應用微流體平台於共生細胞交互作用及神經細胞生長之研究

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(1)行政院國家科學委員會補助專題研究計畫. ■ 成果報告 □期中進度報告. 計畫名稱:應用微流體平台於共生細胞交互作用及神經細胞生長之研究計畫類別：■ 個別型計畫 □ 整合型計畫計畫編號：NSC 97-2221-E-006 -222 -MY3 執行期間： 97 年 08 月 01 日至 100 年 07 月 31 日計畫主持人：林裕城特聘教授共同主持人：計畫參與人員：葉家顯、陳英傑、李孟軒. 成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：□精簡報告 ■完整報告本成果報告包括以下應繳交之附件： □赴國外出差或研習心得報告一份 □赴大陸地區出差或研習心得報告一份 □出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份 □國際合作研究計畫國外研究報告書一份. 處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢 □涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢執行單位：中. 華. 民. 國. 100. 年. 10. 月. 13. 日.

(2) 一、中文摘要本研究計劃共分為兩部分，第一部份係利用此成熟的微流操控技術，製備出細長微纖維，並在此微纖維上培養細胞，用於組織工程中修補神經組織和培養細胞的支架用途上。其實驗之設計不僅是微流體領域中的新式突破，並解決製備技術上的瓶頸，也是製備生醫材料上的另一種模式。在第二部份，我們將利用微機電製程技術提供一種嶄新的細胞共同培養方法，可於同一晶片上同時將兩種細胞分離且共同培養，並觀察細胞在模擬血管流之應力下，因生長因子之變動，所造成分化及遷移之變化。在本研究主要是利用微接觸壓印法與毛細作用微鑄模法，精確的將細胞分別培養於特定的反應區內，且在不同細胞的生長因子之相互影響下，而造成分化及遷移的表現，進而探討在施予不同流體剪應力的環境下，兩種細胞間的分化及遷移情況，最後藉由光學顯微鏡進行細胞樣本分析。關鍵字: 微流操控技術，微纖維，細胞共同培養，毛細作用微鑄模法二、英文摘要 In this project, the first section is to utilize this well developed microfluidic control technology to fabricate long microfibers on which cells will grow, aiming to repair nerve tissue and form the cell scaffolds. The second section is to provide a novel cell co-culture method using MEMS technique, In this new way, two kinds of cells can e separated and cultivated, and later observed their differentiation and migration caused by he change of growth factor under the pressure in the simulated blood vessel fluid. Utilizing microstamping and micromolding in capillarie (MIMIC), this project can accurately separate and co-culture the cells in the specific reaction region. The influences between each growth factor and the result of differentiation and migration in different environment with and without shear stress were discussed, and the cell samples will be analyzed via microscope. Keyword: microfluidic control technology, microfiber, cell co-culture, MIMIC 三、報告內容 3.1 前言隨著半導體產業的興起，使得微小化科技進展速度加快，其中源起於『半導體製程』的新概念，矽製程之微機電系統(Micro-Electro-Mechanical-Systems, MEMS)技術在近幾年已發展出其特有的製造技術與應用領域，例如：黃光微影技術、薄膜沉積、蝕刻技術、翻模技術、接合技術、LIGA及LIGA-like等微型加工技術；在微機電系統技術應用方面也結合了電子、化學、光電、生物醫學技術、奈米材料等，成為一種新世代的微小化應用科技。在跨領域整合的應用上，微機電系統技術更扮演著重要角色，不論生物、化學、分子醫學與工程等專業領域，都由於微機電系統技術所帶來的微小化效應，也激發出全新的想法與看法，對各式應用皆有新的發展。 3.2 研究目的 1.

(3) 本研究為三年期計畫，第一年(97年度) 第一部分主要探討PDMS微流道晶片設計製作，不同環境下對微纖維絲生成影響與其最佳化參數，第二部分主要針對製作細胞共同培養裝置(毛細作用微鑄模)，細胞的收集計數，培養和選用，最佳細胞濃度和細胞共同培養後細胞遷移距離做為探討。第二年(98年度)第一部分主要是小尺寸微流道晶片的製作方法，及各式基材材料對細胞培養的探討和神經細胞的選用和其細胞染色方法之探討，第二部分主要針對縮短細胞間的間距和細胞共同培養後細胞遷移距離做為探討。第三年(99年度) 第一部分主要探討最佳化的材料試劑調配，纖維絲的表面修飾後培養細胞之探討和細胞影像分析與細胞活性探討，第二部分主要探討流場數值模擬，循環式流體裝置平台設計製作和有流體剪應力下共同培養後細胞遷移距離之探討。 3.3 文獻探討微流道晶片最早是由晶片實驗室(Lab-on-a-chip)應用微機電製程技術製作出微小生物晶片，在1994年，由美國Oak Ridge National Laboratory提出的想法，目前已知可以在微流道晶片上進行的生醫相關實驗，譬如複製片段基因功能的聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)、核酸的定序反應、微流體操作、電泳(Electrophoresis)、質譜分析、抗原抗體結合或一般的酵素反應等。藉由這些反應可知，微流道晶片應用的範圍十分廣泛，包括醫學診斷、化學分析儀器、生化感測器、環境偵測、抗體基礎分析、核酸分析、基因片段複製等。在生醫觀點上，血管內血液流動時，流體剪應力之異常是造成心血管疾病的重要因素之一。因此1842 年，Poiseuille等人發表了關於毛細血管中血液流動的論文，之後相繼有許多相關的研究發表[1-3]。在1981 至1985 年間，Dewey、Nerem與Wechezak等學者利用穩態流體機所產生高於7 dyne/cm2 的流體剪應力使內皮細胞骨架拉長，並使細胞順著流體方向排列成長[4-6]。在1992 年時Nerem等人[7]發表了動脈粥狀硬化發生在內皮細胞為方形 (Cuboidal)或圓形(Round)的動脈區域，因為此動脈區域會有較大的阻抗，故於論文提及之內皮細胞的伸展，乃是控制動脈粥狀硬化的重要因子。此外，剪應力會造成內皮細胞本身的 metabolic與gene調控反應更為明顯，此現象也在1995 到2001年間被Resnick、Barakat與 Garcia-Cardena等學者所發表[8-10]。本研究利用微流道晶片與細胞共同培養結合應用之概念，為心血管疾病之研究提供一個新的研究平台，是一相當值得研究的題材。 3.4 研究方法(99年度，計畫執行第三年，本計畫共三年) 本年度將利用上述前兩年所建立之研究基礎，在第一部分中進行微纖維絲的生成實驗，接著針對微纖維絲支架進行修飾處理，再執行細胞之養殖與生長評估，最後透過各式觀察法驗證其成效，以期能為相關神經橋接修復工程領域提供新的發展方向。第二部分，擬針對細胞在受流體剪應力下流場之模擬、建立循環式流體裝式之平台與細胞受流體剪應力時細胞間相互作用之觀察與探討其主要執行內容分述如下：第一部分 1. 材料試劑最佳化調配法之探討 2. 針對微纖維絲之處理與修飾研究 3. 以微纖維絲培養細胞之研究與探討 4. 細胞影像分析與細胞活性探討 2.

(4) 第二部份 1. 流場數值模擬 2. 生長激素於循環式流場中擴散分佈現象之探討 3. 循環式流體裝置平台之設計與製作 4. 單一種細胞進行培養後於流體剪應力下細胞生長型態與遷移之探討 5. 兩種細胞進行共同培養後於流體剪應力下細胞生長型態與遷移之探討 3.5 結果與討論第一部份 1. 材料試劑最佳化調配法之探討由於幾丁聚醣易溶於酸性溶液中，因此在準備上需先調配 2%醋酸溶液，再將幾丁聚醣粉末加入其中，經加熱攪拌以加速溶解，最後配製出 0.25%的幾丁聚醣溶液。本實驗中三聚磷酸鈉溶液為交聯劑，調配方法是以去離子水(D.I. water)溶解調配成 10%的濃度，過濾後添加鹽酸溶液使 pH 為 5.22 左右，以增加交聯反應中 NH3+官能基的數目。許旺細胞培養基調配法是參考生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center)所提供之成份配方所調配而成，成份以 Dulbecco`s modified eagle’s medium 培養基為提供維持細胞的生長所需的養分，其中包含 4 mM L-glutamine、4.5 g/L glucose 與 1.5 g/L 碳酸氫鈉 (Sodium bicarbonate)，以及 10%胎牛血清(Heat-inactivated fetal bovine serum, FBS)，並添加 100 μg/mL streptomycin 與 10 unit/mL Penicillin。再以 1N 的 HCl 或 1N 的 NaOH 調整 pH 值至 7.1~7.4 後，用 0.22 μm 之 Bottle filter 過濾，最後分裝至無菌之血清瓶中，置於 4℃冰箱中保存。纖維母細胞培養基調配法是用 Dulbecco`s modified eagle`s medium 培養基，以提供細胞生長所需的養分，其中包含 1%的 4 mM L-glutamine、1.5 g/L 碳酸氫鈉(Sodium bicarbonate)，以及 5%胎牛血清(Heat-inactivated fetal bovine serum，FBS)，並添加 100 μg/mL streptomycin 與 10 unit/mL Penicillin。以 1 N 的 HCl 或 1 N 的 NaOH 調整 pH 值至 7.1~7.4 後，再經過 0.22 μm 之 Bottle filter 過濾，最後分裝至無菌之血清瓶中，置於 4℃冰箱中保存。 2. 針對微纖維絲之處理與修飾研究該實驗目的是為了探討幾丁聚醣纖維絲應用於細胞培養上的可行性，因此以兩種不同類型的細胞進行實驗，以觀察不同細胞在纖維絲上的生長情形，本節將簡介所用之細胞並敘述實驗方法。 (1) 小鼠許旺細胞(Rat schwann cell, RSC96) 由過去的文獻研究可以發現，人類許旺細胞屬於周圍神經組織的細胞之一，當周圍神經受損後，將扮演起修復神經組織的重要角色，能提供再生所需的良好環境，且具有引導軸突生長方向的功能，常應用於組織工程的試用上。而本研究將選用小鼠許旺細胞(圖1)為對象進行實驗，該細胞株購自新竹-食品工業發展研究所，由於是以冷凍寄送，因此在實驗前需進行解凍培養流程，再進行培養實驗。. 3.

(5) 圖1 小鼠許旺細胞 (比例尺為100 μm) 細胞解凍與繼代培養流程： 1. 開啟UV光滅菌無菌操作台24小時，以維持無菌環境。 2. 將冷凍細胞管在37℃的水浴槽中進行解凍，輕搖冷凍管使其融化(約1分鐘左右)，經酒精噴灑管壁與管口後立即移入無菌操作台。 3. 瓶口過火後打開瓶蓋，吸取1 mL細胞液至含有9 mL培養液的細胞培養皿中培養(稀釋比例約為1:10)，混合均勻並經顯微鏡觀察無聚集現象後，移入培養箱(Incubate) (37℃， 5% CO2)中培養，待細胞貼附後更換新培養基，以去除抗凍劑(Dimethyl sulfoxide, 4. 5. 6. 7.. DMSO)，隔天進行繼代培養。細胞進行繼代培養前以UV光滅菌無菌操作台24小時後，將PBS、Trypsin-EDTA與培養基於恆溫水浴槽升溫到37℃，再以70%之酒精噴灑滅菌後拿進無菌操作台。以塑膠吸管抽掉培養皿內的舊培養基，再以5 mL之PBS反覆沖洗培養皿兩次，以清除殘留的舊培養基，最後抽乾PBS溶液。吸取1 mL的Trypsin-EDTA滴入培養皿，再置入細胞培養箱3分鐘，使細胞懸浮起來。加入1 mL培養基並反覆沖刷培養皿以收集懸浮的細胞，再經打散後將所需的細胞數目加入含有9 mL新培養基的培養皿中，並置入細胞培養箱中進行培養，即完成細胞繼代培養的過程。. (2) 小鼠纖維母細胞(NIH-3T3) NIH-3T3細胞是源自於小鼠胚胎的纖維母細胞(圖2)，為一種與其他細胞接觸時會被抑制生長的連續性細胞株，常被運用在試驗癌化細胞的可能因子。其細胞繼代培養的操作步驟，同小鼠許旺細胞的培養流程第4~7步驟。. 4.

(6) 圖2 小鼠纖維母細胞 (比例尺為100 μm) (3) 幾丁聚醣纖維絲細胞適應性實驗本實驗中所製備的幾丁聚醣纖維絲是透過三聚磷酸鈉溶液進行交聯反應所製得，其中三聚磷酸鈉溶液因加入鹽酸溶液而使pH值徧酸，因此在使用幾丁聚醣纖維絲進行實驗前，需進行洗滌並調整纖維絲的 pH 值以適合細胞培養實驗。而為了增加細胞的貼附性 (Adhesion)，將細胞間基質(Extracellular matrix, ECM)-膠原蛋白(Collage)沾附在纖維絲上，並將沾附ECM的纖維絲放置於普通培養皿(Not-culture dish)中，接著再進行下一步的實驗流程。實驗流程如下： 1. 將幾丁聚醣纖維絲從承接載台吸取到無菌普通培養皿中。 2. 注入PBS溶液浸泡，並更換PBS溶液以洗滌乾淨並調整酸鹼值。 3. 以針頭將幾丁聚醣纖維絲提取出來。 4. 將膠原蛋白溶液以噴霧方式沾附在幾丁聚醣纖維絲上。 5. 待半風乾後，放於普通培養皿中，並移入無菌操作台。 6. 開啟UV光進行滅菌24小時以上，至此即完成纖維絲的實驗準備。 7. 實驗中計數兩類細胞各100萬顆分別注入普通培養皿中。 8. 待細胞貼附在纖維絲上後，進行更換培養基，除去無貼附細胞。 9. 每隔24小時觀察細胞在幾丁聚醣纖維絲上的貼附生長情形。 (4) 細胞染色與觀察為便於觀察細胞在幾丁聚醣上的貼附與生長情形，如細胞外觀上不甚明顯，可加入數滴Trypan blue，使幾丁聚醣纖維絲沾附而呈現淡藍色，細胞因為有細胞膜的保護，將不被染上顏色，藉此可清楚的區別出細胞的分佈與生長情形。 3. 以微纖維絲培養細胞之研究與探討 (1) PMMA晶片製備幾丁聚醣纖維絲結果當幾丁聚醣溶液形成層流的同時，幾丁聚醣液體層流持續向前推進下，交聯後的幾丁聚醣纖維絲也形成於流道中，並由出口端排出到裝有三聚磷酸鈉溶液的承接載台裡，進一 5.

(7) 步促使交聯反應更完全並保存。進一步觀察承接載台裡的纖維絲，不同流量所生成的不同管徑幾丁聚醣纖維絲，外觀形態上大部份能保持直線狀，部分呈現彎曲則是因為在流道中或在出口端處纖維絲相互碰撞所造成的，所收集的幾丁聚醣纖維絲如圖 3 所示，進一步可以發現幾丁聚醣纖維絲在固定流量條件的操控下能呈現均一管徑。幾丁聚醣纖維絲呈半透明狀且略帶淡褐色，其顏色隨管徑的增大而加深，藉由纖維絲的彎曲面可觀察到纖維絲的管徑大小，發現介於 50~200 µm 之間，經由染色後能更清楚的觀察到管徑的尺寸。進一步透過 SEM 觀察，如圖 4 所示，發現幾丁聚醣纖維絲表面略為粗糙狀，此一特點對於應用在細胞培養上，將能增加細胞貼附幾丁聚醣纖維絲的效果。保存在三聚磷酸鈉溶液中的幾丁聚醣纖維絲，能維持彈性與形狀，纖維絲之間不會有相互沾黏的現象，能輕易拉伸出來而予以分離。由此可知，以三聚磷酸鈉溶液進行幾丁聚醣纖維絲的製備，能同時具有交聯作用與保存幾丁聚醣纖維絲的功能。 (a). (b). (c). (d). 圖3 承接載台裡所收集的纖維絲：(a)~(b) 管徑小於100 μm (比例尺為50 μm)，(c)~(d) 管徑小於200 μm (比例尺為100 μm與200 μm) (a). (b). 6.

(8) 圖4 幾丁聚醣纖維絲之SEM圖：(a) 放大500倍視野下 (比例尺為200 μm)，(b) 放大1500倍視野下 (比例尺為50 μm)，PMMA晶片所製備之幾丁聚醣纖維絲，外型上較為筆直，藉由觀察冷凍乾燥造成之冰晶分佈，顯示出纖維絲表面略為粗糙 (放大1500倍，比例尺為50 μm) (2) PDMS晶片製備幾丁聚醣纖維絲結果透過微機電技術所製備的 PDMS 晶片，具有深寬皆 100 μm 的矩形微流道，能製備出更細小的幾丁聚醣纖維絲。以 PDMS 微流體晶片製備幾丁聚醣纖維絲時，由於流道深寬僅 100 μm，且流量以 μL/min 為單位調控，因此液體流速極為快速，纖維絲由出口端進入承接載台時，因所受壓力釋放急速驟減，造成纖維絲前進速度減緩而發生堆疊情形，如圖 5(a) 所示，因此幾丁聚醣纖維絲在外型上折曲比例高。另外，由實驗過程中也發現，當流速相對提高時，折曲的比率也相對的較高。. (a). (b). 圖5 PDMS晶片製備幾丁聚醣纖維絲：(a) 纖維絲以堆疊螺旋方式排出，(b) 幾丁聚醣纖維絲因製備快速，造成纖維絲呈彎曲狀 (比例尺為200 μm) 由上節的實驗結果得知，增加邊鞘流體的流量能生成較細的層流，相對可得到較細的幾丁聚醣纖維絲，如圖 6 所示，雖然在流速比較快的條件下，纖維絲會具有折曲的現象，但管徑大小的生成範圍卻可由 20~50 μm 左右，可製備出較細小的幾丁聚醣纖維絲。而在外觀上顏色也較為透明，圖 6(b)為經染色後所呈現的幾丁聚醣纖維絲，20 μm 管徑的透明纖維絲輪廓可清楚被觀察到。進一步透過 SEM 觀察，如圖 7 所示，可以清楚的觀察到外型上多呈彎曲狀外，同樣可以發現幾丁聚醣纖維絲表面略為粗糙狀。 (a). (b). 圖6 幾丁聚醣纖維絲：(a) 小於50 μm的幾丁聚醣纖維絲 (比例尺為50 μm)，(b) 小於20 μm 的幾丁聚醣纖維絲，經染色後，能清楚觀察到折曲的現象與管徑的大小 (比例尺為20 μm) 7.

(9) (a). (b). 圖7 幾丁聚醣纖維絲之SEM圖：(a) 放大200倍視野 (比例尺為500 μm)，(b) 放大1500倍視野 (比例尺為50 μm)，由PDMS晶片所製備之幾丁聚醣纖維絲，外型上多呈彎曲狀，藉由觀察冷凍乾燥造成之冰晶分佈情形，顯示出纖維絲表面略呈粗糙狀 4. 細胞影像分析與細胞活性探討觀察幾丁聚醣纖維絲與兩種細胞共同培養的結果，培養 24 小時後，發現細胞能成功貼附在 PMMA 晶片所製備之幾丁聚醣纖維絲上，並有生長的跡象，如圖 8(a)~(b)所示；PDMS 晶片所製備的纖維絲，管徑上較細小且呈彎曲狀，細胞不易附著，生長情形也較不理想，如圖 8(c)~(d)所示。因此，在探討細胞與幾丁聚醣纖維絲的培養實驗上，將以 PMMA 所製備之幾丁聚醣纖維絲與細胞共同培養。. 圖8(a)~(b) PMMA晶片所製備之纖維絲分別與許旺細胞及纖維母細胞培養結果，(c)~(d) PDMS晶片所製備之纖維絲分別與許旺細胞及纖維母細胞培養結果 (比例尺為100 μm) 8.

(10) (1) 許旺細胞培養結果將許旺細胞與 PMMA 晶片所製備之幾丁聚醣纖維絲上共同培養 24 小時後，細胞能明顯表現出附著幾丁聚醣纖維絲表面的現象，如圖 9(a)，而其他區域則較難以貼附與生長，藉此可以清楚的觀察到在纖維絲上的細胞生長現象。此外細胞在纖維絲上已有增生的現象，如圖 9(b)所示，經染色後放大倍率更能觀察到細胞的增生與生長的情形。. 圖9 培養24小時後：(a) 放大20倍視野 (比例尺為100 μm)，(b) 放大50倍視野 (比例尺為50 μm)，經染色後可以發現細胞成功附著於幾丁聚醣纖維絲上，並清楚觀察到細胞在纖維絲上的形態持續培養觀察到第 48 小時，如圖 10 所示，細胞數目明顯增多，表示細胞能適應於幾丁聚醣纖維絲上，除細胞株具有生長活化的現象外，也進行細胞分裂增生的過程。此外，進一步可以發現到細胞的增生與生長方向是沿著纖維絲中軸方向延展開來，且細胞間有相互連結排列的現象。. 圖10 培養48小時後：(a) 細胞貼附於幾丁聚醣纖維絲上後數目顯明增多，(b) 細胞生長排列與纖維絲中軸平行 (比例尺為100 μm) 在培養 72 小時之後，發現細胞數目持續增加，由此得知幾丁聚醣纖維絲對於細胞而言 9.

(11) 是無毒性且細胞相容性高，有益於細胞的貼附生長。而細胞之間能沿纖維絲的中軸排列相互連結，也突顯出幾丁聚醣纖維絲能作為引導細胞生長方向的平台。如圖 11 所示，細胞在纖維絲上能完整的活化生長，並藉由細胞分裂相互接觸串連，在纖維絲上形成一條細胞鏈，驗證了纖維絲狀的幾丁聚醣具有成為細胞支架的潛力與作為引導細胞生長方向的平台。. 圖11 培養72小時後：細胞表現出增生現象，在細胞分裂後使細胞相互串連成鏈，證明了幾丁聚醣纖維絲能具備有培養細胞的應用性 (比例尺為100 μm) (2) 纖維母細胞培養結果將纖維母細胞與幾丁聚醣纖維絲共同培養 24 小時後，發現細胞能成功附著於纖維絲上，如圖 12(a)所示，細胞貼附於纖維絲的表面與側面，並有活化生長的跡象，而以約 100 µm 管徑的纖維絲進行培養後，能更明顯觀察到細胞的生長分佈情形，貼附的細胞數目也較多，如圖 12 (b)所示，細胞開始有增生的形象。. 圖12 培養24小時後：(a) 細胞能成功附著於幾丁聚醣纖維絲上，並在表面與側面貼附生長， (b) 以約100 μm管徑的纖維絲進行細胞培養，能觀察到較多的細胞貼附在表面上 (比例尺為 10.

(12) 100 μm) 細胞培養 48 小時後，細胞數目明顯增加，並佈滿纖維絲表面，顯示幾丁聚醣纖維絲能適合細胞的貼附與增生，如圖 13(a)所示，與纖維絲周圍區域相比較，細胞僅於纖維絲上能大量的生長，且伸展方向與纖維絲的中軸方向一致，顯示對於細胞引導生長方向是具有作用的，如圖 13(b)所示。. 圖13 培養48小時後：(a) 細胞於幾丁聚醣纖維絲上能具有增生現象，進行細胞分裂後逐漸佈滿纖維絲表面，(b) 能清楚觀察到細胞在纖維絲上呈現排列一致的形態 (比例尺為100 μm) 在培養 72 小時之後，發現細胞數目持續增加，並能將幾丁聚醣纖維絲完整的包覆起來，由此發現幾丁聚醣纖維絲對於細胞而言是無毒性且細胞相容性高，適合細胞的貼附生長。如圖 14 所示，細胞在纖維絲上能活化生長，並藉由細胞分裂將纖維絲包覆起來，相較周圍區域，細胞局部生長的情形，表示幾丁聚醣纖維絲營造的環境有助於細胞的生長；再從細胞的伸展方向觀察發現，幾丁聚醣纖維絲具有引導細胞生長方向的可能性。. 圖14 培養72小時後：細胞表現出大量增殖現象，在細胞分裂後能沿幾丁聚醣纖維絲表面而將其完整的包覆起來，且出現相互堆疊的現象，表示細胞數目增生甚多，證明了幾丁聚醣纖維絲具有應用在組織工程的可行性 (比例尺為100 μm) 11.

(13) 從以上實驗結果發現，利用微流體晶片所製備的幾丁聚醣纖維絲，在細胞培養上具有其功能性，能使細胞在纖維絲上具有很好的生長情形，並具有引導細胞生長方向的可能。由以上所觀察的現象，初步驗證出的幾丁聚醣纖維絲具有應用在細胞支架使用上的可能性，可提供為相關細胞研究上的應用參考。第二部份 1. 流場數值模擬流體裝置為對稱性結構，故在簡化模型的原則下，只取全反應槽內只含流體的結構處，如圖 15 所示。在進行 CFDRCTM 套裝軟體數值模擬之前，首先必須先確立模型的幾何尺寸，以利後續數值模擬，而流道裝置產生的流場流速與方向分佈情況，只在流體結構反應槽中發生。所以數值模擬的原則是：以盡量簡化模型、以最短的運算解析時間、並獲得正確的數值模擬解析；故本研究數值模型只建立反應槽區域，而不建構全晶片。. 圖15 流體裝置的反應槽模型之實際尺寸圖 CFDRCTM 套裝軟體中的 CFD-GEMO 模組，除了提供主要的結構模型離散化功能外，也附加二維與三維模型建構功能，方便使用者不用再另尋其它軟體建構模型。模型離散化的方法是採用三角錐四面體的元素(element)來切分三維晶片模型，由於元素大小直接影響到模擬的解析度與運算時間，所以依照幾何結構尺寸以精確的調整元素大小。流體裝置總節點數(nodes)為 242642 個、總面數為 2464807 個、而 elements 是 1183147 個。本實驗所取的 elements 個數之所以用 1183147 個，原因是在進行數值模擬時，發現取高於 1100000 的 elements 個數時，反應槽區域所模擬出來的流場曲線梯度幾乎沒有變化；為了節省模擬時的運算時間，故取上述的 elements 個數進行模擬實驗；圖 16 為模型離散化示意圖。. 12.

(14) 圖16 反應槽的離散化圖結構模型離散化完成之後，將檔案匯入 CFD-ACE+模組，進行數值模擬；模組程式內提供電、熱、流、化學、物理性等多項領域(mode)結合的數值運算功能，本研究數值模擬是希望藉由軟體分析出反應槽內的空間流場及流體剪應力的分佈狀況。所以在 CFD-ACE+ 模組程式內，只選擇流體領域(Fluid mode)進行對結構的數值模擬。除了流體領域的選擇外，在數值運算之前還需設定模型的尺度、邊界條件與材料特性參數，其流體裝置邊界與材質設定如圖 17 所示。. 圖17 反應槽的邊界條件與材質設定圖 2. 生長激素於循環式流場中擴散分佈現象之探討對於流體裝置之流場三維穩態數值模擬，結果分別討論如下。進行結構流場數值模擬的目的：1.模擬出來的流速梯度曲線趨勢是否與簡化模型之曲線趨勢相同，若不相同，則必須做修正、2.細胞培養處上的流場方向是否方向相同、3.模擬出細胞培養處之剪應力大小。由於必須考量到剪應力過高與過低時，對細胞造成之不良影響或死亡；經實驗後，細胞在低流體剪應力下，不會造成細胞形狀改變，而細胞在過高流體剪應力下，有些細胞會因無 13.

(15) 法承受，導致於細胞死亡或脫落。故本實驗中，所施予剪力機轉速之範圍為每分鐘 50 到 400 轉內，其流體裝置反應區示意圖與細胞培養處圖，如圖 18 所示。. A 玻璃晶片. B. C. C，. 3 cm. (a) (b) 圖18 (a)為流體裝置的反應槽剖面圖，(b)為細胞培養的晶片圖。其中A、B兩個點是欲模擬流場的點，圖(a)的BB’與DD’線相交的點為圖(b)的B點、BB’與EE’線相交的點為圖(b)的A點， A點為細胞晶片中心點，B點則是距離中心點3 cm處本段探討細胞培養晶片到流體裝置轉子間的流場速度梯度趨勢，取細胞培養區上到流體裝置轉子接觸處，如圖 18(a) DD’剖線所示；而施予剪力機轉速為 50 rpm、100 rpm、150 rpm、300 rpm、400 rpm 時，其模擬出來的流速梯度曲線圖形，如圖 19 所示。從圖 19 中的流速梯度曲線比較後，發現只有轉數為 50 rpm 的流速梯度的曲線趨勢較相似於簡化模型的曲線趨勢，而其餘轉速的流速梯度之曲線趨勢與簡化模型的曲線趨勢相比差異皆較大。下板的流速為零，而上板的流速為 15.7 cm/s、31.4 cm/s、47.1 cm/s、94.2 cm/s 與 125.6 cm/s，此模擬結果非常符合物理意義，並且從模擬結果可知簡化的 2D 模型與實際模型模擬出來的流速梯度趨勢是有落差的，故必須以模擬後的剪應力值來修正所計算出的剪應力結果。 0.12. Y= 0.1 cm. Position ( cm ). 0.1. 0.08. 50 rpm 0.06. 100 rpm 150 rpm. 0.04. 300 rpm 0.02. 400 rpm. Y= 0 cm. 0 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 140. Velocity ( cm/s ). 圖19 流體裝置反應區之DD’剖線的速度與位置關係圖，圖中的Y= 0.1 cm點為剪力機的轉子與培養基接觸處，Y= 0 cm點為培養基與底盤的接觸處. 14.

(16) 欲知流體裝置的轉速與施予細胞的流體剪應力之對應值，需藉由套裝軟體模擬其結果。在此模擬中，所要模擬的區域和轉速跟上段文中模擬流速梯度曲線趨勢一樣，其模擬的位置與剪應力之比值結果，如圖 20 所示。從模擬結果可得知流體裝置的轉速為 50 rpm、100 rpm、 150 rpm、300 rpm 與 400 rpm 時，對應於細胞培養晶片上之剪應力為 2.17 dyne/cm2、3.8 dyne/cm2、5.11 dyne/cm2、8.12 dyne/cm2 與 9.74 dyne/cm2。比較每分鐘轉速為 300 轉，且距離細胞培養晶片上方 5 m 處之模擬結果與簡化模型所計算出來的結果，可發現模擬出來的剪應力值比計算出的剪應力值小 1.9 倍，其原因推測為：1.流體經由剪力機帶動後，會受壁面影響，使得剪應力被由壁面反彈的流體抵制而減小、2.因為簡化模型是從 3D 簡化成 2D，並且假設它的速度梯度曲線為線性，但從 CFDRCTM 套裝軟體模擬真實的分析出模型之流速梯度的曲線並非為線性，故模擬出來的值會與簡化模型所計算之值不同。最後利用歐拉方程式對圖 19 與 20 做分析，從兩圖形中的曲線比較可發現剪應力與速度曲線趨勢十分相像，所以符合歐拉方程式中的剪應力與速度梯度成正比之定義，也證明本研究中利用 CFDRCTM 套裝軟體所模擬出來之剪應力值的正確性，故本研究將以套裝軟體模擬出來的剪應力值，做為流體裝置所能產生的流體剪應力值。 0.12. Y= 0.1 cm 0.1. Position (cm). 0.08. 0.06 50 rpm 100 rpm. 0.04. 150 rpm 300 rpm 400 rpm. 0.02. 0 0. 5. Y= 0 cm. 10. 15. 20. 25. 30. 2. Shear stress (dyne/cm ). 圖20 流體裝置反應區之DD’剖線的位置與剪應力關係圖，圖中的Y= 0.1 cm點為剪力機的轉子與培養基接觸處，Y= 0 cm點為培養基與底盤的接觸處本研究的細胞培養區定義在距離旋轉中心3 cm處，原因是經實驗發現此處細胞受流體作用後，細胞方向最為一致；但因為無法使用肉眼觀測流體反應區內的流場情況，所以藉由CFDRCTM套裝軟體模擬細胞培養區與其它區域之流場情況。此次模擬中，將選擇A與B 點進行流場模擬，其中A點為細胞培養晶片的中心點，B點為細胞培養處，如圖18(b)所示；其模擬後之反應槽整體流場情況，如圖21所示。圖22 (a)為細胞培養晶片中心點處之流場方向局部放大圖，從模擬結果中可發現流場方向是繞著中心點旋轉，原因為本實驗所用的流 15.

(17) 體裝置是以旋轉方式帶動流體轉動，所以流場方向亦會繞著中心點旋轉，故模擬出來的現象是十分符合實際物理意義。再觀察B點上的流場方向放大圖，如圖22 (b)所示，從模擬結果可觀察到B區的流場方向約為一致，故將細胞培養於此處將十分符合本研究的需求。最後，為了驗證實驗的結果會與模擬出來的結果相似，本研究將細胞培養於晶片上的A與B點進行流體實驗，從實驗結果可發現在A與B點上的細胞成長方向與模擬出來的流場方向十分相像，如圖22 (c)與(d)所示。. A. B. 圖21. 反應區之流場模擬整體圖，其中A點為晶片中心點，B點距離為中心點3 cm處. 16.

(18) (a). (b). (c). (d). 圖22 此圖為圖21之局部區域放大圖: (a)A為細胞培養晶片的中心點處之模擬結果、(b)B點為距離細胞培養晶片的中心點30 mm處之模擬結果、(c)細胞在A點上受流體剪應力後所得到之實驗結果、(d)細胞在B點上受流體剪應力後所得到之實驗結果。在圖(c)可觀察到細胞是繞著中心點轉，此現象與圖(a)模擬的流場方向結果一樣。而在圖(d)的細胞成長方向，也是與圖(c)模擬流場方向結果十分吻合 3. 循環式流體裝置平台之設計與製作本實驗的流體裝置設計，如圖 23 所示，共分成六層結構。第一層結構馬達，功用為改變不同的馬達轉速，而產生不同的流體剪應力。第二層結構為壓克力材質，壓克力厚度可自由調整，實驗裡所用的尺寸為 10 mm，此結構層的功用為調整高度用，並作為馬達之載台。第三層結構為壓克力材質，厚度為 1 mm，功用為蓋子與馬達之載台。將結構層挖個凹洞，使馬達的轉軸能夠穿過此結構層，此凹洞的直徑為 6 mm。第四層結構為壓克力材質，厚度可調整，實驗裡所用的尺寸為 12 mm，功用為馬達之轉子與使流體產生流體剪應力。第五層結構為壓克力材質，厚度為 1.5 mm，功用為調整轉子的厚度。第六層結構為壓克力材質，厚度為 1.5 mm，功用為細胞的培養載台及底盤與培養液儲放處。. 17.

(19) 圖 23 流體裝置結構設計圖在流體裝置製作中，馬達轉子與馬達載台元件乃利用二氧化碳氣體雷射雕刻機製作。先於壓克力材質上加工，再以螺絲接合與熱壓接合而成。其製作步驟如下說明： 1. 馬達轉子結構設計：利用二氧化碳氣體雷射雕刻機製作流道裝置結構時，先將設計完成之流道裝置結構圖繪製成 AutoCAD 圖檔。再以類似輸出到印表機的方式，輸出到二氧化碳氣體雷射雕刻機程式裡，以操控二氧化碳氣體雷射雕刻機在基材上進行雕刻動作。 2. 清洗壓克力基材：進行雷射雕刻之前，必須先將欲雕刻之基材做清洗動作。清洗步驟為： (1) 先取適量沙拉脫溶於水，並將壓克力浸泡，置入超音波震盪器中震盪五分鐘、(2) 將壓克力由沙拉脫水溶液中取出，再浸泡於去離子水內，置入超音波震盪器中震盪五分鐘與(3) 最後將壓克力取出，並用氮氣(N2)將壓克力吹乾。 3. 雷射雕刻基材：待壓克力基材清洗後，即可進行雷射雕刻製程。因機台本身會進行自動 18.

(20) 對焦，故二氧化碳雷射經由透鏡聚焦後，可精準的在工作物表面，以造成基材氣化或打斷分子鍵結的方式，進行雕刻或產生切斷的效果。 4. 馬達轉子融接接合：將轉子零件置於接合裝置中，利用熱壓接合(Thermal Bonding)方式進行接合，所應用的技術是以壓克力的軟化點進行接合。將壓克力放入接合裝置中，接著將接合裝置放入真空烤箱加熱至 120°C 持續 90 分鐘。待加熱完成後，打開烤箱旁之氣門自然退火，即完成接合，如圖 24 所示。 5. 最後將馬達、壓克力載台及轉子組裝，即可得到實驗中所使用的流體裝置，如圖 25 所示。. 圖 24 利用熱壓接合完成後的馬達轉子. 圖 25 流體裝置組裝後之實體圖 4. 單一種細胞進行培養後於流體剪應力下細胞生長型態與遷移之探討為了觀測內皮細胞與平滑肌細胞在共同培養後，是否存在相互誘導作用，故本實驗的設計了另ㄧ組在 PDMS 細胞培養晶片中只培養單一種細胞的實驗，以此作為對照驗證，實驗結果如圖 26~圖 29 所示。 19.

(21) SMCs. SMCs. 200 m. 200 m. (a) (b) 圖 26 平滑肌細胞於裝置中進行單邊培養 12 小時後，移除 PDMS 晶片，在受 7 dyne/cm2 流體剪應力的環境中，使細胞在無阻隔物下進行培養之不同時間的結果圖：(a) 0 小時，(b) 12 小時。(箭頭為流體切線方向，比例尺為 200 m) SMCs. SMCs. 200 m. 200 m. (a) (b) 圖 27 平滑肌細胞於裝置中進行單邊培養 12 小時後，移除 PDMS 晶片，在受 12 dyne/cm2 流體剪應力的環境中，使細胞在無阻隔物下進行培養之不同時間的結果圖：(a) 0 小時，(b) 12 小時。(箭頭為流體切線方向，比例尺為 200 m) ECs. ECs. 200 m. (a) (b) 圖 28 內皮細胞於裝置中進行單邊培養 12 小時後，移除 PDMS 晶片，在受 7 dyne/cm2 流體剪應力的環境中，使細胞在無阻隔物下進行培養之不同時間的結果圖：(a) 0 小時，(b) 12 小時。(箭頭為流體切線方向，比例尺為 200 m) 20.

(22) ECs. ECs. 200 m. 200 m. (a) (b) 圖 29 內皮細胞於裝置中進行單邊培養 12 小時後，移除 PDMS 晶片，在受 12 dyne/cm2 流體剪應力的環境中，使細胞在無阻隔物下進行培養之不同時間的結果圖：(a) 0 小時，(b) 12 小時。(箭頭為流體切線方向，比例尺為 200 m) 5. 兩種細胞進行共同培養後於流體剪應力下細胞生長型態與遷移之探討在顯微鏡下分別觀察在 500 m、200 m、100 m 及 50 m 間距下兩細胞共同培養之結果，經各別培養於 7 dyne/cm2 及 12 dyne/cm2 流體剪應力的環境中 12 小時、6 小時、3 小時及 2 小時後，可以發現內皮細胞與平滑肌細胞還未接觸，且比未施加流體剪應力的環境中還要慢接觸。此結果與所預期的結果相似，在流體剪應力環境中，兩細胞接觸的時間變慢，且在 12 dyne/cm2 流體剪應力下更加明顯，其原因在於流體會擾亂細胞間訊息的傳遞。其結果如圖 30~圖 37 所示。 ECs. SMCs. ECs. SMCs. 200 m. 200 m. (a) (b) 圖 30 內皮細胞與平滑肌細胞在 500 m 間距下，於裝置中培養 12 小時後移除 PDMS 晶片，在受 7 dyne/cm2 流體剪應力的環境中，使細胞在無阻隔物下進行共同培養之不同時間的結果圖：(a) 0 小時，(b) 12 小時。(箭頭為流體切線方向，比例尺為 200 m). 21.

(23) SMCs. ECs. ECs. SMCs. 200 m. 200 m. (a) (b) 圖 31 內皮細胞與平滑肌細胞在 500 m 間距下，於裝置中培養 12 小時後移除 PDMS 晶片，在受 12 dyne/cm2 流體剪應力的環境中，使細胞在無阻隔物下進行共同培養之不同時間的結果圖：(a) 0 小時，(b) 12 小時。(箭頭為流體切線方向，比例尺為 200 m). ECs. ECs. SMCs. SMCs. 200 m. 200 m. (a) (b) 圖 32 內皮細胞與平滑肌細胞在 200 m 間距下，於裝置中培養 12 小時後移除 PDMS 晶片，在受 7 dyne/cm2 流體剪應力的環境中，使細胞在無阻隔物下進行共同培養之不同時間的結果圖：(a) 0 小時，(b) 6 小時。(箭頭為流體切線方向，比例尺為 200 m). ECs. ECs. SMCs. SMCs. 200 m. 200 m. (a). (b) 22.

(24) 圖 33 內皮細胞與平滑肌細胞在 200 m 間距下，於裝置中培養 12 小時後移除 PDMS 晶片，在受 12 dyne/cm2 流體剪應力的環境中，使細胞在無阻隔物下進行共同培養之不同時間的結果圖：(a) 0 小時，(b) 6 小時。(箭頭為流體切線方向，比例尺為 200 m). ECs. SMCs. ECS. SMCs. 1. 2. 200 mm. (a) ECs. SMCs. 1. 200 mm. 3. (b) ECs. SMCs. ECs. 2. SMCs. 50 m. 3. (c) 圖 34 內皮細胞與平滑肌細胞在 100 m 間距下，於裝置中培養 12 小時後移除 PDMS 晶片，在受 7 dyne/cm2 流體剪應力的環境中，使細胞在無阻隔物下進行共同培養之不同時間的結果圖：(a) 0 小時，(b) 3 小時，10 倍視野，比例尺為 200 m，(c) 放大 30 倍視野，比例尺為 50 m。(箭頭為流體切線方向). ECs. SMCs. ECs. SMCs. 1. 2. 200 m. 200 m. 3. (a). (b) 23.

(25) ECs. SMCs. 1. ECs. SMCs. ECs. 3. 2. SMCs. 50 m. (c) 圖 35 內皮細胞與平滑肌細胞在 100 m 間距下，於裝置中培養 12 小時後移除 PDMS 晶片，在受 12 dyne/cm2 流體剪應力的環境中，使細胞在無阻隔物下進行共同培養之不同時間的結果圖：(a) 0 小時，(b) 3 小時，10 倍視野，比例尺為 200 m，(c) 放大 30 倍視野，比例尺為 50 m。(箭頭為流體切線方向). ECs. SMCs. ECs. SMCs. 1. 2. 200 m. (a) ECs. 1. SMCs. 200 m. 3. (b) ECs. SMCs. 2. ECs. 3. SMCs. 50 m. (c) 圖 36 內皮細胞與平滑肌細胞在 50 m 間距下，於裝置中培養 12 小時後移除 PDMS 晶片，在受 7 dyne/cm2 流體剪應力的環境中，使細胞在無阻隔物下進行共同培養之不同時間的結果圖：(a) 0 小時，(b) 2 小時，10 倍視野，比例尺為 200 m，(c) 放大 30 倍視野，比例尺為 50 m。(箭頭為流體切線方向) 24.

(26) ECs. SMCs. ECs. SMCs. 1. 2. 200 m. (a) ECs. 1. 200 m. 3. (b). SMCs. ECs. SMCs. 2. ECs. 3. SMCs. 50 m. (c) 圖37 皮細胞與平滑肌細胞在50 m間距下，於裝置中培養12小時後移除PDMS晶片，在受 12 dyne/cm2流體剪應力的環境中，使細胞在無阻隔物下進行共同培養之不同時間的結果圖： (a) 0小時，(b) 2小時，10倍視野，比例尺為200 m，(c) 放大30倍視野，比例尺為50 m。(箭頭為流體切線方向) 將實驗結果予以統計，以呈現出在相同的培養間距下，不同的流體剪應力對細胞遷移距離的變化關係，如圖 38~圖 42 所示。由統計結果圖 38~圖 41 發現，在雙邊相同的培養間距下，細胞遷移的距離隨著流體剪應力的增加，使細胞遷移的距離會隨之減少，如圖 38 所示，在間距 500 m 共同培養 12 小時，內皮細胞分別於 0 dyne/cm2、7 dyne/cm2 及 12 dyne/cm2 流體剪應力中，其細胞遷移的距離分別為 113.58 m、86.92 m 及 45.88 m，顯示出流體會干擾細胞間物質的傳遞而導致此現象；此外，在流體剪應力環境中平滑肌細胞遷移的距離仍然大於內皮細胞遷移的距離，如在間距 500 m 且 7 dyne/cm2 流體剪應力中共同培養 12 小時，內皮細胞遷移的距離為 86.92 m 而平滑肌細胞遷移的距離為 165.6m。圖 42 為單邊單一細胞培養之結果，細胞遷移的距離也隨著流體剪應力增加而減少，若以在不同流體剪應力下，細胞單邊培養與雙邊共同培養的統計結果做比較，可以發現在每ㄧ時間點細胞遷移的距離，雙邊共同培養細胞遷移的距離會大於單邊培養細胞遷移的距離，如在間距 500 m 且 7 dyne/cm2 流體剪應力中共同培養 12 小時，內皮細胞遷移的距離為 86.92m，而單邊培養 12 小時，內皮細胞遷移的距離為 81.03 m。 25.

(27) (a) (b) 圖 38 細胞共同培養於間距 500 m 下，且在不同流體剪應力中之時間與細胞遷移距離的關係圖：(a) 內皮細胞，(b) 平滑肌細胞。. (a) (b) 圖 39 細胞共同培養於間距 200 m 下，且在不同流體剪應力中之時間與細胞遷移距離的關係圖：(a) 內皮細胞，(b) 平滑肌細胞。. (a) (b) 圖 40 細胞共同培養於間距 100 m 下，且在不同流體剪應力中之時間與細胞遷移距離的關係圖：(a) 內皮細胞，(b) 平滑肌細胞。. 26.

(28) (a) (b) 圖 41 細胞共同培養於間距 50 m 下，且在不同流體剪應力中之時間與細胞遷移距離的關係圖：(a) 內皮細胞，(b) 平滑肌細胞。. (a) (b) 圖 42 單邊單一細胞培養在不同流體剪應力中之時間與細胞遷移距離的關係圖：(a) 內皮細胞，(b) 平滑肌細胞。進一步來探討細胞在相同的培養間距下，不同的流體剪應力對細胞遷移速率的變化關係，如圖 43~圖 47 所示。圖 43~圖 46 為細胞共同培養於 500 m、200 m、100 m 及 50 m 間距下，可以發現流體剪應力越大細胞遷移的速率越慢，其細胞開始反應的時間也增長，如圖 43 所示，在間距 500 m 下，內皮細胞分別於 0 dyne/cm2、7 dyne/cm2 及 12 dyne/cm2 流體剪應力中，其細胞反應的時間分別為 1.5 小時、2 小時及 2 小時，且平滑肌細胞遷移的速率會大於內皮細胞遷移的速率，由此可得知，流體剪應力會干擾細胞間物質及信號的傳遞，而使內皮細胞與平滑肌細胞互相接觸的時間變慢，以 12 dyne/cm2 的流體剪應力對細胞的干擾最為明顯。圖 47 為單邊單一細胞培養之結果，細胞遷移的速率也隨著流體剪應力增加而減少，若以在不同流體剪應力下，細胞單邊培養與雙邊共同培養的統計結果做比較，可以發現在每ㄧ時間點細胞遷移的距離，雙邊共同培養細胞遷移的速率大於單邊培養細胞遷移的速率，如在間距 500 m 且 7 dyne/cm2 流體剪應力中共同培養 12 小時，平滑肌細胞遷移的速率為 19.09m/hr，而單邊培養 12 小時，平滑肌細胞遷移的速率為 16.18 m/hr。. 27.

(29) 25.01. 14.48. 19.09. 11.48 9.66. 7.7. 10.91. 9.35. 7.78 3.97. 4.05. 5.13. (a) (b) 圖 43 細胞共同培養於間距 500 m 下，且在不同流體剪應力中之時間與細胞遷移速率的關係圖：(a) 內皮細胞，(b) 平滑肌細胞。. 19.23. 13.13 9.51 7.35. 16.10. 15.18 11.53. 7.46 6.28. 12.67 10.14. 6.56. (c) (d) 圖 44 細胞共同培養於間距 200 m 下，且在不同流體剪應力中之時間與細胞遷移速率的關係圖：(a) 內皮細胞，(b) 平滑肌細胞。. 15.90 12.57 11.97. 14.29 8.93 11.11. 6.21 4.93. 8.15. 7.60 5.47. (e). (f) 28. 11.68.

(30) 圖 45 細胞共同培養於間距 100 m 下，且在不同流體剪應力中之時間與細胞遷移速率的關係圖：(a) 內皮細胞，(b) 平滑肌細胞。. 13.29 13.11. 8.21. 13.13. 10.12. 12.10. 10.07 11.33. 9.15. 9.51. 7.93 7.05. 14.19. 8.51. 8.51. 7.27 5.75. 4.07. (g) (h) 圖 46 細胞共同培養於間距 50 m 下，且在不同流體剪應力中之時間與細胞遷移速率的關係圖：(a) 內皮細胞，(b) 平滑肌細胞。. 19.17 14.50 9.49. 9.23. 6.69. 7.77. 3.91. 4.06. 7.32. 20.80. 16.18. 5.50. (i) (j) 圖 47 單邊單一細胞培養在不同流體剪應力中之時間與細胞遷移速率的關係圖：(a) 內皮細胞，(b) 平滑肌細胞。 3.6 結論第一部分 1. 幾丁聚醣纖維絲的形態比較上，PMMA 與 PDMS 晶片製備的纖維絲皆呈圓柱狀，能製備出均一管徑的幾丁聚醣纖維絲。PMMA 晶片所製備的纖維絲管徑較粗以及外形較筆直，且細胞能成功培養於表面上；而 PDMS 晶片所製備的纖維絲管徑較細且多呈現彎曲狀，經細胞培養實驗後，發現細胞不易於纖維絲表面上生長。 2. 以 PMMA 晶片製備之幾丁聚醣纖維絲，應用於細胞培養的結果上，發現許旺細胞與纖維母細胞皆能成功於幾丁聚纖維絲上生長繁殖，並各自表現出不同的細胞生長模式。小鼠許旺細胞能沿著纖維絲進行增生並連接成細胞鏈，而小鼠纖維母細胞則是能貼附纖維絲上 29.

(31) 進行增生並佈滿表面，由此初步證明出利用微流體晶片所製備之幾丁聚醣纖維絲具有應用在組織工程上的可行性。第二部分 1. 在相同的培養間距下，內皮細胞與平滑肌細胞共同培養於不同流體剪應力環境之結果顯示，流體剪應力會干擾細胞間物質的傳遞，而造成細胞遷移的速度變慢，且隨著流體剪應力增大細胞遷移的速度越慢。 2. 經由 SPSS 統計軟體之顯著性分析得到，7 dyne/cm2 的流體剪應力只會抑制平滑肌細胞遷移的速度，但對內皮細胞則影響較小；而 12 dyne/cm2 的流體剪應力皆會抑制平滑肌細胞與內皮細胞遷移的速度。 3.7 建議第一部分 1. 利用層流的生成現象於纖維絲的製備是本研究的重點，其構想可用為開發其他材料製備成纖維絲的應用上。 2. 在幾丁聚醣的應用層面上，可進一步探討不同的應用方向，期望本研究所發展之技術不僅能在細胞研究與組織工程上有所助益，更能拓展出不同的應用領域。第二部分 1. 在旋轉式流體裝置方面，由於其產生的流場不具同方向性，故可改變流體裝置形成具有單一方性的流場，以此作為研究上的比較。 2. 在細胞觀察方面，可採取即時觀測系統紀錄細胞每分每秒移動的狀態，以減少實驗過程中所造成的誤差及增加準確性。四、參考文獻 [1] K. S. Rhode, T. Lambrou, D. J. Hawkes and A. M. Seifalian, “Novel approaches to the measurement of arterial blood flow from dynamic digital X-ray images,” IEEE Transactions on Medical Imaging, 24, 500-513, 2005. [2] K. Boryczko, W. Dzwinel and D. A. Yuen, “Dynamical clustering of red blood cells in capillary vessels,” Journal of Moaecular Modeling, 9, 16-33, 2003. [3] G. K. Owens, M. S. Kumer and B. R. Wamhoff, “Molecular regulation of vascular smooth musclecell differentiation in development and disease,” Physiological Review, 84, 767-801, 2004. [4] M. M. Mazanet and C. C. W. Hughes, “B7-H1 is expressed by human endothelial cells and suppresses T cell cytokine synthesis,” Journal of Immunology, 169, 3581-3588, 2002. [5] C. F. Dewey Jr., S. R. Bussolari, M. A. Gimbrone Jr. and P. F. Davies, “The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress,” Journal of Biomechanical Engineering, 103, 177-185, 1981. [6] R. M. Nerem, M. J. Levesque and J. F. Cornhill, “Vascular endothelial morphology as an indicator of blood flow,” Journal of Biomechanical Engineering, 103, 172-176, 1981. [7] R. M. Nerem, “Vascular fluid mechanics the arterial wall and atherosclerosis,” Journal of 30.

(32) Biomechanical Engineering, 114, 274-282, 1992. [8] N. Resnick and M. A. Gimbrone, “Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene-expression,” FASEB Journal, 9, 874-882, 1995. [9] E. V. Barakat, P. A. Leaver, Pappone and P. F. Davies, “A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells,” Circulation Research, 85, 820-828, 1999. [10] G. Garcia-Cardena, J. Comander, K. R. Anderson, B. R. Blackman and M. A. Gimbrone, “Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype,” Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 98, 4478-4485, 2001. 五、計畫結果自評本實驗室應用微流體平台於共生細胞交互作用及神經細胞生長之研究已獲得初步之成果。並完成以下進度並符合查核表: 第一部分 1. 材料試劑最佳化調配法之探討(已完成) 2. 針對微纖維絲之處理與修飾研究(已完成) 3. 以微纖維絲培養細胞之研究與探討(已完成) 4. 細胞影像分析與細胞活性探討(已完成) 第二部份 1. 流場數值模擬(已完成) 2. 3. 4. 5.. 生長激素於循環式流場中擴散分佈現象之探討(已完成) 循環式流體裝置平台之設計與製作(已完成) 單一種細胞進行培養後於流體剪應力下細胞生長型態與遷移之探討(已完成) 兩種細胞進行共同培養後於流體剪應力下細胞生長型態與遷移之探討(已完成). 查核表預計完成進度敘述. 預定完成時間 100/01. 1. 2. 3. 4. 5.. 100/07. 1. 完成以微纖維絲培養細胞之研究與探討 2. 完成細胞影像分析與細胞活性探討 3. 完成單一種細胞(SMCs/ECs)進行培養後於流體剪應力下細胞生長型態與遷移之探討 4. 完成兩種細胞(SMCs & ECs)進行共同培養後於流體剪應力下細胞生長型態與遷移之探討. 完成材料試劑最佳化調配法之探討完成針對微纖維絲之處理與修飾研究完成流場數值模擬完成生長激素於循環式流場中擴散分佈現象之探討完成循環式流體裝置平台之設計與製作. 31.

(33) 已發表相關研究成果(SCI論文共6篇，研討會論文共5篇) Conference paper (共5篇) 1.. 2.. 3.. 4.. 5.. C. H. Yeh, P. W. Lin, Q. Zhao and Y. C. Lin, “Application of Microfluidic System to Construct Cross-Linked Chitosan Microfibers by PDMS chip,” 4th IEEE International Conference on Nano/Micro Engineered and Molecular Systems, January, 5-8, 2009, China. C.H. Yeh, P.W. Lin, and Y.C. Lin, “Chitosan Microfiber fabrication using microfluidic chips of different sheath channel angles and its application on cell culture,” The 15th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (Transducer ’09), June 21-25, 2009, Denver, USA. C.H. Yeh, P.W. Lin, and Y.C. Lin, “Chitosan microfiber fabrication using microfluidic chips of different sheath channel angles and its application on cell culture,” EUROSE NSOR S X X I I I , September 6 - 9, 2009, Lausanne, Switzerland. C.-H. Yeh, S.-H. Tsai, Y.-H. Huang, L.-W. Wu, and Y.-C. Lin*, “Study of cell transmigration using a co-culture microsystem under shear stress,” E U R O S E N S O R S X X I I I , September 6 - 9, 2009, Lausanne, Switzerland. C.-H. Yeh, S.-H. Tsai, L.-W. Wu, Y.-H. Huang, and Y.-C. Lin, “Using Co-culture Microsystem for Cell Migration under Fluid Shear Stress,” The 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, October 3-7, 2010,Groningen, Netherlands.. Journal paper (共6篇) 1.. 2.. 3.. 4.. 5.. C.-H. Yeh, Q. Z., S.-J. Lee, and Y.-C. Lin*, “Using a T-junction Microfluidic Chip for Monodisperse Calcium Alginate Microparticles and Encapsulation of Nanoparticles,” Sensors and Actuators A: Physical, 151, pp.231-236, 2009. (SCI. 2009 I.F. 1.674, Rank 14/56 in subject category: INSTRUMENTS & INSTRUMENTATION, Times Cited: 1/0) C.-H. Yeh, W.-T. Chen, T.-C. Chang, H.-P. Lin, and Y-C. Lin*, “Development of an Immunoassay Based on Impedance Measurements Utilizing an Antibody-Nanosilver Probe, Silver Enhancement, and Electro-Microchip,” Sensors and Actuators B: Chemical, 139, pp.387-393, 2009. (SCI. 2009 I.F. 3.083, Rank 5/56 in subject category: INSTRUMENTS & INSTRUMENTATION, Times Cited: 0/0) C.-H. Yeh, H.-H. Huang, T.-C. Chang, H.-P. Lin, and Y.-C. Lin*, “Using an Electro-Microchip, a Nanogold Probe, and Silver Enhancement in an Immunoassay,” Biosensors and Bioelectronics, 24, pp. 1661-1666, 2009. (SCI. 2009 I.F. 5.429, Rank 2/70 in subject category: CHEMISTRY, ANALYTICAL, Times Cited: 2/0) C.-H. Yeh, C.-H. Chen, Y.-C. Lin*, “ Use of a Gradient-generating Microfluidic Device to Rapidly Determine a Suitable Glucose Concentration for Cell Viability Test,” Microfluidics and Nanofluidics, 10, 1011-1018, 2010. (SCI. 2009 I.F. 3.286, Rank 3/56 in subject category: INSTRUMENTS & INSTRUMENTATION, Times Cited: 0/0) C.-H. Yeh, P.-W. Lin, and Y.-C. Lin*, “Chitosan Microfiber Fabrication Using a 32.

(34) Microfluidic Chip and its Application to Cell Cultures,” Microfluidics and Nanofluidics, 8,. 6.. 115~121, 2010. (SCI. 2008 I.F. 3.314, Rank 4/56 in subject category:INSTRUMENTS & INSTRUMENTATION, Times Cited: 0/0) C. H. Yeh, S.H. Tsai, L.W. Wu, Y.C. Lin, “Using Co-culture Microsystem for Cell Migration under Fluid Shear Stress,” Lab on a chip, 11, 2583-2590, 2011. (SCI. 2010 I.F. 6.260, Rank 7/71 in subject category: BIOCHEMICAL RESEARCH METHODS, Times Cited: 0/0). 33.

(35) 國科會補助專題研究計畫成果報告自評表請就研究內容與原計畫相符程度、達成預期目標情況、研究成果之學術或應用價值（簡要敘述成果所代表之意義、價值、影響或進一步發展之可能性）、是否適合在學術期刊發表或申請專利、主要發現或其他有關價值等，作一綜合評估。 1. 請就研究內容與原計畫相符程度、達成預期目標情況作一綜合評估 ■達成目標 □ 未達成目標（請說明，以 100 字為限） □ 實驗失敗 □ 因故實驗中斷 □ 其他原因說明：. 2. 研究成果在學術期刊發表或申請專利等情形：論文：■已發表 □未發表之文稿 □撰寫中 □無專利：□已獲得 □申請中 □無技轉：□已技轉 □洽談中 □無其他：（以 100 字為限）. 3. 請依學術成就、技術創新、社會影響等方面，評估研究成果之學術或應用價值本研究成功將微流體晶片應用於幾丁聚醣纖維絲的製備上，並進一步透過細胞培養實驗證實具有應用在組織工程上的可行性。將所製得之幾丁聚醣纖維絲進行細胞共同培養實驗，經實驗後證明幾丁聚醣纖維絲適合細胞的貼附與增生，具有應用在組織工程上的可行性。另外在新型平面式細胞共同培養微系統，不但可解決傳統細胞共同培養不容易觀察與混合培養等問題，在未來將有助於生物操控與組織修復等應用領域的發展。. 34.

(36)