石斑魚及其病原功能基因體研究－子計畫四:開發石斑魚虹彩病毒疫苗

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

子計畫四:開發石斑魚虹彩病毒疫苗

計畫類別： 整合型計畫

計畫編號： NSC91-2317-B-006-002-

執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立成功大學生物科技研究所

計畫主持人： 陳宗嶽 共同主持人： 楊惠郎

計畫參與人員： 林翰佑、陳永茂、粘茂偉

報告類型： 精簡報告

處理方式： 本計畫涉及專利或其他智慧財產權，2 年後可公開查詢

中 華 民 國 92 年 10 月 2 日

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 成 果 報

告 □期

中進度

報 告

石斑魚及其病原功能基因體研究-開發石斑魚虹彩病

毒疫苗

計畫類別： 個別型計畫 □ 整合型計畫

計畫編號：NSC 91－2317－B006－002

執行期間： 91 年 8 月 1 日至 92 年 7 月 31 日

計畫主持人：陳宗嶽

共同主持人：楊惠郎

計畫參與人員： 林翰佑、陳永茂、粘茂偉

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)： 精簡報告 □完整

報告

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究

計畫、列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢

涉及專利或其他智慧財產權，□一年 二年後可公

開查詢

執行單位：國立成功大學生物科技研究所

中 華 民 國 92 年 9 月 22 日

中文摘要：

台灣為世界三大水產養殖國之一，而台灣的養殖技術，尤其是魚苗的孵化，

更是整個東南亞第一，是魚苗與幼魚的重要輸出國。在台灣和東南亞國家中，石 斑魚(Epinephelus spp.)是主要之海水養殖魚類，但是在近幾年來，因為養殖的石 斑魚苗經常受到石斑魚神經壞死病毒(grouper nervous necrosis virus, GNNV)與虹 彩病毒(Iridovirus)的感染，而且死亡率也相當高，因此造成了經濟上的嚴重損 失；除了感染石斑魚以外，神經壞死病毒也造成其他多種養殖魚類的疾病，其中 以鱸魚、河豚、比目魚、鸚哥魚、魚等，而造成養殖漁業的嚴重損失。

目前對石斑魚神經壞死病毒或虹彩病毒的檢測方法主要是 RT-PCR 或 PCR 檢測，但操作較為繁複、費時；另一方面，由於至今仍然沒有一個有效的神經壞 死病毒或虹彩病毒防治方法，因此發展一個較快速簡便的檢驗方法和一個有效的 疫苗來對抗神經壞死病毒或虹彩病毒對於養殖產業的發展極為重要。因此我們希 望利用生物資訊比對自神經壞死病毒或虹彩病毒鞘蛋白分別挑出各含十個胺基 酸序列的胜月太(peptide)來做為疫苗的候選，結合上 TR-PCR 的方法來建構出線性 重複排列抗原(linear array epitopes, LAE)的抗原蛋白，以此抗原來發展成檢驗試 劑或疫苗，以發展一種新的疫苗發展技術平台。

其中神經壞死病毒屬於野田病毒科(Nodaviridae)的betanodavirus屬，會引起 魚類的病毒性神經壞死症(viral nervous necrosis, VNN)，致死率極高，根據先前對 NNV的研究得知，神經壞死病毒的鞘蛋白(coat protein)具有些微免疫的效果，再 參考1999年由 Nishizawa T.等人利用單株抗體分析魚的神經壞死病毒(SJNNV) 所提出的兩個抗原決定區(epitope)，分別一般型和具基因型專一性的epitope，我 們再用電腦比對NNV鞘蛋白胺基酸與核酸序列的結果，然後自NNV鞘蛋白分別 挑出兩段各含十個胺基酸序列的胜月太(peptide)來做為疫苗的候選，以此作為基礎 利用TR-PCR方法來建構出線性重複排列抗原(linear array epitopes, LAE)的抗原 蛋白，若此抗原能夠有效誘發免疫反應，那麼它就有機會可以發展成檢驗試條和 疫苗，進一步地可應用於檢測NNV和防治由NNV所引起的病害上。

關鍵字：石斑魚、石斑魚神經壞死病毒、虹彩病毒、野田病毒、病毒性神經壞死 病、鞘蛋白、線性重複排列抗原

Abstract：

Taiwan is one of the three prominent aquaculture countries in the world, has the best aquaculture techniques in the Southeast Asian, especially for fry hatch; therefore, Taiwan becomes an important exporting country for fry and larvae. The species of Groupers, epinephelus spp., is a major mariculture in Taiwan and other Southeast Asian. In the recent years, the species of groupers has found to infected easily by grouper nervous necrosis virus (GNNV) and Iridovirus, resulting in high mortalities among the fish stock. Unfortunately, the nervous necrosis virus (NNV) has also been recognized as the cause of severe disease among other fish, such as sea bass, jack, parrotfish, pufferfish and flatfish … etc. This virus has caused severe economic loss.

The diagnosis method for NNV or Iridovirus is to utilize RT-PCR or PCR but is complicated and time-consuming. Since an efficient method for preventing or curing viral disease caused by NNV or Iridovirus has not been reported previously and this is reason requiring to develop a diagnosis method in order to detect the virus faster and easier and design a grouper vaccine to against infectious NNV or Iridovirus.

To compare both amino acids and nucleic acid sequences of the virus gene by bioinformation, peptide fragments has been selected and designed for vaccine development. Therefore, the antigen of virus contains linear array epitopes (LAE) developed by TR-PCR, selects from bioinformation can induce an immune response, this antigen may able to develop a strip for diagnosis or vaccine. It will be important for proving a novel method and beneficial in the treatment of fish disease.

Nervous necrosis virus (NNV) belongs to the genus of betanodavirus and the family of Nodaviridae, usually infects fish and causes viral nervous necrosis; thus, resulting in a high mortality rate. Previous report has demonstrated that the coat protein of NNV can induce an immune response and Nishizawa et al has found two epitope regions by using monoclonal antibody to analyze the coat protein of striped jack NNV and other genotype NNV. Those two epitopes are NNV general epitope and NNV genotype specific epitope. To compare both amino acids and nucleic acid sequences of the NNV coat protein by multiple alignments, two peptide fragments has been selected and designed for vaccine development, has contained ten amino acids, including those two published epitope sequences. If the antigen of NNV contains linear array epitopes (LAE) developed by TR-PCR, selects from conserved region around the epitope of coat protein can induce an immune response, this antigen may

able to develop a strip for diagnosis. It will be important for proving beneficial in the treatment of fish disease, NNV.

Keywor ds: grouper, grouper nervous necrosis virus, Nodaviridae, Viral nervous necrosis, coat protein and, LAE (linear array epitopes)

一、前言

石斑魚，為目前台灣與東南亞國家的最主要經濟養殖魚類，近幾年來在養殖 的過程中常常可以發現在石斑魚在從卵孵化到吋苗的這段期間內，小魚經常會有 不正常如旋轉般的游動情況，此疾病的死亡率極高，有時甚至高達 90~100 %，

造成養殖業者的極大損失。而造成此一疾病的原因是因為魚類受到神經壞死病毒 (Nervous Necrosis Virus, NNV)感染之後所引起的魚體不正常游動及大量死亡的 現象(Chi et al., 1997)。

NNV 對魚類而言是一個重要的病毒性疾病，通常會感染魚苗，並且在感染 後會引起魚的神經壞死 (Yoshikoshi & Inoue 1990)，腦脊髓炎 (Bloch et al., 1991) 和液泡形成、腦病和視網膜病變 (Munday et al.,1992; OIE 2000)，並造成大量的 死亡 (Mori et al., 1992)。至目前為止，已知有 11 科、超過 22 種的魚類有報導過 受神經壞死病毒感染的紀錄，其中又以石斑魚、鱸魚、河豚、比目魚、鸚哥魚和

魚為主(OIE, 2000)，影響甚大。NNV 顆粒大小在 25～30 微米左右(Glazebrook et al., 1990)，無封套膜、二十面體(Yoshikoshi & Inoue 1990)，屬於核糖核酸病毒，

具有兩條單股的正股 RNA，稱為 RNA1 與 RNA2(Mori et al., 1992)，RNA1 所產 生的蛋白質為 RNA 聚 合  ；而RNA2 所產生的蛋白質為鞘蛋白(coat protein)，

主要是組成病毒外殼，根據鞘蛋白上 T4 區域(氨基酸 204~331)之核酸序列所進行 的種源分析(phylogenetic analysis)，可以將 25 種魚類野田病毒區分為四種基因 型，分別是：SJNNV (striped jack NNV)、TPNNV (tiger puffer NNV)、BFNNV (barfin flounder NNV)和 RGNNV (redspotted grouper NNV)四個類型(Nishizawa et al., 1997)。

目前用以檢測魚隻是否受到神經壞死病毒感染的方法包括：1.以光學顯微鏡 觀察魚的腦部、脊索或視網膜，但是不易觀察；2.利用電子顯微鏡、血清學方法 及分子生物學方法偵測魚體內是否有病毒顆粒、病毒抗原或其核酸的存在；3.

偵測魚血清或體液中是否有抗NNV抗體存在，如以重組的病毒鞘蛋白進行酵素 連結免疫分析法 (Huang et al., 2001)；4.對病毒進行細胞培養，如可適用於所有 基因型的魚類NNV的SSN-1(Frerichs et al., 1996； Iwamoto et al., 1999)；和可適 用於石斑魚NNV的GF-1 (Chi et al., 1999)。目前最常用的檢測方法是以抗體偵測 感染魚隻組織中是否有NNV抗原存在；以及針對NNV RNA2進 行 反 轉 錄聚合 鏈所反應，雖然有效，但所用的引子的感受性有時會有因為不同病毒間親源關係 較遠而偵測不到的問題(Thiéry et al., 1999)。

由於NNV會垂直感染傳至下一代(Arimoto et al., 1992；Comps et al., 1996；

Yoshimizu et al.,1997； Grotmol & Totland 2000)，因此目前對於病毒性神經壞死 症的防治方法僅有以臭氧洗卵(Arimoto et al., 1996；Grotmol & Totland 2000) 的 方式來對魚卵進行消毒，以減少魚卵上之病毒，降低發病之機率，雖然可以減少 魚隻發病，但是一但一養殖槽中有魚苗發病，仍會造成其他魚苗受到感染，死亡。

加上目前並無法以投藥的方式治療魚類之病毒性疾病，因此在對抗病毒性神經壞 死症的研究上，主要是朝免疫的方向進行，針對神經壞死病毒的抗原或核酸進行

疫苗的相關研究，而研究開發之疫苗分別是屬於次單位疫苗和DNA疫苗，在次 單位疫苗方面，目前已經有研究指出，利用大腸桿菌所表現的重組病毒鞘蛋白能 夠引起魚的免疫反應，誘發抗體產生，且在進行魚體內活體中和抗體試驗時，有 18~22%的魚隻可以產生抗體並中和掉NNV (Tanaka et al., 2001)；另外也有研究 指出，在以NNV進行攻毒試驗時，有60~77%的魚得到保護的效果(Yuasa et al., 2002)；但在關於DNA疫苗的研究上，以SJNNV和AHNV的RNA作為DNA疫苗之 目標進行免疫魚隻的試驗時，並沒有得到保護之效果(Sommerset, Husgaard &

Nerland 2001)。顯示此病毒的鞘蛋白可以拿來做為進行次單位疫苗的研究對象；

此外，也有學者利用單株抗體來分析NNV鞘蛋白的研究(Nishizawa et al., 1999)，

在該研究中有提出兩組都是由三個胺基酸長度組成的抗原決定區(epitope)，分別 為在不同型態的NNV都具有相同序列的epitope及具有基因型專一性的epitope。因 此我們依據該研究之結果及根據經電腦比對神經壞死病毒鞘蛋白的胺基酸與核 酸序列的結果，從這兩個抗原決定區的兩邊的保留序列中挑選出一段分別含有這 兩個抗原決定區的十個胺基酸長度的胜月太(peptide)片段，來做為我們發展泛用型 和特定基因型的神經壞死病毒疫苗的基礎，但是由於小片段胜月太的免疫性並不 高，如果直接將之進行免疫動物時，可能會有不引起免疫反應的問題，因此在本 計合 畫 中聚， 複我 們 用 模 板 重

連 反 鎖

應 (template-repeated polymerase chain

reaction, TR-PCR) (Hsu C.T.et al., 2000)，來建構含有多個重複數之線性重複排列 抗原LAE(linear array epitopes)，解決抗原蛋白過小而不易引起免疫反應的問題，

同時TR-PCR的方法也具有在尚未獲得目標基因而僅具有基因序列時，即可進行 疫苗開發工作的優點，且不會有密碼子選擇(codon usage)的問題；此外，為了能 夠提升免疫的效果，我們也參考目前利用細菌毒素用來幫助輸送抗原的方法，利 用已去除毒素活性之毒素作為一個運載系統，利用該毒素的特性，可以提升整體 的免疫效果，如霍亂毒素(cholera toxin)( Shi, C.H. et al., 1995)和綠膿桿菌外毒素 (Pseudomonas exotoxin A, PE) (Hsu C.T. et al., 2000)等細菌毒素。在本計畫中，我 們選擇將所得到的LAE融合至PE上。PE的分子量為66 kDa，含有613個氨基酸，

其蛋白結構主要有三個區域：區域Ia(氨基酸1-252)是受體結合區負責和哺乳動物 細胞膜 上的 α2- 巨型球蛋白 / 低密 度 脂蛋白細胞 受體 ( α2-macroglobulin/ low density lipoprotein receptor ， 簡 稱 LDLR) 結 合 後 ， 再 經 由 細 胞 攝 粒 作 用 (receptor-mediated endocytosis)進入細胞的內膜體(endosome)中，當PE被內膜體內 的蛋白酵素切割後，PE區域Ⅱ(移位區)(氨基酸253-364)，會將包含區域Ⅱ和具有 毒性的區域Ⅲ(氨基酸405-613)片段由內膜體(endosome)移位至細胞質中，最後具 有毒性的區域Ⅲ和部分區域Ib(氨基酸365-404)是腺核甘雙磷酸糖化作用區，會抑 制細胞蛋白質的合成，最後導致細胞死亡。自從對PE的結構與功能被了解之後，

就有利用PE作為免疫輔助的相關研究(Hsu C.T. et al., 2000；Becerra et al., 2003)。

在本計畫中，利用TR-PCR的技術發展疫苗並建立一個使用生物資訊協助疫 苗發展的模式，希望能夠發展出一個疫苗來對抗 NNV。用 TR-PCR 得到含有 LAE 的抗原，並利用 PE 的受器結合區或其他的超級抗原作為佐劑，透過受器引導的

內 吞 作 用 (receptor-mediated endocytosis) 來 將 抗 原 送 入 抗 原 呈 現 細 胞 (antigen-presenting cell, APC)，效果較吞噬作用(phagocytosis)來得好。如果這個 含有 LAE 的抗原架構能夠引起免疫反應，代表它或許可以可應用在改善由 NNV 所引起的疾病。

二、研究方法

(一)重 複 模 版 聚 合鏈鎖反應(Template-repeat PCR)

以 0.1 ìM 載有 NNV general epitope (NG)序列或 10 nM 載有 NNV genotype specific epitope (NS)序列的單股寡核醣核酸 Oligo A 和 Oligo B 為模板，0.2ìM dNTP mix，pfu 4u /50 ìl 進行練鎖反應。溫度循環設定為 94℃、30 秒；34℃(NG) 或 44℃(NS)、30 秒， 72℃、30 秒，三步驟重複 30 循環，最後加一步驟 72℃聚 合反應 10 分鍾。

(二)轉 接 端 鏈 聚 合鏈鎖反應(Adapter PCR)

以 TR-PCR 產物作為模板，轉接端引子各 1ìM，0.2 ìM dNTP mix，Taq 4u /50 ìl 進行練鎖反應。溫度循環步驟為 94℃、1 分鍾，34℃(NG)或 44℃(NS)、30 秒，

72℃、30 秒、2 循環，接著 94℃、1 分鍾，60℃、30 秒，72℃、30 秒、4 循環，

最後加一步驟 72℃聚合反應 10 分鍾。所得產物 5’端含 SacⅡ、3’ 端含 EcoRⅠ 限 制 切點，3’ 端並含有轉譯停止密碼(stop codon)。

(三)質體構築

先將濃縮的 AD-PCR 產物與 pGEM T-easy 質體進行黏合，細胞轉形，挑選 序列正確之 clone 後再進行 LAE 與 pET15PMx 質體黏合的次選殖工作(圖四)，依 質體性質為屬於 PE(1~413)片段銜接 NNV general epitope 或 NNV genotype specific epitope 之 LAE 基因片段，將之命名為：pPNGn 或 pPNSn，而其表現之 蛋白質則命名為：PE(1~413)NGn 和 PE(1~413)NSn。

(四)蛋白質表現、純化、濃縮

以 E. coli strain BL21 (DE3) 表現抗原融合蛋白，用 1 mM IPTG 激發表現後 繼續培養 2 小時，然後用低速離心(5000x g, 4℃ 10min)沈澱回收菌體，以超音波 震盪法將大腸桿菌打破，再利用 Cu²⁺-charged His-Bind 管柱來純化帶有 His-Tag 的抗原融合蛋白，經過以兩倍層析管體積之含有 6 M urea 的 50 和 75mM imidazole 沖洗銅離子交換樹脂後，於 110 mM imidazole 濃度可得到純化之目標 抗原蛋白，再以 Minipore 公司所生產的 Amicon 濾膜濃縮純化的融合蛋白。

(五)動物免疫實驗

三吋的石斑魚苗，先以金屬號碼標籤標記(圖十一)，觀察一至二週，看金屬 標記是否脫落再進行免疫實驗，免疫實驗中，分別將石斑魚注射不同之抗原，以 腹腔注射方式，每兩週注射一次，共注射三次，每次注射 70 ìg/ 35ìl 之抗原，

同時以尾部抽血的方式抽取血清進行免疫檢測。

(六) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

將 1 mg/ well 之重組 NNV 鞘蛋白連結在 96-well Falcon microtiter plates 上，

以 TBS-T 稀釋每次採得之血清，進行兩倍連續稀釋(從 1：50 到 1：128,00)作為 一抗，進行 ELISA 測試，rabbit anti-grouper 免疫球蛋白抗血清作為二抗，接有 alkaline phosphatase 的 goat anti-rabbit 免疫球蛋白抗血清為三抗，受質為含有 p-Nitrophenyl Phosphate 的 20 mM Tris 溶液。陰性反應以五條接種緩衝液的石斑 魚控制組為基準；陽性反應以兔抗 NNV coat protein 血清為基準，力價以最大稀 釋倍數仍為陽性反應者為準。

(七)病毒中和試驗

使用 GF-1 細胞株在組織培養平底微量盤中操作。以不含血清之培養基稀釋 每次採得之血清，以 0.22 ìm filter 過濾後，進行兩倍連續稀釋(從 1：10 到 1：

1,280)，與 10⁵的病毒懸浮液混合後，將病毒-抗體混合液加入細胞中，於 28℃，

5 % CO2培養一小時後，將病毒-抗體混合液去除，並以 200 ìl 1x PBS wash，再 加入新鮮不含血清之培養基，培養數天後使用光學顯微鏡進行判讀，看細胞是否 產生 CPE 之現象。

三、結果

(一) 重 複 模 版 聚 合 鏈 鎖 反 應 與 轉接 鎖反 鏈聚端應 鏈 合

依 NNV 鞘蛋白及其核酸序列，還有藉由生物資訊學工具的輔助，設計 TR-PCR Oligo A 和 Oligo B(圖一)，其推測的反應過程示意圖如(圖二)。經測試引 子 濃 度 、 黏 合 溫溫度 度 及 反的 應 循 環 數 後 發 現 黏合 改 變 、聚合鏈鎖反應循環數

的 增 加 並 未 得 重複到 較 佳 的模反 應 產 物 ， 主 要 影響 版 聚 合鏈鎖反應產物結果的

是其引子之濃度，引子濃度過高時，反應產物的大小會逐漸降低。當 NG 模版濃 度為 100 nM 時的產物大小約 300~500 bps，約等於 10-16 個重複；當 NNV genotype specific epitope 模版濃度 10 nM 時的產物大小約 500~800 bps，約等於 16-24 個重 複，也存在其他分子量產物分佈在主要區塊上下，均適於純化製成抗原。然後以 TR-PCR 產物作為模板(圖二)進行 AD-PCR 時，NNV general epitope 的 TR-PCR 產物取 10 倍稀釋後 1 ìl 作為進行 AD-PCR 之模版；NNV genotype specific epitope 的 TR-PCR 產物 1 ìl 作為進行 AD-PCR 之模版(圖三)。

(二) 動物免疫實驗

為了評估結合生物資訊學、TR-PCR 技術和 PE 系統作為疫苗發展之可行性，

本計畫以三吋之石斑魚苗作為免疫實驗之對象，選用於進行評估本計畫中之疫苗 開發系統之可行性的抗原蛋白為 PE(1~413) NCS8和 PE(1~413) NCS13。實驗共分 為 buffer 組 5 隻、PE(1~413)NCS8和 PE(1~413) NCS13組各 8 隻，以金屬號碼標 籤作記號(圖五)，以腹腔注射予以注射 70 ìg 的抗原，同時進行尾部抽血，每兩 週追加注射一次，所得的血清用以進行 ELISA 測抗體力價。由於在第 28 天時所 抽得之血液大多發生溶血現象，故於 10 天後(Tanaka et al., 2001)，即第 38 天時 再抽一次血後進行 ELISA 測定抗體力價。在觀察 PE 是否可以引起石斑魚免疫反 應方面，與控制組相較後，發現在第 38 天時，石斑魚抗 PE 之抗體力價有升高，

且 titer 高達 8,000 倍(圖六)；而在石斑魚抗 NNV 的抗體力價方面，相較於控制

組，在注射後第十四天時，PE(1~143)NCS₈組的抗體力價提高約 50 倍，

PE(1~143)NCS13組的抗體力價提高約 200 倍；在注射第三十八天，PE(1~143)NCS₈ 與 PE(1~143)NCS₁₃組之抗體力價均提高至 1,600 倍，但兩組之間則無明顯差異(圖 七)。

(三) 中和抗體試驗

為更進一步確認石斑魚抗 NNV 血清是否能有效對抗 GNNV，因此選用對 GNNV 感受性高 GF-1 細胞株，以 10⁵的 GNNV 進行中和抗體的測試，在經過 28℃，5 % CO2環境下培養七天後，以光學顯微鏡觀察結果，最後除了未加病毒 之細胞控制組未有 CPE 的現象外，其他有以 GNNV 感染的組別，包括 positive control 的兔抗 GNNV 抗血清，石斑魚注射 buffer、PE(1~413)NCS8和 PE(1~413) NCS13組所有稀釋倍數，10~1,280 倍的血清組別，其 GF-1 細胞均有細胞病變現 象(cytopathic effect , CPE) ，GF-1 細胞型態由纖維狀膨大為球狀，且觀察到細胞 在死亡後，有浮起、瓦解破裂的情形，顯示出 GF-1 細胞株已處理過抗血清的病 毒液感染後，未受到抗血清之保護，而仍受病毒入侵感染，呈現出細胞病變的現 象。

四、討論

本計畫我們希望利用生物資訊比對自神經壞死病毒或虹彩病毒鞘蛋白分別 挑出各含十個胺基酸序列的胜月太(peptide)來做為疫苗的候選，結合上 TR-PCR 的 方法來建構出線性重複排列抗原(linear array epitopes, LAE)的抗原蛋白，以此抗 原來發展成檢驗試劑或疫苗，以發展一種新的疫苗發展技術平台。為了開 GNNV 之疫苗，所以參考 Nishizawa 等人在 1999 年所指出的 NNV epitope 作為實驗設計 的基準；同時以生物資訊學的方法來輔助，利用 multiple alignment 分析包括台灣 本土 GNNV 在內的不同基因型之 NNV 外 鞘 蛋 白 氨 基 酸 及 核 酸序列，以上述研 究指出之 epitope 為核心，向兩邊延伸數個氨基酸至整個 epitope 長度為十個氨基 酸，其於 GNNV 外鞘蛋白之氨基酸位置分別為：112~121 (NNV general epitope) 和 251~260 (NNV genotype specific epitope)，除了多序列比對的方法，其他可應 用在輔 助疫苗開發的 生物資 訊學方法還包 括：預 測抗原性概況(antigenicity profile)，預測蛋白質降解體切位(proteasomal cleavage site)，預測組織相容性複合 體(major histocompatibility complex, MHC)結合胜月太，以及 T 細胞或 B 細胞結合 胜月太的預測等方式。

由於十個氨基酸長度的抗原決定區胜月太，就免疫學上而言，仍會有可能因為 抗原過小，而有免疫性不足而無法引起好的免疫效果的問題，所以我們參考 Chia-Tse Hsu 等人在 2000 年時所發表之論文，利用重鎖鏈 複 模 版 聚 合  反

應 的

方法將小片段的目標抗原基因延長成為具有多個目標抗原基因片段的線性排列 重複抗原基因，同時也利用綠膿桿菌外毒素來作為輔助石斑魚產生免疫反應之工 具，將線性排列重複抗原與去除區域Ⅲ的綠膿桿菌外毒素融合成為目標抗原基

因 。 由 於 本 計 畫 所 採 用 的 方 式 ， 以 重 複 模版聚合鏈所反應來製備線性重複抗

原，以綠膿桿菌外毒素為疫苗運載、促進免疫反應雖然在哺乳動物中已經證實是 有效的(Hsu C.T. et al., 2000)，但在免疫能力較低且研究較為不足之魚類身上是否 同樣可行則不得而知，因此本計畫除了開發石斑魚神經壞死病毒疫苗，同時也評 估此一模式在魚類疫苗開發上的可行性。

在將自抗原決定區兩端延伸至 10 個氨基酸長度的抗原基因延長成為線性排 列重複抗原 LAE，也就是在進行 TR-PCR 時，原先在測試反應條件如模版濃度、

溫度、反應之循環數時，一直未有結果產生，最後才發現是參考論文在方法描述 時有筆誤情形，經修正後即得到 LAE 之基因，而 TR-PCR 反應結果則主要與其 引子濃度有關，產物的分子量會隨著引子濃度增加而降低，例如在 NNV general epitope 一組的重複模版聚合脢鏈鎖反應結果中，當引子濃度為 100 nM 時，主要 之產物大小在 300~500 bps 之間，但適當引子濃度為 0.8 ìM 時，其主要之產物大 小在則在 180~350 bps 之間，有相當明顯的差別；而反應時黏合溫度的些微變更 則影響不大，和反應循環數之間也沒有太大的關係。而在選用合適分子量之 TR-PCR 產物以作為 AD-PCR 模版時，由於其他研究結果中顯示，在免疫動物時，

只需要 12 個重複數即可大幅提昇動物之抗血清力價(Hsu C.T. et al., 2000)，因此 我們選用分子量為 500 bps 左右的重複模版聚合脢鏈鎖反應產物為模版，進行轉 接端鏈聚合脢鏈鎖反應。

在得到 LAE 之 DNA 片段後即開始進行銜接至 pGEM T-easy 質體，在將挑 選得到的 clone 定序後發現，雖然在 TR-PCR 中所使用的聚合酵素為具有校對 (proofreading)功能的pfu (Pyrococcus furiosus) DNA 聚 合  ，且AD-PCR 所使用 的聚合酵素亦為 pfu 與 Taq (Thermus aquaticus) DNA 聚 合 混合，仍有部分的基

因 有 一 至 數 個 核 酸 序 列 改 變 ， 另 外 也 有 極少數的基因轉譯格不正確的情形發 生，此一情形是否為酵素問題所造成的，則需要其他來源之相同酵素來進行相同

實驗，才能夠證實。

在進行免疫石斑魚實驗時，原先進了 70 尾的三吋石斑魚苗，但是因為病害 的影響，導致魚隻陸續死亡，雖然以藥物處理後有所改善，但最後也僅存 28 尾 石斑魚可供實驗之用，因此在石斑魚來源不穩定，且品質亦無法掌控的情況下，

在估計實驗所需魚隻時，因該至少估計所需數量的兩倍以上，以免因為病害關係 導致石斑魚之數量會有不足的情形；另外，因為沒有小的養殖缸可供分組使用，

因此本計畫的動物實驗將全部石斑魚魚隻集中養於大的海水養殖槽中，而在將魚 隻分組時，因為使用螢光染劑成本高，當實驗魚隻多且均在同一養殖槽中時會不 易區別，所以我們採用金屬號碼標籤作記號，此方法簡單方便，成本低廉，而且 辨識方便，除了可以區分組別外，更可以區別不同魚隻，標記的方法是利用鉗子 將金屬標籤扣於石斑魚鰓蓋盡量內側的位置上，我們在剛開始時，並未將石斑魚 麻醉就直接進行標記之工作，結果不易操作，且標記位置也有部分不夠深入石斑 魚之鰓蓋內側，對魚的壓力也過大，因此有部分的魚在標記過後 1~2 天即死亡，

或是金屬標籤脫落的情形產生，應該先將石斑魚麻醉後再進行標記，如此一來，

不但操作方便，不易脫若，對魚造成的壓力也較低，但此一方法可能必須將實驗

時間設計在兩個月左右，因為在本計畫的此一實驗的時間從標記算起，在第九週 時，已經有部分魚隻的金屬標籤隨魚體成長而脫落，雖然只是少數，但仍會對實 驗造成一些影響。

在施打不同抗原來誘發石斑魚之免疫反應，為測試本計畫所開發之石斑魚神 經壞死病毒疫苗及評估綠膿桿菌外毒素對石斑魚是否具有佐劑性質，我們施打不 同抗原來誘發石斑魚之免疫反應。在結果中顯示，施打 PE(1~413)NCS₈ 和 PE(1~413)NCS13 抗原的確能使石斑魚產生抗體來辨識綠膿桿菌外毒素，而且抗 體力價更是高達 8,000 倍，顯示綠膿桿菌外毒素除了在哺乳動物中可以作為一個 具佐劑性質的抗原輸送蛋白(Hsu C.T. et al., 2000；Hertle et al., 2001)外，也可以 引起石斑魚強烈之免疫反應，顯示綠膿桿菌外毒素可能也可以作為魚用疫苗之佐 劑，協助輸送抗原蛋白，但仍須更進一步地以其他不同的蛋白質或不同劑量之綠 膿桿菌外毒素去施打魚隻，然後測其抗體產生的情形才能進一步證實。同時，施 打 PE(1~413)NCS₈和 PE(1~413)NCS₁₃抗原的石斑魚產生的抗體也可以辨識由大 腸桿菌所表現的神經壞死病毒鞘蛋白，其抗體的力價也都達 1,600 倍，雖然高重 複數的抗原可以引起哺乳動物較強的免疫反應(Khan C.M. et al., 1994；Hsu C.T.

et al., 2000)，但在本實驗中，8 和 13 個抗原重複數施打魚隻的結果並無明顯差 異，可能是石斑魚本身要引起免疫反應並不需要到太高重複數(如本計畫中的 13 個重複數)的線性排列重複抗原，但如果要進一步證實，則需要更多、更密集的 不同重複數的抗原進行測試才能得知。

在得到抗體力價達 1,600 倍的石斑魚抗血清後，若要確定此疫苗是否有效，

則必須進行中和抗體和攻毒試驗，然而在經過以 GF-1 細胞株和 10⁵的石斑魚神 經壞死病毒進行中和抗體之細胞實驗後，所有實驗組和 positive control--兔抗石 斑魚神經壞死病毒抗血清的 GF-1 細胞都有細胞病變的現象，顯示出石斑魚神經 壞死病毒並未或不完全受兔子或石斑魚的抗石斑魚神經壞死病毒抗血清的封鎖 (blocking)，使 GF-1 細胞株在以處理過抗血清的病毒液感染後，仍受病毒入侵感 染而呈現出細胞病變的現象。由於每隻石斑魚苗每次抽血所得之血清最多僅約 50~100 ìl，相當有限，僅僅足夠一次中和抗體實驗所需，因此在 NNV 的中和抗 體實驗上，未來應該先用兔抗 NNV 抗血清測試中和抗體所需要之病毒條件，再 開始進行實驗組的中和抗體測試，或是在目的為取得抗血清時，免疫體型較大的 石斑魚，以取得更多的血清，此外，除了利用細胞實驗進行中和抗體測試外，也 可以使用石斑魚，直接進行活體的中和抗體實驗(Tanaka et al., 2001) ，其說服力 更高。

目前結果顯示出，利用細菌性毒素--PE 作為一個疫苗運載系統刺激魚產生抗 體似乎是可行的，但是在使魚隻對目標抗原產生免疫反應的同時，也會使得該魚 隻對 PE 產生強烈的免疫反應，亦即同一隻魚只能接受一次利用 PE 系統所運載 的疫苗，因此未來如果要繼續開發利用毒素運載的疫苗，就必須朝多價行疫苗發 展或尋找其他可以造成魚隻中毒的蛋白質毒素，包括細菌或其他水生生物產生的 毒素。同時我們也以將生物資訊比對，結合上 TR-PCR 的方法來建構出線性重複

排列抗原(linear array epitopes, LAE)的抗原蛋白，以此抗原來發展成檢驗試劑或 疫苗，而發展出一種新的疫苗發展技術平台。

圖一、重 複 模 版 聚 合 鏈 鎖 反板設 的 應模 圖 計

。

依照目標抗原決定區 NG 和 NS 的氨基酸序列及其核酸序列設計鏈鎖反應所 需的 oligonucleotide。OligoA 為載有 NG 及 NS 抗原決定區基因的單股序列，

OligoB 為互補於 OligoA 的單股序列。兩者互補的方式如圖中所示：OligoA 靠 5’

端的一半(A1)與 OligoB 的靠 5’端的一半(B1)互補；OligoA 靠 3’ 端的一半(A2) 與 OligoB 的靠 3’端的一半互補(B2)。

A

B

圖二、重 複 模 版 聚 合 鏈 鎖 反 應 與 轉 接 端 合 聚 鏈 示 意 鏈鎖反 應 圖。

A： 重 複 模 版 聚 合 鏈 鎖Oligo A 和 B 本身是模板也是引子，反應，反應中 溫度循環如方法中描述。起使的幾個循環模板互相黏合、補滿成雙鏈。之後較大 分子扮演模板角色，較小分子或未作用的 Oligo A 和 B 因運動性高，黏合時比大 分子容易，扮演引子角色。如此循環黏合、延長使核酸鏈延長的同時，重複數也 隨之增加。

B：接端鏈聚合 鏈 鎖 反 應，

以 A 圖的產物為模板，進行鏈鎖反應。產物為

含不同重複數的線性重複排列抗原，其 5’端有 SacⅡ、3’ 端有 EcoRⅠ及 stop

codon。

圖 三 、 重 複 模 版 聚 合 鏈 鎖 反 應 與 轉接 端鎖 反 合  鏈 聚 應。 鏈

在 NNV general epitope 的 部 分 ， 轉 接 端 引 子 以 重 複模版聚合鏈鎖反應的產 物為模版，進行鏈鎖反應。產物為含有不同重複數的 NNV epitope，其 5’端有 Sac

Ⅱ、3’端有 EcoRⅠ及 stop codon。反應產物經過酒精沈澱濃縮後取 5ul 於 8﹪

PAGE、EtBr 染色、於 UV 光下照相。第二 行 為 重 複 模 版 聚 合 應產 鎖 反鏈 ，物

第 三 行 為 轉 接， 端 鏈 聚反應 合 鏈行100 bp 分子量標示。為鎖 一 物 產 第

圖四、銜接綠膿桿菌外毒素 PEΔⅢ與線性重複排列抗原示意圖。

將 pET15PMx 和帶有線性排列重複抗原基因的 T-easy 質 體 ， 以 限制Sac

Ⅱ和 EcoRⅠ水解過後進行黏合。

圖五、石斑魚標記法。

利用金屬號碼標籤，直接以鉗子將標籤扣於石斑魚之腮蓋上。

圖六、石斑魚免疫注射 38 天後之抗 PE 之抗體力價。

由 ELISA 結果中發現石斑魚血清抗 PE 的 titer 有明顯的提高，且提高約 8000 倍以上，而 PE(1~413)NCS8與 PE(1~413)NCS13組的 titer 則無明顯差異。

圖七、石斑魚免疫注射後之抗重組 NNV 抗體力價。

由 ELISA 結果中發現石斑魚的 titer 有較 buffer 組提高，在第 14 天時血清抗 體力價僅稍微提高，但在第 38 天時的血清抗體力價則大為提高。從第 14 天到第 38 天， PE(1~143)NCS8組抗體力價由 400 倍提高為 1600 倍；PE(1~143)NCS13

組則是由 50 倍提高至 1600 倍。

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

0 14 38

days

稀釋倍數

buffer PE(1~143)NCS8 PE(1~143)NCS13 0

0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

1000x 2000x 4000x 8000x 16000x 稀釋倍數

OD405

buffer PE(1~413)NCS8 PE(1~413)NCS13

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可供推廣之研發成果資料表

可申請專利 □ 可技術移轉 日期：92 年 9 月 22 日

國科會補助計畫

計畫名稱：石斑魚及其病原功能基因體研究-開發石斑魚虹彩病毒 疫苗

計畫主持人： 陳宗嶽 附件二

計畫編號：NSC 91－2317－B006－002 學門領域：農業生物技術國家型科技計畫

技術/創作名稱

發明人/創作人

中文：藉由生物資訊學中，多序列比對(multiple alignment)，預測 抗 原 性 概 況 (antigenicity profile) ， 預 測 蛋 白 質 降 解 體 切 位 (proteasomal cleavage site) ， 預 測 組 織 相 容 性 複 合 體 (major histocompatibility complex, MHC)結合胜月太，以及 T 細胞或 B 細胞 結合胜月太的預測等輔助疫苗開發的工具尋找欲開發疫苗之合適抗 原決定區，以及 TR-PCR 來延長目標抗原決定區，以解決抗原蛋白 過小而不易引起免疫反應的問題，同時 TR-PCR 的方法也具有在尚 未獲得目標基因而僅具有基因序列時，即可進行疫苗開發工作的優 點，且不會有基因碼不同的問題，因此可以加速疫苗之開發工作，

進一步再加上利用去除毒素活性的細菌毒素，如 PE，用來幫助輸 送抗原的方法，也可以增加免疫反應的效果。

技術說明

英文：

可利用之產業

及

可開發之產品

包括醫學、畜產、養殖等領域均可利用，可開發之產品包括病毒、

腫瘤、自體疾病之疫苗。

技術特點

簡單、方便且可以快速發展新的疫苗。

推廣及運用的價值

對於目前石斑魚受 NNV 的嚴重威脅，若本疫苗開發模式得以成功，

則可進一步的運用到防治其他病毒如虹彩病毒上，也可以運用在防 止畜產業，如豬的口蹄疫病毒；醫學，如 SARS 病毒、腫瘤等疾病 的侵害，降低社會大眾生命財產所受之威脅。

1.每項研發成果請填寫一式二份，一份隨成果報告送繳本會，一份送 貴單位研發成果推廣單位（如技術移轉中心）。

2.本項研發成果若尚未申請專利，請勿揭露可申請專利之主要內容。

3.本表若不敷使用，請自行影印使用。