國立台東大學生命科學系碩士班
Department of Life Science National Taitung University
碩士論文
Master Dissertation
指導教授：黃祥恩博士
Advisor：Dr. Hsiang-En Huang
利用硫鐵蛋白誘導型芽孢桿菌及農業 廢棄物開發複合性植物保護添加劑
防治番荔枝炭疽病
Developing plant-protective additive to reduce the complex disease caused by biotrophic and necrotrophic
pathogen with ferredoxin-inducing Bacillus sp. and organic wastes in the sugar apple
研究生：楊玉君撰
Graduate student：Yu-Jien Yang 中華民國 104 年 7 月
July, 2015
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國立台東大學生命科學系碩士班 碩士論文
利用硫鐵蛋白誘導型芽孢桿菌及農業廢 棄物開發複合性植物保護添加劑
防治番荔枝炭疽病
Developing plant-protective additive to reduce the complex disease caused by biotrophic and necrotrophic
pathogen with ferredoxin-inducing Bacillus sp. and organic wastes in the sugar apple
研 究 生： 楊玉君 撰
指導教授： 黃祥恩 博士
中 華 民 國 104 年 7 月
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利用硫鐵蛋白誘導型芽孢桿菌及農業廢棄物開發複合性 植物保護添加劑防治番荔枝炭疽病
學生：楊玉君
國立台東大學生命科學系 (所) 中文摘要
硫鐵蛋白 (Ferredoxin, Fd) 為一群具有二鐵二硫 (2Fe-2S) 官能基，可於植 物體內進行能量傳遞並參與許多植物的基礎代謝路徑，研究發現提升植物體內硫 鐵蛋白的表現量可以幫助植物抵抗病原菌感染，而目前利用基因轉殖方式來達到 增加硫鐵蛋白的表現量，雖然基因轉殖作物可以解決上述問題，但是消費者難以 接受。因此本研究利用芽孢桿菌來誘導番荔枝 (Annona squamosa) 體內的硫鐵蛋 白增量表現，藉此啟動植物的基礎誘導性抗病能力，再配合多種農業廢棄物的添 加，放大基礎抗病訊號的傳遞，及消除罹病組織表面二次感染原的族群數量。研 究結果顯示，在台東地區分離出 11 株病原菌可以造成 3 種番荔枝病害，分別 為：Colletotrichum gloeosporioides 造成的炭疽病害、Phomopsis sp. 形成的黑潰 瘍病害與 Lasiodiplodia sp. 引起的黑腐病害。利用兩株具誘導番荔枝增量表現硫 鐵蛋白的芽孢桿菌 (Bacillus sp. HS1，HS2) 進行誘導抗性測試，發現可以增加 番荔枝葉片內部過氧化氫的累積量，另外 HS2 也有提升過氧化氫酶 (Peroxidase, POD) 活性的能力，也表現出對於四株炭疽病菌的抑菌效果，但是 HS1 則無此 能力。而奈米級鈣離子處理後，可以提升離子滲漏率來放大抗病訊號，咖啡發酵 液與番荔枝種子水萃液具有提升 POD 活性的能力，增強抗性反應效果，咖啡發 酵液則對病原菌有抑制作用，將上述資材混合調配成複合性植物保護添加劑 NTTU 001，發現此添加劑可以提升過氧化氫累積，促進離子滲漏率，NTTU 001 可以抑制炭疽病菌孢子感染番荔枝的能力，並在 2012-2013 年期間施用於田間，
進行綜合病害防治，結果發現病害發生程度達到 26-31 % 以上時，NTTU 001 具
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有 20-31 % 抑制病害發生的效果。為增強 NTTU 001 的防治效用，添加可以促 進離子導電度、過氧化氫含量與過氧化氫酶活性，且可以抑制炭疽病菌孢子發芽 的乳酸菌 (Lactobacillus sp.) 發酵液形成 NTTU 002，在接種試驗的結果發現 NTTU 002 發現對炭疽病菌的孢子接種抑制效果大於 NTTU 001，但在 2014 年 進行田間綜合病害試驗時，因為當年度病害發展不完整，而未觀察到 NTTU 002 的防治效果，但卻發現 NTTU 002 具有促進開花結果效用。綜合上述結果顯示，
利用硫鐵蛋白誘導型芽孢桿菌及農業廢棄物 開發的複合性植物保護添加劑 NTTU 001 和 NTTU 002，確實能有效提升番荔枝的抗病能力，而 NTTU 002 還 具有增加番荔枝果實產量的效果，未來於田間綜合病害防治，可以利用 NTTU 002 的施用，逐漸減少化學藥劑和肥料的使用率和增加開花結果的作用。
關鍵字：硫鐵蛋白、芽孢桿菌、複合性植物保護添加劑、番荔枝炭疽病
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Developing plant-protective additive to reduce the complex disease caused by biotrophic and necrotrophic pathogen with ferredoxin-inducing Bacillus sp. and organic wastes
in the sugar apple
Author：Yu-Jien Yang
Department of Life Science National Taitung University Abstract
Ferredoxin (Fd) is a electron transferring protein containing 2Fe-2S domain. It involves in many fundamental metabolism. Overexpressionng ferredoxin in transgnic plant can raise plant resistance, but it’s difficulty to be consumer. Therefore, the propose of the investigation is developing plant-protective additive to reduce the disease with ferredoxin-inducing Bacillus sp. and organic wastes against anthracnose disease in sugar apple (Annona squamosa). The results revealed that eleven fungal pathogens had been isolated including Colletotrichum gloeosporioides (anthracnose), Phomopsis sp. (black canker) and Lasiodisplodia sp. (black rot) individually. Two ferredoxin-inducing bacterias Bacillus sp. HS1 and HS2 to promote accumulation of hydrogen peroxide (H2O2) in sugar apple. In addition, Bacillus sp. HS2 also exhibited antifungal activities against hyphae growth of four isolation C. gloeosporioides, but didn’t Bacillus sp. HS1. Treatment of nano-level calcium carbonate increased conductivity of leave in sugar apple. The fermented extraction of coffee demonstrated antifungal activities against six of eleven fungal pathogen strain in the investigation.
All fermented extraction coffee, seed extraction of sugar apple and fermentation of Lactobacillus sp. could induce activity of peroxidase (POD) and conductivity in sugar apple. In addition, fermentation of Lactobacillus sp. also exhibited effect inhibiting
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for spores germination of C. gloeosporioides ability. The mixture of Bacillus sp. and organic wastes (NTTU 001 and NTTU 002) had the ability to induce conductivity, H2O2 accumulation and POD activity, NTTU 001 and NTTU 002 also protected sugar apple from infection rate of C. gloeosporioides in the inoculating test. In the field test, NTTU 001 exhibited 20-31 % protecting rate when the disease degree raise up to 26-31 % in the period 2012-2013. To increase the suppression of NTTU 001, the fermentation of Lactobacillus sp. which was able to promote conductivity, H2O2 accumulation, POD activity and inhibited spore germination of C. gloeosporioides was added to create NTTU 002. NTTU 002 had better suppression against disease caused by C. gloeosporioides than NTTU 001 in sugar apple. However, it’s failed to observe the protecting effect of NTTU 002 in the field test in the period 2014. We propose this result from the climate is uncomfortable for C. gloeosporioides to infect sugar apple. However, fermentation of Lactobacillus sp. could promote the flowing and fructification. In the coming future, both NTTU 001 and NTTU 002 could be applied to reduce the using of chemistry pesticide in agriculture.
Key word: ferredoxin, Bacillus sp., plant-protective additive, anthracnose
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目錄
中文摘要………v
英文摘要………..vii
目錄………...………ix
表目錄………...………..xiii
圖目錄………..……...xiv
第一章、 前言……….……1
第一節、 番荔枝慣行農法栽培………1
第二節、 番荔枝病害種類與防治方式………1
第三節、 芽孢桿菌對植物進行生物防治案例………3
壹、 拮抗病原菌生長作用………...3
貳、 誘導植物抗病能力………...4
第四節、 硫鐵蛋白防治案例………5
第五節、 輔助性資材防治案例………5
壹、 鈣離子………...5
貳、 咖啡發酵液………...6
參、 番荔枝種子水萃液………...7
肆、 乳酸菌發酵液………...7
第六節、 研究動機與目的………8
第二章、 材料方法………...9
第一節、 實驗材料………9
壹、 植物材料………...9
貳、 菌種材料………...9
參、 植物保護添加劑材料……….10
第二節、 實驗方法………..10
壹、 病原菌株獲取 ………...10
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1. 罹病組織分離 2. 離葉接種
貳、 病原菌鑑定………11
1. 真菌基因組 DNA 抽取 2. 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 放大真菌 之保守性序列 參、 蛋白分析 ………...12
1. 蛋白質含量測定 2. 蛋白質墨點法 (Dot blot) 檢測 3. 冷光呈色 肆、 植物生理活性分析 ………...13
1. 過氧化氫檢測 2. 過氧化氫酶檢測 3. 離子滲漏率檢測 伍、 病原菌抑制測試 ………...14
1. 對峙培養 2. 孢子接種 陸、 田間病害調查………...15
第三章、 結果………...16
第一節、 台東地區番荔枝病原菌分離、接種及鑑定………..16
第二節、 炭疽病菌株的特性及對番荔枝感染能力測試………..16
第三節、 黑潰瘍病菌及黑腐病菌感染能力與生長特性測試………..18
第四節、 芽孢桿菌及輔助性資材對番荔枝與病原菌之影響………..19
壹、 芽孢桿菌對番荔枝和病原菌的影響……….19
貳、 鈣離子對番荔枝和病原菌的影響……….21
參、 咖啡發酵液對番荔枝和病原菌的影響……….21
肆、 番荔枝種子水萃液對番荔枝和病原菌的影響……….22
伍、 乳酸菌發酵液對番荔枝和病原菌的影響……….23
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陸、 複合式植物保護添加劑對番荔枝和病原菌的影響………….24
第五節、 複合式植物保護添加劑在炭疽病菌孢子接種試驗之保護效果…..25
壹、 葉錠接種測試……….25
貳、 試驗田接種測試……….26
第六節、 複合式植物保護添加劑在慣行農法田間綜合保護效果…………..27
第四章、 討論………...29
第一節、 病原菌分離株之生長、感染特性比較………..29
第二節、 芽孢桿菌及輔助性資材對提升番荔枝抗性反應與番荔枝病原菌抑 制作用之影響………..32
第三節、 混和藥劑在試驗田接種炭疽病菌分生孢子之影響………..35
第四節、 混和藥劑於田間施用之效用………..35
第五節、 未來展望………..36
第五章、 參考文獻………...37
附錄 1、實驗架構圖………..91
附錄 2、真菌鑑定使用引子條件………92
附錄 3、2 株黑潰瘍病菌 Phomopsis sp. 分離株之菌絲外觀與菌絲塊接種番荔枝 情況。………93
附錄 4、溫度對 2 株黑潰瘍病菌 Phomopsis sp. 分離株之影響。………94
附錄 5、抗生素對 2 株黑潰瘍病菌 Phomopsis sp. 分離株之影響。………95
附錄 6、4 株黑腐病菌 Lasiodiplodia sp. 分離株之菌絲外觀與菌絲塊接種番荔枝 情況。………..96
附錄 7、溫度對 4 株黑腐病菌 Lasiodiplodia sp. 分離株之影響。………97
附錄 8、芽孢桿菌 Bacillus sp. HS1 及 HS2 對 6 株病原菌菌絲生長之影 響。………..98
附錄 9、奈米級鈣離子對 6 株病原菌菌絲生長之影響。………100
xiii
附錄 10、咖啡發酵液對 6 株病原菌菌絲生長之影響。………101 附錄 11、番荔枝種子水萃液對 6 株病原菌菌絲生長之影響。………102 附錄 12、混合藥劑與農藥對 6 株病原菌菌絲生長之影響。………103 附錄 13、利用孢子接種進行複合性植物保護添加劑防治效果試驗之判斷標
準。………105 附錄 14、田間進行綜合病害處理複合性植物保護添加劑防治效果試驗之判斷標
準。………106
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表目錄
表 1、 11 株分離菌株離葉與果實接種之感染程度試驗………46 表 2、利用 NTTU 001 防治炭疽病菌 C. g-4 (53-1-2) 之病徵分級數量…………47 表 3、利用 NTTU 002 防治 4 株炭疽病菌之病徵分級數量與罹病率…………48 表 4、100、101、102 與 103 年台東地區 60 個番荔枝園區病害調查…………49
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圖目錄
圖 1、5 株炭疽病菌 C. gloeosporioides 分離株之菌絲外觀。………50
圖 2、溫度對 5 株炭疽病菌 C. gloeosporioides 分離株之影響。………51
圖 3、4 株炭疽病菌 C. gloeosporioides 分離株之孢子外觀型態。………52
圖 4、抗生素對 5 株炭疽病菌 C. gloeosporioides 分離株之影響。………53
圖 5、4 株炭疽病菌 C. gloeosporioides 分離株之產生孢子條件測試。…………54
圖 6、4 株炭疽病菌 C. gloeosporioides 分離株之感染番荔枝葉片情況。………55
圖 7、4 株炭疽病菌 C. gloeosporioides 分離株之孢子感染番荔枝果實情況。…56 圖 8、5 株炭疽病菌 C. gloeosporioides 分離株之菌絲塊與孢子感染番荔枝葉片 情況。………57
圖 9、芽孢桿菌 Bacillus sp. HS1 及 HS2 對番荔枝光合作用型硫鐵蛋白 (PT-Fd) 之影響。………58
圖 10、芽孢桿菌 Bacillus sp. HS1 及 HS2 對番荔枝過氧化氫含量與離子滲漏之 影響。………..59
圖 11、芽孢桿菌 Bacillus sp. HS1 及 HS2 對 5 株炭疽病菌 C. gloeosporioides 分離株菌絲生長之影響。………61
圖 12 、 奈 米 級 鈣 離 子 對 番 荔 枝 過 氧 化 氫 含 量 與 離 子 滲 漏 之 影 響。………..………63
圖 13、奈米級鈣離子對 5 株炭疽病菌 C. gloeosporioides 分離株菌絲生長之影 響。………65
圖 14、咖啡發酵液對番荔枝過氧化氫含量與離子滲漏之影響。………….……66
圖 15、咖啡發酵液對 5 株炭疽病菌 C. gloeosporioides 分離株菌絲生長之影 響。………68
圖 16 、 番 荔 枝 種 子 水 萃 液 對 番 荔 枝 過 氧 化 氫 含 量 與 離 子 滲 漏 之 影 響。………..………69
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圖 17、番荔枝種子水萃液對 5 株炭疽病菌 C. gloeosporioides 分離株菌絲生長 之影響。………71 圖 18、乳酸菌發酵液對番荔枝過氧化氫含量與離子滲漏之影響。…………..…72 圖 19、乳酸菌發酵液對 4 株炭疽病菌 C. gloeosporioides 分離株之孢子發芽影
響。………74 圖 20、混合藥劑對番荔枝過氧化氫含量與離子滲漏之影響。………..……75 圖 21、混合藥劑與農藥對 5 株炭疽病菌 C. gloeosporioides 分離株菌絲生長之
影響。………77 圖 22、NTTU 001 與 NTTU 002 對炭疽病菌 C.g-4 (53-1-2) 感染番荔枝葉錠之
影響。………79 圖 23 、 NTTU 002 對 炭 疽 病 菌 C.g-1 (1-36-2) 感 染 番 荔 枝 葉 片 之 影
響。………81 圖 24、利用 NTTU 001-Pre 進行 07 -西康路 D 場區田間防治。………82 圖 25、利用 NTTU 001 進行 07 -西康路 D 場區田間防治。……….…….84 圖 26、利用 NTTU 002 進行 07 -西康路 D 場區田間防治。………….………86 圖 27、利用 NTTU 002 進行 07 -西康路 D 場區影響番荔枝開花結果數量測
試。……….………...…88
1
第一章、 前言 第一節、 番荔枝慣行農法栽培
番荔枝在小果時與荔枝外觀相似，稱之為「番荔枝」，在台灣稱之為「釋迦」
(薛聰賢，2003)，為番荔枝科 (Annonaceae)，目前已有 130 屬 2100 種，分佈 於熱帶與亞熱帶，其中有番荔枝屬 (Annona)、巴婆果屬 (Asimina)、樓林果屬 (Rollinia) 和紫玉盤屬 (Uvaria) 會生產食用果實 (Couvreur, Niangadouma, Sonké
& Sauquet, 2015)，屬於多年生半落葉性小喬木，生長環境為溫暖濕潤，年帄均溫 度為 22 ℃以上，經由荷蘭人引進台灣種植，目前已有品種為釋迦 (A. squamosa)、
鳳梨釋迦 (A. atemoya)、冷子番荔枝 (A. cherimola Mill)、滑果番荔枝 (A. glabra)、
山刺番荔枝 (A. montana Macf.)、刺果番荔枝 (A. muricata L.)、牛心梨 (A.
reticulata L.) 和樓 林 果 (Rollinia mucosa S.)， 在 台 東 地 區 以 台 東 一 號 (A.
squamosa)、台東二號 (A. squamosa) 和鳳梨釋迦為主要栽種品種 (黃徳昌，2010)，
種植方式為由種子發芽的實生苗或利用原生種番荔枝做為砧木的架接苗，定植時 以 1-2 年的苗木為佳，種植初期需維持土壤濕度，因此在 1-4 月春雨期間定植 有助提高存活率 (盧柏松，2012)，生長週期為葉片營養期 (3-6 月)，開花繁殖 期 (7-11 月)，果實採收期時 (12-2 月) 和強制剪枝期 (1-2 月)，採收期根據不 同的番荔枝品系與耕種時節，台東一號與台東二號約在七月開始採收夏期果，於 12 月採收冬期果，而在元宵節後強制剪枝。
第二節、 番荔枝病害種類與防治方式
在國外番荔枝病害研究中，果實病害有：Phomopsis anonacearum 造成的黑 潰瘍病 (Black canker)、Phytophthora palmivora 造成的疫病 (Purple blotch)、
Glomerella cingulata var. minor (無性世代 Colletotrichum gloeosporioides) 造成的 炭疽病和有性世代的 Botryodiplodia theobromae (無性世代 Lasiodiplodia sp.) 造 成 番 荔 枝 果 腐 病 (Diplodia rot) ， 而 葉 部 病 害 有 ： Cercospora anonae 、
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Cylindrocladium colhounii 或 Pestalotia annonicolan 引起的葉斑病 (Leaf spot)，
Colletotrichum anonicola 引 起 的 炭 疽 病 (Anthracnose) 和 細 菌 性 病 原 菌 Xanthomonas annonae 引起的葉壞疽病，根莖部病害有：細菌性病原菌 Ralstonia solanacearum 造成的青枯病 (Bacterial wilt)。而在台灣有記錄的病害，與國外記 錄相同的有：青枯病、炭疽病、黑潰瘍病、番荔枝果腐病，又稱黑腐病 (Black rot) 和紫斑病，而在根莖部病害有：Corticium salmonicolor Berk. & Broome 造成莖部 赤衣病、Phellinus noxius (Corner) G. H. Cunningam 引起的褐根病、Ganoderma applanatum、Ganoderma lucidum、Rigidoporus microporus 和 Fomitella supine 造 成的根朽病 (黃，2012、Silveira et al., 2006, Ann, Lee, & Tsai, 1999, Alahakoon &
Brown, 1994, Huang, Leu, & Lee, 1991, Mayers & Hutton, 1987, Morton, 1966)。目 前以果實病害最為嚴重，可以利用去除病枝加上化學性農藥施用，以達到延緩發 病之效果，但果實病害的病徵相似，容易判斷錯誤，而施用錯誤的化學性農藥對 番荔枝病害不具專一性，使防治效果不佳或讓病原菌有抗藥性 (黃德昌與李惠鈴，
1997)。
本實驗為解決上述的問題，利用誘導番荔枝的抗病能力來開發複合性植物保 護添加劑，以幫助番荔枝抵抗多種病害，而本實驗選擇番荔枝炭疽病害來做試驗 對象，因為炭疽病害不只有在番荔枝為害，根據 Sutton (1992) 統計炭疽病菌有 39 種，其宿主範圍包含：穀類、豆類、蔬菜、花卉、多年生作物與果樹 (Than, Prihastuti, Phoulivong, Taylor, & Hyde, 2008)，目前為害熱帶果樹的炭疽病菌發現 有 4 種，分別為：C. gloeosporioides、C. acutatum、C. musae 和 C. magna (Bruce De Silva, Michereff, 2013)，這 4 種炭疽病菌的孢子外觀為長橢圓形，大小約為 8-19 × 3-6.5 μm，培養方式為利用馬鈴薯培養基於 22-25 ℃ 培養 2 星期，即可 獲得分生孢子 (楊秀珠，1998)，其感染植物方式為利用分生孢子入侵植株的自 然開口，在高溫潮濕的環境大量感染植株，其外部病徵為葉部發病具有輪狀病徵，
而在果實感染時，前期為黑色斑塊，後期會有橘紅色孢子堆產生，藉由感染的果 實與枯枝進行越冬，直到隔年環境回復到高溫潮濕，藉由雨水、昆蟲與耕作修剪
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傳播分生孢子，再次成為感染原。已經有學者發現 Colletotrichum graminicola 在 植物體內由分生孢子發芽產生一次菌絲 (Biotrophic hyphae) 進活體寄生，植物產 生 抗 病 機 制 抑 制 病 原 菌 時 ， C. graminicola 轉 變 菌 絲 型 態 為 二 次 菌 絲 (Necotrophic hyphae) 進行攻擊 (Kempf et al., 2010)，而目前發現感染番荔枝的炭 疽病菌是 C. gloeosporoides (李惠鈴，1995)，其在植物體內的攻擊方式則尚未確 認。
第三節、 芽孢桿菌對植物進行生物防治案例
目前常用的生物防治菌種多為芽孢桿菌屬 (Bacillus sp. )，Bacillus sp. 是一 群具有促進植物生長的根圈細菌 (Plant growth-promoting rhizobacterium, PGPR)，
其抑制病原菌的方式分為：拮抗病原菌生長作用 (Antibiosis) 和誘導植物抗病能 力。
壹、拮抗病原菌生長作用
Katz 與 Demain 統計有 169 種以上的抗生物質 (Katz & Demain, 1977)，化 學性質如：脂胜肽類 (Lipopeptides) Surfactin、Fengcin 和 Iturin；聚酮化合物 (Polyketides) Macrolactin 和 Bacillaene，可用來抑制 Beauveria bassiana 的孢子發 芽與菌絲生長 (Guo et al., 2015; Wang et al., 2014)，又以 B. subtilis 產生的 Iturin 類化合物的抑制效果為佳 (Gong et al., 2006)，可用來防治真菌性病原菌，可以拮 抗的真菌為：Cercospora kikuchii、Verticillium dahliae、Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici、Alternaria mali、Rhizoctonia solani 和 Pyricularia oryzae 與細菌型病 原菌： Xanthomonas oryzae 及 Pseudomonas lachrymans 等多種植物病原菌 (Katz & Demain, 1977)，而 B. thuringiensis 產生的基丁質酶 (chitinases) 可以抵 抗 Fusarium oxysporum 和 Rhizoctonia solani (Mehmood et al., 2015)，B. cereus subsp. thuringiensis 產生的環狀二肽 (Cyclic dipeptides，CDPs)，還具有抑制線蟲
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型病害的效果 (Kumar, Nambisan, & Mohandas, 2014)。Bacillus sp. 還有產生氰化 氫 (HCN) ， 啡并 (Phenazines) ， 硝 吡 咯 菌 素 (Pyrrolnitrin) 和 藤 黃 綠 菌 素 (Pyoluteorin)，直接毒殺病原菌 (Babalola, 2010)；物理作用有：B. amyloliquefaciens 產生蛋白酶 (Proteases)、澱粉酶 (Amylases)、β-葡聚酶 (β-glucanases)、幾丁質 酶 (Chitinases) 和木聚糖酶 (Xylanases) 抑制 Penicillium expansum 與 Botrytis cinerea 生長 (Avdeeva et al., 2014)。
貳、誘導植物抗病能力
有些 Bacillus sp. 的種類可以利用誘導植物的系統性抗性 (Induces systemic resistance, ISR) 的方式，同時啟動植物的水楊酸 (Salicylic acid, SA) 與茉莉酸 (Jasmonic acid, JA) 抗性路徑，在細胞中累積作為訊號分子的過氧化氫 (H2O2) 與在植物細胞壁沉積啟動物理性防禦機制的愈傷葡聚醣 (Callose) (Niu et al., 2011)，誘導植物提高抗性，抵抗病原菌攻擊之效用，在作物施用案例有：B. cereus 處理採收後枇杷可防治炭疽病菌感染 (Wang X., Wang L., Wang J., Liu, & Zheng, 2014)、幫助阿拉伯芥同時啟動 SA 與 JA 的抗性抵抗 Pseudomonas syringaepv.
tomato DC3000 (Niu et al., 2011) B. amyloliquifaciens 和 B. subtilis 可以啟動阿拉 伯芥的 ISR 抵抗 Erwinia carotovora 、B. pumilus 可以幫助阿拉伯芥與菸草啟 動 ISR 抵抗 P. syringae pv. maculicola 和 Peronospora tabacina (Choudhary, Prakash, & Johri, 2007)；B. subtilis 可以幫助瓜科產生 Callose、木質素 (Lignin) 與大量累積過氧化氫 (H2O2) 抵抗 Podosphaera fusca 感染 (García-Gutiérrez, Zeriouh, Romero, Cubero, de Vicente, & Pérez-García, 2013) 等。
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第四節、 硫鐵蛋白防治案例
硫鐵蛋白 (Ferredoxin, Fd) 是一群具有 2Fe-2S 官能基的蛋白質，主要功能 區的胺基酸排列為 CX4CX2CXnC，其中 C 代表的是半胱氨酸 (Cysteine) 。 Cysteine 利用特定的序列結合細胞中 2 價或 3 價的鐵離子鍵結形成錯合離子 的螯合物，再藉由電子來改變當中鐵離子的帶電狀況 (Fe2+↔Fe3+)，調控生物體 內氧化還原反應 (Oxidation-reduction reaction)。目前已知硫鐵蛋白參與許多電子 傳遞路徑以調控基礎生理代謝，其中包含光合作用 (Photosynthesis)、胺基酸合 成 (Amino acid synthesis)、脂質合成 (Lipid synthesis)、澱粉生合成 (Starch synthesis)、過氧化物代謝 (Reactive oxygen species metabolism) 及植物生長代謝 (Plant-growing metabolism) 等 (Hanke & Mulo, 2013)。
國際上許多研究團隊注意到硫鐵蛋白的含量是否會影響到作物對於逆境的 耐受能力。已經有報告指出轉基因作物增量表現 Fd 後，可以提高對於許多細菌 性病原菌的抵抗能力。以甜椒 (Capsicum annuum) 選殖出 Fd 基因 (pflp) 舉例，
例如：提高基因轉殖菸草對菸草野火病菌 Pseudomonas syringae pv. tabaci 及引 起軟腐病菌 Erwinia carotovora subsp. carotovora 的抗病能力 (Huang et al., 2004、
2006)。提升基因轉殖蘭花及阿拉伯芥 ，抵抗軟腐病菌 E. carotovora subsp.
carotovora (Ger, Louh, Lin, Feng, & Huang, 2014; Liau et al., 2003)、幫助番茄抵抗 由 Ralstonia solanacearum 所引起青枯病 (Huang et al., 2007)，提高基因轉殖水 稻對水稻白葉枯病菌 Xanthomonas oryzae 的抗病能力 (Tang et al., 2001)。以及 幫助非洲渡過糧食缺乏的香蕉抵抗香蕉枯萎病菌 Xanthomonas sp. (Namukwaya et al., 2012)。
第五節、 輔助性資材防治案例
壹、 鈣離子
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當 植 物 遭 受 病 原 菌 攻 擊 時 ， 病 原 菌 的 分 泌 物 會 引 起 植 物 的 抗 性 反 應 (Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，此時鈣離子會大量進入細胞質與 鈣依賴型蛋白激酶 (Calcium-dependent protein kinases, CPKs) 結合，進行訊號傳 遞促使 NADPH 氧化酶大量產生過氧化物 (Reactive oxygen species, ROS) (Ranf et al., 2014)。此過氧化物的產生可以用來抑制病原菌及啟動植物 SA 抗病，產生 系統性抗病反應 (Systemic acquired resistance, SAR) (Poovaiah et al., 2009)。實際 運用案例：紅光照射與鈣離子對蕃茄抵抗 P. syringae pv. tomato DC3000 具有效 果 (Yang et al., 2015)；在向日葵中，鈣離子處理後可以誘導植株產生 ROS 並啟 動 SA 與 JA 的抗性 (Garrido, Espinosa, &Alvarez-Tinaut, 2009)；在阿拉伯芥中 也可以引起 ROS 的累積 (Dark, Demidchik, Richards, Shabala, & Davies, 2011) 及與脫落酸 (Abscisic acid, ABA) 誘導玉米產生 ROS 累積(Ma et al., 2012) 等。
貳、咖啡發酵液
植物分泌的二次代謝物是經由脂質氧化酶 (Lipoxygenase) 生合成，用來抵 抗病原菌與害蟲的攻擊 (Patui et al., 2007)，如：皂鹼、咖啡因及生物鹼等，這些 抑菌物質會使病原菌無法順利生長於植物體 (Velasco, Lema, Francisco, Soengas,
& Cartea, 2013)，其中在應用上最多的種類為黃銅 (Flavonols) 和羥基肉桂酸 (Hydroxycinnamic acids) ， 可 以 用 來 幫 助 葡 萄 抵 抗 Plasmopara viticola (Latouche,Bellow,Poutaraud,Meyer, &Cerovic, 2013)，而咖啡中含有 50 % 以上的 綠原酸 (Chlorogenic acids) (Koshiro et al., 2007)，在小麥上可以用來抵抗壞疽型 (Necotrophic) 病原菌Stagonospora nodorum的攻擊 (Winterberg et al., 2014)，且 Vasconcelos (2011) 等 人 找 到 咖 啡 中 含 有 一 種 類 似 幾 丁 質 酶 的 木 聚 糖 酶 (Chitinase-like xylanase inhibitor protein, XIP) 可以抑制 Phakopsora pachyrhizi 孢子發芽 (Vasconcelos et al., 2011)。
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參、番荔枝種子水萃液
根據 Deshmukh 在 2011 年時發現，番荔枝種子的萃取物可以提升大鼠細 胞中的超氧化歧化酵素 (Superoxide dismutase, SOD) 活性 (Deshmukh & Patel, 2011)，在植物過氧化反應中，氧從電子傳遞鏈獲得電子轉變成超氧陰離子，可 以用來抵抗病原菌入侵，但超氧陰離子對細胞毒性比較嚴重，會藉由 SOD 轉變 成毒性較低的過氧化氫，讓抗病訊號增加 (del Rio, Sandalio, Corpas, Palma, &
Barroso, 2006) ， 此 外 番 荔 枝 種 子 萃 取 物 對 細 菌 型 微 生 物 ( 如 ： Klebsiella pneumoniae，Staphylococcus aureus，Escherichia coli 和 Salmonella paratyphi) 具 有抑制作用 (Aamir, Kumari, Khan, & Medam, 2013)，可藉此來防治番荔枝目前已 被發表的青枯病菌。
肆、乳酸菌發酵液
乳酸菌運用在動物方面的試驗，許多對人體的腸道菌相的改變與促進免疫力 提升具有效果 (Stiles, 1996)，對人體而言是一種安全的益生菌種 (Generally recognized as safe, GRAS) (Mehta, Arya, Goyal, Singh, & Sharma, 2013)，因此在植 物保護研究方面，開始嘗試希望將乳酸菌開發成有機添加劑，在 2012 年，
SRINIVAS 發現乳酸菌的添加，對番茄青枯病菌 (Ralstonia solanacearum) 具有 產生抑制圈之效果，將乳酸菌處理在番茄植株上還可以促進生長 (Srinivas, Narasimha Murthy, Malini, & Savitha, 2012)，對植物而言乳酸菌也算一種促進生長 的微生物 (Plant growth-promoting bacteria, PGPB)。
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第六節、 研究動機與目的
在過去的研究中，知道植物體內的硫鐵蛋白表現量提升，可以幫助植物渡過 生物性逆境，而目前是以基因轉殖的方式來提升硫鐵蛋白的表現量，但是目前對 轉基因作物的疑慮，讓大眾不容易接受基轉作物，以致於目前植物病害防制大多 以化學防治為主，而生物科技的進步，開始利用生物防治來取代化學性農藥，目 前已被研發出許多以直接抑制病原菌的生物性藥劑，但常遭遇到於田間施用時，
效果有限，因此本實驗利用可以提升植物體內的硫鐵蛋白的芽孢桿菌，引起番荔 枝產生誘導性系統抗性 (Induced systemic resistance，ISR) 做為策略，加入 4 種 的輔助性有機資材，增強被啟動的 ISR 幫助番荔枝抵抗炭疽病菌的感染。
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第二章、 材料方法 第一節、 實驗材料
壹、 植物材料
試驗田番荔枝品種為台東二號 (大目種)，苗株取得方式為台東緣圓源苗園：
種子實生苗 (1 年生)，種植於試驗田，每 2 天澆水一次， 2 周/次施用水耕液。
購自台東大目種番荔枝，收取種子種植於恆溫培養房，播種前先將番荔枝種 子利用 75 % 酒精滅菌，放至於黑暗環境 25 ℃進行春化作用 24 小時後，種植 於土壤條件為 75 % 培養土、25 % 珍珠石，每 3 天澆水一次。培養條件為：
光照時間 16 小時光照，8 小時黑暗，日夜溫度 26 ℃，光強度為 400 μmol m-2 s-1。
貳、菌種材料
實驗中所使用的細菌為：枯草桿菌 Bacillus sp. HS1 與枯草桿菌 Bacillus sp.
HS2。原菌種保存於-80 ℃ 冷凍櫃中，使用前以無菌接種環至保存液中沾取菌源 塗畫於 LB 固態培養基 (Luria Bertani)，以 28 ℃ 培養 2 天，再從此培養基挑 取單一菌落，培養於液態 LB 培養基，培養條件為： 28 ℃，150 rpm，以分光 光度計測量菌體濃度後，以無菌水稀釋於適當濃度後使用。
將罹病組織上分離到的真菌分離株，以無菌解剖刀取下菌絲塊，培養於馬鈴 薯培養基 (Potato dextrose broth medium, PDB) 含有 2 % 瓊脂 (PDA)，培養條件 為：28 ℃，黑暗培養 2-4 天使用，利用無菌解剖刀取下菌絲塊培養於液態 PDB 的培養條件為：28 ℃ 3-5 天，150 rpm。
取炭疽病菌菌絲塊，培養於 1/5 倍 PDA 斜面培養基，28 ℃，黑暗培養 1 個 月，以無菌水清洗獲得孢子，利用血球計數器計數孢子濃度，以無菌水稀釋於適 當濃度後使用。
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參、植物保護添加劑材料
購自台東班鳩冰品的番荔枝種子，將番荔枝種子洗淨曬乾後，取 10 g 種子 磨碎，加入 500 ml 的 RO 水，以 121 ℃，1.25 atm 的條件萃取形成番荔枝種 子水萃原液備用。
收集自台東地區飲料店與統一超商的咖啡殘留物，取 80 % 的咖啡殘留物，
加入自來水於室溫陰涼處發酵 3 個月，取出後以 121 ℃，1.25 atm 的條件滅菌 形成咖啡發酵原液備用。
取自台茂公司的奈米級膠體碳酸鈣的 50 % 為原液，利用 10 mM 磷酸緩衝 溶液稀釋使用。
取自景岳公司乳酸菌發酵液，生產條件為利用 DE Man, Rogosa and Sharpe (MRS) 培養基發酵乳酸菌 (Lactobacillus paracasei)，去除產物後，所剩下之基質 為原液，以無菌水稀釋於適當濃度後使用。。
NTTU 001- Pre：將 105 CFU/ml 芽孢桿菌 HS1、HS2 加入 5 % 的番荔枝種 籽萃取液和咖啡發酵液，以及 0.5 % 奈米級鈣離子，混合備用。
NTTU 001：將 107 CFU/ml 芽孢桿菌 HS1、HS2 加入 10 % 的番荔枝種籽 萃取液和咖啡發酵液，以及 2 % 奈米級鈣離子，混合備用。
NTTU 002：將 NTTU 001 之配方加入 1 % 乳酸菌發酵廢棄液，混合備用。
第二節、 實驗方法
壹、 病原菌株獲取 1. 罹病組織分離
收集台東地區番荔枝園區與台東森林公園的罹病組織，以 75 % 酒精表面 消毒，利用無菌解剖刀切下含有 1/3 病徵與 2/3 健康組織，放置於水培養基 28
℃，黑暗培養 1-2 天後，利用無菌解剖刀取出菌絲塊放置 PDA 培養，培養基 於 28 ℃，黑暗培養 2-4 天後備用。
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2. 離葉接種
取自種植於恆溫培養房的番荔枝葉片，保濕暗處理 7 小時後，以 75 % 酒 精表面消毒後，使用 0.0025 % 界面活性劑 (Silwet L-77) 破壞葉面角質層，利 用直徑 0.8 cm 打洞器製成菌絲塊，放置處理過後的番荔枝葉背，培養於 28 ℃，
黑暗培養，2、5 天觀察 (Gaikwad, Sawant & Nimbalkar, 2005)。
貳、 病原菌鑑定
1. 真菌基因組 DNA 抽取
真菌 基因組 DNA 的 抽取是利用植物基因組 DNA 迷你試劑組 (plant genomic DNA mini kit) (GeneaidBiotech,Taipei, Taiwan)。取約 0.05 g 真菌組織放 入 1.5 ml 微量離心管中，加入液態氮磨碎。加入 400 μl GPX1 緩衝液及 5 μl RNaseA 後均勻混合，放入 65 ℃ 水浴槽 10 分鐘使細胞破裂。再加入 100 μl GP2 緩衝液並置於冰上 3 分鐘，使醣類及蛋白質沉澱下來。將此混合液取出置 入過濾管柱 (filter column)，以 1,000 ×g 離心 1 分鐘，去除葉片組織。將此濾 液加入 750 μl 的 GP3 緩衝液，輕輕上下搖晃加以混合。將混合液吸入 GD 管 柱 (GD column) 中，以 13,000 ×g 離心兩分鐘並丟棄廢液。加入 400 μl W1 緩 衝液，以 13,000 ×g 離心 30 秒並丟棄廢液，加入 600 μl Wash 緩衝液 (Wash buffer)，以 13,000 ×g 離心 30 秒並丟棄廢液。再以 13,000 ×g 空轉 3 分鐘，
去除多餘溶液。將 GD 管柱 (GD column) 放置於新的 1.5 ml 離心管中，加入 30 μl 預熱 65 ℃ 的洗脫緩衝液 (elution buffer)，靜置 5 分鐘。以 13,000 ×g 離 心 30 秒。所收集的濾液即含有高含量的真菌基因組 DNA。
2. 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 放大真菌之保 守性序列
利用 PCR 放大真菌之保守性序列。PCR 反應條件如下：5 μg 的真菌基因 組 DNA，1 μl 的 10 mM 脫氧核醣核酸 (deoxynucleotide triphosphate, dNTP) 混 合液 (Violet bioscience, Taipei, Taiwan)，3 μl 的 10 倍 PCR 緩衝溶液 (Violet bioscience, Taipei, Taiwan)，1 μl 的 1 μM ITS 1 引子 (5’-TCC GTA GGT GAA
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CCT GCG G-3’) (Blossom Biotechnologies Inc., Taipei, Taiwan) ( Liu,2009)，1 μl 的 1 μM ITS 4 引 子 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’) (Blossom Biotechnologies Inc., Taipei, Taiwan) (Liu, 2009)，0.01 μl 的 TaqPlusprecisionTM 聚 合酶酵素 (Violet Bioscience, Taipei, Taiwan)，最後添加無菌水，使其最終體積為 30 μl。PCR 反應器的設定如下：預熱反應為 94 ℃ 加熱 5 分鐘，循環反應為 94
℃，60 秒；58 ℃，45 秒；72 ℃，45 秒。此條件循環 30 次，最後再以 72 ℃ 反應 10 分鐘。將所得到 PCR 產物注入於由 0.5 倍的 Tris-acetate-EDTA (TAE) 緩衝溶液與洋菜凝膠粉 (agarose-LE 1200) (Taiwan Agar-Agar, Chiayi, Taiwan) 配 製的 1 % 洋菜凝膠。以 16.67 v cm-1 條件進行電泳分離。待 DNA 電泳分離後，
取 出 膠 體 並 浸 泡 於 含 0.5 μg mL-1 之 溴 化 乙 錠 (ethidium bromide, EtBr) (ZymesetBiology, Taipei, Taiwan) 溶液 10 分鐘，再泡至於水中進行脫色 10 分 鐘，最後以電泳膠數位影像系統拍攝。即可判斷真菌保守性序列片段是否放大含 量與純度，在將產物定量後送至基隆米克斯生技公司進行解序，將得到的序列以 NCBI 網站進行比對。
參、 蛋白分析
1. 蛋白質含量測定
實驗中測量蛋白質含量的方式是蛋白質微量分析法 (Bio-Rad protein assay microassay procedure kit) (Bio-Rad, USA)。取約 0.05 g 番荔枝嫩葉組織放入 1.5 ml 微量離心管中，加入液態氮磨碎。加入 500 μl 蛋白萃取液，經震盪機均勻震 盪 10 秒後，以 11,000 rpm 離心 10 分鐘取上層溶液，換製新的微量離心管，以 相同條件再次離心取上清液，即為待偵測蛋白溶液。配製染色試劑溶液，即五倍 稀釋的 Bio-Rad protein assay buffer (Bio-Rad, USA)，利用 Whatman No.1 濾紙 (Whatman International, England) 過濾。準備 6.25、3.13、1.56、0.78、0.39 及 0.2 μg μl-1 的小牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 溶液作為標準蛋白溶液。各 取 1 μl 不同濃度的標準蛋白溶液或待偵測蛋白質溶液，分別與 200 μl 的染色試 劑溶液均勻混合，靜置反應 7 分鐘，取出混合液偵測吸光值 (O.D.595)。把標準 蛋白溶液的吸光值對蛋白質濃度作圖，計算出回歸直線公式，再將待偵測蛋白質 溶液的吸光值代入，以內插法算出其蛋白質溶液濃度。
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2. 蛋白質墨點法 (Dot blot) 檢測
先 準 備 磷 酸 鹽 (phosphate buffer saline, PBS) 緩 衝 液 ， 磷 酸 鹽 洗 滌 (PBS-Tween 20, PBST) 緩衝液，1 % 阻圔試劑 (blocking reagent) 緩衝液。將已 轉印蛋白的轉印膜浸泡於 1 % 阻圔試劑 (blocking reagent) 緩衝液並搖晃 60 分鐘。將一次抗體 (Polyclone antiserum against PFLP) 以 500 倍稀釋於 1 % 阻 圔試劑 (Blocking reagent) 緩衝液，稀釋後將轉印膜浸泡於此溶液 12 小時並靜 置於 4 ℃ 冰箱。以磷酸鹽洗滌 (PBS-Tween 20, PBST) 緩衝液清洗 3 次，每次 搖晃 5 分鐘。將二次抗體 (Peroxidase conjugated affinity purified anti-rabbit IgG [Goat]) (Rockland Immunochemicals,Gilbertsville,USA) 以 1,000 倍稀釋於 1 % 阻圔試劑 (Blocking reagent) 緩衝液，再將轉印膜浸泡於此溶液中並搖晃 60 分 鐘。以磷酸鹽洗滌 (PBS-Tween 20, PBST) 緩衝液清洗 3 次，每次搖晃 5 分鐘。
3. 冷光呈色
將已轉印蛋白的轉印膜利用 Western LightningTM Chemiluminescence Reagent Plus Kit (PerkinElmer, USA)， 將 1 ml Western Bright ECL Luminol / enhancer solution 和 1 ml Western Bright Peroxide Chemiluminescent peroxide solution 混 合 均 勻，添 加 至 轉印膜靜置 1 分鐘，利用 Kodak X-Omat Blue Autoradiography Film (Kodak, USA)，覆蓋於轉印膜呈色 1 分鐘，取出浸泡 於 4.5 稀釋的顯影劑 (Kodak, USA) 1 分鐘，取出浸泡於 4.5 稀釋的定影劑 (Kodak, USA) 1 分鐘，以清水清洗並置於 3 mm 濾紙上晾乾。
肆、 植物生理活性分析 1. 過氧化氫檢測
取 0.025 g 番荔枝嫩葉組織放入 1.5 ml 微量離心管中，加入液態氮磨碎。
加入 600 μl 磷酸鹽緩衝液 (50 mM, pH 6.8)，經震盪機均勻震盪 10 秒後，以 9,000 g 離心 25 分鐘取 300 μl 上層溶液，換製新的微量離心管，加入 300 μl 硫 酸鈦溶液，經震盪機均勻震盪 10 秒後，以 6,000 g 離心 15 分鐘取 200 μl 上 層 溶 液 ， 即 為 待 偵 測 過 氧 化 氫 溶 液 ， 利 用 波 長 410 nm 檢 測 ， 以
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{[(X410-0.0011)/0.0004]*1.5}/重量(mg) 換算過氧化氫含量 (Jana & Choudhuri, 1981)。
2. 過氧化氫酶檢測
取 0.025 g 番荔枝嫩葉組織放入 1.5 ml 微量離心管中，加入液態氮磨碎。
加入 1,000 μl 磷酸鹽緩衝液 (50 mM, pH 5.8)，經震盪機均勻震盪 10 秒後，以 12,000 g 離心 20 分鐘取 10 μl 上層溶液，加入 100 μl 磷酸鹽緩衝液、100 μl Guaiacol 與 90 μl 過氧化氫 (39 mM)，均勻混合後，即為待偵測過氧化氫酶溶 液利用波長 470 nm 檢測，以 [(△A470)/26.6*反應體積(ml)*稀釋倍率/反應時間 (min)/重量(g)] 換算過氧化酶活性 (MacAdam, Nelson, & Sharp, 1992)。
3. 離子滲漏率檢測
取 0.025 g 番荔枝嫩葉組織放入 1.5 ml 微量離心管中，加入 1,000 μl 超純 水，以抽氣裝置進行抽氣靜置，抽氣靜置條件為：700 mmHg，抽氣 5 分鐘，緩 慢洩氣，3 循環後，靜置 6 小時，利用電導度計 (Conductivity meter) 檢測細胞 破壞前之離子含量，得到數值 A，將組織以沸水煮 10 分鐘，放涼靜置 15 分 鐘後，檢測細胞破壞後之離子含量，得到數值 B，利用 (A÷B) × 100 %，即為離 子滲漏率 (Wu & Wallner, 1983)。
伍、 病原菌抑制測試 1. 對峙培養
以馬鈴薯培養基 (PDA) 為基礎，各加入 10 % 咖啡發酵液、10 % 番荔枝 種籽萃取液與 2 % 奈米級鈣離子，做成藥劑培養基，將真菌培養於 PDA 培養 基 28 ℃ 2-4 天後，以直徑 0.8 cm 打洞器製成菌絲塊，放置藥劑培養基培養，
根據真菌的生長速率不同，以 8、12、16 和 24 小時為相異的時間間距，紀錄真 菌生長情形。
將真菌培養於 PDA 培養基 28 ℃ 2-4 天後，以直徑 0.8 cm 打洞器製成
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菌絲塊，放置於馬鈴薯培養，根據真菌的生長速率不同，將培養於 LB 培養基 的芽孢桿菌 HS1 和 HS2 加到距離菌絲塊 1.5-2.5 cm 處，進行芽孢桿菌的對峙 培養，其他液態藥劑則以 10 μl 的體積，添加到濾紙錠之方式進行測試，以 8、
12、16 和 24 小時為相異的時間間距，紀錄真菌生長情形。
2. 孢子接種
利用炭疽病菌培養於 1/5 PDA 斜面培養基 28 ℃ 30 天後，以無菌水清洗 獲得孢子後，使用血球計數器計算孢子濃度，以無菌水稀釋，接種於以 75 % 酒 精表面消毒後，使用 0.0025 % 界面活性劑 (Silwet L-77) 破壞葉面角質層的番 荔枝葉片，保濕培養觀察，以感染面積將接種後葉片分級，感染面積 0 % 為 0 級、
10 % 以下感染面積為 1 級、30 % 以下為 2 級、50 % 以下為 3 級和感染面 積達 50 % 以上為 4 級 (附錄 13)。
陸、 田間病害調查
以病害感染面積將田間葉片分級，感染面積 0 % 為 0 級、25 % 以下感染 面積為 1 級、50 % 以下為 2 級、75 % 以下為 3 級和感染面積達 75 % 以上 為 4 級 (附錄 14)。
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第三章、 結果
第一節、 台東地區番荔枝病原菌分離、接種及鑑定
為了解台東地區番荔枝真菌性病害的發生與分布，本研究分別在台東市區、
卑南鄉、太麻里鄉選擇 60 個番荔枝園區，從這些園區的番荔枝罹病組織分離可 能具有致病性的病原真菌，研究結果發現在編號 1、7 和 53 的番荔枝園區罹病 葉片上，分別分離到病原菌編號為：C. g-1 (1-36-2)、C. g-2 (1-39-1)、C. g-3 (7-g 3-3)、
C. g-4 (53-1-2) 與 C. g-5 (53-3-5)，經由菌絲塊的番荔枝離葉接種試驗，初步確 定上述分離株具有感染番荔枝葉片的能力 (表 1)。為進一步鑑定這些分離株，分 別抽取上述分離株的基因組 DNA，再利用 ITS 序列所設計的引子進行 PCR 增 幅及 DNA 定序，經由美國國家生物技術資訊中心 (NCBI) 的 DNA 資料庫比 對 後 ， 發 現 上 述 5 株 分 離 菌 株 皆 與 造 成 炭 疽 病 害 的 Colletotrichum gloeosporioides 真菌相似度均在 99-100 % 範圍。另外藉由相同方式也在第 1 和第 5 園區的罹病葉片，分別發現到 2 株與造成黑潰瘍病害的擬莖點黴屬 (Phomopsis sp.) 真菌，其相似度為 97-99 %，編號為：P-1 (1-33-1) 與 P-2 (5-2-4) (附錄 3)，而在其他罹病植物的莖部，也分離到 4 株分離株，其 DNA 序列比對 結果，與形成黑腐病的毛球雙孢菌屬 (無性世代 Lasiodiplodia sp.，有性世代 Botryosphaeria sp.) 真菌相似度達到 99-100 %，編號分別為：L-1 (BR-2-2)、L-2 (BR-2-4)、L-3 (BR-2-7) 與 L-4 (BR-5-3) (附錄 6)，綜合上述研究結果顯示，在本 實驗過程中，總共成功分離 11 株可以感染番荔枝葉片的真菌性病原菌，其資料 分別統整於後 (表 1)。
第二節、 炭疽病菌株的特性及對番荔枝感染能力測試
為了解上述 5 株於台東地區分離的炭疽病菌生長特性，本實驗利用 PDA 培養基進行菌株的培養試驗，結果發現在 28 ℃ 黑暗培養條件下生長 2 天後，
發現 C. g-1 (1-36-2)、C. g-4 (53-1-2) 與 C. g-5 (53-3-5) 的菌絲會開始轉變成灰
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黑色，但是分離株 C. g-2 (1-39-1) 則持續呈現白色菌絲，而分離株 C. g-3 (7-g 3-3) 則比較容易產生橘色孢子堆 (圖 1)。進一步探討不同溫度對於炭疽病菌菌絲的生 長影響，結果發現在 28 ℃培養時，分離株 C. g-3 (7-g 3-3) 的菌絲生長速率較 其他 4 株分離株緩慢，如果將培養溫度提高至 37 ℃ 時，則這 5 株炭疽病菌 分離株的菌絲生長均受到明顯的抑制，而在 22 ℃ 的培養環境則發現，除了分 離株 C. g-3 (7-g 3-3) 的生長速度不受影響之外，大部份的炭疽病菌菌絲生長速 度在 22 ℃ 的培養時，會比在 28 ℃ 培養時出現降低約 20 % 的現象 (圖 2)。
除了針對菌絲的生長條件，實驗過程也檢測炭疽病菌的分生孢子型態，結果顯示 分離株 C. g-1 (1-36-2)、C. g-4 (53-1-2) 與 C. g-5 (53-3-5) 在 1/5 PDA 培養基產 生的孢子大小約為 14×7.8 μm，而分離株 C. g-3 (7-g 3-3) 的孢子大小則約為 15.6×10.9 μm (圖 3)。
為 了 讓 研 究 過 程 中 ， 容 易 追 蹤 分 離 炭 疽 病 菌 ， 實 驗 也 利 用 Pentachloronitrobenzene (PCNB)、Ampicillin (Amp)、Rifamycin (Rif) 等藥劑來發 展具有選擇性的培養基，實驗結果發現這 5 株病原菌在含有 5ppm PCNB、100 ppm Amp、5ppm Rif 及上述三者的混合藥劑之培養基具有抗性 (圖 4)。另外為 取得產量穩定的炭疽病菌之分生孢子進行後續試驗，利用 PDA、1/5 濃度稀釋 的 PDA 和 V8 培養基，對於上述 4 株炭疽病菌分離株的產孢能力影響，實驗 結果顯示，分離株 C. g-1 (1-36-2) 在 PDA 培養基上，無論光照或黑暗條件，其 產孢數量都非常低，如果將 PDA 進行 5 倍稀釋成為 1/5 PDA 培養基後，其產 孢率在黑暗培養條件會比在 PDA 培養基多出 29 倍、而在光照培養下則增加 24.7 倍。再將培養基換成 V8 培養基則分別比 PDA 多出 19 倍 (Dark) 與 7.6 倍 (Light) 的孢子量 (圖 5A)。此情況在分離株 C. g-3 (7-g 3-3) 的試驗結果則出 現差異，該分離株在 1/5 PDA 培養基中，孢子於黑暗培養條件下增加 13 倍，
但是在光這條件下及 V8 培養基上則無顯著差異 (圖 5B)。而分離株 C. g-4 (53-1-2) 則在 1/5 PDA 培養基光照條件下增加 18 倍，於黑暗培養條件增加 64.5 倍，在 V8 培養基上則只有在黑暗條件下增加 3.8 倍，而光照條件下則無
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顯著差異 (圖 5C)。最後分離株 C. g-5 (53-3-5) 與前述菌株不同，其在 PDA 培 養基黑暗培養條件下，可以有 3,000 spores/ml 的分生孢子產率遠高於其他菌株，
但是這種現象在光照培養條件下就不明顯，而在 1/5 PDA 培養基上，則不論黑 暗或光照培養條件都可以有 1.4 及 9.6 倍的增加，此現象在 V8 培養基則不顯 著 (圖 5D)。
為了解上述分離株的分生孢子在番荔枝的感染能力差異，實驗中分別以 100-103 倍的稀釋倍率，將孢子懸浮液進行序列稀釋，並將稀釋過的孢子懸浮液 噴灑在番荔枝葉錠及果實上，實驗結果發現在原液 (1X) 接種組別，四株炭疽病 菌孢子皆可以感染番荔枝葉錠 (圖 6A)，稀釋後接種也具有濃度效應，感染面積 逐漸縮小 (圖 6B)。番荔枝果實接種實驗則發現分離株 C. g-1 (1-36-2) 可以造成 41 % 的感染面積，C. g-3 (7-g 3-3) 為 26 %、C. g-4 (53-1-2) 為 91 % 和 C. g-5 (53-3-5) 為 71 % (圖 7)。將菌絲塊和孢子接種於番荔枝離葉上，發現 C. g-1 (1-36-2) 和 C. g-3 (7-g 3-3) 是藉由孢子攻擊，在菌絲塊接種離葉時，無法擴大 感染面積，C. g-4 (53-1-2) 和 C. g-5 (53-3-5) 在葉部感染是以菌絲進行擴散，其 孢子接種葉片時，相較弱於接種果實，而 C. g-2 (1-39-1) 因為沒有孢子進行測試，
則無法比較 (圖 8)。綜合以上結果得知，四株炭疽病菌孢子懸浮液皆可以在番荔 枝葉錠及果實造成感染，又以孢子接種果實的感染程度較為嚴重。
第三節、 黑潰瘍病菌及黑腐病菌感染能力與生長特性測試
利用上述相同的檢測方式，檢驗 2 株黑潰瘍病菌分離株 P-1 (1-33-1) 和 P-2 (5-2-4) 的生長特性，結果發現 2 株分離株在 22 ℃培養條件時，生長速率一致，
但是在 28 ℃培養時，分離株 P-1 (1-33-1) 的生長速率會比 P-2 (5-2-4) 快約 2.7 %，而在 37 ℃培養時，2 株黑潰瘍病菌的菌絲則皆無法生長 (附錄 4)。實 驗過程也測試 3 種抗生素對於 2 株黑潰瘍病菌菌絲生長的影響，結果發現這 2 株病原菌也可以抵抗 5 ppm PCNB、100 ppm Amp、5 ppm Rif 與前述 3 者混合
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藥劑 (附錄 5)。另外實驗過程也檢測 4 株不同黑腐病菌分離株 L-1 (BR-2-2)、
L-2 (BR-2-4)、L-3 (BR-2-7) 和 L-4 (BR-5-3)，結果顯示在 28 ℃培養條件下，4 株 黑腐病菌的生長速率最好，而且 4 株分離菌株間並無顯著差異，而在 37 ℃ 培 養時，分離株 L-2 (BR-2-4) 和 L-3 (BR-2-7) 有 59 % 的抑制效果，L-1 (BR-2-2) 和 L-4 (BR-5-3) 則只有 39 % 的抑制作用，在 22 ℃培養時，4 株黑腐病菌約 有 17 % 的抑制作用 (附錄 7)。以上結果顯示，黑腐病菌的菌絲可以在 37 ℃ 的 高溫條件下生長。
第四節、 芽孢桿菌及輔助性資材對番荔枝與病原菌之影響
本研究的主要目的在利用芽孢桿菌觸發硫鐵蛋白相關的的抗病機制，藉此發 展出廣效性的植物保護添加劑，因此在本實驗中必須使用具有誘導鐵蛋白表現能 力的芽孢桿菌屬及放大抗病訊號的輔助性資材，包含奈米級鈣離子、咖啡發酵液、
番荔枝種子水萃液和乳酸菌發酵液。，因此必須檢測這些芽孢桿菌、各種輔助資 材及調配成複合性植物保護添加劑 NTTU 001 和 NTTU 002 後對於番荔枝及 病原菌的各別影響。
壹、 芽孢桿菌對番荔枝和病原菌的影響
在過去的研究結果顯示，提升植物體內光合作用型硫鐵蛋白 (PT-Fd) 含量，
可以提高植物的抗病能力。，因此本研究使用過去在台東初鹿地區分離的 2 株 芽孢桿菌 HS1、HS2，作為誘導植物體內 PT-Fd 表現量的工具。該兩株芽孢桿 菌經 16s rDNA 序列比對後，推測為芽孢桿菌屬 (Bacillus sp.) 細菌。實驗中將 此 2 株芽孢桿菌分別處理於番荔枝根部後，抽取番荔枝葉部總量蛋白質，並進 行蛋白質墨點法 (Dot blot) 測試 PT-Fd 的表現量，結果發現在處理後第 1、3 和 5 天，均可在 1010 倍蛋白質稀釋濃度時，觀察到 HS1 和 HS2 可以誘導番荔枝 的 PT-Fd 表現量增加，而混合藥劑 (NTTU 001, N1 和 NTTU 002, N2) 在 1010
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倍蛋白質稀釋濃度時，也均可以觀察到在處理後具有誘導 PT-Fd 表現量增加的 能力，但是在 NTTU 002 處理組，PT-Fd 的誘導表現量在第三天以後開始出現下 降的情形 (圖 9)。
為了確認芽孢桿菌 HS1 和 HS2 的處理，是否可以直接在番荔枝的細胞引 起初步的逆境反應，導致細胞膜離子滲漏反應出現差異，實驗檢測在處理芽孢桿 菌之後，番荔枝的葉片離子導電度差異，結果發現這 2 株芽孢桿菌均不會改變 番荔枝葉片的離子滲漏率 (圖 10A)。但是進一步檢測 2 株芽孢桿菌 HS1 和 HS2 處理後，番荔枝葉片內部的過氧化氫含量累積，結果發現於處理後 36 小 時，其過氧化氫的含量會有顯著高於對照組的情況，但是在處理的 48 小時 後，
該過氧化氫含量增加的情況，就會降回與對照組相同 (圖 10B)。在過去的研究顯 示，當植物體內過氧化物提升時，同時也會增加移除過氧化物的相關酵素活性會 上升，因此實驗中也檢測番荔枝葉片內部總體 POD 在處理芽孢桿菌 HS1 及 HS2 之後的活性，結果發現處理 HS2 後 48 小時，POD 的活性有顯著提高的 情形，但是 HS1 的處理則無顯著促進的效果 (圖 10C)。
在過去的研究結果顯示，芽孢桿菌屬細菌除了可以誘導植物提高抗病能力外，
也有直接抑制病原菌生長的作用，因此實驗過程檢測 2 株芽孢桿菌 HS1 和 HS2 對 11 株病原菌的直接抑制作用，結果發現 HS1 僅對 C. g-5 (53-3-5) 的菌 絲生長有 10 % 的抑制效果，但是對大部分包括 C. g-1 (1-36-2)、C. g-2 (1-39-1)、
C. g-3 (7-g 3-3)、C. g-4 (53-1-2)、P-1 (1-33-1)、P-2 (5-2-4)、L-1 (BR-2-2)、L-2 (BR-2-4)、L-3 (BR-2-7) 和 L-4 (BR-5-3) 都無明顯的菌絲生長抑制作用，而 HS2 則對炭疽病菌 C. g-1 (1-36-2)、C. g-2 (1-39-1)、C. g-4 (53-1-2)、C. g-5 (53-3-5)、
L-1 (BR-2-2) 與黑腐病菌 L-2 (BR-2-4) 的菌絲生長有 10-30 % 的抑制效果，而 對炭疽病菌分離株 C. g-3 (7-g 3-3)、黑潰瘍病菌 P-1 (1-33-1)、P-2 (5-2-4)、黑腐 病菌 L-3 (BR-2-7) 與 L-4 (BR-5-3) 沒有抑制作用 (圖 11、附錄 8)。上述結果顯 示，發現本研究使用的芽孢桿菌 HS2 則對於 11 株番荔枝真菌性病原菌中有 6 株具有抑制作用，而 HS1 則僅對一株病原分離株具有直接抑制菌絲生長的效
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果。
貳、 鈣離子對番荔枝和病原菌的影響
在本實驗中鈣離子的添加主要目的在提升植物的物理性防禦能力、增強植物 抗病訊號與增強過氧化物產生酵素活性，因此實驗同樣檢測鈣離子處理番荔枝葉 片後，其葉肉細胞的離子滲漏率差異，實驗結果發現，鈣離子處理後 12 小時，
其細胞膜離子導電度開始上升，在 24 小時 上升至高點，於 36 小時 略為下降，
但仍然比對照組高，而在 48 小時 回復到高點(圖 12A)。並且同時檢測鈣離子 處理後，其葉片組織內過氧化氫的含量，結果發現處理後 48 小時內，並沒有看 到過氧化氫含量有顯著增加的情況，特別是在處理 24 小時 後，更有明顯降低 的效果，但在 48 小時 之後，過氧化氫的含量會回復到與對照組一致 (圖 12B)。
而在 POD 活性的測試方面，則發現，鈣離子的處理並無任何明顯的差異 (圖 12C)。
將鈣離子添加於 PDA 培養基中，檢測對病原菌菌絲生長的影響，結果發現 鈣離子對於炭疽病菌分離株 C. g-4 (53-1-2)、C. g-5 (53-3-5) 和黑潰瘍病菌 P-2 (5-2-4) 的菌絲生長有 11-24 % 的抑制效 果，而對炭疽病菌分離株 C. g-1 (1-36-2)、C. g-2 (1-39-1)、C. g-3 (7-g 3-3)、黑潰瘍病菌 P-1 (1-33-1)、P-2 (5-2-4)、
黑腐病菌分離株 L-1 (BR-2-2)、L-2 (BR-2-4)、L-3 (BR-2-7) 與 L-4 (BR-5-3) 沒 有抑制作用 (圖 13、附錄 9)。上述結果顯示，鈣離子具有促進番荔枝葉片細胞 膜離子滲漏率上升的效果，而對過氧化氫總量的累積及 POD 酵素活性則無明顯 差異，對病原菌菌絲生長的影響則只出現在少數病原分離株中。
參、 咖啡發酵液對番荔枝和病原菌的影響
咖啡種子含有大量的酚類化合物，在過去的研究中指出，這些酚類化合物對 於病原菌有直接抑制的作用，因此本實驗選擇咖啡發酵液作為複合性植物保護添 加劑的其中一個資材，實驗中檢測咖啡發酵液對於番荔枝葉片離子滲漏率的影響，
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結果發現處理咖啡發酵液後 24 小時，可以顯著的提升離子導電度，但是處理 36 小時之後，其離子導電度會回復到與對照組相同的程度 (圖 14A)。而同時實 驗也檢測咖啡發酵液處理番荔枝葉片後，過氧化氫含量的累積量，結果顯示咖啡 發酵液並無明顯誘導植物累積過氧化氫含量的效果 (圖 14B)。而在 POD 的活性 檢測結果則顯示，咖啡發酵液的處理可以在 12 小時有明顯而短暫的顯著提升效 果，但是在處理 24 小時之後，則會回復到與對照組相同的活性 (圖 14C)。
另外實驗也檢測咖啡發酵液對於病原菌菌絲生長直接抑制的效果，實驗結果 發現咖啡發酵液對炭疽病菌分離株 C. g-1 (1-36-2)、C. g-3 (7-g 3-3)、C. g-4 (53-1-2)、C. g-5 (53-3-5) 與黑潰瘍病菌 P-2 (5-2-4) 有 13-54 % 的菌絲生長抑制 效果，但是對於炭疽病菌 C. g-2 (1-39-1)、黑潰瘍病菌 P-1 (1-33-1)、及黑腐病菌 L-1 (BR-2-2)、L-2 (BR-2-4)、L-3 (BR-2-7) 與 L-4 (BR-5-3) 都沒有抑制作用。另 外實驗也檢測了咖啡發酵液對於病原菌的，實驗結果發現，咖啡發酵液可以對於 炭疽病菌 C. g-1 (1-36-2)、C. g-4 (53-1-2) 與 C. g-5 (53-3-5) 均有 24-50 % 的發 芽抑制效果 (圖 15、附錄 10)。綜合上述實驗結果發現，咖啡發酵液對於番荔枝 的葉片組織直接影響效果並不明顯，但是對於 5 株病原菌分離株的菌絲生長及 4 株病原菌分離株的孢子發芽，有直接的抑制效果。
肆、 番荔枝種子水萃液對番荔枝和病原菌的影響
過去學者對番荔枝種子水萃液的研究指出，番荔枝的種子萃取物中含有可以 誘導細胞產生過氧化物，由於抗病反應中，過氧化物產生的速度常被當作開啟抗 病反應的重要因素，因此本實驗也將番荔枝種子水萃液作為複合性植物保護添加 劑中一個重要的組成因子。實驗過程檢測番荔枝種子水萃液對於葉片組織的影響，
實驗結果發現，處理番荔枝種子水萃液之後 48 小時可以看到，葉片組織的離子 滲漏度會有明顯提升的情形 (圖 16A)。另外在番荔枝種子水萃液處理後 48 小時 內，並沒有看到植物葉片組織內過氧化氫的含量有明顯的差異 (圖 16B)。但是再 移除過氧化物相關酵素 POD 的活性檢測結果，可以再番荔枝種子水萃液處理 36
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小時之後，看到短暫而且明顯促進活性的效果 (圖 16C)。
同時實驗也檢測番荔枝種子水萃液在 PDA 培養基中直接對病原菌菌絲生 長抑制的效果。實驗結果發現對番荔枝種子水萃液對於炭疽病菌 C. g-4 (53-1-2)、
C. g-5 (53-3-5) 與 黑潰瘍病菌 P-2 (5-2-4) 的菌絲生長能力，具有 14-38 % 明顯 的抑制效果，但是對於炭疽病菌 C. g-1 (1-36-2)、C. g-2 (1-39-1)、C. g-3 (7-g 3-3)、
黑潰瘍病菌 P-1 (1-33-1)、P-2 (5-2-4)、黑腐病菌 L-1 (BR-2-2)、L-2 (BR-2-4)、L-3 (BR-2-7) 與 L-4 (BR-5-3) 則均沒有明顯抑制菌絲生長的作用 (圖 17、附錄 11)。
由上述結果顯示，番荔枝種子水萃液確實具有促進番荔枝葉片組織離子滲漏率上 升及 POD 活性上升的能力，但是對過氧化氫的累積量則無明顯的促進的效果，
對於病原菌的菌絲生長抑制作用則僅在 11 株分離株中的 3 株病原菌可以看到 部分抑制的效果。
伍、 乳酸菌發酵液對番荔枝和病原菌的影響
在過去的研究報告中也發現，乳酸菌發酵液具有直接抑制病原菌生長及保護 植物對抗非生物性逆境與促進開花結果的效果，因此本實驗也將乳酸菌發酵液作 為保護性藥劑的添加資材之一，分別測試乳酸菌發酵液對於番荔枝葉片組織及 4 株病原菌分離株的影響，實驗結果顯示處理乳酸菌發酵液 24 小時之後，可以有 效提升番荔枝葉片組織的離子滲漏率，而且這個提升的效果會呈現雙波峰的形式，
在處理後 36 小時下降，到了 48 小時後又再度提升 (圖 18A)。實驗也同時檢 測乳酸菌發酵液處理後。番荔枝葉片組織內的過氧化氫含量，結果顯示乳酸菌發 酵液處理後 36 小時可以看到其組織內過氧化氫的含量有明顯提升的現象，而該 提升現象會在處理 48 小時候回到與對照組一致 (圖 18B)，另外實驗也檢測乳酸 菌發酵液處理後，番荔枝葉片內過氧化物代謝相關酵素 POD 的活性，實驗結果 顯示乳酸菌發酵液的處理，可以在處理 12 小時後看到明顯提升的情形，而此提 升的現象可以維持到 36 小時，到了處理 48 小時之後才降到與對照組一致 (圖 18C)。
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另外實驗過程也檢測了乳酸菌發酵液對於病原菌孢子發芽率的抑制作用，實 驗結果顯示乳酸菌發酵液可以對炭疽病菌的 4 個分離株 C. g-1 (1-36-2)、C. g-3 (7-g 3-3)、C. g-4 (53-1-2)、C. g-5 (53-3-5) 達到 27-45 % 的抑制效果 (圖 19)。綜 合上述實驗結果顯示，乳酸菌發酵液確實可以在番荔枝葉片組織產生提升離子滲 漏率，誘導過氧化氫含量及提升 POD 酵素活性的效果，同時可以對 4 株不同 炭疽病菌的孢子發芽率產生明顯的抑制效果。
陸、 複合式植物保護添加劑對番荔枝和病原菌的影響
在上述實驗過程中分別檢測了芽孢桿菌及多種資材對於番荔枝葉片組織及 病原菌的直接抑制作用，為了進一步了解這些資材與芽孢桿菌混合後，是否會影 響其個別原本的能力，因此實驗將上述因子分別混合成不含有有乳酸菌發酵液的 NTTU001 及含有乳酸菌發酵液的 NTTU002，並分別以 NTTU 001 與 NTTU 002 進行上述相同的測試，實驗結果顯示不論 NTTU 001 或 NTTU 002，均能在 處理 12 小後，產生明顯提升番荔枝葉片組織離子滲漏率，而且此提升情形可以 延續到 48 小時之後 (圖 20A、B)。而在番荔枝葉片組織內部過氧化氫含量的檢 測結果也顯示，NTTU001 及 NTTU002 均能有效的顯著提升其內部的含量，但是 NTTU 001 的處理會提早在 24 小時就觀察到促進累積的現象，此現象可以延續 到處理後 48 小時，而 NTTU 002 的處理卻會延遲到處理 48 小時之後才看到 顯著的提升情形 (圖 20C、D)。而在番荔枝葉片組織內部 POD 活性測試結果則 顯示，NTTU 001 沒有明顯誘導 POD 活性的能力，但是 NTTU 002 則可以在 處理後 12 與 36 小時看到 POD 酵素活性明顯提升的結果，只是此提升現象會 在處理 48 小時之後降回對照組一致的活性 (圖 20E、F)。
為進一步了解 NTTU 001 與 NTTU 002 對於病原菌的直接抑制效果，實驗 過程以對峙培養的方式分別檢測 NTTU 001 與 NTTU 002 對於 11 株不同病 原菌菌絲生長的抑制效果，同時使用 2 種炭疽病建議使用的農藥，分別為撲克 拉錳和賽普護汰寧，做為正對照組進行試驗。結果發現 NTTU 001 與 NTTU 002
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對於炭疽病菌 C. g-1 (1-36-2)、C. g-3 (7-g 3-3)、C. g-4 (53-1-2)、黑潰瘍病原菌 P-1 (1-33-1)、黑腐病菌 L-1 (BR-2-2)、L-3 (BR-2-7) 與 L-4 (BR-5-3) 的菌絲生長 均無明顯的抑制效果，只有作為正對照組的 2 種農藥對上述 7 株病原菌有 25-40 %明顯的菌絲生長抑制效果，但是 NTTU 001 與 NTTU 002 對於炭疽病菌 C. g-2 (1-39-1)、C. g-5 (53-3-5)、黑潰瘍病菌 P-2 (5-2-4) 與黑腐病菌 L-2 (BR-2-4) 這 4 株病原真菌則有 8-22 % 明顯的菌絲生長抑制作用，但其抑制效果比作為正 對照組的 2 種農藥的抑制能力差 (圖 21、附錄 12)。另外實驗也檢測了 NTTU001 及 NTTU002 對於炭疽病菌分生孢子的發芽抑制作用，實驗結果顯示 NTTU001 及 NTTU002 均對炭疽病菌的孢子發芽率無明顯的抑制效果 (圖 21G)。綜合上述 實驗結果發現，複合式植物保護添加劑 NTTU 001 與 NTTU 002 皆可保留提升 番荔枝葉片組織離子滲漏率與促進過氧化氫含量的能力，而僅只有 NTTU 002 保有誘導番荔枝葉片組織 POD 的活性上升的能力，但 NTTU 001 則沒有效果。
而在直接抑制病原菌菌絲生長能力方面，NTTU 001 與 NTTU 002 均只對 4 株 病原菌分離株產生部分的有抑制效果，但在孢子發芽測試中則發現不論 NTTU 001 與 NTTU 002 都失去對炭疽病菌孢子發芽的抑制效果。
第五節、 複合式植物保護添加劑在炭疽病菌孢子接種試驗之保護效 果
壹、 葉錠接種測試
從上述實驗結果了解複合式植物保護添加劑 NTTU 001 與 NTTU 002 的特 性與功能之後，接著利用番荔枝葉錠的接種試驗來了解 NTTU001 及 NTTU002 對於保護番荔枝對於炭疽病菌入侵的能力，實驗結果顯示，C. g-4 (53-1-2) 的分 生孢子 (104 spores/ml) 可以在對照組的葉錠造成 46 % 的感染率 (圖 22A)，而 事先處理 NTTU 001 2 天後再進行接種，可以把 C. g-4 (53-1-2) 孢子造成的感染 程度降低到 27 %，總體相對病害感染比例下降了 42 % (圖 22B)；若將處理試劑
