拌)，以 pH 計測定。

3. 飽和水導電度 (Rhoades, 1982)

秤 50 g 土壤於 100 mL 塑膠燒杯中，加入去離子水使土壤達飽和，攪拌均勻後靜置一小時 (期間偶爾攪拌)。以 Whatman No. 1 濾紙抽氣過濾，

所得之濾液以電導度計測定。

4. 總氮 (Bremner, 1965)

(43)

(1) 秤取 1 g 土壤置於分解管中，加入 2 mL 去離子水靜置 30 分鐘，加入 1.1 g 分解物促進劑 (硫酸鉀：硫酸銅：硒 = 100：10：1)，加入 0.2 g 水楊酸及 8 mL 濃硫酸，混合均勻後靜置過夜 (需將分解管封口，避免吸入氨氣) ，於加熱前加入 0.3 g 硫代硫酸鈉。

(2) 以微火加熱 (100°C) 至不產生泡沬時，以每 20-30 分鐘升溫 50°C 的速度加熱至 350°C，於 350°C 加熱至固體分解 (分解液呈醬油色)。

(3) 取出分解管待冷卻後加入 2 mL 30%過氧化氫，繼續以 350°C 加熱至澄清，並使過氧化氫分解 (約需 20 分鐘)。

(4) 未澄清，則重覆步驟 (3) 至澄清為止。

(5) 待冷卻後，加入少量去離子水使分解液釋出部分稀釋熱。

(6) 將分解液定量至 50 mL，均勻混合後以 Whatman No. 1 濾紙過濾，裝至塑膠瓶中貯藏待測。

(7) 以蒸氮法測定總氮。

5. 無機態氮 (Bremner, 1965)

(1) 取 4 g 土壤樣品置於 50 mL 離心管中，加入 40 mL 2 M 氯化鉀溶液震盪萃取兩小時，過濾後儲存於塑膠瓶待用。

(2) 取 50 mL 上述萃取液，加入適量氧化鎂和 Devarda 合金粉，以蒸餾法測定無機態氮含量。

6. Mehlich Ⅲ可萃取性磷 (Mehlich, 1984)

(1) 秤取 4 cm³的土壤於 50 mL 離心管中，加入 40 mL Mehlich Ⅲ萃取劑振盪五分鐘 (200 rpm)，以 Whatman No. 1 濾紙過濾，以鉬藍法測定磷濃度。

(2) 取適量濾液於 50 mL 定量瓶中，添加去離子水使總體積約 40 mL，再加入 8 mL 單一試劑後定量至 50 mL，並均勻混合。

(3) 呈色 30 分鐘後，以分光光度計於波長 882 nm 下測定其吸光值。

7. Mehlich Ⅲ可萃取性鉀、鈣、鎂、鐵、錳、銅與鋅 (Mehlich, 1984)

(44)

(1) 秤取 4 cm³的土壤於 50 mL 離心管中，加入 40 mL Mehlich Ⅲ萃取劑振盪五分鐘 (200 rpm)，以 Whatman No. 1 濾紙過濾。

(2) 濾液經適當稀釋後，以火焰光度計測定鉀濃度，以原子吸收光譜儀測定鈣、鎂、鐵、錳、銅與鋅濃度。

8. 有機質測定 (Soon and Abboud, 1991) (1) 記錄乾淨之坩堝重 (W0)。

(2) 秤取約 20 g 土壤，在 105°C 之溫度下加熱兩小時，放置乾燥皿內冷卻至室溫後秤重 (W1)。

(3) 置於高溫爐中 250°C 下加熱兩小時，再於 375°C 下加熱 16 小時，停止加熱後，在高溫爐中冷卻至約 200°C 時，放入乾燥皿中冷卻至室溫後秤重 (W2)。

(4) 計算土壤之有機質含量。其計算公式如下：

有機質含量 (g kg^-1) = (W1 – W2) / (W1 – W0)×1000 (四) 植體分析

1. 總氮

如 (二) 之 3 分析法。

2. 磷：消解後，以修正張 (1981) 與 Horwitz 等 (1975) 之鉬黃法測定。

(1) 精秤 0.2 g 樣品置於分解管中，加入 4 mL 二酸 (濃硝酸：濃過氯酸 = 4：1)，混合均勻後靜置過夜。

(2) 將分解管置於高溫爐緩慢加熱至 200°C，持續加熱至澄清狀態。

(3) 待分解完成後，取出冷卻，將分解液定量至 50 mL。

(4) 取適量分解液於 50 mL 定量瓶中，加水約 20 mL，再加入硝酸-釩酸-鉬酸呈色液 10 mL，混合後加去離子水至刻度，混合均勻。

(5) 靜置 30 分鐘，以分光光度計在 420 nm 下測定吸光值 (6) 標準液磷之終濃度為 0、2、4、6、8 和 10 mg L^-1。

(45)

將磷測定之分解液經適當的稀釋後，鉀以火焰光度計測定。

4. 鈣、鎂、鐵、錳、銅與鋅

將磷測定之分解液經適當的稀釋後，鈣、鎂、銅、鋅、鎘、鎳與鉛以原子吸收光光譜儀測定。

5. 總酚及咖啡酸衍生物萃取液之製備：以修正 Bergeron 等 (2000) 之方法萃取。

(1) 取 0.5 g 烘乾磨碎之樣品，加入 8 mL 70%乙醇溶液後振盪混合均勻。

(2) 於常溫水浴中進行超音波振盪 30 分鐘。

(3) 以 2,000 rpm (CN-5120, HsiangTai, Taipei, Taiwan) 離心 10 分鐘後取上清液。

(4) 重複萃取三次後，收集上清液混合，將萃取液定量至 25 mL。

(5) 以孔徑 0.22 μm 之 PTFE syringe filter 過濾，貯存至−20°C。

6. 總酚含量測定 (Kujala et al., 2000)

(1) 取 1.0 mL 稀釋萃取液 (萃取液：70%乙醇 = 1：9) 於試管中，加入 0.5 mL 1 N 福林酚試劑 (Folin-Ciocalteu’s reagent)，均勻混合後靜置五分鐘。

(2) 加入 2.0 mL 20%碳酸鈉溶液，均勻混合後於室溫下靜置十分鐘。

(3) 以 3,000 rpm 離心八分鐘後取上清液。

(4) 於波長 730 nm 下進行吸光值測定，總酚含量以每克樣品中所含等當量沒食子酸毫克數表示 (g gallic acid kg^-1)。

(5) 標準液為 0、10、20、40、60 和 80 mg L^-1沒食子酸溶液。

7. 咖啡酸衍生物分析 (Bergeron et al., 2000)

(1) 標準品製備：分別將四種標準品以 70%乙醇溶解，以孔徑 0.22 μm 之 PTFE syringe filter 過濾，配置成不同濃度以製作標準品檢量線，濃度範圍及檢量線方程式如表五。四種咖啡酸衍生物標準品皆購自 ChromaDex Inc. (Santa Ana, CA, USA)。

(46)

(2) 樣品製備：取 1 mL 萃取液，通過 0.2 μm 微孔濾膜，將過濾後之萃取液以逆向高效液相層析儀 (Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC) 進行分析。咖啡酸衍生物含量以 (μmol g^-1) 表示。

(3) 分析條件

A. 機型：幫浦 (SepetraSYSTEM P100, Thermo Separation Products Inc., Floride, USA)、UV 偵測器 (Aglient HP1100, Agilent Technologies Manufacturing GmbH & Co., Waldbronn, Germany)。

B. 管柱：Mightysil RP-18 GP (4.6 × 250 mm, 5 μm, Kanto Chemicals, Tokyo, Japan)。

C. 移動相：A：含有 0.1% 磷酸 (phosphoric acid) 之超純水，B：含有 0.1% 磷酸之乙腈。使用梯度沖提，參考 Bergeron 等 (2000) 及吳 (2007) 方法，略加調整，條件如表三。

D. 注入體積為 20 μL，流速為 1.0 mL min^-1，波長為 320 nm，滯留時間如表四。

8. 植體養分吸收量計算：植物根及地上部吸收之該養分濃度分別乘以該株植物根及地上部之乾重，兩者相加可得全株該養分吸收量。

五、統計分析

統計方法採用 R 軟體 (2.15.2) 進行 ANOVA 及 Least significant difference (LSD) 分析，各處理間之差異以 P < 0.05 視為顯著差異。

(47)

表三、高效液相層析儀之動相條件

Table 3. Chromatographic conditions of high performance liquid chromatograph Time (min) Flow rate

(mL min^-1) Solvent A ^a Solvent B ^b

0 1 90 10

10 1 87 13

15 1 85 15

24 1 85 15

25 1 80 20

30 1 70 30

a Solvent A: 0.1% phosphoric acid in water. ^b Solvent B: 0.1% phosphoric acid in acetonitrile.

表四、本試驗中五種咖啡酸衍生物標準品之滯留時間

Table 4. The retention time of the five caffeic acid derivatives in this study Caffeic acid derivatives Peak number Retention time (min)

Caftaric acid 1 11.27 ± 0.09

Chlorogenic acid 2 12.36 ± 0.07

Cynarin 3 21.10 ± 0.10

Echinacoside 4 23.10 ± 0.14

Cichoric acid 5 33.40 ± 0.12

氮肥種類與施用量對紫花紫錐菊生長及咖啡酸衍生物含量的影響

國立臺灣大學生物資源暨農學院農業化學系 碩士論文

Department of Agricultural chemistry College of Bio-Resources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

氮肥種類與施用量對紫花紫錐菊生長及咖啡酸衍生物 含量的影響

Effects of Different Nitrogen Fertilizers and Application Rates on the Growth and Caffeic Acid Derivative Contents in

Echinacea purpurea (L.) Moench

盧 逸 Yi Lu

指導教授：鍾仁賜 博士 Advisor: Ren-Shih Chung, Ph. D.

中華民國 104 年 7 月

July, 2015

誌謝

摘要

Abstract

目錄

圖目錄

表目錄

附錄目錄

第一章 前言

第二章 前人研究

一、 紫錐菊簡介

二、 紫錐菊之二次代謝物

三、 紫錐菊之藥理作用

四、 影響紫錐菊活性成分之要素

第三章、研究目的

第四章 材料與方法

材料

一、 試驗地點與時間

二、 土壤

三、 肥料

四、 試驗作物

方法

一、 試驗設計與處理

二、 採樣

三、 樣品處理

四、 樣品分析

五、 統計分析

國立臺灣大學生物資源暨農學院農業化學系碩士論文

氮肥種類與施用量對紫花紫錐菊生長及咖啡酸衍生物含量的影響

盧逸 Yi Lu

指導教授：鍾仁賜博士 Advisor: Ren-Shih Chung, Ph. D.

第一章前言

第二章前人研究

一、紫錐菊簡介

二、紫錐菊之二次代謝物

三、紫錐菊之藥理作用

四、影響紫錐菊活性成分之要素

第四章材料與方法

一、試驗地點與時間

二、土壤

三、肥料

四、試驗作物

一、試驗設計與處理

二、採樣

三、樣品處理

四、樣品分析

五、統計分析