添加麩醯胺對腹膜炎引致敗血症老鼠脾臟細胞激素
添加麩醯胺對腹膜炎引致敗血症老鼠脾臟細胞激素 mRNA mRNA 表現之影響 表現之影響
Effects of glutamine supplementation on splenocyte cytokine mRNA expre Effects of glutamine supplementation on splenocyte cytokine mRNA expre
ssion in rats with septic peritonitis ssion in rats with septic peritonitis
賴育妮 賴育妮 * * 商惠芳 邱琬淳 葉松鈴 商惠芳 邱琬淳 葉松鈴 # #
台北醫學大學保健營養研究所 微生物免疫學科 台北醫學大學保健營養研究所 微生物免疫學科
前言
敗血症（ sepsis ）是一種在臨床上十分常見且死亡率極高的併發症，當細 菌及其內毒素侵入人體後，會造成體內的代謝失衡以及組織之分解，最後導致 多重器官之衰竭。已有研究顯示，代謝失衡主要是由於敗血症引致免疫系統及 器官細胞中細胞激素分泌不正常所致，許多研究均以細胞激素之分泌量作為發 炎或受傷嚴重程度之指標。然而由於細胞激素半衰期很短，分泌的高峰期各有 不同，在體液內的濃度極低，故有些細胞激素並無法偵測到。於是敏感性及準 確度皆高之 RT-PCR (reverse-transcription polymerase chain reaction) 技 術被廣泛的運用在偵測細胞激素 mRNA 的表現量，以預測細胞激素之分泌量。
全靜脈營養（ total parenteral nutrition, ， TPN ）是一種非經腸道的營 養支持方式，常用於腸道功能障礙之病人，由於 TPN 之使用會造成腸黏膜細胞 及組織內 gut associated lymphoid tissue (GALT) 發生萎縮，而使得腸黏膜 通透性增加，增加細菌轉移的比例而引發感染，並併發敗血症。因此如何增進 病人免疫功能，降低感染是重要的研究方向，近年來免疫營養 (immunonutriti on) 遂成為研究之重點，而 glutamine (Gln) 之添加受到相當之重視。 Gln 為 人體中含量最多的游離胺基酸，同時也是腸黏膜及免疫細胞之重要能量來源。
已有研究顯示 Gln 添加於 TPN 配方中，有助於維持腸道構造和功能之完整性
、增加氮保留量並防止細菌轉移。另外，於 TPN 溶液中添加 Gln 可維持 Th2 細胞所分泌的細胞激素－ IL-4 、 IL-10 mRNA 的表現量並維持小腸 IgA 的分泌
，增進黏膜免疫的功能。本實驗室前之研究顯示，於敗血症前給予飲食中補充 Gln ，可增進腹腔巨噬細胞之吞噬能力；而無論是在敗血症前或後給予 Gln 之 補充皆可增加 GALT 內淋巴細胞之增生，並促進 IgA 之分泌。為了更進一步探 討 Gln 之補充對敗血症所引起之免疫反應，到底是偏向細胞性或是體液性免疫 反應，故本實驗以盲腸結紮並穿刺手術 (cecal ligation and puncture, CLP) 引致老鼠敗血症，進而觀察 Gln 對敗血症老鼠脾臟淋巴細胞分佈及 Th1 或 Th2 所分泌之細胞激素 mRNA 表現之影響。
目的
CLP 為最接近人體因腹膜炎引致敗血症之良好動物模式，故本實驗以此方 式引致敗血症，並在敗血症前以由口進食，敗血症後以 TPN 輸入方式給與 Gln
，來研究 Gln 對敗血症的影響。由於敗血症之發生並無法預知，因此本實驗在 敗血症發生之前後給或不給 Gln 來模擬有敗血症危險之重症病人，探討是否可 在住院後即給予 Gln ，來預防敗血症或減輕敗血症之嚴重程度，或敗血症發生 後以靜脈輸入也可達到同樣之效果。
材料與方法
實驗以 Wistar 雄性老鼠為對象，共分為五組，一組為 normal control 組，不做 CLP 但做頸靜脈插管手術，手術前給予一般飼料配方，術後給予傳 統之 TPN 輸液。其餘四組均施行 CLP 及頸靜脈插管手術，分別為： CLP 前 給一般飼料配方，術後給傳統之 TPN 輸液（－－）； CLP 前給一般飲食，
CLP 後給富含 Gln 之 TPN 輸液（－＋）； CLP 前給富含 Gln 之飲食，手
術後給傳統之 TPN 輸液（＋－）； CLP 前後均給富含 Gln 之配方（＋＋）。
五組之營養素組成、總熱量以及總氮量均相等，富含 Gln 之配方以 Gln 取代 總氮量之 25% 。在引致敗血症三天後犧牲老鼠，取腹水及脾臟供分析之用。
分析項目
腹水中 NO 的測定； ELISA kit
脾臟細胞中 T 細胞、 B 細胞之分佈 : Flow cytometry
細胞激素包括 Th1: interferon (IFN)- , interleukin (IL)-2 ； Th2: IL-4, IL-
10, 及 tumor necrosis factor (TNF)- mRNA 表現量之測定 : RT-PCR 結論
1. 研究結果顯示敗血症會造成脾臟 T 細胞分布之減少，但無論是在敗血 症前或後給予 Gln 的補充皆可以維持脾臟 T 細胞之分佈。
2. 在敗血症前後皆補充 Gln 其腹水中 NO 之濃度較 control 組高，脾臟細 胞內 TNF- mRNA 表現量亦較高，可能 TNF- 之表現促進敗血症後巨噬 細胞之活性，因而釋出較多之 NO 增進巨噬細胞之吞噬能力，此結果與 本實驗室前之研究結果有一致性。
3. 在敗血症後給予 Gln 的補充會增加脾臟細胞內 Th1 及 Th2 細胞激素 m RNA 表現量，雖然 Th1 與 Th2 細胞兩者所分泌之細胞激素具拮抗作用，
但細胞激素之分泌還要經過一連串 post-transcription 修飾，並經 transla tion 之後才能合成蛋白質，是否細胞激素之分泌會在此期間受到一些因子 之調控則需更進一步之研究 。
a
b
ab b
b
b b
a
ab b
a
b b b
b b
a
ab ab
ab
Gln-supplemente
d without Gln
Casein 165 220
Corn starch 667 657
Soybean oil 44 44
Gln 45 --
Total nitrogen 35.2 35.2
Vitamin a 10 10
Salt mixture b 35 35
Methyl-cellulose 30 30
Choline chloride 1 1
DL-Methionine 3 3
Total calorie 3904kcal 3904kcal
+Gln --
Glucose soln (50%) 20% Fat emulsion
Moriamin-SN (10%) * Gln (g)
Infuvita **No1 Infuvita **No2 NaCl 3%
KCl 7%
K3PO4 8.7%
Ca-gluconate MgSO4
Zn SO4
Choline chloride(g)
418 41750
11 7 351 10 10 104
2 1
412 55650
-- 7 351 10 10 104
2 1
Table 2. Composition of TPN solution (mL/L)
Table 1. Composition of semipurified diet ( g/kg )
IL-2 IL-4 IL-10 IFN- TNF-
(ratio of 15S rRNA)
Control 1.90.11a 1.870.16a 1.790.11a 1.990.26a 1.650.05a
－－ 2.060.21ac 2.130.30ac 1.900.23a 2.210.26a 1.790.24a
－＋ 2.450.16b 2.490.16b 2.210.19b 2.680.21b 2.310.41b
＋－ 2.260.26bc 2.350.22bc 1.970.21ac 2.570.34b 1.990.21ab
＋＋ 2.420.23b 2.370.29b 2.120.17bc 2.520.33b 2.190.34b Figure 1. The distribution of CD45Ra+, CD3+, CD4+ and CD8+
lymphocytes in the spleen in the five groups 3 days after CLP.
Different letters indicate significant difference among groups (p <
0.05)
Figure 2. Nitric oxide (NO) concentrations in PLF of the five groups 3 days after CLP. Different letters indicate significant difference among groups (p < 0.05)
Figure 3. The mRNA expression of cytokines in the spleen of the five groups 3 days after CLP
Values are expressed as means SD. Groups without sharing common letters in the same column indicate significant difference at p < 0.05
