科技部補助
大專學生研究計畫研究成果報告
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計 畫 ：
名 稱
開發新型廣效性抗體閉鎖器非活化治療性抗體藥物進 行選擇性標靶治療
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執行計畫學生： 劉君婷
學生計畫編號： MOST 103-2815-C-041-014-B
研 究 期 間 ： 103 年 07 月 01 日至 104 年 02 月 28 日止，計 8 個月 指 導 教 授 ： 呂玉玲
處理方式： 本計畫涉及專利或其他智慧財產權，2 年後可公
開查詢
執 行 單 位： 嘉藥學校財團法人嘉南藥理大學藥學系(含碩 士班)
中華民國 104 年 03 月 31 日
行政院國家科學委員會補助 大專學生研究計畫研究成果報告
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計畫名稱：To develop new wide application antibody locker
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inactivated antibody for selective targeted therapy ＊
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執行計畫學生：劉君婷
學生計畫編號：103-2815-C-041 -014 -B
研 究 期 間 ：2014 年 7 月 1 日至 年 2 月底止，計 8 個月 指 導 教 授 ：呂玉玲 教授
處理方式(請勾選)：□立即公開查詢
█涉及專利或其他智慧財產權，□一年█二年後可公開查詢
執 行 單 位：高雄醫學大學生物醫學暨環境生物學系
中華民國 104 年 3 月 27 日
To develop new wide application antibody locker inactivated antibody for selective targeted therapy
開發新型廣效性抗體閉鎖器非活化治療性抗體藥物進行選擇性標靶治療
一、摘要
目前有許多藥物都是針對腫瘤細胞會大量表現特定蛋白酶的特性來設計，然而標靶藥物對於蛋 白酶的抑制是全身性而缺乏專一性的，對人體的正常組織仍會造成一些傷害，使病患在治療癌症的同 時還必須承受因藥物所引發的副作用，所以若是能改良目前的標靶藥物，降低藥物的副作用並提高其 專一性將會是癌症醫療上的一大突破。
標靶抗體藥物是目前醫藥發展趨勢，但由於目標抗原分布全身，患者長期使用單株抗體治療，因缺 乏藥物選擇性而與正常組織抗原結合，造成嚴重性感染、肝炎病毒活化、敗血症，甚至引起淋巴癌之 嚴重副作用發生的可能性。為了改善抗體藥物所造成的副作用，我們實驗室已成功開發可屏蔽抗原結 合位的抗體閉鎖器(locker)，選用人體 IgG1 抗體腰部結構 hinge，作為閉鎖器的主體結構，以蛋白 酶專一受質胜肽鏈將閉鎖器連接抗體變異區，達到屏蔽抗體活化位的功能，並利用疾病區域會大量分 泌基質金屬蛋白酶 2(matrix metalloprotease 2，MMP2)的特性，使帶有閉鎖器的前驅標靶藥物 (pro-anti-TNFαantibody)於患部再活化而達到抗體療效。不過目前的抗體閉鎖器需要經由 MMP2 作 用四次才能使抗體完全活化，導致無法達到抗體藥物的最佳療效；因此為了提升抗體閉鎖器的活化效 率，我們的實驗策略是：將蛋白酶受質胜肽鏈數量減少，使閉鎖器只需兩次即可完全活化，此外加上 KKGG 長側鏈胺基酸增加其親水性，當閉鎖器與蛋白酶作用時更容易脫離抗體前端。目前我們已利用 cloning 技術建構出 IgG1hinge 閉鎖器基因，並利用 Transient transfection 確認是否能由哺乳類 細胞表現，未來利用 ELISA 比較新型與原始閉鎖器的屏蔽效果及蛋白酶活化後的抗體功能性，進一步 以in vivo 評估帶有新型閉鎖器的前驅抗體藥物功能及藥物治療效果。若我們的新型廣效性閉鎖器開 發成功，將可以降低標靶抗體藥物副作用，並且達到更有效治療的目標，未來這樣的策略將能應用於 各種不同療效的單株抗體，拓展標靶抗體藥物的市場，造福人群。
Figure 1：廣效性閉鎖器活化策略圖
當我們所開發新型閉鎖器前驅抗體藥物，進入疾病部位後，因疾病部位大量分泌 MMP2，與閉 鎖器之單邊受質胜肽鏈作用兩次，即可使抗體再活化，達到提高活化效率、改善副作用，提高 單株抗體的藥物選擇性。
二、研究動機與研究問題
標靶藥物產業至今於全球市場銷售總額超過 500 億美元，年均增長率超過 20%，2014 年後全球年 銷售額將可高達 1000 億美元，是未來國際生物醫藥發展重點。但現今標靶藥物普遍缺乏對疾病區域 抗原的選擇性，導致與正常組織抗原結合，使正常細胞造成不必要傷害，對病患產生藥物治療後的副 作用[1]。以治療類風性關節炎的標靶藥物 Remicade® (anti-TNF-α-antibody)為例[2, 3]，因為人 體內 TNFα廣泛分佈全身，抗體藥物無法達到疾病部位專一性的治療作用，而導致敗血症、淋巴癌[4]
甚至是結核菌嚴重感染等副作用，因此提升標靶藥物的專一性是很重要的。
目前研究已證實許多疾病區域(如自體免疫疾病、癌症)會過度表現基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase-2, MMP2)[5]，目前我們實驗室已利用 IgG1 hinge 與 MMP2 專一受質胜肽鏈，開 發了具有專一性活化功能的抗體閉鎖器，屏蔽於抗體藥物 Remicade® (anti-TNF-α- antibody)的抗 原辨認區，形成前驅抗體藥物(pro-anti-TNF-α-antibody)。前驅抗體藥物的結構為：利用四段 MMP2 蛋白酶專一受質胜肽鏈連結 IgG1 閉鎖器，以屏蔽住抗體的抗原結合位。然而當前趨抗體藥物於疾病 區域時，需要藉由 MMP2 作用 4 次才可完全活化，導致抗體原本的功能受限制而無法百分之百發揮療 效[6, 7]。因此為了使閉鎖器在抗體活化時能達到更好的效率，我們開發出新型廣效性抗體閉鎖器，
利用 4GS linker(glycine- glycine- glycine- glycine-serine)連結兩段 IgG1 hinge 序列，使之 互相鍵結為穩固的雙硫鍵以屏蔽抗體功能區，因此我們以自體移植的概念，將 IgG1 hinge 屏蔽住抗 體活化區，形成閉鎖器結構。而新型閉鎖器具有單邊的 MMP2 蛋白酶專一受質胜肽鏈，分別連接於抗 體輕鏈或重鏈變異端，使前驅抗體藥物在疾病區域，只須經 MMP2 兩次即可活化，同時，我們於閉鎖 器 N 端增添上了 KKGG 胺基酸小片端序列， Glycine(G)能提供蛋白質較大的彈性及空間，Lysine(K) 則具有長側鏈結構且具親水性的性質，能使閉鎖器更快速脫離抗原結合位、避免抗體藥物在尚未達到 疾病區便與人體中正常組織受器結合，進而降低非必要的嚴重副作用。我們設計的新型廣效性抗體閉 鎖器優點不僅是提高了蛋白酶專一性活化效率的特性，也能降低標靶藥物造成的副作用，增加對於疾 病區域的選擇性，此外本策略對於不同療效的單株抗體也具有置換性[8]，未來可應用於其他疾病的 治療，提升標靶抗體藥物療效[9, 10]。
此策略之優點
一、 提升原始閉鎖器活化效率：
新型廣效性閉鎖器在疾病區只須經 MMP2 切兩刀即可使單邊 MMP2 專一受質胜肽鏈水解，而快 速、有效活化抗體藥物，進一步達到治療的目的。
二、 降低副作用：
Figure 2：新型廣 效性閉鎖器可改 善原始閉鎖器的 活化效率
A.圖為原始閉鎖器結 構圖。
B.圖為新型廣效性閉 鎖器結構圖。
新型廣效性閉鎖器只 具一段 MMP2 專一受 質胜肽鍊因此較容易 被活化。
我們所採用的新型廣效性閉鎖器，帶有 MMP2 專一受質胜肽鏈，利用疾病部位大量分泌 MMP2 的特點，避免抗體藥物廣泛分布於全身作用而傷害正常組織細胞、引發副作用。
三、 不引起免疫反應：
此前驅抗體藥物之閉鎖器採用全人類化抗體結構所建構，人體不會產生排斥性免疫反應，大幅 提高安全性與穩定性。
四、 廣泛應用性：
可將蛋白酶專一受質胜肽鏈置換至不同抗體上，用於治療各種疾病及癌症，甚至將此策略廣泛 應用於標靶藥物或其餘藥物開發上，將是疾病治療與藥物開發領域的重大突破。
三、文獻回顧及探討
目前有許多治療自體免疫疾病、癌症的研究是利用蛋白酶的特性來設計藥物來抑制疾病，例如 TNF（tumor necrosis factor）pro-drug 和 CD95L fusion protein pro-drug 等等，皆是利用具有蛋白酶專一 性的受質胜肽 peptide linker，例如：uPA （Urokinase plasminogen activator） selective linker，MMPs
（matrix metalloproteases）連接可以毒殺細胞的物質，將整個前趨蛋白藥物 construct 送入腫瘤細胞 後，蛋白酶就會專一性的切斷受質胜肽，活化可以毒殺細胞的物質。之所以會選擇 MMP2 主要是因 為類風溼性關節炎疾病區都會大量表現 MMP2，可以較為廣泛的運用在自體免疫疾病治療上。
四、研究方法及步驟
1.建構前驅抗體基因。2.利用ELISA進行新型閉鎖器屏蔽功能測試。
3.利用ELISA進行新型閉鎖器活化效率測試。
五、研究成果
先前的實驗結果
目前我們已建構抗體鎖基因，接著利用 cloning 的技術完成建構 pro-anti-TNF-α-antibody，並將此基因 接到質體 pLKO_AS2 上，藉由 TransIT 以 transient transfection 技術將前驅抗體藥物基因到 293T 細胞中，
並用 Western blotting 證實 pro-protein 能夠在細胞中短暫表現。接下來藉由 ELISA 來偵測前驅抗體藥 物的功能，證明在具備 MMP2 蛋白酶專一性活化性下，之後利用 In vivo 實驗對我們的前驅抗體藥物 進行專一性活化功能檢定。
1.建構前驅抗體基因
目的：成功建構前驅抗體基因於載體 pLKOAS3 上。
方法：將以建構出之廣效性閉鎖器 subclone 至類風性關節炎之抗體藥物 anti-TNFα 抗原辨認位。
實驗結果：
結果中可見載體 pLKOAS3 之 9190bp 的基因表現，以及廣效性閉鎖器分別建構於抗體藥物(anti-TNFα) 重鏈(HC)及輕鏈(LC)之基因表現：2414/2357 bp
Figure 3：利用 assembly PCR 建構連接於重鏈(左)及輕鏈(右)上的閉鎖器基因電泳圖 我們利用 assembly PCR 建構出新型廣效性閉鎖器基因，之後跑 DNA 電泳可得如圖。由結 果和 Maker 比較可見連接於單株抗體藥物重鏈 317bp(左圖)、輕鏈 294bp(右圖)上的 IgG1 hinge 閉鎖器基因。成功建構出新型廣效性抗體閉鎖器基因後，我們接著利用 subclone 將 基因送入表現質體內。
結論：以膠體電泳證實成功建構出完整前驅抗體藥物基因。
2.利用西方點墨法進行前驅抗體藥物偵測
目的：利用細胞表現前驅抗體蛋白質。
方法：將以成功建構之前驅抗體利用 Trans IT 送入 293T 細胞中短暫表現前驅抗體蛋白質。之後取細 胞上清液及細胞碎片，藉由西方點墨法偵測蛋白質表現。
實驗結果：
實驗結果如下，左半部是細胞上清液、右半部是細胞碎片。分別代表的是可分泌出細胞之蛋白質表現、
及細胞內的蛋白質表現。此圖表示，經由 293T 可分泌出前驅抗體，並於西方點法偵測其蛋白質。
結論：以西方點墨法證實建構出的前驅抗體在細胞中可表現蛋白質。
3.利用ELISA測定前驅抗體藥物濃度
目的：測定蛋白質濃度。
Sup Lysate
3K
pLKO_AS3
9190 bp
2414bp 2357bp Ab. HC 1kb LC
~55kDa
~70kDa
方法：將廣效性閉鎖器屏蔽於抗體重鏈(HC)之前驅抗體和類風性關節炎抗體藥物(anti-TNFα) 以 sandwich ELISA 做濃度偵測。
實驗結果：
實驗結果中橫軸是抗體濃度稀釋倍率，縱軸是 O.D 值。我們將取和抗體藥物 anti-TNFα 相近濃度的 27 被稀釋濃度做廣效性閉鎖器之屏蔽功能和活化效率測試。
結論：將稀釋濃度以 ELISA assay 做測定。
4.利用ELISA進行新型閉鎖器屏蔽功能及活化效率測試
目的：偵測蛋白質活化效率。
方法：以前驅抗體藥物 27 倍稀釋濃度去測試廣效性閉鎖器的屏蔽及活化效果。實驗中加入基質金屬 蛋白酶 MMP2 與前驅抗體分別反應 0 分鐘和九十分鐘。0 分鐘代表廣效性閉鎖器未活化的狀 態，因此可判斷閉鎖器之屏蔽效果；90 分鐘代表加入酵素反應，活化閉鎖器，因此能依結果 判斷其活化效率。
實驗結果：
結論：實驗證實，廣效性閉鎖器屏蔽於抗體前端之效率相較於抗體藥物(anti-TNFα)並無明顯差異。
六、結論
我們將廣效性閉鎖器，利用所設計之基因序列建構於抗體藥物前端，屏蔽住抗原辨
認位，形成前驅抗體藥物，並送入 293T 細胞做蛋白質短暫表現。經西方點墨法證實細
胞確實可分泌出所設計前驅抗體。進一步，以基質金屬蛋白酶(MMP2)活化廣效性抗體
閉鎖器，並以類風性關節炎抗體藥物(anti-TNFα)比較其屏蔽效果和蛋白酶活化效率。
於實驗結果中可得知，廣效性閉鎖器屏蔽之抗體藥物相較於抗體藥物 anti-TNFα，其抗
體與抗原結合之活性(Ab. binding activity)並無明顯差異，因此，我們認為此廣效性閉鎖
器設計仍需改善，以望達成有效屏蔽、提高活化效率、降低藥物副作用之目的。
七、參考資料
1. Khaled, W., et al., [Non oncologic applications of molecular targeted therapies]. Bull Cancer, 2012.
99(10): p. 953-62.
2. Use of infliximab in a patient with rheumatoid arthritis and chronic hepatitis B.
3. Keystone, E.C., Does anti-tumor necrosis factor-alpha therapy affect risk of serious infection and cancer in patients with rheumatoid arthritis?: a review of longterm data. J Rheumatol, 2011. 38(8):
p. 1552-62.
4. Radioimmunotherapy: a new treatment modality for B-cell non-Hodgkin's lymphoma.
5. Artacho-Cordon, F., et al., Matrix metalloproteinases: potential therapy to prevent the development of second malignancies after breast radiotherapy. Surg Oncol, 2012. 21(3): p.
e143-51.
6. Ko, H.S., et al., The effects of oncostatin M on trophoblast cells: influence on matrix metalloproteinases-2 and -9, and invasion activity. Placenta, 2012. 33(11): p. 908-13.
7. Yoshimatsu, H., et al., Mechanism of the 24-hour rhythm of tumor necrosis factor-alpha formed by onset of rheumatoid arthritis. Chronobiol Int, 2014.
8. Lukina, G.V., et al., [Use of monoclonal antibodies to tumor necrosis factor (remicade) in rheumatoid arthritis: preliminary results]. Ter Arkh, 2003. 75(5): p. 9-12.
9. Carter, C.T., A.K. Changolkar, and R. Scott McKenzie, Adalimumab, etanercept, and infliximab utilization patterns and drug costs among rheumatoid arthritis patients. J Med Econ, 2012. 15(2):
p. 332-9.
10. Tanaka, Y., et al., Discontinuation of infliximab after attaining low disease activity in patients with rheumatoid arthritis: RRR (remission induction by Remicade in RA) study. Ann Rheum Dis, 2010.
69(7): p. 1286-91.
